CN101346131A - 用于克服肿瘤细胞耐药性的基于蛋白质的载体系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米粒子，该纳米粒子的粒子基质基于至少一种蛋白质并含有至少一种包埋其内的活性剂，涉及用包埋在蛋白质基质内的至少一种活性剂制备该纳米粒子的方法以及所述纳米粒子用于治疗肿瘤、尤其用于治疗对化学药物耐药的肿瘤的用途。

Description

用于克服肿瘤细胞耐药性的基于蛋白质的载体系统
背景技术
在对实体肿瘤的治疗中耐药性的形成造成肿瘤学中的重大问题。由于由肿瘤细胞排出的化学治疗物质增加使耐药性频繁发生。这种耐药性形成的机制与P-糖蛋白(Pgp)的过表达有关[Krishna等人，(2000)，Eur.J.Pharm.Sci.11，265]。Pgp是一种ATP依赖性外排泵(efflux pump)，其能够从肿瘤细胞主动排出药用物质。Pgp的过表达导致了细胞内化学治疗剂的聚集减少，这样其细胞内浓度不足以获得抗肿瘤作用。为代偿化学治疗剂聚集的减少，需要细胞生长抑制剂的剂量适应，即，剂量增加，但是，由于与这样的增加伴随出现的是细胞生长抑制剂的毒副作用，其受到限制。Pgp的过表达导致了所谓的多重耐药性[多药耐药性，MDR]，其中，细胞不仅对最初的物质而且还对多种细胞生长抑制剂有耐药性。这种现象相当大地限制了肿瘤化学疗法的成功。
在过去，已经开发出多种对抗肿瘤细胞耐药性的方法，最常研究的方法是使用用作Pgp抑制剂的活性剂。在1981年就已经确定了钙拮抗剂对Pgp的抑制作用[Tsuruo等人，(1981)，Cancer Res.41，1967]。在这些研究中，当将长春花新碱耐药性P388肿瘤细胞另外用钙离子拮抗剂培养时，观察到在这些细胞中长春花新碱和阿霉素的聚集增加。异搏定被证实是钙离子拮抗剂的活性剂组中的一个有价值的成员。但是，如能够显示的是，如环孢菌素A的其它活性剂也是Pgp的强效抑制剂[Slater等人，(1986)，J.Clin.Invest.77，1405]。在这些研究中，通过同时施用环孢菌素A能够克服急性淋巴白血病细胞对长春花新碱和柔红霉素的耐药性。
由于异搏定和环孢菌素A均具有许多潜在的副作用，探寻了其它的Pgp抑制剂。因此，在体外试验中使用两种Pgp抑制剂MS-209和SDZ PSC 833克服了P388/ADM和K562/ADM细胞的多重耐药性[Naito等人，(1997)，Cancer Chemother.Pharmacol.40，Suppl.S20]。
另一种用于克服多重耐药性的方案是对活性剂的化学改性。这种方案试图通过使抗肿瘤活性剂与不同的大分子结合来克服肿瘤细胞的耐药性。在该方案中大分子起到了作为活性剂载体的作用。这就是所谓的载体系统。
在1992年就已经指出：用加载阿霉素的聚异己基氰基丙烯酸酯(polyisohexylcyanoacrylate)(PIHCA)纳米球能够克服多种肿瘤细胞系中Pgp介导的耐药性[Cuvier等人，(1992)，Biochem.Pharmacol.44，509]。用阿霉素耐药性C6细胞验证了这些试验，在该细胞中，加载阿霉素的聚异己基氰基丙烯酸酯纳米球的抑制浓度50(inhibitory concentration50)(IC50)明显低于未结合阿霉素的IC50[Bennis等人，(1994)，Eur.J.Cancer 30A，89]。使用适合的加载阿霉素的PIHCA纳米球，也能够在肝癌细胞上验证该结果[Barraud等人，(2005)，J.Hepatol.42，736]。
