TWI598341B - 苯達莫司汀衍生物及其使用方法 - Google Patents

苯達莫司汀衍生物及其使用方法 Download PDF

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Description

苯達莫司汀衍生物及其使用方法 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2012年11月12日申請之美國臨時申請案第61/725,213號及2013年3月12日申請之美國臨時申請案第61/776,951號之權益，該等臨時申請案之全文均以引用的方式併入本文中。
本發明係有關苯達莫司汀(bendamustine)之酯及醯胺，其係用於治療癌症。
苯達莫司汀，4-[5-[雙(2-氯乙基)胺基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸：
係以鹽酸鹽形式以商標名RIBOMUSTIN及TREANDA市售且為已成功用於治療血液癌症(諸如慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)及多發性骨髓瘤)之化合物。該等產品係以靜脈內輸注液形式投予。
然而，使用苯達莫司汀治療實體腫瘤受到化合物在水性環境中之化學不穩定性的限制。實際上，已報導苯達莫司汀在活體內之半衰期僅為約6-10分鐘。因此，苯達莫司汀之循環含量無法持續足夠長的時間使 苯達莫司汀到達循環系統外部之腫瘤。需要增加苯達莫司汀之循環時間的方法。
本發明係有關式I化合物：
其中R1為C6-C24烷基或聚乙二醇；或其醫藥學上可接受之鹽形式。亦描述使用式I化合物治療實體及非實體癌症腫瘤之方法。
本發明亦有關式IA化合物或其醫藥學上可接受之鹽形式之用途：
其中R為C1-C24烷基或聚乙二醇，其係用於治療實體及非實體癌症腫瘤。
本發明進一步有關式II化合物：
其中R2為C1-C24伸烷基；且R3為-COOC1-3烷基；或R2-R3為C1-C24烷基；或其醫藥學上可接受之鹽形式。使用式II化合物治療實體及非實體癌症腫瘤之方法。
包括式I或式IA化合物之奈米粒子以及包含該等奈米粒子之凍乾組成物亦在本發明之範疇內。
圖1描述CD-1小鼠中本發明之某些具體實例之血漿含量，於3% DMSO、30% Solutol中以100μL按3mg/kg靜脈內給予。
圖2描述鹽酸苯達莫司汀及本發明之某些具體實例對負載MDA-MB-231異種移植物之小鼠中之腫瘤體積的作用。
圖3描述在用本發明之某些具體實例處理MDA-MB-231乳房腫瘤S9之後，隨時間推移而觀測到之苯達莫司汀之量。
圖4描述在用本發明之某些具體實例處理H460非小細胞肺腫瘤S9之後，隨時間推移而觀測到之苯達莫司汀之量。
圖5描述在使用不同調配物在大鼠中給予本發明之一個具體實例之後，大鼠中苯達莫司汀之血漿含量。
圖6描述在使用不同調配物在大鼠中給予本發明之一個具體實例之後，大鼠中該具體實例之血漿含量。
圖7描述本發明之一個具體實例(苯達莫司汀C14酯)之奈米粒子的Cryo-TEM影像。
圖8描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之血漿含量。
圖9描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之血液含量。
圖10描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具 體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之腦含量。
圖11描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之肝臟含量。
圖12描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之肺含量。
圖13描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之脾含量。
圖14描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯之後，苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯(呈液體及奈米粒子調配物形式)之腎含量。
圖15描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給藥之後，在投予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯(呈液體調配物形式)之後，大鼠中苯達莫司汀之血漿、血液及器官含量。
圖16描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯(呈液體調配物形式)之後，大鼠中苯達莫司汀C12酯之血漿、血液及器官含量。
圖17描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給藥之後，在投予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯(呈奈米粒子調配物形式)之後，大鼠中苯達莫司汀之血漿、血液及器官含量。
圖18描述在以30mg/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給予本發明之一個具體實例苯達莫司汀C12酯(呈奈米粒子調配物形式)之後，大鼠中苯達莫司 汀C12酯之血漿、血液及器官含量。
圖19描述在以3mg-eq/kg(1mL/kg)靜脈內對大鼠給藥之後，在投予本發明之具體實例苯達莫司汀PEG-2000酯及苯達莫司汀PEG-5000酯之後，大鼠中苯達莫司汀之血漿含量。與TREANDA進行比較。
圖20描述在以3mg/kg靜脈內給予本發明之具體實例(3% DMSO、30% Solutol)之後，CD-1小鼠中苯達莫司汀之血漿含量。
圖21描述在52,000x放大率下之本發明之代表性奈米粒子具體實例。在樣品中觀測到：看來比周圍緩衝液更均勻地密集的球狀粒子(最左側箭頭)、背景中之小粒子(最右側箭頭)。插圖以較大比例展示由最左側箭頭表示的兩個粒子。左側影像中十字標之間的距離為28nm，右側插圖中十字標之間的距離為43nm。比例尺：200nm。
圖22描述在52,000x放大率下之本發明之代表性奈米粒子具體實例。在樣品中觀測到：看來比周圍緩衝液更均勻地密集的球狀粒子(最左側箭頭)、背景中之小粒子(最右側箭頭)。插圖以較大比例展示由最左側箭頭表示的兩個粒子。左側影像中十字標之間的距離為28nm，右側插圖中十字標之間的距離為43nm。比例尺：200nm。
圖23描述在投予VELCADE®、苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯奈米粒子後之腫瘤體積。
圖24描述在投予VELCADE®、苯達莫司汀及苯達莫司汀C12酯奈米粒子後之體重量測值。
已發現將苯達莫司汀之羧酸部分轉化為C1-C24烷基酯基、聚乙二醇酯基或C1-C24烷基醯胺基團可產生會提供更長的苯達莫司汀循環時間之化合物。儘管不希望受任何特定理論約束，但假設酯或醯胺部分會降低苯達莫司汀分子之溶解度，從而產生針對水性環境之保護作用。隨時間 推移，酯或醯胺部分水解，從而暴露活性苯達莫司汀分子之羧酸部分。整體結果為隨時間推移而產生苯達莫司汀。
藉由改變酯/醯胺部分中碳之數目，可對所得苯達莫司汀衍生物之親脂性進行改質。已將親脂性增加與酯/醯胺之穩定性增加及苯達莫司汀之循環時間延長相關聯。
式IA化合物：
其中R為C1-C24烷基或聚乙二醇；或其醫藥學上可接受之鹽形式在本發明之範疇內。式IA化合物適用於治療患者中之實體或非實體癌症腫瘤。
本發明之化合物可調配成醫藥組成物，其包含式IA化合物或其醫藥學上可接受之鹽形式及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。在本發明之較佳醫藥組成物中，R為C10-C24烷基。R較佳為C10烷基。亦較佳為其中R為C12烷基。其他較佳具體實例包括其中R為C14烷基之具體實例。其中R為C16烷基之組成物亦為較佳。
本發明之其他具體實例包括奈米粒子，其包含式IA化合物。
治療患者中之實體或非實體癌症腫瘤之方法亦在本發明之範疇內，其包含向患者投予式IA化合物。較佳實體或非實體腫瘤包括慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病、惰性非霍奇金氏淋巴瘤(T細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤)、侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴球性白血病、乳癌或肺癌(例如小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC))。亦預想可使用本發明之化合物及組成物治療其他實體及非實體癌症腫瘤，諸如肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、睾丸癌、黑素瘤、神經膠母細胞瘤、結腸 癌、頭頸癌、卵巢癌及前列腺癌。亦預想可使用本發明之化合物治療其他實體及非實體癌症腫瘤，例如乳癌、胰臟癌及胃癌。
本發明之較佳化合物為式I化合物：
其中R1為C6-C24烷基或聚乙二醇；或其醫藥學上可接受之鹽形式。式I化合物適用於治療患者中之實體或非實體癌症腫瘤。
在較佳具體實例中，R1為C8-C24烷基。在其他具體實例中，R1為C10-C24烷基。在其他具體實例中，R1為C12-C24烷基。在其他具體實例中，R1為C14-C24烷基。亦較佳為其中R1為C16-C24烷基之式I化合物。在其他具體實例中，R1為C18-C24烷基。
在其他具體實例中，R1為C10烷基。在其他具體實例中，R1為C12烷基。在其他具體實例中，R1為C14烷基。在其他具體實例中，R1為C16烷基。
醫藥組成物亦在本發明之範疇內，其包含式I化合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
本發明之其他具體實例包括奈米粒子，其包含式I化合物。
治療癌症之方法亦在本發明之範疇內，其包含向患者投予式I化合物。該治療可對多種癌症起作用，包括涉及實體腫瘤之癌症以及不涉及實體腫瘤之癌症。該等癌症包括慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病、惰性非霍奇金氏淋巴瘤(T細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤)、侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴球性白血病、乳癌或肺癌(例如小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC))。亦預想可由本發明之化合物 及組成物治療之其他癌症為特徵在於存在實體腫瘤之癌症，包括肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、睾丸癌、黑素瘤、神經膠母細胞瘤、結腸癌、頭頸癌、卵巢癌及前列腺癌。亦預想可使用本發明之化合物治療其他實體及非實體癌症腫瘤，例如乳癌、胰臟癌及胃癌。
本發明之尤其較佳化合物包括：
式II化合物：
其中R2為C1-C24伸烷基；且R3為-COOC1-3烷基；或R2-R3為C1-C24烷基；或其醫藥學上可接受之鹽形式亦在本發明之範疇內。式II化合物適用於治療患者中之實體或非實體癌症腫瘤。
在式II化合物之較佳具體實例中，R2-R3為C8-C24烷基。在其 他具體實例中，R2-R3為C10-C24烷基。在其他具體實例中，R2-R3為C12-C24烷基。在其他具體實例中，R2-R3為C14-C24烷基。亦較佳為其中R2-R3為C16-C24烷基。在其他具體實例中，R2-R3為C18-C24烷基。
對於式II化合物，R2-R3較佳為C10烷基。亦較佳為其中R2-R3為C12烷基。在其他具體實例中，R2-R3為C14烷基。在其他具體實例中，R2-R3為C16烷基。
在其他具體實例中，R2為C2伸烷基且R3為-COOCH3。
較佳式II化合物包括：
醫藥組成物亦在本發明之範疇內，其包含式II化合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
本發明之其他具體實例包括奈米粒子，其包含式II化合物。
在本發明之一個具體實例中，本發明之化合物及組成物係用於治療對一或多種化學治療劑(諸如烷化劑)具有抗性之患者。患者可抵抗之例示性烷化劑包括：氮芥；乙烯亞胺；烷基磺酸酯；三氮烯；哌；及亞硝基脲。患者可變得具有抵抗性之各種類型之化學治療劑之更特定實例列舉於下文中。對該等試劑中之一或多者具有抗性之患者將得益於用本發明之化合物及組成物進行之治療。
氮芥
