EA029706B1 - Сложные алкиловые эфиры бендамустина и способы их применения - Google Patents
Сложные алкиловые эфиры бендамустина и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA029706B1 EA029706B1 EA201590925A EA201590925A EA029706B1 EA 029706 B1 EA029706 B1 EA 029706B1 EA 201590925 A EA201590925 A EA 201590925A EA 201590925 A EA201590925 A EA 201590925A EA 029706 B1 EA029706 B1 EA 029706B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cancer
- bendamustine
- alkyl
- pharmaceutically acceptable
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
- C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
- C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
- C07D235/16—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4164—1,3-Diazoles
- A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к эфирам бендамустина (I) и к их применению для лечения ракагде Rпредставляет собой С-Салкил; или к их фармацевтически приемлемым солевым формам.
Description
Изобретение относится к эфирам бендамустина (I) и к их применению для лечения рака
029706 Β1
где К1 представляет собой С8-С24алкил; или к их фармацевтически приемлемым солевым формам.
029706
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Рассматриваемая заявка испрашивает приоритет относительно предварительной заявки США №61/725213, поданной 12 ноября 2012, и предварительной заявки США №61/776951, поданной 12 марта 2013, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к сложным эфирам бендамустина для использования при лечении рака. Предпосылки изобретения
Бендамустин, 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил]бутановая кислота
продается как соль хлористоводородной кислоты под торговыми наименованиями ΚΙΒΟΜϋ8ΤΙΝ и ΤΚΕΑΝΌΑ и является соединением, которое успешно используют для лечения раковых заболеваний крови, таких как хроническая лимфоцитарная лейкемия, болезнь Ходжкина, неходжскинская лимфома и множественная меланома. Указанные продукты вводят в виде внутривенных вливаний.
Использование бендамустина для лечения солидных опухолей ограничено, однако, из-за химической нестабильности соединений в водной среде. Действительно, сообщают, что бендамустин имеет срок полу-жизни ίη νίνο только около 6-10 мин. В результате, циркулирующие уровни бендамустина не сохраняются достаточно долго для того, чтобы бендамустин мог достичь опухолей вне циркуляторной системы. Необходимы способы увеличения времени циркуляции бендамустина.
Сущность изобретения
Изобретение относится к соединениям формулы I
где К1 представляет собой С8-С24алкил или полиэтиленгликоль; или его фармацевтически приемлемые солевые формы. Также раскрыты способы использования соединений формулы I для лечения солидных и несолидных раковых опухолей.
Изобретение также относится к использованию соединений формулы ΙΑ
где К представляет собой С8-С24алкил; или его фармацевтически приемлемых солевых форм для лечения солидных и несолидных раковых опухолей.
Наночастицы, включающие соединения формул I или ΙΑ, также как лиофилизированные композиции, включающие такие наночастицы, также включены в объем настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 изображает уровни содержания в плазме некоторых вариантов настоящего изобретения у СИ-Ι мышей, после введения дозы 3 мг/кг внутривенно в 3% ДМСО, 30% солютол, 100 мкл;
фиг. 2 - влияние гидрохлорида бендамустина и некоторых вариантов настоящего изобретения на объемы опухолей у мышей с ΜΌΑ-ΜΒ-231 ксенотрансплантатами;
фиг. 3 - количество бендамустина, наблюдающееся с течением времени после обработки ΜΌΑ-ΜΒ231 опухоли молочной железы 89 некоторыми вариантами настоящего изобретения;
фиг. 4 - количество бендамустина, наблюдающееся в течение времени после обработки Н460 немелкоклеточной опухоли легких 89 некоторыми вариантами настоящего изобретения;
фиг. 5 - уровни содержания в плазме бендамустина у крыс после введения дозы одного варианта настоящего изобретения крысам, используя различные лекарственные композиции;
фиг. 6 - уровни содержания в плазме одного из вариантов настоящего изобретения у крыс после введения дозы крысам, используя различные лекарственные композиции;
фиг. 7 представляет собой Крио-ПЭМ изображения наночастиц одного из вариантов настоящего
- 1 029706
изобретения, С14 эфира бендамустина;
фиг. 8 изображает уровни содержания в плазме бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно с С12 эфиром бендамустина;
фиг. 9 - уровни содержания в крови бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг совместно с С12 эфиром бендамустина;
фиг. 10 - уровни содержания в мозге бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно С12 эфиром бендамустина;
фиг. 11 - уровни содержания в печени бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно с С12 эфиром бендамустина;
фиг. 12 - уровни содержания в легких бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно с С12 эфиром бендамустина;
фиг. 13 - уровни содержания в селезенке бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно с С12 эфиром бендамустина;
фиг. 14 - уровни содержания в почках бендамустина и одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкости и композиций наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно с С12 эфиром бендамустина;
фиг. 15 - уровни содержания бендамустина в плазме, в крови и в органах у крыс после введения одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде жидкой композиции), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг;
фиг. 16 - уровни содержания в плазме, в крови и в органах у крыс одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина, после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг, совместно с С12 эфиром бендамустина (в виде жидкой композиции);
фиг. 17 - уровни содержания бендамустина в плазме, в крови и в органах у крыс после введения одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина (в виде композиции наночастиц), после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг;
фиг. 18 - уровни содержания в плазме, в крови и в органах у крыс одного из вариантов настоящего изобретения, С12 эфира бендамустина, после введения крысам дозы 30 мг/кг внутривенно, 1 мл/кг С12 эфира бендамустина (в виде композиции наночастиц);
фиг. 19 - уровни содержания в плазме бендамустина у крыс после введения вариантов настоящего изобретения, РЕС-2000 эфира бендамустина и РЕС-5000 эфира бендамустина, после введения крысам дозы 3 мг-экв/кг внутривенно, 1 мл/кг. Сравнение с ТРЕАЫОЛ;
фиг. 20 - уровни содержания в плазме бендамустина у СО-Ι мышей после введения дозы вариантов настоящего изобретения, 3 мг/кг внутривенно, 3% ДМСО, 30% солютол;
фиг. 21 - представительный вариант наночастицы настоящего изобретения при увеличении 52000х. В образце наблюдают: сферические частицы, которые по внешнему виду равномерно более плотные, чем окружающий буфер (крайние левые стрелки), небольшие частицы на фоне (крайняя правая стрелка). На вкладке показаны две частицы, обозначенные крайними левыми стрелками, в более крупном масштабе. Расстояние между крестиками на левой вкладке составляет 28 нм, и расстояние на правой вкладке составляет 43 нм. Масштабная линейка: 200 нм;
фиг. 22 - представительный вариант наночастицы настоящего изобретения при увеличении 52000х. В образце наблюдают сферические частицы, которые по внешнему виду равномерно более плотные, чем окружающий буфер (крайние левые стрелки), небольшие частицы на фоне (крайняя правая стрелка). На вкладке показаны две частицы, обозначенные крайними левыми стрелками, в более крупном масштабе. Расстояние между крестиками на левой вкладке составляет 28 нм, и расстояние на правой вкладке составляет 43 нм. Масштабная линейка: 200 нм;
фиг. 23 - объемы опухолей после введения УЕЬСАОЕ®. бендамустина и наночастиц С12 эфира бендамустина;
фиг. 24 - результаты измерений массы тел после введения УЕЕСАОЕ®, бендамустина и наночастиц С12 эфира бендамустина.
Подробное описание предпочтительного варианта изобретения
Было обнаружено, что превращение фрагмента карбоновой кислоты бендамустина в группу С8С24алкилового сложного эфира приводит к получению соединения, которое обеспечивает более длительные времена циркуляции соединения, чем для бендамустина. Хотя не желая быть связанными с какойлибо конкретной теорией, авторы предполагают, что сложноэфирный фрагмент снижает растворимость молекул бендамустина, что создает защитный эффект от водной среды. С течением времени сложно- 2 029706
эфирный фрагмент гидролизуется, выявляя фрагмент карбоновой кислоты активной молекулы бендамустина. Общим результатом является то, что с течением времени образуется бендамустин.
Варьируя число атомов углерода в сложноэфирном фрагменте, липофильность полученного производного бендамустина можно модифицировать. Возрастание липофильности коррелирует с повышением стабильности сложного эфира и с более длительными временами циркуляции бендамустина.
В объем настоящего изобретения включены соединения формулы ΙΑ
где К представляет собой С8-С24алкил; или их фармацевтически приемлемые соли. Соединения формулы ΙΑ можно использовать для лечения солидных или несолидных раковых опухолей у пациентов.
Соединения настоящего изобретения можно приготовить в виде фармацевтических композиций, включающих соединение формулы ΙΑ, или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В предпочтительных фармацевтических композициях настоящего изобретения, К представляет собой С!0-С24алкил. Предпочтительно, если К представляет собой Сюалкил. Также предпочтительно, если К представляет собой С!2алкил. Другие предпочтительные варианты включают те, в которых К представляет собой С!4алкил. Композиции, в которых К представляет собой С!6алкил, также предпочтительны.
Другие варианты настоящего изобретения включают наночастицы, включающие соединение формулы ΙΑ.
Также в объем настоящего изобретения включены способы обработки солидных или несолидных раковых опухолей у пациентов, включающие введение указанным пациентам соединения формулы ΙΑ. Предпочтительные солидные или несолидные опухоли включают хроническую лимфоцитарную лейкемию, болезнь Ходжкина, индолентную неходжкинскую лимфому (Т-клеточная лимфома, В-клеточная лимфома), агрессивную неходжкинскую лимфому, множественную меланому, острую лимфоцитарную лейкемию, рак молочной железы или рак легких (мелкоклеточный рак легких (8С1.С) и немелкоклеточный рак легких (Х8С1.С), например). Предполагают также, что другие солидные и несолидные раковые опухоли можно лечить соединениями и композициями настоящего изобретения, например, такие как саркома, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак яичек, меланома, глиобластома, рак прямой кишки, рак головы и шеи, рак яичников и рак простаты. Предполагают также, что другие солидные и несолидные раковые опухоли можно лечить соединениями настоящего изобретения, например рак молочной железы, рак поджелудочной железы и рак желудка.
Предпочтительными соединениями настоящего изобретения являются соединения формулы I
где К! представляет собой С8-С24алкил или полиэтиленгликоль; или их фармацевтически приемлемые соли. Соединения формулы Ι можно использовать для лечения солидных или несолидных раковых опухолей у пациентов.
В предпочтительных вариантах К! представляет собой С!0-С24алкил. В еще других вариантах К! представляет собой С!2-С24алкил. В еще других вариантах К! представляет собой С!4-С24алкил. Также предпочтительны те соединения формулы I, где К! представляет собой С!6-С24алкил. В других вариантах К! представляет собой С!8-С24алкил.
В других вариантах К! представляет собой С!0алкил. В еще других вариантах К! представляет собой С!2алкил. В еще других вариантах К! представляет собой С!4алкил. В других вариантах, К! представляет собой С!6алкил.
Также в объем настоящего изобретения включены фармацевтические композиции, включающие соединение формулы I и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Другие варианты настоящего изобретения включают наночастицы, включающие соединение формулы I.
Также в объем настоящего изобретения включены способы лечения рака, включающие введение пациенту соединения формулы I. Целый ряд раковых заболеваний, включая те, которые включают солидные опухоли, также как те, которые не включают солидные опухоли, можно подвергнуть такому ле- 3 029706
чению. Такие раки включают хроническую лимфоцитарную лейкемию, болезнь Ходжкина, индолентную неходжкинскую лимфому (Т-клеточная лимфома, В-клеточная лимфома), агрессивную неходжкинскую лимфому, множественную меланому, острую лимфоцитарную лейкемию, рак молочной железы или рак легких (мелкоклеточный рак легких(ЗСЬС) и немелкоклеточный рак легких (ЫЗСЬС), например). Предполагают, что дополнительные раковые заболевания, которые также можно лечить соединениями и композициями настоящего изобретения, представляют собой такие, которые характеризуются наличием солидной опухоли, включая саркому, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак яичек, меланому, глиобластому, рак прямой кишки, рак головы и шеи, рак яичников и рак простаты. Предполагают также, что другие солидные и несолидные раковые опухоли можно лечить соединениями настоящего изобретения, например рак молочной железы, рак поджелудочной железы и рак желудка.