通过胶态载体系统克服耐药性的机制开始引发了思考。根据一种流传广泛的观点，由靶细胞通过内吞过程(endocytotic process)摄取了该载体系统，因此避开了Pgp介导的耐药性机制。与聚异己基氰基丙烯酸酯纳米粒子有关，这种观点被证实是错误的[Henry-Toulme等人，(1995)，Biochem.Pharmacol.50，1135]。在用PIHCA纳米粒子培养后的耐药性肿瘤细胞系的荧光显微镜的研究中，在该细胞中没有观察到粒子的聚集，而在如巨噬细胞的吞噬细胞中能够显示聚集。因此，将PIHCA纳米粒子对多重耐药性的克服作为聚合物基质与活性剂的产物的协同作用来讨论。这种假设得到了显示出加载阿霉素的聚异己基氰基丙烯酸酯(PIBCA)纳米粒子对耐药性P388/Adr细胞具有增强的细胞毒性作用的试验的支持[Colin de Verdiere等人，(1994)，CancerChemother.Pharmacol.33，504]。用PIBCA纳米粒子培养细胞引起在靶细胞中活性剂浓度5倍的增长。与内吞摄取纳米粒子相反，讨论了纳米粒子/细胞的相互作用作为以该现象为基础的机制。
在1993年，Ohkawa等人公开了阿霉素牛血清白蛋白结合物对耐药性大鼠肝癌细胞(AH66DR)作用的研究[Cancer Res.53，4238-4242]。与未改性的活性剂的对照相比，该阿霉素-牛血清结合物显现出增强的细胞毒性作用。讨论将由于排出减少引起该结合物聚集增加作为这种作用的原因。对腹膜荷瘤大鼠的治疗显示阿霉素牛血清白蛋白结合物将平均生存率从对照组中的30天增加到50天。
由Ohkawa等人描述的阿霉素牛血清白蛋白结合物是通过将活性剂和牛血清白蛋白溶解在合适的溶剂中然后加入戊二醛来制备。戊二醛与活性剂和靶蛋白的官能团反应，在此情况下官能团为氨基，因此导致分子的共价偶联。阿霉素牛血清白蛋白的转运能力显示为每个载体单元相当于3至4个活性剂分子。
因此由Ohkawa等人描述的阿霉素牛血清白蛋白结合物是阿霉素与牛血清白蛋白的共价化学结合物。对活性剂这样的化学改性改变了该活性剂的物理化学特性。形成了在生物系统中具有不同的和新的作用的新的活性剂(NCI：new chemical entities)。
对具有抗肿瘤作用的阿霉素牛血清白蛋白结合物而言，其必须能够在靶组织中裂开共价的活性剂-蛋白质的键。只有这样才能够释放治疗性活性剂。
尽管具有这些缺点，应用如纳米粒子或纳米球的胶态“给药系统”或结合活性剂的载体系统也是用于克服肿瘤细胞的有价值的方案之一。
发明内容
因此，本发明的目的为提供一种用于克服肿瘤细胞中耐药性的胶态“给药系统”，其不具有活性剂与载体物质共价结合的已知结合物的缺点。
通过提供纳米粒子实现了上述目的，在该纳米粒子中，至少一种活性剂被包含在蛋白质基质中，但该活性剂不与所述蛋白质共价偶联。
本发明的主题为纳米粒子，所述纳米粒子的粒子基质基于至少一种蛋白质并且包含至少一种包埋在其中的活性剂；该纳米粒子的制备方法；以及该纳米粒子用于治疗肿瘤和用于制备治疗肿瘤(尤其是用于治疗对化学药物有耐药性的肿瘤)的药物的用途。
根据本发明所述的纳米粒子包含至少一种粒子基质基于的蛋白质和至少一种包埋在所述基质中的活性剂。
大体上，任何可溶于水性介质的生理上可耐受的、可药用的蛋白质均适于作为形成纳米粒子的基质的一种或多种蛋白质。尤其优选的蛋白质是源自不同的动物物种(牛、猪等)的明胶和白蛋白，以及乳蛋白质酪蛋白。大体上，也可以将例如免疫球蛋白的其它蛋白质用作原材料制备根据本发明的纳米粒子。