二氯甲基二乙胺(Mechlorcthamine)(以商標名Mustargen®市售)係藉由注射提供以治療霍奇金氏疾病及非霍奇金氏淋巴瘤，且作為乳癌及肺癌之緩解性療法提供，且作為蕈樣真菌病(皮膚T細胞淋巴瘤)之皮膚病變之局部治療法提供。
異環磷醯胺(Ifosfamide)(以商標名Ifex®出售)係用於治療霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤，以及復發性睾丸癌及生殖細胞腫瘤、肉瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌及子宮頸癌。
美法侖(Melphalan)為以商標名Alkeran®出售之化學療法藥物，且亦稱為L-PAM或苯丙胺酸氮芥。其係用於治療多發性骨髓瘤、卵巢癌、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤及乳癌。
苯丁酸氮芥(Chlorambucil)係以商標名Leukeran®出售，且最廣泛地用於治療慢性淋巴球性白血病、惡性淋巴瘤，包括淋巴肉瘤、巨濾泡性淋巴瘤及霍奇金氏疾病。其亦已成功地用於治療非霍奇金氏淋巴瘤、乳癌、卵巢癌及睾丸癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、血小板增多及絨膜癌。
環磷醯胺(Cyclophosphamide)係以Cytoxan®或Neosar®市售，且用於治療霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴球性白血病、慢性髓細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、急性淋巴球性白血病、t細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；乳癌、睾丸癌、子宮內膜癌、卵巢癌及肺癌。
亞硝基脲
鏈脲佐菌素(Streptozocin)係以商標名Zanosar®出售，且用於治療胰島細胞胰臟癌。
卡莫司汀(Carmustine)亦稱為BiCNU®或BCNU，且係用於一些種類之腦腫瘤、神經膠母細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤及轉移性腦腫瘤。其亦用於治療多發性骨髓瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、黑素瘤、肺癌及結腸癌。
洛莫司汀(Lomustine)(亦稱為CCNU或CeeNU®)係用於治療原發性及轉移性腦腫瘤、霍奇金氏疾病及非霍奇金氏淋巴瘤，且亦已用於黑素瘤、肺癌及結腸癌。
烷基磺酸酯
白消安(Busulfan)(以商標名Busulfex®及Myleran®出售)係用於治療慢性骨髓性白血病。
三
達卡巴(Dacarbazine)係以商標名DTIC-Dome®出售且用於治療轉移性惡性黑素瘤、霍奇金氏疾病、軟組織肉瘤、神經母細胞瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、胰島細胞癌瘤及甲狀腺髓質癌。
替莫唑胺(Temozolomide)係以商標名Temodar®出售且用於治療特定類型之腦腫瘤退行性星形細胞瘤及多形性膠質母細胞瘤。
伸乙基亞胺
噻替派(Thiotepa)(以商標名Thioplex®已知)為用於治療乳癌、卵巢癌、霍奇金氏疾病及非霍奇金氏淋巴瘤之烷化劑。
六甲蜜胺(Altretamine)係以商標名Hexalen®出售且亦稱為六甲三聚氰胺或HMM。其係用於治療卵巢癌。
如本文中所用，「C1-C24烷基」係指含有1至24個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和烴基團。代表性烷基包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正十二烷基等。在本發明之範疇內，「C1-C24烷基」亦涵蓋「環烷基」，其係指單環、雙環及三環飽和烴，例如環丙基、環丁基、環戊基、環丁基、雙環[2.1.1]己烷、雙環[2.2.1]庚基、金剛烷基及其類似基團。
如本文中所用，「聚乙二醇」(亦稱為「PEG」)係指通式H(OCH2CH2)nO-或H(OCH2CH2)nOCH3之聚合物，其中n至少為4。較佳PEG之平均分子量為約200至約5000道爾頓，更佳PEG之平均分子量為約2000至約5000道爾頓。
如本文中所用，術語「醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑」係指生理學上可相容之溶劑、分散介質、塗層、增積劑、穩定劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、糖(諸如海藻糖及蔗糖)、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、糖與多元醇之混合物及氯化鈉中之一或多者。醫藥學上可接受之載劑可進一步包括輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑及緩衝劑。
如本文中所用，「醫藥組成物」係指適於在醫學或獸醫學用途中投予之組成物。該等化合物將較佳包括本發明化合物與一或多種載劑 及/或稀釋劑之組合。該等組成物亦稱為「調配物」。
如本文中所用，「投予」係指此項技術中可用於將本發明化合物遞送至患者的任何手段。較佳投予方法包括局部投予，亦即向需要化合物作用之位置直接投予本發明化合物；及全身投予。投予方法之實例包括(但不限於)經口、經腸、舌下、唇下、皮下、經鼻、靜脈內、動脈內、肌肉內及腹膜內投予。
如本文中所用，「實體腫瘤」係指呈局部組織塊之惡性腫瘤。實體癌症腫瘤之實例包括淋巴瘤、肉瘤及癌瘤且包括乳癌、腦癌、骨癌、結腸癌、胰臟癌、肺癌及其類似癌症。
如本文中所用，「非實體腫瘤癌症」最通常係指血液學癌症，亦即血液之惡性癌症。非實體腫瘤癌症之實例包括慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病、惰性非霍奇金氏淋巴瘤(T細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤)、多發性骨髓瘤及其類似癌症。
如本文中所用，「奈米粒子」係指平均直徑為約0.2μm或0.2μm以下，較佳為約0.1μm或0.1μm以下(如由Malvern Zetasizer量測)之粒子。
實驗部分
製備4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-丁酸甲酯(苯達莫司汀C 1 酯)：
方法A：將4-(5-胺基-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-丁酸甲酯(10.2g，41.2mmol，1.0當量)及氯乙酸(81.9g，866mmol)及20mL無水四氫呋喃(THF)饋入配備有頂置式攪拌器、具有氮氣吹掃器之冷凝器及具有溫度控制器之熱電偶的1L三頸圓底燒瓶中。將漿料在自來水浴中攪拌以使所有固體溶解。經由加料漏斗經25分鐘緩慢添加硼烷-THF(288mL，288mmol)。當BH3-THF添加完成時，將所得反應溶液在室溫下攪拌1.5小時且 接著使用加熱套(heat mantle)在58℃下加熱45分鐘。冷卻反應物且保持在室溫下隔夜且接著用甲醇(10mL)淬滅。用旋轉蒸發器藉由蒸發將所得溶液濃縮至約三分之一重量且在冰-水浴中用氫氧化鈉水溶液中和至pH 8-9。藉由真空過濾收集固體，用水(200mL)洗滌，接著用稀碳酸氫鈉水溶液(50mL)再漿化20分鐘。過濾，接著在室溫下在室內真空下乾燥隔夜，得到棕褐色固體(9.6g，63%產率，93A%純度)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.32(d,J=8.8Hz,1H),6.92(d,J=2.3Hz,1H),6.78(dd,J=8.8,2.3Hz,1H),3.70(br s,8H),3.66(s,3H),3.59(s,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2H),2.48(t,J=7.4Hz,2H，與DMSO部分重疊)，2.01(五重峰，J=7.4Hz,2H)；LC/MS(ESI,m/z)372(M+1),mp 60-63℃。
方法B：將鹽酸苯達莫司汀(50.0g，126.7mmol，1.0當量)、甲醇(500mL)及甲烷磺酸(2.47mL，38.1mmol)饋入配備有加熱套、熱電偶、冷凝器、氮氣入口/出口及頂置式攪拌器之2L三頸玻璃容器中。反應混合物加熱至回流且在65℃下攪拌一小時。反應溶液冷卻至40℃且在真空中濃縮。向濃縮殘餘物中添加水(500mL)，且使用飽和NaHCO3水溶液(150mL)經1.5小時將混合物中和至pH 6。藉由過濾收集產物，用水(150mL)洗滌且在真空中於40℃下乾燥，得到44.2g(94%產率)白色、粉狀固體，藉由HPLC測定純度為98.4A%。
製備4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-丁酸乙酯(苯達莫司汀C 2 酯)：
方法B：將鹽酸苯達莫司汀(30.0g，76mmol，1.0當量)、乙醇(300mL)及甲烷磺酸(1.48mL，22.8mmol)饋入配備有加熱套、熱電偶、冷凝器、氮氣入口/出口及頂置式攪拌器之1L三頸玻璃容器中。反應混合物在70℃下加熱一小時。反應溶液冷卻至40℃且在真空中濃縮。向濃縮殘餘物中添加水(300mL)，且使用飽和NaHCO3水溶液(115mL)經 1.5小時將混合物中和至pH 6。藉由過濾收集產物，用水(100mL)洗滌且在真空中於40℃下乾燥，得到28.6g(97%產率)白色固體，藉由HPLC測定純度為99.2A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.32(d,J=8.8Hz,1H),6.92(d,J=2.3Hz,1H),6.78(dd,J=8.8,2.3Hz,1H),4.04(五重峰，J=7.12Hz,2H),3.70(br s,8H),3.66(s,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2 H),2.45(t,J=7.4Hz,2H，與DMSO部分重疊)，2.00(五重峰，J=7.4Hz,2H),1.18(t,J=7.12Hz,3H)。
方法B：將4-(5-胺基-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-丁酸乙酯(6.4g，1.0當量)、氯乙酸(42.5g)及四氫呋喃(THF，13mL)饋入配備有加熱套、熱電偶、冷凝器、氮氣入口/出口及頂置式攪拌器之500mL三頸玻璃燒瓶中。將所得混合物在室溫下於水浴中攪拌1.5小時。經20分鐘添加硼烷-THF(150mL)。一旦饋料完成，將反應混合物加熱至55℃-58℃且攪拌1.5小時。藉由HPLC進行之過程中分析(in-process analysis)表明存在94A%所需產物。將反應物冷卻至室溫且直接進行下一水解步驟以產生苯達莫司汀。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸丁酯(苯達莫司汀C 4 酯)： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、1.9g(2.35mL，25.6mmol，1.01當量)1-丁醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)、去離子水(1×100mL)及鹽水(1×100mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到褐色油狀物。該油狀物用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用25mL MDC洗滌。濾液在真 空中濃縮至乾燥，得到9.5g(22.8mmol，90%)呈透明淺褐色油狀之產物，HPLC純度為94.5A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.76Hz,1H),7.08(d,J=2.32Hz,1H),6.77(dd,J=2.36,8.8Hz,1H),4.05(t,J=6.76Hz,2 H),3.72(m,4H),3.69(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.4Hz,2H),2.49(t,J=7.1Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,2H),0.89(t,J=4.56Hz,3H)。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸己酯(苯達莫司汀C 6 酯)：