Особенно предпочтительные соединения настоящего изобретения включают
- 4 029706
Азотистый иприт.
Мехлорметамин, в продаже под торговой маркой мустарген®, вводят с помощью инъекций для лечения болезни Ходжкина и неходжкинской лимфомы, и используют в качестве паллиативной терапии при лечении рака молочной железы и легких, и используют в качестве местного лечения поражений кожи фунгоидным микозом (кожная Т-клеточная лимфома).
Ифосфамид, в продаже под торговым наименованием ифекс®, используют для лечения лимфом, как ходжкинской, так и неходжкинской, также как рецидивирующего рака яичек и опухоли половых клеток яичек, сарком, рака легких, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи и рака шейки матки.
Мелфалан представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, в продаже под брендовым наименованием алкеран®, и также именуемое как Б-РАМ или фенилаланиновый иприт. Его используют для лечения множественной меланомы, рака яичников, нейробластомы, рабдомиосарком и рака молочной железы.
Хлорамбицил продают под торговым названием лейкеран®, и наиболее широко используют для лечения хронической лимфоцитарной лейкемии, злокачественных лимфом, включая лимфосаркому, макрофолликулярную лимфому и болезнь Ходжкина. Его также успешно используют для лечения неходжкинской лимфомы, рака груди, яичников и яичек, макроглобулинемии Вальденстрома, тромбоцитемии и хориокарциномы.
Циклофосфамид продают как цитоксан® или неосар®, и используют для лечения ходжскинской и неходжскинфой лимфомы, лимфомы Буркитта, хронической лимфоцитарной лейкемии, хронической миелоцитарной лейкемии, острой миелоцитарной лейкемии, острой лимфоцитарной лейкемии, Тклеточной лимфомы, множественной меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, саркомы Ивинга; рака молочной железы, яичек, эндометрия, яичников и рака легких.
Нитрозомочевины.
Стрептозоцин, в продаже под торговым наименованием заносар®, используют для лечения рака островковых клеток поджелудочной железы.
Кармустин также известен как ΒΐΟΝυ® или ΒΟΝυ, и его используют при некоторых типах опухолей мозга, глиобластоме, стволовой глиоме, медуллобластоме, астроцитоме, эпендимоме и метастазирующих опухолях мозга. Его также используют при лечении множественной миеломы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, меланомы, рака легких и рака прямой кишки.
Ломустин, известный также как ССШ,1 или СееШ,1®, используют для лечения первичных и метастазирующих опухолей мозга, болезни Ходжкина и неходжскинской лимфомы, и также используют для
- 5 029706
лечения меланомы, рака легких и прямой кишки.
Алкилсульфонаты.
Бусульфан, торговые названия Ви8и1£ех® и Му1егаи®, используют для лечения хронической миелогенной лейкемии.
Триазины.
Дакарбазин, в продаже под торговым наименованием ИТ1С-Ооте®, используют для лечения метастазирующей злокачественной меланомы, болезни Ходжкина, сарком мягких тканей, нейробластомы, фибросарком, рабдомиосаркомы, карциномы островковых клеток и медуллярного рака щитовидной железы.
Темозоломид, в продаже под торговым наименованием Тетобаг®, используют для лечения конкретных типов опухолей мозга, анапластической астроцитомы и полиморфной глиобластомы.
Этиленимины.
Тиотепа, известный под торговым наименованием Т1йор1ех®. представляет собой алкилирующий агент, который используют для лечения рака молочной железы, рака яичников, болезни Ходжкина и неходжскинской лимфомы.
Алтретамин, в продаже под торговым наименованием Неха1еп®, называемый также гексаметилмеламином или НММ, используют для лечения рака яичников.
В том смысле, как использован в описании, термин "СгСАалкил" относится к неразветвленным или разветвленным, насыщенным углеводородным группам, содержащим от одного до 24 атомов углерода. Представительные алкильные группы включают, но ими не ограничиваются, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-додецил и т.д. В объеме настоящего изобретения термин "С1-С24алкил" также включает термин "циклоалкил", который относится к моноциклическим, бициклическим и трициклическим насыщенным углеводородам, например, циклопропилу, циклобутилу, циклопентилу, циклобутилу, бицикло[2.1.1]гексану, бицикло[2.2.1]гептилу, адамантилу и т.п.
Используемый в описании термин "полиэтиленгликоль", именуемый также как "РЕО", относится к полимерам общей формулы Н(ОСН2СН2)пО- или Н(ОСН2СН2)пОСН3, где п принимает значения по меньшей мере 4. Предпочтительные РЕО имеют среднечисловую молекулярную массу от около 200 до около 5000 Да, причем более предпочтительны РЕО от около 2000 до около 5000 Да.
В том смысле как использовано в описании, выражение "фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель" относится к растворителям, дисперсионным средам, покрытиям, увеличивающим объем агентам, стабилизирующим агентам, антибактериальным и противогрибковым агентам, изотоническим и задерживающим абсорбцию агентам и т.п., которые физиологически совместимы. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из воды, солевого раствора, фосфатнобуферного солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола, сахаров, таких как трегалоза и сахароза, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, смесей сахаров и полиспиртов, и хлорида натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты и буферы.
В том смысле как использован в описании, термин "фармацевтическая композиция" относится к композициям, пригодным для введения при медицинском использовании или в ветеринарии. Такие композиции предпочтительно включают соединение настоящего изобретения в комбинации с одним или более из носителей и/или разбавителей. Такие композиции также называют "лекарственными формами".
В том смысле как использован в описании, термин "введение" относится к любому способу, известному специалистам, с помощью которого соединения настоящего изобретения можно доставить пациенту. Предпочтительные способы введения включают местное введение, т.е. введение соединения настоящего изобретения непосредственно в место, в котором необходимо действие указанного соединения, и системное введение. Примеры способов введения включают, но ими не ограничиваются, пероральный, энтерический, сублингвальный, за губы, подкожный назальный, внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный и внутрибрюшинный способы введения.
В том смысле как использован в описании, термин "солидная опухоль" относится к злокачественной опухоли, которая представляет собой локализованную массу ткани. Примеры солидных раковых опухолей включают лимфомы, саркомы и карциномы, и включают рак молочной железы, рак мозга, рак костей, рак прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак легких и т.п.
В том смысле как использован в описании, термин "рак несолидных опухолей" относится чаще всего к гематологическим раковым заболеваниям, т.е. к злокачественным ракам крови. Примеры раков несолидных опухолей включают хроническую лимфоцитарную лейкемию, болезнь Ходжкина, индолентную неходжскинскую лимфому (Т-клеточную лимфому, В-клеточную лимфому), множественную миелому и т.п.
В том смысле как использован в описании, термин "наночастицы" относится к частицам со средним диаметром около 0,2 мкм или меньше, предпочтительно около 0,1 мкм или меньше, по данным Ма1уегп 2е1а81/ег.
- 6 029706
Экспериментальный раздел.
Получение метилового эфира 4-{5-[бис-(2-хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензоимидазол-2ил}масляной кислоты (С1 эфира бендамустина).
Способ А. В 1 л трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, холодильником с продувкой азотом и термопарой с регулятором температуры, загружают метиловый эфир 4(5-амино-1-метил-1Н-бензоимидазол-2-ил)масляной кислоты (10,2 г, 41,2 ммоль, 1,0 экв.) и хлоруксусную кислоту (81,9 г, 866 ммоль) и 20 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ). Полученную суспензию перемешивают на бане с водопроводной водой до полного растворения всей твердой части. Боран-ТГФ (288 мл, 288 ммоль) медленно добавляют через капельную воронку в течение 25 мин. После завершения добавления ВН3-ТГФ полученный реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч и затем нагревают при 58°С, используя нагревательную рубашку, в течение 45 мин. Реакционную смесь охлаждают и выдерживают при комнатной температуре в течение ночи и затем гасят метанолом (10 мл). Полученный раствор концентрируют до приблизительно одной трети массы, используя испарение в роторном испарителе, и нейтрализуют до рН 8-9 водным раствором гидроксида натрия в бане со смесью лед-вода. Твердую часть собирают, используя вакуумную фильтрацию, промывают водой (200 мл), затем снова суспендируют в разбавленном водном растворе бикарбоната натрия (50 мл) в течение 20 мин. После фильтрования следует сушка в эксикаторе при комнатной температуре в течение ночи и получение твердого вещества желто-коричневого цвета (9,6 г, 63% выход, 93А% степень чистоты) 'ΐ I ЯМР (400 МГц, ДМСО-й6) δ 7,32 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 6,92 (д, 1=2,3 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=8,8, 2,3 Гц, 1Н), 3,70 (уш.с, 8Н), 3,66 (с, 3Н), 3,59 (с, 3Н), 2,83 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,48 (т, 1=7,4 Гц, 2Н, частично перекрывается с ДМСО), 2,01 (кв., 1=7,4 Гц, 2Н); ЖХ/МС (ΕδΙ, т/ζ) 372 (М+1), Т.пл. 60-63°С с разложением.
Способ В. В 2 л трехгорлый стеклянный сосуд, снабженный нагревательной рубашкой, термопарой, холодильником, отверстиями для впуска/выпуска азота и верхнеприводной мешалкой, загружают бендамустин НС1 (50,0 г, 126,7 ммоль, 1,0 экв.), метанол (500 мл), и метансульфоновую кислоту (2,47 мл, 38,1 ммоль). Полученную реакционную смесь нагревают до кипения с обратным холодильником и перемешивают при 65°С в течение одного часа.
Реакционный раствор охлаждают до 40°С и концентрируют в вакууме. К сконцентрированному остатку добавляют воду (500 мл) и насыщенный водный раствор ЫаНСО3 (150 мл) используют для нейтрализации смеси до рН 6 в течение 1,5 ч. Полученный продукт собирают фильтрованием, промывают водой (150 мл) и сушат при 40°С в вакууме, получая порошкообразное вещество белого цвета, 44,2 г (94% выход) с 98,4А% степенью чистоты по данным ВЭЖХ.
Получение этилового эфира 4-{5-[бис-(2-хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензоимидазол-2ил}масляной кислоты (С2 эфир бендамустина).
Способ А. В 1 л трехгорлый стеклянный сосуд, снабженный нагревательной рубашкой, термопарой, холодильником, отверстиями для впуска/выпуска азота и верхнеприводной мешалкой, загружают бендамустин НС1 (30,0 г, 76 ммоль, 1,0 экв.), этанол (300 мл) и метансульфоновую кислоту (1,48 мл, 22,8 ммоль). Полученную реакционную смесь нагревают при 70°С в течение одного часа. Реакционный раствор охлаждают до 40°С и концентрируют в вакууме. К сконцентрированному остатку добавляют воду (300 мл) и насыщенный водный раствор ЫаНСО3 (115 мл) используют для нейтрализации полученной смеси до рН 6 в течение 1,5 ч. Полученный продукт собирают фильтрованием, промывают водой (100 мл) и сушат при 40°С в вакууме, получая твердое вещество белого цвета, 28,6 г (97% выход) со степенью чистоты 99,2А% по данным ВЭЖХ. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Т.) δ 7,32 (д, .1 8.8 Гц, 1Н), 6,92 (д, 4 2.3 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=8,8, 2,3 Гц, 1Н), 4,04 (кв., 1=7,12 Гц, 2Н), 3,70 (уш.с, 8Н), 3,66 (с, 3Н), 2,83 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,45 (т, 1=7,4 Гц, 2Н, частично перекрывается с ДМСО), 2,00 (кв., 1=7,4 Гц, 2Н), 1,18 (т, 1=7,12 Гц, 3Н).