基本上，可以将任何具有细胞内作用的所需活性剂包埋进粒子基质中。但是，优选的是，借助根据本发明的纳米粒子施用细胞生长抑制剂和/或其它抗肿瘤活性剂来治疗肿瘤，尤其是对细胞生长抑制性药物或其它抗肿瘤活性剂具有耐药性的肿瘤。尤其优选含有包埋在其蛋白质基质中如阿霉素、柔红霉素、表柔比星或伊达比星的蒽环类的纳米粒子。
适合作为包埋在纳米粒子的蛋白质基质中的抗肿瘤剂为，例如：-细胞生长抑制剂，
-植物细胞生长抑制剂，例如：槲寄生制剂，
-化学限定的细胞生长抑制剂，
-生物碱和鬼臼毒素，
-长春花生物碱和类似物，例如：长春花碱、长春花新碱、长春酰胺、长春烯碱，
-鬼臼毒素衍生物，例如：足叶乙甙、表鬼臼毒噻吩糖苷，
-烷化剂，
-亚硝基脲，例如：嘧啶亚硝脲、亚硝基脲氮芥、环己亚硝脲，
-氮芥类似物，例如：环磷酰胺、磷雌氮芥、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、三芥环磷酰胺、苯丁酸氮芥、宾达氮芥，
-其它烷化剂，例如：氮烯唑胺、二甲磺酸丁酯、普鲁苄肼、丁四醇磺酯、替莫唑胺、硫替派，
-细胞毒性抗生素，
-蒽环类相关物质，例如：米托蒽醌，
-其它细胞毒性抗生素，例如：博来霉素、丝裂霉素、更生霉素，
-抗代谢物，
-叶酸类似物，例如：氨甲蝶呤，
-嘌呤类似物，例如：氟达拉滨、克拉屈滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤，
-嘧啶类似物，例如：阿糖胞苷、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨，
-其它细胞生长抑制剂，例如：紫杉醇、多烯紫杉醇，
-其它抗肿瘤剂，
-铂化合物，例如：卡铂、顺铂、奥沙利铂，
-其它抗肿瘤剂，如：安吖啶、伊立替康、羟基脲、喷司他丁、卟吩姆钠、阿地白介素、维甲酸和门冬酰胺酶。
可以将任何在上述列表中列出的活性剂包埋在基于蛋白质的载体系统的粒子基质中。但是，由于活性剂不同的物理化学特性(例如，溶解度、吸附等温线、血浆蛋白质结合、pKa值)，可能必须针对不同的活性剂最优化含有活性剂的纳米粒子的制备方法。
因此，根据本发明的纳米粒子构成了基于蛋白质的载体系统，该载体系统含有至少一种包埋在该粒子的蛋白质基质中的活性剂，该纳米粒子优选用于肿瘤的治疗，尤其用于耐药性肿瘤的治疗。
根据本发明的纳米粒子优选大小为100～600nm，更优选为100～400nm。在特别优选的实施方案中，该纳米粒子大小为100～200nm。
根据本发明的纳米粒子能够克服肿瘤细胞对化学药物的耐药性。
根据本发明的纳米粒子可以具有经改性的表面。例如，该表面可以被聚乙二醇化(PEGylated)，即，聚乙二醇可以通过共价键与纳米粒子的表面结合。通过用聚乙二醇(PEG)改性该表面，可以改变纳米粒子的特性，从而改善其稳定化、在机体中的半衰期、水-溶解度、免疫特性和/或生物利用率。
但是，该纳米粒子还可以在其表面具有能使纳米粒子在特定器官或在特定细胞中靶向性聚集的“药物导向配体”。优选的药物导向配体为识别肿瘤特异性蛋白质的配体，例如，所述配体选自包括如曲妥珠单抗和西妥昔单抗的肿瘤特异性蛋白质识别抗体和运铁蛋白以及半乳糖的组中。该药物导向配体也可以通过双功能PEG衍生物与纳米粒子的表面偶联。
与根据本发明的纳米粒子表面的改性有关，本发明参考了WO2005/089797A2，将其内容以完整的形式引入本发明的公开内容中作为参考。
优选地，首先通过优选在水或水性介质中共溶解一种活性剂/多种活性剂和一种蛋白质/多种蛋白质制备根据本发明的纳米粒子。接着，通过有控制地加入蛋白质的非溶剂，优选为有机溶剂，更优选为乙醇，使蛋白质以缓慢且有控制的方式通过简单去溶剂化从溶液中沉淀出。在上述过程中，在溶液中的活性物质周围形成了胶态载体系统(纳米粒子)。从而将活性剂包埋在未经改性的载体系统的基质中。