方法A：使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、2.62g(3.22mL，25.6mmol，1.01當量)1-己醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)、去離子水(1×100mL)及鹽水(1×100mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到褐色油狀物。該油狀物用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用25mL MDC洗滌。濾液在真空中濃縮至乾燥，得到8.91g(20.1mmol，79%)呈透明淺褐色油狀之產物，HPLC純度為91.9A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.76Hz,1H),7.08(d,J=2.32Hz,1H),6.77(dd,J=2.36,8.8Hz,1H),4.05(t,J=6.76Hz,2 H),3.72(m,4H),3.69(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.4Hz,2H),2.49(t,J=7.1Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,6H),0.89(t,J=4.56Hz,3H)。
方法B：將30g(76.0mmol)鹽酸苯達莫司汀及300mL二氯甲烷饋入配備有頂置式攪拌器、熱電偶及氮氣入口/出口之1公升4頸圓底燒瓶中。開始攪拌且經注射器添加10.6mL(7.69g，76.0mmol)三乙胺， 接著在室溫下攪拌15分鐘，隨後添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDAC，21.86g，114mmol)及正己醇(9.57mL，7.84g，76.8mmol)。在攪拌20分鐘後，混濁白色反應混合物變為澄清溶液。在室溫下繼續攪拌22.5小時且在30℃下攪拌1小時直至HPLC分析表明反應完成。添加去離子水(300mL)以淬滅反應物且使用1N HCl調節pH至6。分離各層，水層用二氯甲烷(100mL)萃取，接著合併有機相且經硫酸鈉乾燥。在過濾且在真空中濃縮至乾燥後，獲得透明黃色油狀物，藉由管柱層析(含25%至50%乙酸乙酯之庚烷)純化。總共回收16.5g(37.3mmol，49.1%)黏稠黃色油狀物，藉由HPLC測定純度為99.1A%。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸率酯(苯達莫司汀C 8 酯)： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、3.33g(4.03mL，25.6mmol，1.01當量)1-辛醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)、去離子水(1×100mL)及鹽水(1×100mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到褐色油狀物。該油狀物用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用5mL MDC洗滌。濾液在真空中濃縮至乾燥，得到9.7g(20.5mmol，81%)呈透明淺褐色油狀之產物，HPLC純度為91.9A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.76Hz,1H),7.08(d,J=2.28Hz,1H),6.77(dd,J=2.4,8.76Hz,1H),4.05(t,J=6.8Hz,2 H),3.72(m,4H),3.69(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.44Hz,2H),2.49(t,J=7.12Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,10H),0.89(t,J=6.72Hz,3H)。
製備4-[5-[雙-(氯癸基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸癸酯(苯達莫司汀C 10 酯)：
方法A：將10.0g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀、4.9mL(4.08g，25.6mmol，1.01當量)癸醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL二氯甲烷及0.31g(2.53mmol，0.1eq當量)N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP)饋入配備有攪拌棒、熱電偶及氮氣入口/出口之250mL三頸圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌18小時，此時HPLC分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且濾液用去離子水(2×100mL)及飽和碳酸氫鈉(1×100mL)洗滌，隨後經硫酸鈉乾燥。過濾有機相以移除乾燥劑，接著在真空中濃縮至乾燥，得到9.6g(19.2mmol，75.9%)呈低熔點白色固體狀之所需產物，HPLC純度為94.1A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.76Hz,1H),7.08(d,J=2.32Hz,1H),6.77(dd,J=2.4,8.76Hz,1H),4.05(t,J=6.76Hz,2 H),3.72(m,4H),3.69(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.4Hz,2H),2.49(t,J=7.08Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,14H),0.87(t,J=6.68Hz,3H)。
方法B：將10g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀及100mL二氯甲烷饋入配備有磁性攪拌棒、熱電偶及氮氣入口/出口之250mL 4頸圓底燒瓶中。開始攪拌且經注射器添加3.53mL(2.56g，25.3mmol)三乙胺，接著在室溫下攪拌15分鐘，隨後添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDAC，7.28g，38mmol)及正癸醇(4.88mL，4.04g，25.5mmol)。在攪拌20分鐘後，混濁白色反應混合物變為澄清溶液。在室溫下繼續攪拌20小時，直至HPLC分析表明反應完成。饋入去離子水(100mL)以淬滅反應物且使用1N HCl調節pH至6-7。分離各層，水層用二氯甲烷(25mL)萃取，接著合併有機相且經硫酸鈉乾燥。在過濾且在真空中濃縮至乾燥後，獲得透明黃色油狀物，藉由管柱層析(含20%至60%乙酸乙酯之庚烷)純 化。總共回收11.2g(22.42mmol，88.6%)黏稠黃色油狀物，藉由HPLC測定純度為98.9A%。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸十二烷基酯(苯達莫司汀C 12 酯)：
方法A：使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、4.77g(25.6mmol，1.01當量)1-十二烷醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)、去離子水(1×100mL)及鹽水(1×100mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到灰白色半固體。此固體用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用5mL MDC洗滌。濾液在真空中濃縮至乾燥，得到11.53g(21.9mmol，86.4%)呈灰白色半固體狀之產物，HPLC純度為93.7A%。
方法B：將苯達莫司汀之游離鹼(374g，1.04mol，1.0當量)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDAC，300g，1.57mol，1.5當量)及二氯甲烷(DCM，3.74L，10體積)饋入配備有熱電偶、加熱器/冷卻器、氮氣入口/出口、加料漏斗及真空管線之20公升夾套圓柱形ChemGlass反應容器中。在攪拌下添加1-十二烷醇(292.1g，1.57mol，1.5當量)。將反應混合物加熱至27℃，接著在27℃下攪拌4小時。冷卻批料且保持在20℃下隔夜。接著用3.75L水洗滌批料且分離各層。水性部分用1.2L二氯甲烷再萃取，且合併之二氯甲烷部分經Na2SO4乾燥。在過濾以移除乾燥劑後，在真空中濃縮濾液以產生呈粗油狀之產物。用374g苯達莫司汀之游離鹼在相同條件下對另一批進行此反應。合併來自兩個批次之粗產物，與4494mL 庚烷混合且加熱至45℃-50℃。使所得溶液緩慢冷卻至室溫，沈澱出灰白色固體。將漿料在室溫下攪拌隔夜且在10℃下藉由真空過濾分離固體。濕濾餅用1L庚烷洗滌且在20℃-22℃下用2.5L庚烷再漿化隔夜。藉由過濾收集產物且每次用500mL庚烷洗滌兩次。在20℃-22℃下乾燥濕濾餅隔夜，得到653g(59%產率)白色固體，藉由HPLC測定純度為99.0A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.32(d,J=8.8Hz,1H),6.92(d,J=2.3Hz,1H),6.78(dd,J=8.8,2.3Hz,1H),3.99(t,J=6.64Hz,2H),3.70(br s,8H),3.65(s,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2 H),2.45(t,J=7.4Hz,2H，與DMSO部分重疊)，2.01(五重峰，J=7.4Hz,2H),1.54(五重峰，J=6.9Hz,2H),1.24(m,18H),0.85(t,J=6.8Hz,3H)。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸十四烷基酯(苯達莫司汀C 14 酯)：
方法A：將10.0g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀、6.5g(30.4mmol，1.2當量)十四烷基醇、6.3g(30.4mmol，1.2當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL二氯甲烷及0.62g(5.1mmol，0.2當量)N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP)饋入配備有攪拌棒、熱電偶及氮氣入口/出口之500mL三頸圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌20小時，此時HPLC分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且濕濾餅用50mL二氯甲烷洗滌，接著在真空中濃縮濾液至乾燥。所得淺橙色油狀物用50mL二氯甲烷濕磨且藉由真空過濾移除不需要的固體。在真空中將濾液再一次濃縮至乾燥，得到16.5g半固體，藉由1H NMR證實其含有十四烷醇及DMAP。用150g矽膠60(230-400篩目)對殘餘物進行層析(用1500mL MDC、1000mL 0.5%甲醇/MDC及2000mL 1%甲醇/MDC溶離)，收集100-150mL溶離份。合併含有所需產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥。殘餘物再用30mL MDC濕磨且藉由過濾移除不需要的固體。在真空中濃縮濾液，得到5.0g(9.2mmol，36.4%)呈淺紫色固體狀之所需產物，純度為95.0A%。