Способ В. В 500 мл трехгорлую стеклянную колбу, снабженную нагревательной рубашкой, термопарой, холодильником, отверстиями для впуска/выпуска азота и верхнеприводной мешалкой, загружают этиловый эфир 4-(5-амино-1-метил-1Н-бензимидазол-2-ил)масляной кислоты (6,4 г, 1,0 экв.), хлоруксусную кислоту (42,5 г) и тетрагидрофуран (ТГФ, 13 мл). Полученную смесь перемешивают в течение 1,5 ч на водяной бане при комнатной температуре. В течение 20 мин добавляют боран-ТГФ (150 мл). После завершения добавления полученную реакционную смесь нагревают до 55-58°С и перемешивают в течение 1,5 часа. Анализ в процессе с использованием ВЭЖХ свидетельствует о степени чистоты 94А% целевого продукта. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и переносят на следующую стадию гидролаза для получения бендамустина.
Получение бутилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2-ил}масляной кислоты (С4 эфир бендамустина). В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 1,9 г (2,35 мл, 25,6 ммоль, 1,01 экв.) 1-бутанола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 100 мл МЭС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ΌΜΛΡ. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, ис- 7 029706
пользуя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), деионизированной водой (1x100 мл) и солевым раствором (1x100 мл) перед тем, как сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют досуха в вакууме, получая масло коричневого цвета. Полученное масло тщательно растирают с 25 мл МЭС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая 9,5 г (22,8 ммоль, 90%) продукта в виде прозрачного светло коричневого масла со степенью чистоты 94,5А% по данным ВЭЖХ. 1Н ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 7,17 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,32 Гц, 1Н), 6,77 (дд, 1=2,36, 8,8 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,76 Гц, 2Н), 3,72 (м, 4Н), 3,69 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=1,1 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 2Н), 1,32 (м, 2Н), 0,89 (т, 1=4,56 Гц, 3Н).
Получение гексилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2-ил}масляной кислоты (С6 эфир бендамустина).
Способ А. В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 2,62 г (3,22 мл, 25,6 ммоль, 1,01 экв.) 1-гексанола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС). 100 мл МЭС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ΌΜΑΡ. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), деионизированной водой (1x100 мл) и солевым раствором (1x100 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая масло коричневого цвета. Полученное масло тщательно растирают с 25 мл МЭС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая 8,91 г (20,1 ммоль, 79%) продукта в виде прозрачного масла светло коричневого цвета со степенью чистоты 91,9А% по данным ВЭЖХ. 1Н ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 7,17 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,32 Гц, 1Н), 6,77 (дд, 1=2,36, 8,8 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,76 Гц, 2Н), 3,72 (м, 4Н), 3,69 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=1,1 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 2Н), 1,32 (м, 6Н), 0,89 (т, 1=4,56 Гц, 3Н).
Способ В. В однолитровую 4-горлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой и отверстиями для впуска/выпуска азота, загружают 30 г (76,0 ммоль) гидрохлорида бендамустина и 300 мл дихлорметана. Начинают перемешивание и 10,6 мл (7,69 г, 76,0 ммоль) триэтиламина добавляют через шприц, затем перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре перед добавлением 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (БОАС, 21,86 г, 114 ммоль) и нгексилового спирта (9,57 мл, 7,84 г, 76,8 ммоль). Мутная белая реакционная смесь превращается в прозрачный раствор после перемешивания в течение 20 мин. Перемешивание продолжают в течение 22,5 ч при комнатной температуре и при 30°С в течение одного часа до тех пор, пока реакция не завершается по данным анализа ВЭЖХ. Загружают деионизированную воду (300 мл), чтобы погасить реакцию, и рН доводят до 6, используя 1н. НС1. Слои разделяют, водный слой экстрагируют дихлорметаном (100 мл), перед объединением органических фаз и сушкой над сульфатом натрия. После фильтрования и концентрирования досуха в вакууме получают прозрачное масло желтого цвета, которое очищают, используя хроматографическую колонку с силикагелем (от 25 до 50% этилацетат в гептане). Выделяют всего 16,5 г (37,3 ммоль, 49,1%) в виде густого масла желтого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 99,1 А%.
Получение октилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2-ил}масляной кислоты (С8 эфир бендамустина). В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 3,33 г (4,03 мл, 25,6 ммоль, 1,01 экв.) 1-октанола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида ЩСС), 100 мл МОС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ОМАР. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), деионизированной водой (1x100 мл) и солевым раствором (1x100 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая масло коричневого цвета. Полученное масло тщательно растирают с 25 мл МЭС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл МЭС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая 9,7 г (20,5 ммоль, 81%) продукта в виде прозрачного масла светло коричневого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 91,9А%. 1Н ЯМР (400 МГц, ССС1;) δ 7,17 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,28 Гц, 1Н), 6,77 (дд, 1=2,4, 8,76 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,8 Гц, 2 Н), 3,72 (м, 4Н), 3,69 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=7,44 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=7,12 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 2Н), 1,32 (м, 10Н), 0,89 (т, 1=6,72 Гц, 3Н).
Получение децилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2-ил}масляной кислоты (Сю эфир бендамустина).
- 8 029706
Способ А. В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термопарой и отверстиями для впуска и выпуски азота, загружают 10,0 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 4,9 мл (4,08 г, 25,6 ммоль, 1,01 экв.) децилового спирта, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 100 мл дихлорметана и 0,31 г (2,53 ммоль, 0,1 экв.) Ν,Ν-диметиламинопиридина (ΌΜΑΡ). Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч, и к этому времени результаты ВЭЖХ анализа свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и полученный фильтрат промывают деионизированной водой (2x100 мл) и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (1x100 мл) перед тем, как сушат над сульфатом натрия. Органическую фазу фильтруют для удаления осушающего агента, затем концентрируют досуха в вакууме, получая 9,6 г (19,2 ммоль, 75,9%) продукта в виде твердого вещества белого цвета с низкой температурой плавления, со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 94,1А%. 'Н ЯМР (400 МГц, СОС13) δ 7,17 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,32 Гц, 1Н), 6,77 (дд, 1=2,4, 8,76 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,76 Гц, 2Н), 3,72 (м, 4Н), 3,69 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=7,08 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 10 2Н), 1,32 (м, 14Н), 0, 87 (т, 1=6,68 Гц, 3Н).
Способ В. В 250 мл 4-горлую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, термопарой и отверстиями для впуска/выпуска азота, загружают 10 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина и 100 мл дихлорметана. Начинают перемешивание и 3,53 мл (2,56 г, 25,3 ммоль) триэтиламина добавляют через шприц, затем перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре перед добавлением 1этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭАС, 7,28 г, 38 ммоль) и н-децилового спирта (4,88 мл, 4,04 г, 25,5 ммоль). Мутная белая реакционная смесь превращается в прозрачный раствор после перемешивания в течение 20 мин. Перемешивание продолжают в течение 20 ч при комнатной температуре до тех пор, пока реакция не завершается по данным анализа ВЭЖХ. Деионизированную воду (100 мл) загружают, чтобы погасить реакцию, и рН доводят до 6-7, используя 1 н НС1. Слои разделяют, водный слой экстрагируют дихлорметаном (25 мл), перед объединением органических фаз и сушкой над сульфатом натрия. После фильтрования и концентрирования досуха в вакууме, получают прозрачное масло желтого цвета, которое очищают, используя хроматографическую колонку с силикагелем (от 20 до 60% этилацетата в гептане). Выделяют всего 11,2 г (22,42 ммоль, 88,6%) в виде густого масла желтого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 98,9 А%.
Получение додецилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (С12 эфир бендамустина).
Способ А. В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 4,77 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) 1-додеканола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 100 мл МЭС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ΌΜΑΡ. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствует о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), деионизированной водой (1x100 мл) и солевым раствором (1x100 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая полутвердое вещество не совсем белого цвета. Это вещество тщательно растирают с 25 мл МЭС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл МЭС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая 11,53 г (21,9 ммоль, 86,4%) продукта в виде полутвердого вещества не совсем белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 93,7А%.
Способ В. В 20-литровый цилиндрический реактор из химического стекла (СйетС1а88) с рубашкой, снабженный термопарой, нагревателем/охладителем, отверстиями для впуска/выпуска азота, капельной воронкой и вакуумной линией, загружают свободное основание бендамустина (374 г, 1,04 моль, 1,0 экв.), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭАС, 300 г, 1,57 моль, 1,5 эквив.) и дихлорметан (ЭСМ, 3,74 л, 10 объемов). При перемешивании добавляют 1-додеканол (292,1 г, 1,57 моль, 1,5 эквив.). Полученную реакционную смесь нагревают, затем перемешивают при 27°С в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают и выдерживают при 20°С в течение ночи. Затем реакционную смесь промывают 3,75 л воды и слои разделяют. Водный слой повторно экстрагируют, используя 1,2 л дихлорметана, и объединенные дихлорметановые порции сушат над №28О4. После удаления осушающего агента путем фильтрования, полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая продукт в виде сырого масла. Осуществляют аналогичную реакцию с другой порцией свободного основания бендамустина 374 г в тех же самых условиях. Сырые продукты - результаты двух загрузок объединяют, смешивают с 4494 мл гептанов и нагревают до 45-50°С. Полученный раствор оставляют медленно охлаждаться до комнатной температуры, при этом в осадок выпадает твердое вещество не совсем белого цвета. Полученную суспензию перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и твердый продукт выделяют при 10°С, используя вакуумную фильтрацию. Влажную фильтровальную лепешку промывают 1 л гептанов и снова суспендируют в 2,5 л гептана при 20-22°С в течение ночи. Полученный продукт собирают фильтрованием и дважды промывают 500 мл гептанов каждый раз. В результате сушки влажных фильтровальных лепешек
- 9 029706
в течение ночи при 20-22°С получают 653 г (59% выход) твердого вещества белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 99,0 А%. !Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-+) δ 7,32 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 6,92 (д, 1=2,3 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=8,8, 2,3 Гц, 1Н), 3,99 (т, 1=6,64 Гц, 2Н), 3,70 (уш.с, 8Н), 3,65 (с, 3Н), 2,83 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,45 (т, 1=1,4 Гц, 2Н, частично перекрывается с ДМСО), 2,01 (кв., 1=7.4 Гц, 2Н), 1,54 (кв., 1=6.9 Гц, 2Н), 1,24 (м, 18Н), 0,85 (т, 1=6,8 Гц, 3Н).
Получение тетрадецилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (С14 эфир бендамустина).
Способ А. В 500 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термопарой и отверстиями для впуска и выпуска азота, загружают 10,0 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 6,5 г (30,4 ммоль, 1,2 экв.) тетрадецилового спирта, 6,3 г (30,4 ммоль, 1,2 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 100 мл дихлорметана и 0,62 г (5,1 ммоль, 0,2 экв.) Ν,Ν-диметиламинопиридина (ОМАР). Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 ч, и к этому времени результаты ВЭЖХ анализа свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и влажную фильтровальную лепешку промывают 50 мл дихлорметана перед тем, как концентрируют полученный фильтрат досуха в вакууме. Полученное масло светло оранжевого цвета тщательно растирают с 50 мл дихлорметана, и нежелательные твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию. Полученный фильтрат снова концентрируют досуха в вакууме, получая 16,5 г полутвердого вещества, которое по данным 'Н ЯМР содержит тетрадеканол и ОМАР. Полученный остаток обрабатывают на хроматографической колонке со 150 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя 1500 мл МОС, 1000 мл 0,5% метанол/МОС и 2000 мл 1% метанол/МОС, отбирая фракции по 100150 мл. Фракции, содержащие нужный продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме. Полученный остаток снова тщательно растирают с 30 мл МОС, и нежелательные твердые вещества удаляют фильтрованием. Полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая 5,0 г (9,2 ммоль, 36,4%) нужного продукта в виде твердого вещества светло пурпурного цвета со степенью чистоты 95,0 А%.