当制备加载活性剂的纳米粒子时，优选以相对于蛋白质的摩尔数超量使用活性剂。特别优选，活性剂与蛋白质的摩尔比为5∶1至50∶1。也可以以超过50∶1的摩尔比加载纳米粒子。
通过加入优选戊二醛的交联剂进行蛋白质基质后续的交联，从而使纳米粒子的基质稳定化。
通过改变交联剂的量，能够获得粒子基质的不同的稳定化程度。优选制备50％～200％稳定化的纳米粒子。这些百分比与出现在所用蛋白质中的氨基与戊二醛的醛官能团的摩尔比相关。1∶1的摩尔比相当于100％的稳定化。
除了双官能醛戊二醛外，其它能够与蛋白质形成共价键的双官能物质也适合用于蛋白质基质的稳定化。例如，这些物质能够与蛋白质的氨基或巯基反应。适合的交联剂的实例为：甲醛、双官能琥珀酰亚胺、异硫氰酸酯、磺酰氯、马来酰亚胺和吡啶基硫化物。
但是，蛋白质基质的稳定化还可能受加热作用的影响。优选地，通过在70℃下保温2小时或在80℃下保温1小时来使蛋白质基质稳定化。
由于只有在纳米粒子沉淀后才发生交联，根据本发明的载体系统不会使活性剂与蛋白质形成化学性共价键。而是将活性物质包埋在载体系统的基质中。因此，活性物质的整合很大程度上不依赖于活性剂的类型，并且这种整合能被普遍应用。
与必须能够在靶组织中断开活性剂-蛋白质的结合以实现活性剂释放的共价结合的活性剂结合物不同，在本发明的胶态载体系统中的活性剂的释放由在所有组织中存在的溶酶体酶通过蛋白质结构的降解发生。为达到该目的，不需要直接断开活性剂-蛋白质的结合。
用于克服肿瘤细胞耐药性的本发明的粒子系统具有以下优点：
1、克服了肿瘤细胞的耐药性。
2、与脂质体制剂相比以及与活性剂溶液相比，其增加了对肿瘤细胞的细胞毒性。
3、基于蛋白质的纳米粒子是由生理物质构成的。
4、不需要另外的含有Pgp抑制剂的药物。
5、位于粒子基质内部的活性剂受到保护免受外部的影响。
6、容易实现对粒子表面的改性。
通过用适合的化学试剂对位于粒子表面的官能团(氨基、羧基、羟基)进行化学转化，能够使例如不同链长的聚乙二醇链(PEG)与纳米粒子结合。在被称为聚乙二醇化或蛋白质聚乙二醇化的该方法中，主要通过在蛋白质上的一个氨基或巯基与在PEG上的一个化学活性基团(碳酸盐、酯、醛或三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate))之间稳定的共价键进行对纳米粒子的表面改性。形成的结构可以是直链或分枝的。聚乙二醇化反应受到例如PEG质量、蛋白质类型、在反应混合物中蛋白质的浓度、反应时间、温度和pH值的因素的影响。因此，必须为每种载体系统找到适合的PEG。
除了较狭意理解的对粒子表面的聚乙二醇化，即，用单官能PEG衍生物转化蛋白质粒子外，为了使所谓的“药物导向配体”与粒子偶联，还可以将双官能PEG衍生物与粒子表面结合。其它的表面改性为，例如，为与乙酰基或乙酸基附着，用乙酸酐或碘乙酸转化粒子表面的官能团。
根据本发明的纳米粒子的表面也能够用合适的药物导向配体通过蛋白质-化学反应来改性，从而能够在特定组织或细胞中聚集纳米粒子而无需适应之前的载体系统。
能够将任何肿瘤特异性蛋白用作“药物导向配体”的受体。特别优选的是，将识别肿瘤特异性蛋白的抗体，例如抗体曲妥珠单抗和西妥昔单抗，用作“药物导向配体”。曲妥珠单抗()识别由多种肿瘤细胞过表达的HER2受体，并被批准用于乳腺癌的治疗。西妥昔单抗(
Figure A20068004907200142