方法B：將苯達莫司汀之游離鹼(10.6g，44.6mol，1.0當量)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDAC，9.42g，49.2mol)、1-十四烷醇(10.6g，49.2mmol)及二氯甲烷(120mL)饋入配備有熱電偶、冷凝器、氮氣入口/出口及頂置式機械攪拌器之150mL三頸玻璃容器中。將反應混合物在27℃下攪拌隔夜。反應溶液冷卻至室溫且用100mL水洗滌。在攪拌下添加1M鹽酸水溶液以將水層之pH調節至pH 3-4。分離各層。水性部分用100mL二氯甲烷再萃取，且合併之二氯甲烷部分經MgSO4乾燥。在過濾以移除乾燥劑後，在真空中濃縮濾液以產生呈蠟狀黃色固體狀之產物。固體在室溫下於80mL庚烷中漿化隔夜。藉由過濾收集產物且乾燥，得到20.6g(83.4%產率)白色固體，藉由HPLC測定純度為97.2A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.32(d,J=8.8Hz,1H),6.91(d,J=2.3Hz,1H),6.78(dd,J=8.8,2.3Hz,1H),3.98(t,J=6.64Hz,2H),3.70(br s,8H),3.66(s,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2 H),2.45(t,J=7.4Hz,2H，與DMSO部分重疊)，2.01(五重峰，J=7.3Hz,2H),1.54(m,2 H),1.23(m,18 H),0.85(t,J=7.12Hz,3H)。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸十五烷基酯(苯達莫司汀C 15 酯)： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、5.85g(25.6mmol，1.01當量)十五烷醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)、去離子水(1×100mL)及鹽水(1×100mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到灰白色半固體。此固體用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用5mL MDC洗滌。濾液在真 空中濃縮至乾燥，得到10.8g(19.0mmol，75%)呈灰白色固體狀之產物，HPLC純度為94.6A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.76Hz,1H),7.08(d,J=2.32Hz,1H),6.78(dd,J=2.4,8.76Hz,1H),4.05(t,J=6.8Hz,2 H),3.72(m,4H),3.69(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.4Hz,2H),2.49(t,J=7.08Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,24H),0.88(t,J=6.68Hz,3H)。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸十六烷基酯(苯達莫司汀C 16 酯)： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、6.2g(25.6mmol，1.01當量)十六烷醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)、去離子水(1×100mL)及鹽水(1×100mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到灰白色半固體。此固體用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用5mL MDC洗滌。濾液在真空中濃縮至乾燥，得到13.1g(22.5mmol，88.8%)呈灰白色固體狀之產物，HPLC純度為94.0A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.76Hz,1H),7.08(d,J=2.32Hz,1H),6.78(dd,J=2.36,8.72Hz,1H),4.05(t,J=6.8Hz,2 H),3.72(m,4H),3.69(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.4Hz,2H),2.49(t,J=7.08Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,26H),0.88(t,J=6.68Hz,3H)。
製備4-(5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-丁酸油醯酯(苯達莫司汀C 18 酯)：
方法A：將1-十八烷醇(50g，185mmol，7.3當量)饋入配備有頂置式攪拌器、具有氮氣吹掃器之冷凝器、具有溫度控制器之加熱套 及熱電偶之250mL三頸圓底燒瓶中。加熱固體以使其熔融，隨後緩慢添加4-(5-胺基-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-丁酸(10g，25.3mmol，1.0當量)及硫酸(0.5mL)。將所得漿料在70℃下攪拌6小時且接著冷卻至56℃，其中添加二氯甲烷(150mL)。反應混合物冷卻至室溫且用水(100mL)洗滌。在相分離後，再用二氯甲烷(100mL)進行萃取。合併有機相且經MgSO4乾燥。藉由過濾移除乾燥劑。濃縮濾液且經SFC分離。藉由在減壓下蒸發SFC溶離份中之溶劑而獲得白色固體且在室溫下於室內真空中乾燥5天，得到1.2g所需產物(7.1%產率及95.4A%純度)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.18(d,J=8.8Hz,1H),7.09(d,J=2.3Hz,1H),6.78(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),4.05(t,J=6.8Hz,2H),3.74(m,7H),3.62(m,4H),2.93(t,J=7.4Hz,2H),2.49(t,J=7.1Hz,2H),2.22(五重峰，J=7.1Hz,2H),1.60(五重峰，J=7.1Hz,2H),1.28(m,30H),0.88(t,J=7.1Hz,3H)；LC/MS(ESI,m/z)610(M+1)。
方法B：將鹽酸苯達莫司汀(5.04g，12.8mmol)、1-十八烷醇(4.15g，15.3mmol)、N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC，3.17g，15.4mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP，0.31g，2.56mmol)及二氯甲烷(250mL)饋入配備有攪拌棒、氮氣吹掃器及熱電偶之500mL三頸圓底燒瓶中。在室溫下攪拌所得漿料16小時。產生固體且藉由過濾自反應混合物移除。濾液用水(150mL)洗滌。在相分離後，有機相經MgSO4乾燥。藉由過濾移除乾燥劑，且濃縮濾液且經ISCO層析純化(使用EtOAc與庚烷之混合物)，得到5.68g(73%產率)白色固體，純度為99A%。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸二十二烷基酯(苯達莫司汀C 22 酯)： 將5.0g(12.7mmol)鹽酸苯達莫司汀、4.2g(12.9mmol，1.01當量)十四烷基醇、2.7g(12.9mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、50mL二氯甲烷(MDC)及0.16g(1.27mmol，0.1當量)N,N-二甲 基胺基吡啶(DMAP)饋入配備有攪拌棒、熱電偶及氮氣入口/出口之250mL三頸圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，此時HPLC分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且濕濾餅用50mL洗滌。研發兩種替代性純化程序。濾液用去離子水(2×150mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥。所得蠟狀殘餘物用80g矽膠60(230-400篩目)進行層析(用以100% MDC開始，接著0.5%甲醇/MDC且最終1%甲醇/MDC之梯度溶離)，收集100-150mL溶離份。合併含有所需產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥。殘餘物再用20mL MDC濕磨且藉由過濾移除不需要的固體。在真空中濃縮濾液，得到3.65g(5.5mmol，43.1%)呈蠟狀固體狀之所需產物，純度為95.7A%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.17(d,J=8.72Hz,1H),7.08(d,J=2.28Hz,1H),6.78(dd,J=2.36,8.72Hz,1H),4.05(t,J=6.76Hz,2 H),3.72(m,4H),3.70(s,3H),3.63(m,4H),2.91(t,J=7.44Hz,2H),2.49(t,J=7.08Hz,2H),2.18(m,2H),1.60(m,2H),1.32(m,38H),0.88(t,J=6.64Hz,3H)。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸2-十二烷基酯(分支鏈苯達莫司汀C 12 酯)： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10.0g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、4.77g(5.75mL，25.6mmol，1.01當量)2-十二烷醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。將反應物在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用25mL MDC洗滌。濾液用200mL MDC稀釋，接著用4%碳酸氫鈉水溶液(1×500mL)洗滌，隨後經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到灰白色固體。此固體用25mL MDC濕磨，且藉由真空過濾移除固體雜質且用5mL MDC洗滌。在真空中濃縮濾液至乾燥，得到粗產物，藉由1H NMR證實其含有殘餘2-十二烷醇。使用100g矽膠60 (230-400篩目)對粗產物進行層析(首先用1L庚烷，接著用500mL 3：1庚烷/EtOAc、500 2：1庚烷/EtOAc且最終500mL 1：1庚烷/EtOAc溶離)，收集100mL溶離份。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥，得到5.35g(10.16mmol，40%)呈淺紫色黏性油狀之產物，HPLC純度為99.5A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.31(d,J=8.76Hz,1H),6.93(d,J=2.28Hz,1H),6.78(dd,J=2.36,8.76Hz,1H),4.8(m,1H),3.7(s,8H),3.65(s,3H),2.82(t,J=7.4Hz,2H),2.42(t,J=7.36Hz,2H),2.00(m,2H),1.50(m,2H),1.25(s,b,16H),1.14(d,J=6.24,2H),0.84(t,J=6.68Hz,3H)。
製備苯達莫司汀C 12 酯
將428g(1.10mmol)經預處理之鹽酸苯達莫司汀於10體積微量GC分析級二氯甲烷中之漿料饋入配備有熱電偶、加熱器/冷卻器、氮氣入口、加料漏斗、冷凝器及真空管線之20公升夾套圓柱形ChemGlass反應容器中。攪拌設定在100RPM下且夾套設定在20℃下。經由加料漏斗經10分鐘向此混合物中添加二異丙基乙基胺(213ml，1.1當量)。在靜置34分鐘後，一次性添加熔融十二烷醇(227g，1.1當量)。在靜置11分鐘後，向批料中添加EDCI(320.3g，1.5當量)。所得澄清黃色溶液在約20℃下攪拌23.5小時。此時，IPC表明剩餘0.54%起始物質。添加十體積水且再攪拌反應物15分鐘。排出下部有機層，經5微米濾筒過濾且濾筒用1體積GC分析級二氯甲烷沖洗。在真空中濃縮二氯甲烷溶液，得到呈黏性黃色油狀之粗產物。將五體積經過濾之正庚烷添加至油狀物中且在真空中濃縮混合物以移除殘餘二氯甲烷，得到615g粗固體，其中92.9wt%轉換為98.0%產率。以乾量基準計，最終純度為98.4%。
純化苯達莫司汀C 12 酯
將粗CEP-40125(1100g API，1250g粗物質)溶解於正庚烷(6體積)中且轉移至配備有熱電偶、加熱器/冷卻器、氮氣入口、冷凝器及 真空管之20公升夾套圓柱形ChemGlass反應容器中。將漿料溫熱至40℃以溶解所有固體。溶解在達到32.6℃時發生。接著經2.5小時將反應混合物冷卻至17.7℃，此時產物沈澱。接著經26分鐘將反應混合物再溫熱至23℃以使精細粒子溶解，且經2小時冷卻至4℃。固體經密封過濾器過濾且用2體積冷的正庚烷洗滌4.5小時。IPC表明存在0.20%殘餘十二烷醇。固體在真空中於30℃下乾燥24小時達到恆定重量，得到1018g(表示92.5%產率)CEP-40125，純度為98.3%。