Способ В. В 150 мл трехгорлый стеклянный сосуд, снабженный термопарой, холодильником, отверстиями для впуска/выпуска азота, и верхнеприводной мешалкой, загружают свободное основание бендамустина (16,0 г, 44,6 ммоль, 1,0 экв.), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭАС, 9,42 г, 49,2 моль), 1-тетрадеканол (10,6 г, 49,2 ммоль) и дихлорметан (120 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают при 27°С в течение ночи. Полученный реакционный раствор охлаждают до комнатной температуры и промывают 100 мл воды. При перемешивании добавляют 1М водный раствор НС1, чтобы довести значение рН водного слоя до рН 3-4. Слои разделяют. Водный слой снова экстрагируют 100 мл дихлорметана и объединенные дихлорметановые слои сушат над М§§04. После фильтрования для удаления осушающего агента полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая продукт в виде воскообразного твердого вещества желтого цвета. Твердый продукт суспендируют в 80 мл гептанов при комнатной температуре в течение ночи. Полученный продукт собирают фильтрованием и сушат, получая твердое вещество белого цвета, 20,6 г (83,4% выход) со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 97,2 А%. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,32 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 6,91 (д, 1=2,3 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=8,8, 2,3 Гц, 1Н), 3,98 (т, 1=6,64 Гц, 2Н), 3,70 (уш.с, 8Н), 3,66 (с, 3Н), 2,83 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,45 (т, 1=1,4 Гц, 2Н, частично перекрывается с ДМСО), 2,01 (кв., 1=7,3 Гц, 2Н), 1,54 (м, 2Н), 1,23 (м, 18Н), 0,85 (т, 1=7,12 Гц, 3Н).
Получение пентадецилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (С15 эфир бендамустина).
В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 5,85 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) пентадеканола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 100 мл МОС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ΌΜΑΡ. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МОС. Полученный фильтрат промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), деионизированной водой (1x100 мл) и солевым раствором (1x100 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая твердое вещество не совсем белого цвета. Это вещество тщательно растирают с 25 мл МОС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл МОС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая 10,8 г (19,0 ммоль, 75%) продукта в виде твердого вещества не совсем белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 94,6А%. 1Н ЯМР (400 МГц, СОС13) δ 7,17 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,32 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=2,4, 8,76 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,8 Гц, 2Н), 3,72 (м, 4Н), 3,69 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=7,08 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 2Н), 1,32 (м, 24Н), 0,88 (т, 1=6,68 Гц, 3Н).
Получение гексадецилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (С16 эфир бендамустина).
В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида
- 10 029706
бендамустина, 6,2 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) гексадеканола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС). 100 мл МОС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ОМАР. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МОС. Полученный фильтрат промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), деионизированной водой (1x100 мл) и солевым раствором (1x100 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая туерное вещество не совсем белого цвета. Указанное твердое вещество тщательно растирают с 25 мл МОС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл МОС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая 13,1 г (22,5 ммоль, 88,8%) продукта в виде твердого вещества не совсем белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 94,0А%. 'Н ЯМР (400 МГц, СОС13) δ 7,17 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,32 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=2,36, 8,72 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,8 Гц, 2 Н), 3,72 (м, 4Н), 3,69 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=7,08 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 2Н), 1,32 (м, 26Н), 0, 88 (т, 1=6,68 Гц, 3Н).
Получение олеоилового эфира 4-{5-[бис-(2-хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензоимидазол-2ил}масляной кислоты (С18 эфир бендамустина).
Способ А. В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, холодильником с продувкой азотом, нагревательной рубашкой с регулятором температуры и термопарой, загружают 1-октадеканол (50 г, 185 ммоль, 7,3 экв.). Твердый продукт нагревают до расплава перед медленным добавлением 4-(5-амино-1-метил-1Н-бензоимидазол-2-ил)масляной кислоты (10 г, 2 5,3 ммоль, 1,0 экв.) и серной кислоты (0,5 мл). Полученную взвесь перемешивают при 70°С в течение 6 ч и затем охлаждают до 56°С, после чего добавляют метиленхлорид (150 мл). Полученную реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и промывают водой (100 мл). После разделения фаз осуществляют другую экстракцию метиленхлоридом (100 мл).
Органические фазы объединяют и сушат над М§804. Осушающий агент удаляют фильтрованием. Полученный фильтрат концентрируют и выделяют, используя 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография). После испарения растворителя при пониженном давлении получают твердое вещество белого цвета из 8РС фракций и сушат в вакууме при комнатной температуре в течение 5 дней, получая 1,2 г целевого продукта с выходом 7,1% и степенью чистоты 95,4А%. 1Н ЯМР (400 МГц, СОС13) δ 7,18 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 7,09 (д, 1=2,3 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=8,8, 2,4 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,8 Гц, 2Н), 3,74 (м, 7Н), 3,62 (м, 4Н), 2,93 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=7,1 Гц, 2Н), 2,22 (кв., 1=1,1 Гц, 2Н), 1,60 (кв., 1=7,1 Гц, 2Н), 1,28 (м, 30Н), 0,88 (т, 1=1,1 Гц, 3Н); ЬС/М8 (ЕС1, т/ζ) 610 (М+1).
Способ В. В 500 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, линией для продувки азотом и термопарой, загружают бендамустин НС1 (5,04 г, 12,8 ммоль), 1-октадеканол (4,15 г, 15,3 ммоль), Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ОСС, 3,17 г, 15,4 ммоль), 4-диметиламинопиридин (ОМАР, 0,31 г, 2,56 ммоль) и метиленхлорид (250 мл). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Образующееся твердое вещество выделяют из реакционной смеси фильтрованием. Полученный фильтрат промывают водой (150 мл). После разделения фаз органическую фазу сушат над Мд304. Осушающий агент удаляют фильтрованием и полученный фильтрат концентрируют и очищают, используя флеш-хроматографию 18С0 со смесью Е10Ас и гептанов, получая твердое вещество белого цвета 5,68 г (73% выход) со степенью чистоты 99А%.
Получение докозилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (С22 эфир бендамустина).
В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термопарой и отверстиями для впуска и выпуски азота, загружают 5,0 г (12,7 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 4,2 г (12,9 ммоль, 1,01 экв.) тетрадецилового спирта, 2,7 г (12,9 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ОСС), 50 мл дихлорметана (МОС) и 0,16 г (1,27 ммоль, 0,1 экв.) Ν,Ν-диметиламинопиридина (ОМАР). Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты ВЭЖХ анализа свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и влажную фильтровальную лепешку промывают 50 мл. Используют две альтернативные процедуры очистки. Полученный фильтрат промывают деионизированной водой (2x150 мл), сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют досуха в вакууме. Полученный воскообразный остаток очищают на хроматографической колонке с 80 г силикагеля 60, 230-400 мешей, осуществляя градиентное элюирование, начиная со 100% МОС, затем 0,5% метанол/МОС и наконец, 1% метанол/МОС, собирая 100-150 мл фракции. Фракции, содержащие нужный продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме. Полученный остаток снова тщательно растирают с 20 мл МОС и нежелательные твердые вещества удаляют фильтрованием. Полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая 3,65 г (5,5 ммоль, 43,1%) целевого продукта в виде воскообразного твердого вещества со степенью чистоты 95,7А%. !Н ЯМР (400 МГц, СОС13) δ 7,17 (д, 1=8,72 Гц, 1Н), 7,08 (д, 1=2,28 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=2,36, 8,72 Гц, 1Н), 4,05 (т, 1=6,76 Гц, 2Н), 3,72 (м, 4Н), 3,70 (с, 3Н), 3,63 (м, 4Н), 2,91 (т, 1=7,44 Гц, 2Н), 2,49 (т, 1=7,08 Гц, 2Н), 2,18 (м, 2Н), 1,60 (м, 2Н), 1,32 (м, 38Н), 0,88 (т, 1=6,64 Гц, 3Н).
- 11 029706
Получение 2-додецилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (разветвленный С12 эфир бендамустина): В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10,0 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 4,77 г (5,75 мл, 25,6 ммоль, 1,01 экв.) 2-додеканола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС). 100 мл МЭС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ΌΜΛΡ. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствует о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 25 мл МЭС. Полученный фильтрат разбавляют 200 мл МЭС, затем промывают 4% водным раствором бикарбоната натрия (1x500 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая твердое вещество не совсем белого цвета. Его тщательно растирают с 25 мл МЭС, и твердые примеси удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл МЭС. Полученный фильтрат концентрируют досуха в вакууме, получая сырой продукт, который по данным 'Н ЯМР содержит остаточный 2додеканол. Сырой продукт очищают, используя хроматографическую колонку со 100 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя вначале 1 л гептанов, затем 500 мл смеси 3:1 гептан/ЕЮАе, 500 мл 2:1 гептан/ЕЮАе и наконец, 500 мл 1:1 гептан/ЕЮАе, собирая фракции по 100 мл. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме, получая 5,35 г (10,16 ммоль, 4 0%) продукта в виде вязкого масла светло пурпурного цвета а со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 99,5А%. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6) δ 7,31 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 6,93 (д, 1=2,28 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=2,36, 8,76 Гц, 1Н), 4,8 (м, 1Н), 3,7 (с, 8Н), 3,65 (с, 3Н), 2,82 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,42 (т, 1=7,36 Гц, 2Н), 2,00 (м, 2Н), 1,50 (м, 2Н), 1,25 (уш.с, 16Н), 1,14 (д, 1=6,24, 2Н), 0,84 (т, 1=6,68 Гц, 3Н).
Получение С12 эфира бендамустина.
В 20-литровый цилиндрический реактор из химического стекла СЬетС1а88 с рубашкой, снабженный термопарой, нагревателем/охладителем, отверстием для впуска азота, капельной воронкой, холодильником, и вакуумной линией, загружают суспензию 428 г (1,10 ммоль) предварительно обработанного гидрохлорида бендамустина в 10 объемах метиленхлорида ГХ степени чистоты. Перемешивание осуществляют со скоростью 100 об/мин и температуру рубашки устанавливают 20°С. К этой смеси добавляют диизопропилэтиламин (213 мл, 1,1 экв.) через капельную воронку в течение 10 мин. После 34минутного выдерживания одной порцией добавляют расплавленный додеканол (227 г, 1,1 экв.). Через 11 мин в реакционную смесь добавляют ΕΌΓΊ (320,3 г, 1,5 экв.). Полученный прозрачный раствор желтого цвета перемешивают в течение 23,5 ч при ~ 20°С. К этому моменту по данным 1РС остается 0,54% исходного материала. Добавляют 10 объемов воды и реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 15 мин. Нижний органический слой сливают, фильтруют через 5-микронный фильтровальный картридж и фильтровальный картридж промывают 1 объемом метиленхлорида ГХ степени чистоты. Метиленхлоридный раствор концентрируют в вакууме, получая сырой продукт в виде вязкого масла желтого цвета. Пять объемов профильтрованного н-гептана добавляют к полученному маслу и смесь концентрируют в вакууме для удаления остатков метиленхлорида, получая 615 г сырого твердого вещества с 92,9 мас.%, что соответствует выходу 98,0%. Конечная степень чистоты составляет 98,4% в расчете на сухую основу.