)识别多种肿瘤细胞上的表皮生长因子受体，并被批准用于结肠癌的治疗。除抗体外，通过与粒子结合的配体，例如识别由肿瘤细胞过表达的运铁蛋白受体的运铁蛋白，或者通过低分子受体配体，例如与肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白结合的半乳糖，也能够获得“药物导向”。
附图说明
图1为显示阿霉素纳米粒子(Dxr-NP)、阿霉素溶液(Dxr-Soln)和阿霉素脂质体(Dxr-Lip)对肠胃外成神经细胞瘤细胞(parenteralneuroblastoma cell)的细胞活性的影响的图。
图2为显示阿霉素纳米粒子(Dxr-NP)、阿霉素溶液(Dxr-Soln)和阿霉素脂质体(Dxr-Lip)对耐药性成神经细胞瘤细胞的细胞活性的影响的图。
具体实施方式
实施例
为制备根据本发明的纳米粒子，将相当于5∶1(活性剂∶蛋白质)摩尔比的20.0mg人血清白蛋白和1.0mg盐酸阿霉素溶解在1.0mL超纯水中，并在搅拌的同时孵育2小时。当通过泵系统(1.0mL/min)加入3.0mL96％的乙醇时，血清白蛋白沉淀以纳米粒子的形式出现。通过加入不同量的8％的戊二醛使上述物质交联24小时以达到不同的程度(表1)。将稳定的纳米粒子分成2.0mL的试样量并通过3个循环的离心和在超声波水浴中的再分散来纯化。收集各个洗涤步骤的上清液并用RP18HPLC测定其内含有的未结合的阿霉素部分。为测定纳米粒子的浓度，向称重后的金属盘(weighted metal boat)加入50.0μL制剂并在80℃下干燥2h。冷却后，再次对制剂称重并计算纳米粒子的浓度。
由RP18-HPLC定量未结合部分来测定用阿霉素加载的效率。根据交联度，绝对加载量为每mg载体系统35.0～48.0μg活性剂。因此，载体系统的转运能力为每个载体单元(＝纳米粒子)大约106活性物质分子。
表1：以人血清白蛋白为基础的含有阿霉素的纳米粒子的稳定化
  稳定化   戊二醛的量(8％溶液)
  200％   23.50μL
  100％   11.75μL
  75％   5.88μL
  50％   2.94μL
为检测制备的阿霉素纳米粒子(Dxr-NP)与阿霉素溶液(Dxr-Soln)和脂质体阿霉素制剂(
Figure A20068004907200161
)相比的细胞毒性，使用了下面的细胞系：
Frankfurt(法兰克福大学临床中心)的人成神经细胞瘤细胞系的肠胃外细胞(UKF-NB3Par.)；
Figure A20068004907200163
Frankfurt的人成神经细胞瘤细胞系的阿霉素耐药性细胞(UKF-NB3Dxr-R.)。
为检测细胞毒性，采用了MTT试验。在该试验中，检测了细胞在不同浓度物质存在下的活性，然后与对照组细胞比较。从该结果中能够计算出IC50值(抑制浓度50)，即，在该浓度下50％细胞死亡的物质浓度。该试验是基于在活细胞的线粒体中3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物的还原反应。通过该还原反应，黄色的四唑盐被还原为以蓝色结晶沉淀的甲臜(formazan)。用SDS/DMF溶液溶解该结晶后，能够光度测量色度。在本试验中高吸收表示高的细胞活性。
为检测肠胃外和耐药性成神经细胞瘤细胞的细胞毒性，将细胞平均分配加入96-孔微孔板的孔中。一列孔含有纯培养基并相当于空白值；在第二列中培养用作增殖对照(100％值)的细胞。用移液管将含有阿霉素的制剂(Dxr-NP、Dxr-Soln和Dxr-Lip)加入剩余的孔中，浓度从右至左增加(0.75；1.5；3.0；6.0；12.5；25.0；50.0；100.0ng/mL)。接着将该微孔板在37℃、5％CO2的培养箱中培养5天。用移液管向各孔中加入25μL MTT溶液并再次在37℃培养箱中培养4h。通过加入100μLSDS/DMF-溶液终止四唑溴化物转化成蓝色甲臜的还原反应。进一步在37℃培养过夜后，有色结晶已经被完全溶解，在620/690μm光度测量各孔中的色度。通过从测量值减去空白值并参考对照，能够以百分比表示细胞活性。