製備4-[5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸5-癸酯(分支鏈苯達莫司汀C 10 酯)： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入3.0g(7.6mmol)鹽酸苯達莫司汀、1.21g(7.7mmol，1.01當量)5-癸醇、1.59g(7.7mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、30mL 1,2-二氯乙烷(EDC)及0.1g(0.76mmol，0.1當量)DMAP。反應物在75℃下攪拌五天直至過程中分析表明反應完成。藉由真空過濾移除固體且用5mL EDC洗滌。濾液用4%碳酸氫鈉水溶液(1×50mL)洗滌，隨後經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥。將殘餘物與來自在相同條件下處理之10g批料之殘餘物合併且對合併之批料進行層析。層析係使用100g矽膠60(230-400篩目)進行(首先用2L庚烷，接著用1L 3：1庚烷/EtOAc及1L 2：1庚烷/EtOAc溶離)，收集100mL溶離份。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥，得到3.97g(7.96mmol，24.2%)呈透明黃色油狀之產物，HPLC純度為99.4A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.31(d,J=8.76Hz,1H),6.93(d,J=2.28Hz,1H),6.78(dd,J=2.40,8.80Hz,1H),4.8(m,1H),3.7(s,8H),3.65(s,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2H),2.44(t,J=7.36Hz,2H),2.02(m,2H),1.48(m,4H),1.25(s,b,10H),0.84(m,6H)。
製備4-{5-[雙-(氯乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}丁酸環己酯： 使250mL三頸圓底燒瓶配備有頂置式攪拌器、熱電偶、溫度控制器及氮氣吹掃器，接著饋入10g(25.34mmol)鹽酸苯達莫司汀、2.56g(2.7mL，25.6mmol，1.01當量)環己醇、5.3g(25.6mmol，1.01當量)二環己基碳化二亞胺(DCC)、100mL MDC及0.31g(2.54mmol，0.1當量)DMAP。反應漿料在室溫下攪拌18小時，直至過程中分析表明反應完成。觀測到兩個新的主要產物峰。藉由真空過濾移除固體且用5mL MDC洗滌。濾液用4%碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)洗滌，隨後經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥，得到黃色油狀物(其中存在一些固體)。1H NMR分析表明除所需產物外，亦存在殘餘DMAP及環己醇以及DCC副產物。殘餘物用50mL MDC漿化以移除殘餘環己醇，接著在真空中濃縮且進行層析。層析法係使用50g矽膠60(230-400篩目)進行(用1：1庚烷/EtOAc溶離)，收集100mL溶離份。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥，得到3.11g(7.06mmol，27.9%)呈灰白色固體狀之產物，HPLC純度為97.8A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.31(d,J=8.76Hz,1H),6.93(d,J=2.28Hz,1H),6.77(dd,J=2.40,8.80Hz,1H),4.65(m,1H),3.7(s,8H),3.65(s,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2H),2.44(t,J=7.36Hz,2H),2.00(m,2H),1.76(m,4H),1.65(m,2H),1.33(m,b,6H)。
製備4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-丁酸PEG-2000酯(苯達莫司汀PEG-2000酯)： 將鹽酸苯達莫司汀(2.0g，5.1mmol，1.0當量)及二氯甲烷(30mL)饋入配備有攪拌棒、熱電偶、冷凝器及氮氣入口/出口之100mL三頸玻璃容器中。在22℃下將三乙胺(0.71mL，5.1mmol)添加至漿料中且攪拌20分鐘。添加甲氧基聚乙二醇2000(PEG-OMe-2000，12.2g，6.1mmol)及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDAC，1.5g，7.6mol)。反應混合物在22℃下攪拌5.5小時，此時添加PEG-OMe-2000(1.0g)，接著攪拌 3天度過週末。添加水(20mL)且藉由添加1M鹽酸將pH調節至pH 5-6。緩慢分離各相。水性部分用20mL二氯甲烷再萃取，且合併之二氯甲烷部分經MgSO4乾燥。在過濾以移除乾燥劑後，在真空中濃縮濾液以產生呈蠟狀固體狀之產物。固體在室溫下於10mL庚烷中漿化。藉由過濾收集產物且在真空中於30℃下乾燥，得到11.7g(99%產率)白色且呈粉狀固體，藉由HPLC測定純度為97.9A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.32(d,J=8.6Hz,1H),6.92(d,J=2.2Hz,1H),6.78(dd,J=8.8,2.2Hz,1H),4.12(t,J=4.8Hz,2H),3.70(m,12H),3.60(m,3H),3.51(m,224H),3.43(m,4 H),3.32(m,58H),2.84(t,J=7.4Hz,2 H),2.45(2H，與DMSO部分重疊)，2.01(五重峰，J=7.3Hz,2H)。
製備4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-丁酸PEG-5000酯(苯達莫司汀PEG-5000酯)： 將鹽酸苯達莫司汀(0.5g，1.27mmol，1.0當量)及二氯甲烷(15mL)饋入配備有攪拌棒、熱電偶、冷凝器及氮氣入口/出口之50mL三頸玻璃容器中。在22℃下將三乙胺(0.18mL，1.28mmol)與甲氧基聚乙二醇5000(PEG-OMe-5000，6.33g，1.27mmol)及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDAC，0.36g，1.88mol)一起添加至漿料中且攪拌20分鐘。反應混合物在22℃下攪拌隔夜。添加水(20mL)且藉由添加1M鹽酸將pH調節至pH 3-4。緩慢分離各相。水性部分用10mL二氯甲烷再萃取。合併之二氯甲烷部分用鹽水(20mL)洗滌且經MgSO4乾燥。在過濾以移除乾燥劑後，在真空中濃縮濾液以產生呈蠟狀固體狀之產物。固體在室溫下於20mL庚烷中漿化。藉由過濾收集產物且在真空中於30℃下乾燥，得到5.24g(77%產率)白色且呈粉狀固體，藉由HPLC測定純度為99A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.38(d,J=12Hz,1H),6.91(d,J=2.4Hz,1H),6.82(d,J=10Hz,1H),4.12(t,J=4.7Hz,2H),3.72(br s,8H),3.68(m,5H),3.59(m,3H), 3.51(m,436 H),3.42(m,3H),3.31(m,28H),2.88(t,J=7.4Hz,2 H),2.45(t,2H,與DMSO部分重疊)，2.01(五重峰，J=7.3Hz,2H)。
用於苯達莫司汀甲酯之酯基轉移之一般程序
將苯達莫司汀甲酯(0.5g，1.27mmol，1.0當量)、催化劑(0.05-1.4當量)、適當溶劑(5-15體積)及過量十二烷醇(5-10當量)饋入配備有攪拌棒、熱電偶、具有迪安-斯塔克分離器(Dean-Stark trap)之冷凝器及氮氣入口/出口之50mL三頸玻璃容器中。將所得反應混合物加熱至回流且藉由HPLC進行監測。在不同條件下之結果概述於下文中。
製備鹽酸苯達莫司汀醯胺
4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-N-癸基-丁醯胺(苯達莫司汀C 10 醯胺)： 將10.0g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀、10.6g(27.8mmol) HATU及100mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)饋入配備有攪拌棒、熱電偶、冷卻浴、60mL壓力平衡滴液漏斗及氮氣入口/出口之250mL三頸圓底燒瓶中。向此經攪拌之黃色溶液中添加4.41mL(3.27g，25.3mmol)N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)。注意到放熱至27.1℃且溶液變為深黃色。將反應物冷卻至6.6℃，其中在2.7℃-7.6℃下經13分鐘逐滴添加6.2mL(4.59g，35.5mmol)DIPEA、5.11mL(4.1g，25.6mmol)癸胺於20mL DMF中之溶液。一旦添加完成，將反應物在低於10℃之溫度下攪拌1.5小時，此時過程中分析表明反應完成。批料用200mL去離子水淬滅且用乙酸乙酯(2×175mL)萃取。合併有機相，用10%磷酸氫二鈉(1×200mL)、8%碳酸氫鈉水溶液(1×200mL)及鹽水(1×200mL)洗滌，隨後在真空中濃縮至乾燥，得到黏性白色固體。此固體用庚烷(75mL)濕磨且變為可流動固體，藉由真空過濾分離該固體。濕濾餅在真空烘箱中於25℃下乾燥隔夜，得到13.33g(25.3mmol，100%)呈白色固體狀之所需產物，HPLC純度為98.01A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.72(s,b,1H),7.33(d,J=8.76Hz,1H),6.91(d,J=2.28Hz,1H),6.80(dd,J=2.36,8.8Hz),3.7(s,8H),3.66(s,3H),3.01(q,J=6.8,12.68,2H),2.79(t,J=7.44Hz,2H),2.18(t,J=7.36Hz,2H),1.95(m,2H),1.36(m,2H),1.22(s,b,14),0.84(t,J=6.68Hz,3H)。
4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-N-十四烷基-丁醯胺(苯達莫司汀C 14 醯胺)： 將10.0g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀、10.6g(27.8mmol)HATU及100mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)饋入配備有攪拌棒、熱電偶、冷卻浴、60mL壓力平衡滴液漏斗及氮氣入口/出口之250mL三頸圓底燒瓶中。向此經攪拌之黃色溶液中添加4.41mL(3.27g，25.3mmol)N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)。注意到放熱至27.1℃且溶液變為深黃色。將反應物冷卻至3.3℃，其中在低於10℃之溫度下經6分鐘逐滴添加6.2mL(4.59g，35.5 mmol)DIPEA、5.75g(25.6mmol)十四烷基胺於40mL DMF中之溶液。一旦添加完成，則反應物變為極稠密且難以攪拌。將其轉移至配備有頂置式攪拌器及熱電偶之500mL三頸圓底燒瓶中，接著在室溫下攪拌三小時，此時過程中分析表明反應完成。批料用400mL去離子水淬滅且用乙酸乙酯(2×300mL)萃取。合併有機相，用10%磷酸氫二鈉(1×300mL)、8%碳酸氫鈉水溶液(1×300mL)及鹽水(1×300mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥。殘餘物使用100g矽膠60(230-400篩目)藉由層析(用1% MeOH/MDC(2L)、2.5% MeOH/MDC(1L)及5% MeOH/MDC(1L)溶離)純化，收集約100mL溶離份。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥，得到7.86g(14.6mmol，57.6%)呈白色固體狀之所需產物，HPLC純度為97.3A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.72(s,b,1H),7.33(d,J=8.84Hz,1H),6.91(d,J=2.22Hz,1H),6.80(dd,J=2.36,8.84Hz),3.71(s,8H),3.70(s,3H),3.01(q,J=6.8,12.68,2H),2.79(t,J=7.44Hz,2H),2.18(t,J=7.36Hz,2H),1.97(m,2H),1.36(m,2H),1.28(s,b,22),0.84(t,J=7.04Hz,3H)。