Очистка С12 эфира бендамустина.
Сырой СЕР-40125 (1100 г АР1, 1250 г сырой) помещают в н-гептан (6 объемов) и переносят в 20литровый цилиндрический реактор из химического стекла СЬетС1а88 с рубашкой, снабженный термопарой, нагревателем/охладителем, отверстием для впуска азота, холодильником и вакуумной линией. Полученную суспензию нагревают до 40°С для растворения твердых веществ. После достижения 32,6°С происходит растворение. Полученную реакционную смесь затем охлаждают до 17,7°С в течение 2,5 ч, причем к этому времени полученный продукт осаждается. Полученную реакционную смесь затем снова нагревают до 23°С для растворения тонких частиц в течение 26 мин и охлаждают до 4°С в течение 2 ч. Твердые вещества отфильтровывают, используя запаянный фильтр, и промывают 2 объемами холодного н-гептана в течение 4,5 ч. По данным 1РС остаточный дедеканол составляет 0,20%. Твердые вещества сушат в вакууме в течение 24 ч при 30°С до постоянного веса, получая 1018 г СЕР-40125 со степенью чистоты 98,3%, что соответствует выходу 92,5%.
Получение 5-децилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты (разветвленный С10 эфир бендамустина). В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 3,0 г (7,6 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 1,21 г (7,7 ммоль, 1,01 экв.) 5деканола, 1,59 г (7,7 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 30 мл 1,2-этилендихлорида (ЕОС) и 0,1 г (0,76 ммоль, 0,1 экв.) ОМАР. Реакционную смесь перемешивают при 75°С в течение 45 дней до тех пор, пока данные анализа в процессе не свидетельствуют о завершении реакции. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл ЕОС. Полученный фильтрат промывают 4% водным раствором бикарбоната натрия (1x50 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме. Полученный остаток объединяют с полученным
- 12 029706
остатком из порции 10 г, обработанной в таких же условиях, и объединенные порции обрабатывают хроматографически. Хроматографическую обработку осуществляют, используя 100 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя вначале 2 л гептанов, затем 1 л смеси 3:1 гептан/ЕЮАс и 1 л смеси 2:1 гептан/ЕЮАс, собирая 100 мл фракции. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме, получая 3,97 г (7,96 ммоль, 24,2%) продукта в виде прозрачного масла желтого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 99,4А%. !Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,31 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 6,93 (д, 1=2,28 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=2,40, 8,80 Гц, 1Н), 4,8 (м, 1Н), 3,7 (с, 8Н), 3,65 (с, 3Н), 2,83 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,44 (т, 1=7,36 Гц, 2Н), 2,02 (м, 2Н), 1,48 (м, 4Н), 1,25 (уш.с, 10Н), 0,84 (м, 6Н).
Получение циклогексилового эфира 4-{5-[бис(хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-2ил}масляной кислоты. В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, термопарой, регулятором температуры и линией для продувки азотом, загружают 10 г (25,34 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 2,56 г (2,7 мл, 25,6 ммоль, 1,01 экв.) циклогексанола, 5,3 г (25,6 ммоль, 1,01 экв.) дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), 100 мл МЭС и 0,31 г (2,54 ммоль, 0,1 экв.) ΌΜΑΡ. Реакционную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч до тех пор, пока анализы в процессе не свидетельствуют о завершении реакции. Наблюдают два новых основных пика продукта. Твердые вещества удаляют, используя вакуумную фильтрацию, и промывают 5 мл МЭС. Полученный фильтрат промывают 4% водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме, получая масло желтого цвета с некоторым количеством твердого вещества. 'Н ЯМР анализ регистрирует остаточный ΌΜΑΡ и циклогексанол наряду с ЭСС побочными продуктами, которые присутствуют в дополнении к нужному продукту. Полученный остаток суспендируют в 50 мл МЭС для удаления остаточного циклогексанола, затем концентрируют в вакууме и обрабатывают хроматографически. Хроматографическую обработку осуществляют, используя 50 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя смесью 1:1 гептан/ЕЮАс, собирая 100 мл фракции. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме, получая 3,11 г (7,06 ммоль, 27,9%) продукта в виде твердого вещества не совсем белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 97,8А%. !Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,31 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 6,93 (д, 1=2,28 Гц, 1Н), 6,77 (дд, 1=2,40, 8,80 Гц, 1Н), 4,65 (м, 1Н), 3,7 (с, 8Н), 3,65 (с, 3Н), 2,83 (т, 1=7,4 Гц, 2Н), 2,44 (т, 1=7,36 Гц, 2Н), 2,00 (м, 2Н), 1,76 (м, 4Н), 1,65 (м, 2Н), 1,33 (м, шир, 6Н).
Получение РЕ0-2000 эфира 4-{5-[бис-(2-хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензоимидазол-2ил}масляной кислоты (РЕ0-2000 эфир бендамустина). В 100 мл трехгорлый стеклянный реактор, снабженный мешалкой, термопарой, холодильником и отверстиями для впуска/выпуска азота, загружают гидрохлорид бендамустина (2,0 г, 5,1 ммоль, 1,0 экв.) и дихлорметан (30 мл). К суспензии добавляют триэтиламин (0,71 мл, 5,1 ммоль) при 22°С, и перемешивают в течение 20 мин. Добавляют метоксиполиэтиленгликоль 2000 (РЕ0-0Ме-2000, 12,2 г, 6,1 ммоль) и 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭАС, 1,5 г, 7,6 моль). Полученную реакционную смесь перемешивают при 22°С в течение 5,5 ч и в это время добавляют еще РЕ0-0Ме-2000 (1,0 г) и продолжают перемешивание в течение 3 дней и выходные. Добавляют воду (20 мл) и рН доводят до рН 5-6, добавляя 1М хлористоводородную кислоту. Фазы медленно разделяются. Водную фазу снова экстрагируют 20 мл дихлорметана и объединенные дихлорметановые фазы сушат над М§§04. После фильтрования для удаления осушающего реагента, фильтрат концентрируют в вакууме, получая продукт в виде воскообразного твердого вещества. Твердый продукт суспендируют в 10 мл гептанов при комнатной температуре. Полученный продукт собирают фильтрованием и сушат при 30°С в вакууме, получая порошкообразное твердое вещество белого цвета, 11,7 г (99% выход) со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 97,9А%. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,32 (д, 1=8,6 Гц, 1Н), 6,92 (д, 1=2,2 Гц, 1Н), 6,78 (дд, 1=8,8, 2,2 Гц, 1Н), 4,12 (т, 1=4,8 Гц, 2Н), 3,70 (м, 12Н), 3,60 (м, 3Н), 3,51 (м, 224Н), 3,43 (м, 4Н), 3,32 (м, 58Н), 2,84 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,45 (2Н, частично перекрывается с ДМСО), 2,01 (кв., 1=7,3 Гц, 2Н).
Получение РЕ0-5000 эфира 4-{5-[бис-(2-хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензоимидазол-2ил}масляной кислоты (РЕ0-5000 эфир бендамустина). В 50 мл трехгорлый стеклянный сосуд, снабженный мешалкой, термопарой, холодильником, и отверстиями для впуска/выпуска азота, загружают гидрохлорид бендамустина (0,5 г, 1,27 ммоль, 1,0 экв.) и дихлорметан (15 мл). К суспензии добавляют триэтиламин (0,18 мл, 1,28 ммоль) при 22°С и перемешивают в течение 20 мин вместе с метоксиполиэтиленгликолем 5000 (РЕ0-0Ме-5000, 6,33 г, 1,27 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (ЕЭАС, 0,36 г, 1,88 моль). Полученную реакционную смесь перемешивают при 22°С в течение ночи. Добавляют воду (20 мл) и рН доводят до рН 3-4, добавляя 1М хлористоводородную кислоту. Фазы медленно разделяются. Водную фазу снова экстрагируют 10 мл дихлорметана. Объединенные дихлорметановые фазы промывают солевым раствором (20 мл) и сушат над М§§04. После фильтрования для удаления осушающего агента, полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая продукт в виде воскообразного твердого вещества. Твердый продукт суспендируют в 20 мл гептанов при комнатной температуре. Полученный продукт собирают фильтрованием и сушат при 30°С в вакууме, получая порошкообразное твердое вещество белого цвета, 5,24 г (77% выход) со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 99А%. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,38 (д, 1=12 Гц, 1Н), 6,91 (д, 1=2,4 Гц, 1Н), 6,82 (д, 1=10 Гц, 1Н), 4,12 (т,
- 13 029706
1=4,7 Гц, 2Н), 3,72 (уш.с, 8Н), 3,68 (м, 5Н), 3,59 (м, 3Н), 3,51 (м, 436 Н), 3,42 (м, 3Н), 3,31 (м, 28Н), 2,88 (т, 1=1,4 Гц, 2Н), 2,45 (т, 2Н, частично перекрывается с ДМСО), 2,01 (кв., 1=7,3 Гц, 2Н).
Общая процедура для трансэтерификации метилового эфира бендамустина.
В 50 мл трехгорлый стеклянный реактор, снабженный мешалкой, термопарой, холодильником с ловушкой Дина-Старка и отверстиями для впуска/выпуска азота, загружают метиловый эфир бендамустина (0,5 г, 1,27 ммоль, 1,0 экв.), катализатор (0,05-1,4 экв.), соответствующий растворитель (5-15 объемов), и избыток додеканола (5-10 экв.). Полученную реакционную смесь нагревают до кипения с обратным холодильником и контролируют с помощью ВЭЖХ. Результаты, полученные в различных условиях, суммированы далее.