检测了含有不同阿霉素的制剂对没有耐药性机制的肠胃外成神经细胞瘤细胞系(UKF-NB3Par.)和阿霉素耐药性成神经细胞瘤系(UKF-NB3Dxr-R.)的细胞毒性。对肠胃外细胞系的检测(图1)显示具有100％稳定化的Dxr溶液和Dxr-NP对肠胃外成神经细胞瘤细胞均具有强细胞毒性作用。在阿霉素为3ng/mL的低浓度下，细胞活性已经下降至低于50％。脂质体Dxr制剂(
Figure A20068004907200171
)显现出对细胞明显较低的细胞毒性。使用该制剂，需要药物物质的较高浓度(25.0ng/mL)。通过计算各个制剂的IC50值证实了该结果(表2)。Dxr-NP和Dxr-Soln分别在2.4ng/mL和1.6ng/mL的浓度就已经造成了50％细胞的死亡，而不得不使用相对较大剂量的具有25.8ng/mL IC50的Dxr脂质体。
为验证是否能够克服耐药性，还用含有阿霉素的制剂检测了阿霉素耐药性成神经细胞瘤细胞。在这些试验中，发现：不同制剂间存在相当大的差别(图2)。观察到具有14.4ng/mL IC50的纳米粒子化(nanoparticulate)的Dxr制剂具有最高的细胞毒性。Dxr溶液对细胞活性的影响相对较弱。使用该溶液，与用肠胃外UKF-NB3细胞的试验相比，其IC50升至53.46ng/mL。脂质体Dxr制剂对UKF-NB3Dexr-R细胞的生长没有影响。即使阿霉素的浓度为100ng/mL也没有显示出细胞毒性作用。
表2：Dxr-NP、Dxr-Soln、Dxr脂质体在肠胃外和耐药性UKF-NB3细胞中的IC50值
Figure A20068004907200181
细胞毒性试验的结果清楚地显示出在不同制剂中的阿霉素强烈地抑制了肿瘤细胞的生长。在非耐药性细胞中，Dxr纳米粒子和Dxr溶液显示出相似的作用。但是，如果是在用细胞生长抑制剂治疗的过程发生耐药性的形成，纳米粒子Dxr制剂优于活性剂溶液。另一方面，脂质体Dxr制剂不能够克服肿瘤细胞的耐药性机制。

Claims (18)

1、用于治疗耐药性肿瘤细胞的纳米粒子，所述纳米粒子包含其中包埋有至少一种活性剂的至少一种蛋白质的基质。
2、根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述蛋白质选自包括白蛋白、明胶、酪蛋白和免疫球蛋白的组中，尤其优选人血清白蛋白。
3、根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其特征在于，所述活性剂为抗肿瘤活性剂。
4、根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其特征在于，所述活性剂选自包括植物细胞生长抑制剂、化学限定的细胞生长抑制剂的细胞生长抑制剂的组中，所述化学限定的细胞生长抑制剂选自生物碱，尤其是长春花生物碱；鬼臼毒素；鬼臼毒素衍生物；烷化剂，尤其是亚硝基脲、氮芥类似物；细胞毒性抗生素，优选蒽环类；抗代谢物，尤其是叶酸类似物、嘌呤类似物和嘧啶类似物的组中。