4-{5-[雙-(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-N-十八烷基-丁醯胺(苯達莫司汀C 18 醯胺)： 將10.0g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀、10.6g(27.8mmol)HATU及100mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)饋入配備有攪拌棒、熱電偶、冷卻浴、60mL壓力平衡滴液漏斗及氮氣入口/出口之250mL三頸圓底燒瓶中。向此經攪拌之黃色溶液中添加4.41mL(3.27g，25.3mmol)N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)。注意到放熱至27.1℃且溶液變為深黃色。將反應物冷卻至2.0℃，其中經吸管添加6.2mL(4.59g，35.5mmol)DIPEA、7.65g(25.6mmol)十八烷基胺於0mL DMF中之懸浮液。一旦添加完成，則反應物變為極稠密且難以攪拌。將其溫熱至室溫且用頂置式攪拌器替換磁性攪拌棒。批料在室溫下攪拌隔夜，此時過程中分析表明反應完成。批料用300mL 去離子水淬滅且用二氯甲烷(2×150mL)萃取。合併有機相，用10%磷酸氫二鈉(1×300mL)、8%碳酸氫鈉水溶液(1×300mL)及鹽水(1×300mL)洗滌，接著經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮至乾燥。殘餘物使用100g矽膠60(230-400篩目)藉由層析(用1% MeOH/MDC(2L)、2.5% MeOH/MDC(1L)及5% MeOH/MDC(1L)溶離)純化，收集約100mL溶離份。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥，得到5.11g(8.38mmol，33%)呈白色固體狀之所需產物，HPLC純度為90.9A%。證實主要雜質為C-16醯胺，其係由起始胺中之雜質產生。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.72(s,b,1H),7.33(d,J=8.84Hz,1H),6.91(d,J=2.22Hz,1H),6.80(dd,J=2.36,8.84Hz),3.71(s,8H),3.70(s,3H),3.01(q,J=6.8,12.68,2H),2.79(t,J=7.44Hz,2H),2.18(t,J=7.36Hz,2H),1.97(m,2H),1.36(m,2H),1.28(s,b,30H),0.85(t,J=6.32Hz,3H)。
(S)-2-(4--{5-[雙(2-氯-乙基)-胺基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基}-丁醯基胺)-丙酸甲酯： 將10g(25.3mmol)鹽酸苯達莫司汀、10.6g(27.8mmol)HATU及100mL DMF饋入配備有攪拌棒、熱電偶、冷卻浴、加料漏斗及氮氣入口/出口之250mL三頸圓底燒瓶中。將批料冷卻至1.9℃，其中經2分鐘添加8.8mL(6.54g，50.6mmol)DIPEA。反應物放熱至9℃且變為橙色。在4.9℃-5.7℃下經10分鐘逐滴添加3.57g(25.6mmol)L-丙胺酸甲酯鹽酸鹽及6.2mL(4.57g，35.4mmol)DIPEA於20mL DMF中之溶液。經一小時將反應物緩慢溫熱至室溫且攪拌三小時，此時過程中分析法表明反應完成。批料用400mL 1：1乙酸乙酯/去離子水淬滅。分離各層，有機層用10%磷酸氫二鈉(1×200mL)、8%碳酸氫鈉(1×200mL)及鹽水(1×200mL)洗滌，隨後經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中蒸發至乾燥。殘餘物使用100g矽膠60(230-400篩目)藉由層析(用1% MeOH/MDC(3L)、2.5% MeOH/MDC (1L)及5% MeOH/MDC(500mL)溶離)純化，收集約100mL溶離份。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮至乾燥，得到7.1g(16.0mmol，63.3%)呈白色固體狀之所需產物，HPLC純度為97.4A%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.25(d,J=6.92Hz),1H),7.40(d,J=8.84Hz,1H),6.92(d,J=2.2Hz,1H),6.86(dd,J=2.32,8.88Hz),4.25(q,1H),3.72(s,8H),3.71(s,3H),3.62(s,3H),2.87(t,J=7.48Hz,2H),2.25(t,J=7.52Hz,2H),1.99(m,2H),1.26(d,J=7.32Hz,3H)。
用於製備本發明之苯達莫司汀酯之溶液調配物之一般程序：將本發明之苯達莫司汀酯之儲備溶液以約100mg/mL濃度溶解於二甲基乙醯胺(「DMA」)及Solutol® HS-15之60/40(v/v)混合物中。在室溫下攪拌混合物直至溶解。所得儲備溶液可穩定數月，用0.9%生理食鹽水稀釋至所需濃度且在約2小時內給藥。
苯達莫司汀C 14 酯溶液調配物：藉由將320.1mg苯達莫司汀C14酯溶解於4mL DMA與Solutol® HS-15之60/40(v/v)混合物中來製備儲備溶液。將混合物攪拌約2小時直至溶解。在給藥之前，藉由移除1.00mL儲備溶液且添加16.20mL生理食鹽水且在室溫下攪拌5分鐘來稀釋儲備溶液。所得調配物為3mg-equ/mL苯達莫司汀。
進行預處理以移除殘餘乙醇： 將鹽酸苯達莫司汀(277g)饋入5L蒸發燒瓶中，接著饋入2體積去離子水及5體積丙酮。在40℃之最高溫度下在真空中經5.5小時蒸餾溶劑。再添加5體積丙酮且用旋轉蒸發器將所得漿料在35℃下於大氣壓力下旋轉15分鐘。接著批料經密封燒結玻璃漏斗過濾且所得白色固體用2體積丙酮沖洗。將固體轉移至乾燥盤且在40℃下經17小時乾燥至恆定重量，接著分離得到266g(96.0%)產物，純度為99.8A%且KF為0.26%。
用於製備本發明之苯達莫司汀酯之人類血清白蛋白(「HAS」)奈米粒 子調配物之一般程序
奈米粒子係由使用二氯甲烷及HSA作為界面活性劑之O/W乳液形成。藉由將所需量之苯達莫司汀酯以約120mg/mL之濃度溶解於二氯甲烷中來製備油相。藉由將2-4倍量之HSA(基於苯達莫司汀酯之w/w)溶解於5-15倍體積之水(基於二氯甲烷之w/w)中來製備水相。典型地，向水相中添加5%-10%甘露糖醇以使溶液等張以用於注射且在凍乾後提供醫藥學上適當的產物。藉由使用IKA手持型均質器將油相及水相在中等強度下乳化約30秒來形成O/W乳液。奈米粒子係藉由經Microfluidizer®高壓均質器(在約30,000psi下通過5次)處理粗O/W乳液以提供50-100nm尺寸粒子(如使用動態光散射(Malvern Zetasizer)量測)而形成。在真空中移除溶劑且在給藥之前將所得濃縮物凍乾或冷凍儲存。該等調配物呈現優良物理及化學穩定性。
將凍乾之奈米粒子復原且使用低溫穿透式電子顯微鏡(c-TEM)分析。大部分奈米粒子為20-40nm實心球體，其容易分散於水中。少數粒子在125nm範圍內。粒子皆具有光滑表面。
苯達莫司汀C 12 酯HSA奈米粒子：藉由將600mg苯達莫司汀C12酯溶解於5mL二氯甲烷中來製備油相。使用IKA Ultra-Turrex手持型均質器將油相與包含60mL去離子(「DI」)水、2.4g HSA(來自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO之凍乾固體)及6.6g甘露糖醇之水相一起乳化以獲得粗乳液。此乳液在約30,000psi下通過Microfluidics M-110P高壓均質器五次。使用旋轉蒸發器自所得奈米粒子懸浮液移除二氯甲烷且用去離子水稀釋所得水性懸浮液使總體積達到100mL。接著將此懸浮液以10mL等分試樣分配於30mL血清小瓶中且凍乾。
具有聚乳酸乙醇酸(PLGA)之苯達莫司汀C 12 酯HSA奈米粒子：藉由將300mg苯達莫司汀C12酯及500mg PLGA(50/50乳酸：乙醇 酸，MW為7,000-17,000；Aldrich Part#719897)溶解於2.5mL二氯甲烷中來製備油相。使用IKA Ultra-Turrex手持型均質器將油相與包含30mL去離子水、1.2g HSA(來自Sigma-Aldrich之凍乾固體)及3.3g甘露糖醇之水相一起乳化以獲得粗乳液。此乳液在約30,000psi下通過Microfluidics M-110P高壓均質器五次。使用旋轉蒸發器自所得奈米粒子移除二氯甲烷且用去離子水稀釋所得水性懸浮液使總體積達到50mL。所得奈米粒子之粒子尺寸為90.5nm(Zavg)，如由Malvern Zetasizer量測。接著將此懸浮液以10mL等分試樣分配於30mL血清小瓶中且凍乾。
製備本發明之苯達莫司汀酯之聚乙二醇化奈米粒子調配物：製備一系列具有PEG塗層之奈米粒子調配物，文獻(Alexis,F.,Molecular Pharmaceutics,5,(2008),505-515)中報導其可提供「隱匿(stealth)」塗層且有助於粒子回避身體免疫系統之能力。PEG之併入如下進行：使用基於PEG之界面活性劑(PEG與聚乳酸之共聚物)替代HSA或使用生物結合化學方法將PEG基團共價連接至HSA奈米粒子表面上之自由NH2基團。兩種系統在PK研究中皆展示血漿循環時間增加。
具有聚乙二醇(PEG)塗層之苯達莫司汀C 12 酯HSA奈米粒子：藉由將600mg苯達莫司汀C12酯溶解於5mL二氯甲烷中來製備油相。使用IKA Ultra-Turrex手持型均質器將油相與包含60mL去離子水、2.4g HSA(來自Sigma-Aldrich之凍乾固體)及6.6g甘露糖醇之水相一起乳化以獲得粗乳液。此乳液在約30,000psi下通過Microfluidics M-110P高壓均質器五次。使用旋轉蒸發器自所得奈米粒子懸浮液移除二氯甲烷且用去離子水稀釋所得水性懸浮液使總體積達到50mL。接著在200mL 100mM pH 8.5硼酸鹽緩衝液中稀釋奈米粒子之懸浮液且使用Malvem Zetasizer量測所得奈米粒子之粒子尺寸及ζ-電位。奈米粒子之粒子尺寸為78.9nm(Zavg)且表面電荷為-13.0mV。攪拌懸浮液且添加150mg甲氧基-PEG5,000-n-羥基丁二醯亞胺酯 (Laysan Polymer)。反應物在室溫下混合約90分鐘且再量測粒子尺寸及ζ-電位。發現奈米粒子之粒子尺寸為83.6nm(Zavg)且ζ-電位為-7.35mV。對奈米粒子進行緩衝液交換且使用6.6%(wt/wt)甘露糖醇溶液及50,000 MWCO透濾濾筒進行濃縮。接著將此懸浮液以10mL等分試樣分配於30mL血清小瓶中且凍乾。
具有聚乳酸乙醇酸(PLGA)及聚環氧乙烷乳酸共聚物(PELA)界面活性劑之苯達莫司汀C 12 酯奈米粒子：藉由將300mg苯達莫司汀C12酯及500mg PLGA(50/50乳酸：乙醇酸，MW為7,000-17,000；Aldrich Part#719897)溶解於2.5mL二氯甲烷中來製備油相。使用IKA Ultra-Turrex手持型均質器將油相與包含30mL去離子水、0.6g PEG-5,000-聚乳酸1,000之共聚物(使用來自A.Lucke,Biomaterials,21,(2000),2361-2370之程序製備之共聚物)及3.3g甘露糖醇一起乳化以獲得粗乳液。此乳液經Microfluidics M-110P高壓均質器在約30,000PSI下處理5分鐘。使用旋轉蒸發器自所得奈米粒子懸浮液移除二氯甲烷且用去離子水稀釋所得水性懸浮液使總體積達到50mL。所得奈米粒子之粒子尺寸為248.0nm(Zavg)，如由Malvern Zetasizer量測。接著將此懸浮液以10mL等分試樣分配於30mL血清小瓶中且凍乾。
來自濃縮物之苯達莫司汀C 12 酯HSA奈米粒子：藉由將4.8g苯達莫司汀C12酯溶解於13.4g二氯甲烷中來製備油相。使用IKA Ultra-Turrex手持型均質器將油相與包含111g去離子(「DI」)水及9g HSA之水相一起乳化以獲得粗乳液。此乳液在約30,000psi下通過Microfluidics M-110P高壓均質器五次。藉由添加12g NaCl且混合直至溶解來使所得奈米乳液濃縮物穩定化。亦可使用此項技術中已知的其他方法，例如其他鹽、受控加熱及/或pH調節來實現穩定化。與例如戊二醛之交聯亦可幫助防止聚集。