Катализатор | Катализатор (экв.) | Растворитель | Объемы растворителя | Спирт (эквив) | Темп. °С | Ловушка ДинаСтарка | Время (час) | Исх. материал (ВЖЭХ А%) | Продукт ВЖЭХ А%) |
СНзСОзН | 1,40 | ΝΑ | ΝΑ | 2,50 | 30 | Нет | 3 | 3,8 | 94,5 |
СНзСОзН | 1,40 | ДСМ | 10 | 2,50 | 30 | Нет | 47 | 22,0 | 76,2 |
СНзСОзН | 1,40 | Толуол | 10 | 2,50 | 70 | Нет | 24 | 19,3 | 69,7 |
12 | 0,25 | Толуол | 5 | 2,50 | 75 | Нет | 7 | 96, 0 | 0,2 |
ТЮ(асас)2 | 0,05 | Ксилол | 10 | 1,01 | 130 | Нет | 7 | 92,7 | 4,0 |
ТЮ(асас)2 | 0,10 | Ксилол | 5 | 10,0 | 130 | Нет | 6 | 10,5 | 85,5 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,10 | Ксилол | 5 | 10,0 | 160 | Нет | 5 | 9,0 | 78,6 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,10 | Ксилол | 15 | 5,00 | 160 | Да | 6 | 1,0 | 97,0 |
Н2СО4 | 0,5 | Толуол | 10 | 5,0 | 100 | Нет | 23 | 78,9 | 13,5 |
ДМАР | 0,5 | Толуол | 10 | 5,0 | 100 | Нет | 23 | 83 | 0 |
р-ТСА | 0,5 | Ксилол | 10 | 5,0 | 130 | Нет | 21 | 67,2 | 15,6 |
5т(0ЮРг)з | 0,5 | ТНК | 10 | 5,0 | 25-45 | Нет | 27 | 2,6 | 90,5 |
СирегЪасе | 0,5 | ТНК | 10 | 5,0 | 25-45 | Нет | 27 | 3,3 | 49,8 |
5т(Οί-Рг)з | 0,1 | Ксилол | 15 | 5,0 | 160 | Нет | 8 | 72,8 | 24,3 |
5т(Οί-Рг)з | 0,5 | ТНК | 10 | 5,0 | 40 | Нет | 16 | 95,8 | 2,5 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,05 | Ксилол | 15 | 5,0 | 150 | Да | 3 | 0,3 | 96, 9 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,05 | Толуол | 15 | 5,0 | 105 | Нет | 70 | 78,9 | 15,9 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,10 | Толуол | 15 | 5,0 | 115 | Да | 22 | Νϋ | 96, 4 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,05 | Толуол | 15 | 5,0 | 130 | Нет | 24 | 83,2 | 4,1 |
ΤίΟ(асас)2 | 0,05 | Толуол | 15 | 5,0 | 115 | Да | 21 | 0,4 | 97,7 |
Получение амидов гидрохлорида бендамустина 4-{5-[бис-(2-хлорэтил)амино]-1-метил-1Нбензоимидазол-2-ил}-^децилбутирамид (С10 амид бендамустина). В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термопарой, охлаждающей баней, 60 мл уравнивающей давление капельной воронкой и отверстиями для впуска и выпуска азота, загружают 10,0 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 10,6 г (27,8 ммоль) НАТи и 100 мл Ν,Ν-диметилформамида (ДМФ). К полученному перемешиваемому раствору желтого цвета добавляют 4,41 мл (3,27 г, 25,3 ммоль), Ν,Νдиизопропилэтиламина (ΌΙΡΕΑ). Отмечается экзотермическая реакция при 27,1°С, и раствор становится более темно-желтым. Реакционную смесь охлаждают до 6,6°С, при этом добавляют раствор 6,2 мл (4,59 г, 35,5 ммоль) ΌΙΡΕΑ, 5,11 мл (4,1 г, 25,6 ммоль) дециламина в 20 мл ДМФ по каплям в течение 13 мин при 2,7-7,6°С. После завершения добавления реакционную смесь оставляют при перемешивании при <10°С на 1,5 ч, и к этому времени результаты анализа в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Реакционную смесь гасят 200 мл деионизированной воды и экстрагируют этилацетатом (2x175 мл). Органические фазы объединяют, промывают 10% гидрофосфатом натрия (1x200 мл), 8% водным раствором бикарбоната натрия (1x200 мл) и солевым раствором (1x200 мл) перед тем, как концентрируют досуха в вакууме, получая липкое твердое вещество белого цвета. Это твердое вещество тщательно растирают с гептанами (75 мл), и оно становится текучим твердым веществом, которое выделяют, используя вакуумную фильтрацию. Влажную фильтровальную лепешку сушат в вакуумном термостате при 25°С в течение ночи, получая 13,33 г (25,3 ммоль, 100%) нужного продукта в виде твердого вещества белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 98,01А%. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,72 (уш.с, 1Н), 7,33 (д, 1=8,76 Гц, 1Н), 6,91 (д, 1=2,28 Гц, 1Н), 6,80 (дд, 1=2,36, 8,8 Гц), 3,7 (с, 8Н), 3,66 (с, 3Н), 3,01 (ц, 1=6,8, 12,68, 2Н), 2,79 (т, 1=7,44 Гц, 2Н), 2,18 (т, 1=7,36 Гц, 2Н), 1,95 (м, 2Н), 1,36 (м, 2Н), 1,22 (уш.с, 14), 0,84 (т, 1=6,68 Гц, 3Н).
4-{5- [бис-(2-Хлорэтил)амино]-1 -метил-1 Н-бензоимидазол-2-ил } -Ν-тетрадецилбутирамид (С 14 амид бендамустина). В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термопарой, охлаждающей баней, 60 мл уравнивающей давление капельной воронкой и отверстиями для впуска и выпуска азота, загружают 10,0 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 10,6 г (27,8 ммоль) НАТИ и 100 мл Ν,Ν-диметилформамида (ДМФ). К полученному перемешиваемому раствору желтого цвета добавляют 4,41 мл (3,27 г, 25,3 ммоль) Ν,Ν-диизопропилэтиламина (ΌΙΡΕΑ). Отмечается экзотермическая реакция при 27,1 °С, и раствор становится более темно желтым. Реакционную смесь охлаждают до 3,3°С и добавляют раствор 6,2 мл (4,59 г, 35,5 ммоль) ΌΙΡΕΑ, 5,75 г (25,6 ммоль) тетрадециламина в 40 мл ДМФ по
- 14 029706
каплям в течение 6 мин при температуре <10°С. После завершения добавления реакционная смесь становится очень густой и трудноперемешиваемой. Смесь переносят в 500 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой и термопарой, перемешивают при комнатной температуре в течение трех часов, и к этому времени результаты анализов в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Реакционную смесь гасят 400 мл деионизированной воды и экстрагируют этилацетатом (2x300 мл). Органические фазы объединяют, промывают 10% гидрофосфатом натрия (1x300 мл), 8% водным раствором бикарбоната натрия (1x300 мл) и солевым раствором (1x300 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме. Полученный остаток очищают, используя хроматографическую колонку со 100 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя 1% МеОН/МОС (2 л), 2,5% МеОН/МОС (1 л) и 5% МеОН/МОС (1 л), собирая фракции по 100 мл. Полученные фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме, получая 7,86 г (14,6 ммоль, 57,6%) целевого продукта в виде твердого вещества белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 97,3А%. ΊI ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,72 (уш.с, 1Н), 7,33 (д, 1=8,84 Гц, 1Н), 6,91 (д, 1=2,22 Гц, 1Н), 6,80 (дд, 1=2,36, 8,84 Гц), 3,71 (с, 8Н), 3,70 (с, 3Н), 3,01 (кв., 1=6,8, 12,68, 2Н), 2,79 (т, 1=7,44 Гц, 2Н), 2,18 (т, 1=7,36 Гц, 2Н), 1,97 (м, 2Н), 1,36 (м, 2Н), 1,28 (уш.с, 22), 0,84 (т, 1=7,04 Гц, 3Н).
4-{5-[бис-(2-Хлорэтил)амино]-1-метил-1Н-бензоимидазол-2-ил}-Н-октадецилбутирамид (С18 амид бендамустина). В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термопарой, охлаждающей баней, 60 мл уравнивающей давление капельной воронкой и отверстиями для впуска и выпуска азота, загружают 10,0 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 10,6 г (27,8 ммоль) НАТИ и 100 мл Ν,Ν-диметилформамида (ДМФ). К полученному перемешиваемому раствору желтого цвета добавляют 4,41 мл (3,27 г, 25,3 ммоль) Ν,Ν-диизопропилэтиламина (ΌΙΡΕΑ). Отмечается экзотермическая реакция при 27,1°С, и раствор становится более темно желтым. Реакционную смесь охлаждают до 2,0°С, и добавляют через пипетку суспензию 6,2 мл (4,59 г, 35,5 ммоль) ΌΙΡΕΑ, 7,65 г (25,6 ммоль) октадециламина в 0 мл ДМФ. После завершения добавления реакционная смесь становится слишком густой и трудноперемешиваемой. Смесь нагревают до комнатной температуры и магнитную мешалку заменяют верхнеприводной мешалкой. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, причем в это время анализы в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Реакционную смесь гасят 300 мл деионизированной воды и экстрагируют дихлорметаном (2x150 мл). Органические фазы объединяют, промывают 10% гидрофосфатом натрия (1x300 мл), 8% водным раствором бикарбоната натрия (1x300 мл) и солевым раствором (1x300 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и концентрированием досуха в вакууме. Полученный остаток очищают, используя хроматографическую колонку со 100 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя 1% МеОН/МЭС (2 л), 2,5% МеОН/МЭС (1 л) и 5% МеОН/МЭС (1 л), собирая фракции по 100 мл. Полученные фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме, получая 5,11 г (8,38 ммоль, 33%) целевого продукта в виде твердого вещества белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 90,9А%. Показано, что основной примесью является С-16 амид, который образуется из примеси в исходном амине. 'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 7,72 (уш.с, 1Н), 7,33 (д, 1=8,84 Гц, 1Н), 6,91 (д, 1=2,22 Гц, 1Н), 6,80 (дд, 1=2,36, 8,84 Гц), 3,71 (с, 8Н), 3,70 (с, 3Н), 3,01 (кв., 1=6,8, 12,68, 2Н), 2,79 (т, 1=7,44 Гц, 2Н), 2,18 (т, 1=7,36 Гц, 2Н), 1,97 (м, 2Н), 1,36 (м, 2Н), 1,28 (уш.с, 30Н), 0,85 (т, 1=6,32 Гц, 3Н).
Метиловый эфир (§)-2-(4-{5-[бис(2-хлорэтил)амино] -1 -метил-1Н-бензоимидазол-2-ил}бутириламино)пропионовой кислоты. В 250 мл трехгорлую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, термопарой, охлаждающей баней, капельной воронкой и отверстиями для впуска и выпуска азота, загружают 10 г (25,3 ммоль) гидрохлорида бендамустина, 10,6 г (27,8 ммоль) НАТИ и 100 мл ДМФ. Реакционную смесь охлаждают до 1,9°С и добавляют 8,8 мл (6,54 г, 50,6 ммоль) ΌΙΡΕΑ в течение 2 мин. При 9°С происходит экзотермическая реакция, и раствор становится оранжевым. По каплям добавляют раствор 3,57 г (25,6 ммоль) гидрохлорида метилового эфира Ь-аланина и 6,2 мл (4,57 г, 35,4 ммоль) ΌΙΡΕΑ в 20 мл ДМФ в течение 10 мин при 4,9-5,7°С. Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры в течение одного часа и перемешивают в течение трех часов, причем к этому времени анализы в процессе свидетельствуют о завершении реакции. Реакционную смесь гасят 400 мл смеси 1: 1 этилацетат/деионизированная вода. Слои разделяют, органический слой промывают 10% гидрофосфатом натрия (1x200 мл), 8% раствором бикарбоната натрия (1x200 мл) и солевым раствором (1x200 мл) перед сушкой над сульфатом натрия, фильтрованием и выпариванием досуха в вакууме. Полученный остаток очищают, используя хроматографическую колонку с 100 г силикагеля 60, 230-400 мешей, элируя 1%>МеОН/МОС (3 л), 2,5% МеОН/МОС (1 л) и 5% МеОН/МОС (500 мл), собирая фракции по 100 мл. Полученные фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют досуха в вакууме, получая 7,1 г (16,0 ммоль, 63,3%) целевого продукта в виде твердого вещества белого цвета со степенью чистоты по данным ВЭЖХ 97,4А%. !Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6) δ 8,25 (д, 1=6,92 Гц), 1Н), 7,40 (д, 1=8,84 Гц, 1Н), 6,92 (д, 1=2,2 Гц, 1Н), 6,86 (дд, 1=2,32, 8,88 Гц), 4,25 (кв., 1Н), 3,72 (с, 8Н), 3,71 (с, 3Н), 3,62 (с, 3Н), 2,87 (т, 1=7,48 Гц, 2Н), 2,25 (т, 1=7,52 Гц, 2Н), 1,99 (м, 2Н), 1,26 (д, 1=7,32 Гц, 3Н).
Общая процедура для приготовления раствора лекарственных форм эфиров бендамустина настоящего изобретения.
- 15 029706
Исходный раствор эфира бендамустина настоящего изобретения растворяют в смеси 60/40 (об./об.) диметилацетамида ("ΌΜΆ") и солютола (8о1и1о1® Ηδ-15) в концентрации примерно 100 мг/мл. Смесь перемешивают при комнатной температуре до растворения. Полученный исходный раствор, который остается стабильным в течение нескольких месяцев, разбавляют 0,9% солевым раствором до необходимой концентрации и дозируют в течение около 2 ч.