5、根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其特征在于，所述活性剂选自包括槲寄生制剂、长春花碱、长春花新碱、长春酰胺、长春烯碱、足叶乙甙、表鬼臼毒噻吩糖苷、嘧啶亚硝脲、亚硝基脲氮芥、环己亚硝脲、环磷酰胺、磷雌氮芥、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、三芥环磷酰胺、苯丁酸氮芥、宾达氮芥、氮烯唑胺、二甲磺酸丁酯、普鲁苄肼、丁四醇磺酯、替莫唑胺、硫替派、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博来霉素、丝裂霉素、更生霉素、氨甲蝶呤、氟达拉滨、克拉屈滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、紫杉醇、多烯紫杉醇、卡铂、顺铂和奥沙利铂的组中。
6、根据权利要求3所述的纳米粒子，其特征在于，所述抗肿瘤活性剂选自包括铂化合物、安吖啶、伊立替康、羟基脲、喷司他丁、卟吩姆钠、阿地白介素、维甲酸和门冬酰胺酶的组中。
7、根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子的表面包含聚乙二醇分子或药物导向配体。
8、根据权利要求7所述的纳米粒子，其特征在于，所述聚乙二醇分子为单官能或双官能聚乙二醇衍生物。
9、根据权利要求7或8所述的纳米粒子，其特征在于，所述药物导向配体选自包括曲妥珠单抗、西妥昔单抗、肿瘤特异性蛋白质识别抗体、运铁蛋白和半乳糖的组中。
10、根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子的大小为100～600nm，优选为100～400nm，并尤其优选为100～200nm。
11、制备用于治疗耐药性肿瘤细胞的纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：
在水性介质中溶解至少一种蛋白质和至少一种活性剂；
通过有控制地加入所述蛋白质的非溶剂，优选有机溶剂，尤其优选乙醇来以纳米粒子的形式沉淀所述蛋白质；
通过加入交联剂或通过热处理稳定沉淀的纳米粒子；
通过洗涤/离心纯化所述纳米粒子。
12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述活性剂与所述蛋白质的摩尔比为5∶1～50∶1。
13、根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自包括戊二醛、甲醛、双官能琥珀酰亚胺、异硫氰酸酯、磺酰氯、马来酰亚胺和吡啶基二硫化物的物质的组中。
14、根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述热处理在80℃下进行1小时或者在70℃下进行2小时。
15、根据权利要求11～14中任一项所述的方法，其特征在于，通过PEG衍生物和/或药物导向配体的共价结合而将所述纳米粒子的表面改性。
16、根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述药物导向配体选自包括识别肿瘤特异性蛋白质的抗体、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、运铁蛋白和半乳糖的组中。
17、根据权利要求1～10中任一项所述的纳米粒子用于制备用于治疗肿瘤、尤其用于治疗耐药性肿瘤的药物的用途。
18、根据权利要求1～10中任一项所述的纳米粒子用于治疗肿瘤、尤其用于治疗耐药性肿瘤的用途。
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