使用旋轉蒸發器自所得奈米粒子懸浮液移除二氯甲烷。所得 水性懸浮液與12g蔗糖混合且添加去離子水使總重量達到480g。接著將此懸浮液以7.5mL等分試樣分配於20mL血清小瓶中且凍乾。
HSA奈米粒子之溶液呈現隨時間推移之緩慢粒子尺寸增加。一些溶液在12-24小時內達到約200nm尺寸，如由動態光散射量測。使用c-TEM研究此增加之性質以便確定奈米粒子是否聚集或是否存在將調配物中之過量蛋白質添加至粒子表面從而使粒子尺寸增加。將凍乾奈米粒子之小瓶復原且使用c-TEM成像(圖21)。使奈米粒子之同一小瓶在室溫下靜置24小時，接著再成像(圖22)。原始樣品含有尺寸分佈介於25-60nm之間的球狀粒子。老化樣品呈現尺寸分佈增加至35-130nm且無粒子聚集跡象。兩種樣品皆含有1-3nm粒子之群體，其與「自由」蛋白質一致。該等結果表明在溶液中，「自由」HSA添加至奈米粒子表面，從而引起粒子尺寸緩慢增加。若干策略可用於減少此過程，包括pH改變、容積莫耳滲透濃度改變、用於移除過量蛋白質之溶劑添加及透濾。
用於製備腫瘤細胞分離物之方案：將攜帶MDA-MB-231乳癌細胞系皮下異種移植物(基質膠中5×106個細胞)之Charles River Labs無胸腺裸小鼠處死以製備腫瘤分離物。使用無菌器具且在無菌條件下操作，自安樂死之動物移出腫瘤。將腫瘤置於50mL無菌錐形管中且添加5mL胰蛋白酶。將腫瘤切割成小片且在37℃下培育30分鐘。在培育後，將細胞過濾器置於第二無菌50mL錐形管上且將第一管中之內含物置於細胞過濾器中。使用注射器柱塞之平坦端迫使組織通過過濾器。細胞過濾器用5mL含有FBS之培養基洗滌。使細胞短暫離心且棄去上清液。將細胞再懸浮於20mL含有P/S之完全培養基中且置於75cm燒瓶中。此資料闡述於表1中。
用於MTS細胞分析法之一般程序：人類癌瘤細胞(2,000個細胞/孔)與所需濃度之測試分子(0-200μM)一起培育72小時。接著細胞與MTS溶液(Promega)一起培育1-2小時，且藉由量測在490nm下之吸 光度來測定化合物對細胞增殖之作用。細胞生長表示為相對適當對照物(安慰劑)之百分比。使用此資料計算各化合物之IC50。所有報導之資料皆為三次獨立實驗之平均值±SE。此資料闡述於表1中。
R2=決定係數
上述生物學資料亦描述於圖1中。投予前述酯之後苯達莫司汀之血漿含量描述於圖20中。
腫瘤功效
用於裸小鼠MDA-MB-231腫瘤功效研究之程序：對Charles River Labs無胸腺裸小鼠皮下注射含5×106個人類腫瘤細胞之基質膠。監測腫瘤體積，直至獲得小鼠群體中約150mm3之平均腫瘤尺寸。接著將小鼠隨機分配至九個處理組(概述於下表中)中之一組中，其中每組具有10隻小鼠之群體(n=10)。在研究之第1天及第2天將各調配物以100μL固定體積經尾靜脈注射給藥。將小鼠稱重且在3週研究持續時間內每3-4天量測一次腫瘤體積。此資料描述於表2及圖2中。
用於裸小鼠H460腫瘤功效研究之程序：H460腫瘤細胞(大細胞肺癌)在37℃下於含有10% FBS之RPMI-1640培養基中在95%空氣及5% CO2下培養。當達到80%-90%匯合時，藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在5-10分鐘內使細胞脫離，用新鮮培養基中和且藉由細胞計數器(Cellometer,Auto T4,Nexcelom)進行計數。將2×106個細胞/100μl之培養基與基質膠(1：1比率)溶液之混合物注射至各nu/nu小鼠之右背側腹中。監測經植入之小鼠且用電測徑規進行量測。在腫瘤達到約150mm3尺寸時開始研究。量測小鼠且根據下表隨機分成9個組，其中每組10隻小鼠： 腫瘤功效給藥組
在調配化合物之後，調配物係以100μL劑量體積經尾靜脈 注射在30分鐘內投予。將所有小鼠稱重且每週量測腫瘤兩次。在研究中之最後一天，在給藥後兩小時收集血漿、腫瘤、肺、肝臟、脾、左腎、腦及腿且快速冷凍以用於進一步分析。結果展示於表3中。
藥物動力學研究實驗
用於裸小鼠腫瘤功效PK組之程序：向一部分攜帶腫瘤之小鼠給藥作為衛星PK組(satellite PK group)。各組係如關於腫瘤功效組所描述給藥，然而在第2天在給藥後1、3及6小時將PK組處死且收集組織樣品。收集之組織包括血液、肺、肝臟及腫瘤。如LC-MS方案部分中所描述針對鹽酸苯達莫司汀及相應酯類似物分析樣品。
用於PK研究之LC-MS實驗方案：在使用含有內標之乙腈使蛋白質沈澱後，根據標準方案準備血漿及其他組織以進行高效液相層析(HPLC)/質譜分析。接著經由與串聯質譜分析聯合之HPLC針對本發明之鹽酸苯達莫司汀及苯達莫司汀酯以及烯丙洛爾(alprenolol)(內標)分析樣品。將組織樣品在磷酸鈉緩衝液中均質化且將自分析法獲得之值乘以3以校正在處理期間之稀釋作用。
用於PK研究之動物給藥方案：所有實驗中皆使用成年動物 (Charles River,Kingston,New York；n=3或4/時間點)。小鼠或大鼠在經側尾靜脈進行靜脈內劑量投予之前未禁食隔夜。靜脈內劑量係以100μL固定劑量體積(小鼠中)或1mL/kg劑量體積(大鼠中)投予。藉由斷頭術處死小鼠且在規定之取樣時間將軀幹血液收集至肝素化管中。對於血液收集，將各大鼠(未麻醉)置於透明Plexiglas®約束管中，且在規定之取樣時間自側尾靜脈抽吸血液樣品(約0.25mL)至肝素化收集管中(注意：未獲得給藥前樣品)。此程序之例外情況為最後一次取樣時間，此時藉由斷頭術處死大鼠且經尾靜脈獲得軀幹血液而非血液。將血液樣品置於濕冰上直至進行離心以分離血漿。將血漿部分轉移至潔淨、乾燥管中，在乾冰上冷凍且在約-20℃下儲存以待分析。在預定時間點快速移出全腦及其他經高度灌注之器官(肝臟、肺、脾、腎及心臟)且在乾冰上冷凍。所有組織樣品亦在約-20℃下儲存以待分析。
藥物動力學分析：將所有小鼠及大鼠之血漿濃度資料輸入Excel試算表中以便為藥物動力學分析作準備。使用WinNonlin軟體(專業版4.1，Pharsight公司，Palo Alto,CA)藉由血漿濃度對時間資料之非室體模型分析(Gibaldi及Perrier 1982)來估算平均藥物動力學參數。藉由半對數血漿濃度對時間之曲線之末端部分之線性回歸來估算血漿之最終清除速率常數(β)。表觀終末半衰期(t1/2)計算為0.693除以β。藉由線性梯形法則測定在單次劑量後自時間零至最後可量測濃度之時間，血漿濃度對時間之曲線下面積(AUC0-t)。自零至無限之曲線下面積(AUC0-∞)計算為AUC0-t與自最後可量測濃度外推至無限之曲線下面積(Clast/β)之和。出於計算AUC之目的，將給藥前濃度皆假設為零。出於計算AUC之目的，最後可定量取樣時間之後的任何低於定量限制(BLQ)之濃度皆視為空值；其對於既定取樣時間之平均濃度計算皆作為零加以處理。
藥物動力學研究之資料描述於表4-17中。
表4中之資料亦描述於圖8中。
表5中之資料亦描述於圖9中。
表6中之資料亦描述於圖10中。
表7中之資料亦描述於圖11中。
表8中之資料亦描述於圖12中。
表9中之資料亦描述於圖13中。
表10中之資料亦描述於圖14中。
表11中之資料亦描述於圖15中。
表12中之資料亦描述於圖16中。
表13中之資料亦描述於圖17中。
表14中之資料亦描述於圖18中。
表15中之資料亦描述於圖5中。
表16中之資料亦描述於圖6中。
根據上述方法將本發明之另一具體實例(苯達莫司汀C14酯)調配成奈米粒子靜脈內調配物且投予CD-1小鼠。測定小鼠血漿中苯達莫司汀(BM1)及苯達莫司汀C14酯之量。該等實驗之結果概述於表18中。
亦測試聚乙二醇化苯達莫司汀酯。苯達莫司汀之PEG-2000及PEG-5000酯之資料描述於以下表19及20中。此資料亦描述於圖19中。
苯達莫司汀酯之試管內穩定性分析
腫瘤S9製備：將攜帶乳癌(MB-231)或非小細胞肺癌(H460)之Charles River Labs無胸腺裸小鼠處死。立即移出腫瘤且用冰冷1.15% KCl沖洗。將腫瘤稱重、切割且切碎。將切碎之組織與4X(v/w)冰冷SET緩衝液(250mM蔗糖、5.4mM Na2EDTA及20mM Tris，pH 7.4)混合且用組織均質器均質化。將均質物轉移至潔淨的聚碳酸酯超離心管中且在4℃下於10,000g下離心20分鐘。用棉拭移除超離心管頂部之脂質且將上清液(S9)等分試樣儲存於-80℃冷凍器中。
試管內培育：將含有50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)、NADPH-(還原之菸鹼醯胺二磷酸腺苷)再生系統及1mg/mL腫瘤S9之培育混合物在37℃水浴中預溫熱。藉由將1μL苯達莫司汀C6、C8、C12或C14酯添加至各別培育混合物中以獲得10μM之各苯達莫司汀酯之最終濃度來起始反應。在經設計之時間點，移出培育混合物之100μL等分試樣且與400μL停止溶液(含4μM或8μM噻加賓(tiagabine)[IS]之0.1%甲酸/乙腈溶液)混合。將所有樣品渦旋混合且置於冰上持續至少10分鐘，且接著藉由在Eppendorf 5417R離心機中以14000rpm離心8分鐘來使蛋白質沈澱。將上清液轉移至HPLC小瓶中且注射10μL以使用高效液相層析及串聯質譜偵測進行分析。
LC-MS/MS方法：LC-MS/MS系統係由Shimadzu HPLC及Sciex API 4000 MS組成。層析係在Phenomenex 00B-4448-B0之Luna PFP(2)管柱(50×2mm，5μm粒子尺寸)上進行。總移動相流動速率為0.5mL/min。梯度以70%移動相A(0.1%三氟乙酸水溶液)及30%移動相B(100%乙腈)開始。移動相B之比例接著在0.5分鐘內線性增加至95%且在該比率下保持 1.3分鐘，在1分鐘內再平衡至初始條件。將質譜儀調諧至各苯達莫司汀酯之各別最佳條件，監測442.2/340.1(C6)、470.2/340.1(C8)、526.3/340.1(C12)及554.3/340.1(C14)之轉變。
試管內穩定性研究之資料闡述於圖3及圖4中。
電子顯微術實驗
用於c-TEM研究之樣品製備：藉由向樣品中添加7.8mL注射用水(WFI)來使樣品溶解且用手倒置使其混合。樣品在約2-5分鐘內快速溶解且溶液中無可見的不溶解粒子。將樣品保存於400篩目銅柵格上由碳塗佈之有孔碳膜支撐之玻璃化冰中。藉由將3μL未經稀釋之樣品溶液液滴塗覆至潔淨的柵格，用濾紙吸取且立即在液體乙烷中進行玻璃化來製備樣品。將柵格儲存在液氮下直至轉移至電子顯微鏡用於成像。
c-TEM成像參數：使用配備有FEI Eagle 4K×4K CCD攝影機之FEI Tecnai T12電子顯微鏡(在120KeV下操作)進行電子顯微術。使用低溫台將柵格轉移至電子顯微鏡中，該低溫台保持柵格溫度低於-170℃。以多種比例獲得柵格之影像以評估試樣之整體分佈。在較低放大率下鑑別可能適用於成像之目標區域之後，在52,000x(0.21奈米/像素)及21,000x(0.50奈米/像素)之標稱放大率下獲得高放大率影像。在-4μm(52,000x)及-5μm(21,000x)之標稱弱焦點及約10-15e/Å2之電子劑量下獲得影像。
電子顯微術實驗之結果描述於圖7中。
使用苯達莫司汀酯之HSA奈米粒子調配物之交聯實驗
可使用基於HSA之奈米粒子調配物延長本發明之苯達莫司汀及苯達莫司汀酯之循環時間，在該調配物中蛋白質部分在奈米粒子結構形成之後共價交聯。參見例如K.Langer等人International Journal of Pharmaceutics 347(2008)109-117。此將使表面塗層之結構化程度更高且將防止奈米粒子內含物之快速釋放。此亦可藉由將PEG基團引入交聯劑中來提 供奈米粒子之「隱匿」保護。使用市售二醛(戊二醛)證明HSA奈米粒子之有效封裝及硬化。可使用例如如下文所展示而製備之三官能PEG交聯劑來引入適當定尺寸的PEG部分：
程序：HSA奈米粒子用去離子水稀釋至每毫升苯達莫司汀C14酯1.5毫克之濃度，其對應於6mg/mL之HSA濃度。接著將所得奈米粒子懸浮液以1mL部分等分至五個裝備有磁性攪拌棒之玻璃小瓶中。添加適量50%戊二醛溶液且封蓋各小瓶且在室溫下攪拌隔夜。接著將各樣品在N-甲基吡咯啶酮(NMP)中稀釋1至10倍且使用微離心器將樣品離心約2分鐘以移除HSA及交聯HSA奈米粒子。接著藉由HPLC分析上清液且測定苯達莫司汀C14酯之濃度(峰面積)以確認粒子封裝。下表展示隨戊二醛之μL數而變之未封裝之苯達莫司汀C14酯之濃度：
資料展示以每毫克HSA 3.33μL之比率添加戊二醛適於產生交聯之含有苯達莫司汀酯之奈米粒子之系統。
活體內多發性骨髓瘤模型
材料及方法
RPMI 8226(人類漿細胞瘤，骨髓瘤B細胞)ATCC # CCL-155；ECM GeL(基質膠)，Sigma-Aldrich，目錄號E1270，5ml
RPMI(Beit Haemek，批號：1110235)