Приготовление раствора С14 эфира бендамустина.
Исходный раствор приготавливают, растворяя 320,1 мг С14 эфира бендамустина в 4 мл смеси 60/40 (об./об.) ΌΜΆ и 8о1и1о1® Ηδ-15. Смесь перемешивают в течение около 2 ч до растворения. Перед дозированием исходный раствор разбавляют, отбирая 1,00 мл исходного раствора и добавляя 16,20 мл солевого раствора и перемешивая в течение 5 мин при комнатной температуре. Полученная лекарственная форма содержит 3 мг-экв/мл бендамустина.
Предварительная обработка для удаления остаточного этанола.
Гидрохлорид бендамустина (277 г) загружают в 5 л роторный испаритель, затем добавляют 2 объема деионизированной воды и 5 объемов ацетона. Растворители отгоняют в вакууме при максимальной температуре 40°С в течение 5,5 ч. Добавляют дополнительно 5 объемов ацетона и полученную суспензию вращают при атмосферном давлении в роторном испарителе при 35°С в течение 15 мин. Затем реакционную смесь фильтруют через запаянную воронку из спеченного стекла и полученное твердое вещество белого цвета промывают 2 объемами ацетона. Твердое вещество переносят на сушильный лоток и сушат при 40°С до постоянного веса в течение 17 ч перед тем, как выделяют 266 г (96,0%) продукта со степенью чистоты 99,8А% и с КР (титр по Фишеру) 0,26%.
Общая процедура получения наночастиц альбумина сыворотки человека ("ΗδΑ").
Композиции эфиров бендамустина настоящего изобретения.
Наночастицы образуют из эмульсии типа масло-в-воде (ОЛУ), используя дихлорметан и ΗδΑ в качестве поверхностно активного вещества. Масляную фазу приготавливают, растворяя необходимое количество эфира бендамустина в дихлорметане в концентрации около 20 мг/мл. Водную фазу приготавливают, растворяя 2-4 кратное количество ΗδΑ (мас./мас. в расчете на эфир бендамустина) в 5-15 объемах воды (мас./мас. в расчете на дихлорметан). Обычно в водную фазу добавляют маннит в количестве 510%, для того чтобы сделать раствор изотоничным для инъекций и для создания фармацевтически приемлемого продукта после лиофилизации. Эмульсию ОЛУ образуют, эмульгируя полученную масляную фазу и водную фазу, используя ручной гомогенизатор ΙΚΑ со средней интенсивностью в течение около 30 с. Наночастицы образуются в результате обработки сырой ОЛУ эмульсии с помощью гомогенизатора высокого давления МюгоПшШ/сг® (5 пассажей при около 30000 пси), что обеспечивает получение частиц размером 50-100 нм, по данным динамического светорассеяния (Макет ΖοΙαδίζοΓ). Растворитель удаляют в вакууме и полученный концентрат или лиофилизируют или хранят замороженным до дозирования. Такие лекарственные формы обладают хорошей физической и химической стабильностью.
Лиофилизированные наночастицы повторно растворяют и анализируют, используя криотрансмиссионную электронную микроскопию (сгуо-Тгащткйоп Е1ес1тои М1сго8сору (с-ТЕМ)). Большинство наночастиц представляет собой твердые сферы размером 20-40 нм, которые легко диспергируются в воде. Меньшая часть частиц находится в интервале значений 125 нм. Все частицы имеют гладкую поверхность.
Наночастицы С12 эфира бендамустина ΗδΑ. Масляную фазу приготавливают, растворяя 600 мг С12 эфира бендамустина в 5 мл дихлорметана. Полученную масляную фазу эмульгируют с водной фазой, состоящей из 60 мл деионизированной ("ΌΙ") воды, 2,4 г ΗδΑ (лиофилизированный твердый продукт от δί^α-Α1άτκΕ, δΐ. Бонк, МО) и 6,6 г маннита, используя ручной гомогенизатор ΙΚΑ иИта-Тштех и получая грубую эмульсию. Полученную эмульсию пять раз пропускают через гомогенизатор высокого давления Мютойшбюк М-110Р в условиях около 30000 пси. Дихлорметан удаляют из полученной суспензии наночастиц, используя роторный испаритель, и полученную водную суспензию разбавляют до полного объема 100 мл деионизированной водой. Затем суспензию распределяют 10 мл аликвотами в 30 мл пенициллиновые флаконы и лиофилизируют.
Наночастицы С12 эфира бендамустина ΗδΑ с поли(молочной-со-гликолевой) кислотой (ΡΕΟΑ).
Масляную фазу приготавливают, растворяя 300 мг С12 эфира бендамустина и 500 мг ΡΕΟΑ (отношение 50/50 молочной кислоты к гликолевой при Мм (молекулярная масса) 7000-17000; Л1бпсН Рай# 719897) в 2,5 мл дихлорметана. Полученную масляную фазу эмульгируют с водной фазой, состоящей из 30 мл деионизированной воды, 1,2 г ΗδΑ (лиофилизированное твердое вещество от δ^дта-Л1ά^^сЬ) и 3,3 г маннита, используя и ручной гомогенизатор ΙΚΑ ийта-Тштех, получая грубую эмульсию. Эту эмульсию пропускают пять раз через гомогенизатор высокого давления Мютойшбюк М-110Р в условиях около 30000 пси. Дихлорметан удаляют из полученных наночастиц, используя роторный испаритель, и полученную водную суспензию разбавляют, доводя до полного объема 50 мл ΌΙ водой. Полученные наночастицы имеют размер 90,5 нм (Ζηνβ) по данным Макет Ζеΐа8^ζе^. Затем отбирают 10 мл аликвоты полученной суспензии в 30 мл пенициллиновые флаконы и лиофилизируют.
Получение пегилированных лекарственных форм наночастиц эфиров бендамустина настоящего
- 16 029706
изобретения.
Приготавливают ряд лекарственных форм наночастиц с РЕО оболочкой, о которых сообщалось в литературе (Αίβχίδ Ρ., ΜοΙοοιιΙαΓ РЬагтасеийсз, 5, (2008), 505-515) для получения "малозаметных" оболочек, обеспечивающих возможность избежать иммунной системы организма. Включение РЕО осуществляют, используя поверхностно активное вещество на базе РЕО (сополимер РЕО и полимолочной кислоты) вместо Η8Α, или используя биоконъюгатную химию для ковалентного присоединения РЕО групп к свободным ΝΗ2 группам на поверхности Η8Α наночастиц. Обе системы демонстрируют повышенное время циркуляции в плазме в РК (фармакокинетических) исследованиях.
Наночастицы С12 эфира бендамустина Η8Α в оболочке полиэтиленгликоля (РЕО).
Масляную фазу приготавливают, растворяя 600 мг С12 эфира бендамустина в 5 мл дихлорметана. Полученную масляную фазу эмульгируют с водной фазой, состоящей из 60 мл деионизированной воды, 2,4 г Η8Α (лиофилизированное твердое вещество от §^§та-Λ1ά^^сЬ) и 6,6 г маннита, используя ручной гомогенизатор ΙΚΑ ийга-Тиггех, получая грубую эмульсию. Эту эмульсию пять раз пропускают через гомогенизатор высокого давления Μίαοίΐωάκδ М-110Р в условия около 30000 пси. Дихлорметан удаляют из полученной суспензии наночастиц, используя роторный испаритель, и полученную водную суспензию разбавляют до полного объема 50 мл ΌΙ водой. Затем суспензию наночастиц разбавляют 200 мл 100 мМ рН 8,5 боратного буфера и размеры частиц и зета-потенциалы полученных наночастиц измеряют, используя Μ;·ι1\Όπι 2е1а51/ег. Наночастицы имеют размер 78,9 нм (Ζην§) и поверхностный заряд -13,0 мВ. Суспензию перемешивают и добавляют 150 мг метокси-РЕО5000-н-гидроксисукцинимидного эфира (Ьаузап Ро1утег).
Реакционную смесь перемешивают в течение ~90 мин при комнатной температуре и снова измеряют размеры частиц и их зета-потенциал. Найдено, что размеры наночасиц составляют 83,6 нм (Ζην§) и зета-потенциал составляет -7,35 мВ. Буфер для наночастиц заменяют и концентрируют, используя 6,6% (мас./мас.) раствор маннита, и диафильтрационный картридж с номинальным отсечением по молекулярной массе 50000 (Μ\νί'.'Ο). Затем суспензию распределяют 10 мл аликвотами в 30 мл пенициллиновые флаконы и лиофилизируют.
Наночастицы С12 эфира бендамустина с поли(молочной-со-гликолевой) кислотой (ΤΕ-ΟΑ) и сополимером полиоксиэтилена и молочной кислоты (РЕ^Λ), поверхностно активным веществом.
Масляную фазу приготавливают, растворяя 300 мг С12 эфира бендамустина и 500 мг РЕ-ΟΑ (отношение 50/50 молочной кислоты к гликолевой с ММ 7000-17000; ΑΙάήΛ Рай # 719897) в 2,5 мл дихлорметана. Полученную масляную фазу эмульгируют с водной фазой, состоящей из 30 мл ΌΙ воды, 0,6 г сополимера РЕО-5000-полимолочная кислота 1000 (сополимер, полученный с использованием способа Α. Ьиске, ВюнкЦепак. 21, (2000), 2361-2370) и 3,3 г маннита, используя ручной гомогенизатор ΙΚΑ ИИгаТиггех, и получая грубую эмульсию. Эту эмульсию пропускают в течение 5 мин через гомогенизатор высокого давления ΜκΓοίΙωάκδ Μ-110Р в условиях ~30000 пси. Дихлорметан удаляют из полученной суспензии наночастиц, используя роторный испаритель, и полученную водную суспензию разбавляют до полного объема 50 мл ΌΙ водой. Размер полученных наночастиц составляет 248,0 нм (Ζ;·ιν§) по данным ΜηΕόγπ Ζеΐа8^ζе^. Эту суспензию распределяют аликвотами по 10 мл в 30 мл пенициллиновые флаконы и лиофилизируют.
Наночастицы С12 эфира бендамустина Η8Α из концентрата.
Масляную фазу приготавливают, растворяя 4,8 г С12 эфира бендамустина в 13,4 г дихлорметана. Полученную масляную фазу эмульгируют с водной фазой, состоящей из 111 г деионизированной ("ΌΙ") воды и 9 г Η8Α, используя ручной гомогенизатор ΙΚΑ иКга-Тштех, получая грубую эмульсию. Эту эмульсию пропускают пять раз через гомогенизатор высокого давления Μΐαοίΐϋΐάκδ Μ-110Р в условиях около 30000 пси. Полученный концентрат наночастиц стабилизируют, добавляя 12 г Ν;·ιί'.Ί и перемешивая до растворения. Стабилизацию можно также обеспечить, используя другие способы хорошо известные специалистам в данной области, например, используя другие соли, контролируемое нагревание и/или регулируя величину рН. Предотвращению агрегации может также способствовать сшивка, например, с глутаральдегидом.
Дихлорметан удаляют из полученной суспензии наночастиц, используя роторный испаритель. Полученную водную суспензию смешивают с 12 г сахарозы и добавляют деионизированную воду для доведения полной массы до 480 г. Затем отбирают аликвоты полученной суспензии по 7,5 мл в 20 мл пенициллиновые флаконы и лиофилизируют.