Velcade®(硼替佐米)3.5mg凍乾，於小瓶中，批號BIZSC00
苯達莫司汀(批號TD-D0815，API批號00039P0012)
苯達莫司汀C12酯奈米粒子(C12NP)，批號2861-241-22，17.6毫克/小瓶
氯化鈉
注射用水(DEMO S.A.)
測試動物
80 CB.17 SCID雌性小鼠，4-6週齡，16-20公克，自Harlan動物繁殖中心(Harlan animal breeding center)獲得
細胞製備
細胞(來源於ATCC)在RPMI培養基上培養。將細胞懸浮液離心且再懸浮於50%基質膠/HBSS中達到7×107個細胞/毫升之最終濃度。將懸浮液以100μl體積皮下植入經麻醉之小鼠之右側腹中。
化合物製備
每週製備VELCADE®一次。將7ml生理食鹽水添加至含有3.5mg粉末之原始小瓶中，達到0.5mg/ml。將3ml此溶液添加至27ml生理食鹽水中以達到0.05mg/ml濃度。
苯達莫司汀製備：在即將處理前，將13.5mg溶解於3.6ml 0.9%生理食鹽水/5%甘露糖醇之1：1混合物中。將1.05ml此溶液添加至0.95ml稀釋劑中以獲得2mg/ml溶液。
C12NP製備：在即將處理前，將3.1ml SWFI添加至含有17.62mg之樣品小瓶中。將1.05ml此溶液添加至0.95ml稀釋劑中以獲得2mg/ml溶液。
實驗設計
在第0天對小鼠進行皮下植入，其中每隻小鼠7×106個RPMI 8226細胞(於50%基質膠/HBSS中)。在第21天，藉由最佳平均腫瘤體積(約150mm3)對小鼠進行分類且將其分配至八個組中，每組9隻小鼠。
應注意，SCID小鼠之性質(亦即嚴重免疫功能降低)使其成為更脆弱/敏感的動物，且因此其不太能耐受裸小鼠(其免疫功能降低程度相對較低)中所用之C12NP劑量。特定言之，以100mg/kg及70mg/kg向SCID小鼠給藥顯示不可接受的耐受性問題(亦即超過20%之體重損失)(資料未圖示)。咸信此現象(裸小鼠對SCID小鼠之間的耐受性差異)為菌株相關現象。因此，使用37.5mg/kg及20mg/kg劑量之C12NP進行研究。
統計分析
腫瘤體積計算如下：。使用單因子ANOVA，接著進行塔基事後比較(Tukey post-hoc comparisons)來分析體重增加及腫瘤體積進程。
結果
處理反應概述於圖23及圖24中。與對照組相比，除C12NP(20mg/kg)以外，所有處理皆顯著抑制腫瘤生長(參見表21中之資料)。在37.5mg/kg下，苯達莫司汀與C12NP之功效類似，其中腫瘤生長受到81%及70%抑制。然而，如圖24中可見，C12NP之可耐受性優於苯達莫司汀，如藉由經C12NP處理之動物中體重損失較小所量測。

Claims (62)

  1. 一種式I化合物， 其中R1為C8-C24烷基。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C10-C24烷基。
  3. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C12-C24烷基。
  4. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C14-C24烷基。
  5. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C16-C24烷基。
  6. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C18-C24烷基。
  7. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C10烷基。
  8. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C12烷基。
  9. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C14烷基。
  10. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為C16烷基。
  11. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該式I化合物為
  12. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該式I化合物為
  13. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該式I化合物為
  14. 一種醫藥組成物，其包含根據式IA之化合物： 其中R為C8-C24烷基；及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  15. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其中R為C10-C24烷基。
  16. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其中R為C10烷基。
  17. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其中R為C12烷基。
  18. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其中R為C14烷基。
  19. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其中R為C16烷基。
  20. 一種奈米粒子，其包含根據式IA之化合物： 其中R為C8-C24烷基。
  21. 一種根據式IA之化合物的用途，其係用於製造用於治療患者中之癌症的醫藥品： 其中R為C8-C24烷基。
  22. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該癌症為慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病(Hodgkin's disease)、惰性非霍奇金氏淋巴瘤(indolent non-Hodgkin's lymphoma)、侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴球性白血病、乳癌或肺癌。
  23. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該癌症係選自肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、睾丸癌、黑素瘤、神經膠母細胞瘤、結腸癌、頭頸癌、卵巢癌及前列腺癌。
  24. 如申請專利範圍第21項至第23項中任一項之用途，其中該患者對一或多種化學治療劑具有抗性。
  25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該一或多種化學治療劑為烷化劑。
  26. 一種式II化合物， 其中R2為C1-C24伸烷基；且R3為-COOC1-3烷基；或R2-R3為C1-C24烷基；或其醫藥學上可接受之鹽形式。
  27. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C8-C24烷基。
  28. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C10-C24烷基。
  29. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C12-C24烷基。
  30. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C14-C24烷基。
  31. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C16-C24烷基。
  32. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C18-C24烷基。
  33. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C10烷基。
  34. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C12烷基。
  35. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C14烷基。
  36. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2-R3為C16烷基。
  37. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中R2為C2伸烷基且R3為-COOCH3。
  38. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中該式II化合物為
  39. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中該式II化合物為
  40. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中該式II化合物為
  41. 如申請專利範圍第26項之化合物，其中該式II化合物為
  42. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第26項之化合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  43. 一種奈米粒子，其包含如申請專利範圍第26項之化合物。
  44. 一種如申請專利範圍第26項之化合物的用途，其係用於製造用於治療患者中之癌症的醫藥品。
  45. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該癌症為慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病、惰性非霍奇金氏淋巴瘤、侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴球性白血病、乳癌或肺癌。
  46. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該癌症係選自肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、睾丸癌、黑素瘤、神經膠母細胞瘤、結腸癌、頭頸癌、卵巢 癌及前列腺癌。
  47. 如申請專利範圍第44項至第46項中任一項之用途，其中該患者對一或多種化學治療劑具有抗性。
  48. 如申請專利範圍第47項之用途，其中該一或多種化學治療劑為烷化劑。
  49. 一種奈米粒子，其包含如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之化合物。
  50. 如申請專利範圍第49項之奈米粒子，其進一步包含人類血清白蛋白。
  51. 如申請專利範圍第49項或第50項之奈米粒子，其進一步包含聚乳酸乙醇酸。
  52. 如申請專利範圍第49項或第50項之奈米粒子，其進一步包含聚乙二醇。
  53. 如申請專利範圍第49項或第50項之奈米粒子，其進一步包含聚乳酸乙醇酸(PLGA)及聚環氧乙烷乳酸共聚物。
  54. 如申請專利範圍第50項之奈米粒子，其中該人類血清白蛋白與二醛交聯。
  55. 如申請專利範圍第54項之奈米粒子，其中該二醛為戊二醛。
  56. 一種凍乾組成物，其包含如申請專利範圍第49項至第55項中任一項之奈米粒子。
  57. 如申請專利範圍第56項之凍乾組成物，其進一步包含甘露糖醇、海藻糖、蔗糖或NaCl中之一或多者。
  58. 一種如申請專利範圍第49項至第55項中任一項之奈米粒子的用途，其係用於製造治用於治療患者中之癌症的醫藥品。
  59. 如申請專利範圍第58項之用途，其中該癌症為慢性淋巴球性白血病、霍奇金氏疾病、惰性非霍奇金氏淋巴瘤、侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴球性白血病、乳癌或肺癌。
  60. 如申請專利範圍第58項之用途，其中該癌症係選自肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、睾丸癌、黑素瘤、神經膠母細胞瘤、結腸癌、頭頸癌、卵巢癌及前列腺癌。
  61. 如申請專利範圍第58項至第60項中任一項之用途，其中該患者對一或多種化學治療劑具有抗性。
  62. 如申請專利範圍第61項之用途，其中該一或多種化學治療劑為烷化劑。
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