Растворы Η8Α наночастиц проявляют со временем медленное увеличение размера частиц. Некоторые частицы в растворах достигают размера ~200 нм за 12-24 ч по данным измерений способом динамического светорассеяния. Природу такого увеличения исследуют, используя с-ТЕМ для определения того, происходит ли агрегация наночастиц, или избыток белка в композиции присоединяется к поверхности частиц, увеличивая размеры частиц. Лиофилизированные наночастицы в ампуле снова растворяют и обрабатывают, используя с-ТЕМ (фиг. 21). Такую же ампулу наночастиц оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 24 ч, затем снова получают изображение (фиг. 22). Исходный образец содержит сферические частицы с распределением по размерам между 25-60 нм. Состаренный образец демонстрирует увеличение распределения по размерам до 35-130 нм но без следов агрегации частиц. Оба
- 17 029706
образца содержат популяцию частиц 1-3 нм, которые соответствуют "свободному" белку. Полученные результаты предполагают, что "свободный" ΗδΑ присоединяется к поверхности наночастиц, находясь в растворе и вызывая медленное увеличение размера частиц. Несколько стратегий можно использовать, чтобы ослабить указанный процесс, включая изменение рН, изменение осмолярности, добавление растворителя и диафильтрацию для удаления избытка белка.
Протокол получения изолятов опухолевых клеток. Безтимусных голых мышей (Сйаг1ез КАег ЬаЬз), с подкожным ксенотрансплантатами, содержащими клеточную линию ΜΌΑ-ΜΒ-231 карциномы молочной железы (5х106 клеток в матригеле), умерщвляют для получения опухолевого изолята. Используя стерильные инструменты в асептических условиях, опухоли удаляют из умерщвленных животных. Опухоль помещают в 50 мл стерильную коническую ампулу и добавляют 5 мл трипсина. Опухоль разрезают на маленькие кусочки и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После инкубирования клеточный уловитель помещают на вторую стерильную 50 мл коническую ампулу и содержание первой ампулы помещают в клеточный уловитель. Ткань продавливают через фильтр, используя плоский конец плунжера шприца. Клеточный уловитель промывают 5 мл среды, содержащей ΤΒδ. Клетки осаждают, используя вращение, и надосадочную жидкость сливают. Клетки снова суспендируют в 20 мл полной среды, содержащей ΡΒδ, и помещают в 75 см колбу. Результаты представлены далее в табл. 1.
Общая процедура для ΜΤδ клеточного анализа. Клетки карциномы человека (2000 клеток/лунку) инкубируют с необходимой концентрацией тестируемых молекул (0-200 мкМ) в течение 72 ч. Затем клетки инкубируют с ΜΤδ раствором (Рготеда) в течение 1-2 ч и влияние соединений на клеточную пролиферацию определяют, измеряя поглощение на 490 нм. Клеточный рост выражают в процентах соответствующего контроля (плацебо). Полученные результаты используют для расчета 1С50 для каждого соединения. Все приведенные результаты представляют собой среднее значение ± δΕ из трех независимых экспериментов. Полученные результаты представлены далее в табл. 1.
Таблица 1
С1 \\ \ СООК-, | МВ-231 (НВС) | Н-460 Щ8СЬС) | ||
Κι | 1С5о (мкМ) | К2 | 1С5о (мкМ) | К2 |
-ОН | 13-16 | 0.88-0.95 | 4-26 | 0.83-0.95 |
-СНз | 66 | 0.95 | 1.2 | 0.9 |
-С4Н9 | 13.3 | 0.91 | 15.73 | 0.9 |
-с6н13 | 43.7 | 0.93 | 7.4 | 0.89 |
-с8н17 | 53.1 | 0.86 | 49 | 0.89 |
-СюН21 | 38.89 | 0.87 | 23.76 | 0.93 |
-Οι2Η25 | 33.3 | 0.78 | 28.8 | 0.69 |
-Οι4Η29 | >200 | 0.83 | 129.9 | 0.87 |
-С15Нз1 | >200 | 0.93 | >200 | 0.66 |
-С4бНзз | >200 | 0.85 | 77.8 | 0.9 |
-С18Н37 | Ν.ϋ. | Ν.ϋ. | 29 |
К2 - коэффициент детерминациию
Вышеприведенные биологические результаты также представлены на фиг. 1. Уровни содержания бендамустина в плазме после введения указанных выше эфиров представлены на фиг. 20.
Эффективность в отношении опухоли.
Процедура для исследования эффективности против опухоли ΜΌΑ-ΜΒ-231 у голых мышей. Безтимусным голым мышам (Сйаг1ез Кгсег ЬаЬз) вводят подкожной инъекцией 5х106 клеток опухоли человека в матригеле. Объем опухоли контролируют до тех пор, пока средний размер опухоли в мышиной популяции не достигает ~150 мм3. Мышей произвольно распределяют в одну из девяти обработанных групп (суммировано в таблице далее) при популяции 10 мышей в группе (п=10). Каждую из лекарственных форм вводят инъекцией в фиксированном объеме 100 мкл в хвостовую вену в 1 и 2 день исследований. Мышей взвешивают и объем опухоли измеряют каждые 3-4 дня в течение 3 недель длительности исследований. Полученные результаты представлены в табл. 2 и на фиг. 2.
- 18 029706
Таблица 2. Суммарные результаты исследований эффективности против опухоли МВ-231 бендамустина (ВМ1), С12 эфира бендамустина и С14 эфира бендамустина: % ингибирования опухоли, % заболеваемости/смертности и уровни содержания в опухоли и в плазме
Процедура исследования эффективности против опухоли Н460 у голых мышей. Н460 опухолевые клетки (крупные клетки рака легких) культивируют в среде КРМ1-1640, содержащей 10% ΡΒ8 и в условиях 95% воздуха и 5% СО2 при 37°С. При достижении 80-90% конфлюентности клетки отделяют, используя 0,25% трипсин-ΕΌΤΑ раствор в течение 5-10 мин, нейтрализуют свежей культуральной средой и подсчитывают, используя счетчик клеток (Се11оше1ег, Аи1о Τ4 Ьу №\се1от). 2х106 клеток/100 мкл раствора в смеси среды и матригеля (отношение 1:1) вводят инъекцией в правый бок каждой пи/пи мыши. Имплантированных мышей контролируют и измеряют, исследуя электрический кронциркуль. Исследования начинают, когда размер опухоли достигает ~150 мм3. Мышей измеряют и произвольно распределяют на 9 групп по 10 мышей в каждой группе в соответствии с данными приведенной далее таблицы.
Эффективность против опухолей в дозированных группах
Соединение | Композиция | Доза (мг/кг свободное основание, экв.) |
Носитель, контроль | Раствор | ΝΑ |
Бендамустин НС1 | ΤΚΕΑΝΌΑ | 37,5 |
С12 эфир бендамустина | Раствор | 55 |
С12 эфир бендамустина | Раствор | 80 |
С12 эфир бендамустина | Наночастицы | 55 |
С12 эфир бендамустина | Наночастицы | 80 |
С12 эфир бендамустина | Наночастицы | 100 |
С14 эфир бендамустина | Раствор | 80 |
С14 эфир бендамустина | Наночастицы | 80 |
Лекарственные формы вводят как дозы объемом 100 мкл инъекцией в хвостовую вену через 30 мин после приготовления лекарственных форм. Всех мышей взвешивают и опухоли измеряют дважды в неделю. В последний день исследований собирают плазму, опухоль, легкие, печень, селезенку, левую почку, мозг и лапы и быстро замораживают для дальнейших исследований через два часа после дозирования. Полученные результаты представлены в табл. 3.
- 19 029706
Таблица 3. Суммирование данных об эффективности против опухоли Н-460 для бендамустина (ВМ1), С12 эфира бендамустина и С14 эфира бендамустина: % ингибирования опухоли, % заболеваемости/смертности и уровни в опухоли и плазме
Уровни через 1 час (нг/мл) | ||||||||
Эфир | ВМ1 | |||||||
мг/кг | % ингиб. опухоли | % заболеваемости/ смертности | Опухоль | Плазма | Опухоль | Плазма | ||
Раствор | ВМ1 | 37.5 | 41.5 | 0/0 | - | - | 1472 | 1550 |
С12 | 55 | 66 | 20/20 | 163 | 12 | 3760 | 6943 | |
С12 | 80 | 75 | 100/50 | 206 | 12 | 5180 | 13600 | |
с14 | 80 | 81 | 100/40 | 8570 | 32233 | 4650 | 24633 | |
Н5А наночастицы | С12 | 55 | 47 | 10/0 | 154 | 0 | 1761 | 4743 |
С-12 | 80 | 64 | 40/0 | 321 | 0 | 2997 | 8053 | |
С12 | 100 | 70 | 50/0 | 437 | 2 | 3565 | 12386 | |
с14 | 80 | 40 | 10/0 | 4570 | 3648 | 1872 | 4467 |
Экспериментальные фармакокинетические исследования.
Процедура для определения эффективности против опухоли для голых мышей РК группы. Часть мышей с опухолью дозируют как спутниковую РК группу. Каждую из групп дозируют, как раскрыто для групп по определению эффективности протии опухоли, однако, мышей в РК группе эвтанизируют и образцы тканей отбирают через 1, 3 и 6 ч после дозирования в день 2. Собирают ткани, включая кровь, легкие, печень и опухоли. Осуществляют анализ образцов для бендамустина НС1 и соответствующих эфирных аналогов, как раскрыто в разделе протокола ЖХ-МС.
ЖХ-МС экспериментальный протокол для РК исследований.
Плазму и другие ткани приготавливают для анализов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)/масс-спектрометрии в соответствии со стандартными протоколами с последующим осаждением белка ацетонитрилом, содержащим внутренний стандарт. Полученные образцы анализируют как для определения бендамустина НС1, так и эфиров бендамустина настоящего изобретения и алпренолола (внутренний стандарт). Образцы тканей гомогенизируют в натрий-фосфатном буфере, и аналитическое значение умножают на 3 для поправки на разбавление в процессе обработки.
Протокол дозирования животных для РК исследований.
Во всех исследованиях используют взрослых животных (Сйаг1ез Ктуег, Кт§з1оп, Νομ Уогк; п=3 или 4 для каждой временной точки). Мышам или крысам не дают голодать в течение ночи перед введением IV дозы в латеральную хвостовую вену. IV дозы вводят в фиксированном объеме доз 100 мкл для мышей или в объеме доз 1 мл/кг для крыс. Мышей умерщвляют обезглавливанием и кровь из туловища собирают в гепаринизированные ампулы в определенные моменты отбора образцов. Для сбора крови каждую крысу (без анестезии) помещают в прозрачную плексигласовую ограничивающую камеру и образцы крови (приблизительно 0,25 мл) отбирают из латеральной хвостовой вены в гепаринизированные пробирки для сбора образцов в определенные моменты времени отбора образцов (примечание: образцов до введения доз не было получено). Исключением для указанной процедуры был последний момент отбора образцов, когда крыс умерщвляют обезглавливанием, и кровь отбирают скорее из туловища, а не из хвостовой вены. Собранные образцы крови помещают на влажный лед до центрифугирования для выделения плазмы. Фракции плазмы переносят в чистые сухие ампулы, замораживают на сухом льду и хранят приблизительно при -20°С в ожидании анализов. Весь мозг и другие сильно перфузированные органы (печень, легкие, селезенку, почки и сердце) быстро извлекают в определенные моменты времени и замораживают в сухом льду. Все образцы тканей также хранят при приблизительно -20°С в ожидании анализов.
Фармакокинетический анализ. Результаты по концентрациям плазмы для всех мышей и крыс вводят в таблицы в формате Ехсе1 для подготовки к фармакокинетическому анализу. Средние фармакокинетические параметры оценивают, используя анализ без учета компартментов (О1Ъа1Ф апй Регпег 1982) концентрации плазмы в зависимости от времени, используя программное обеспечение ^ίηΝοηΙίη зойэдаге (Рго£езз1опа1 νοΓ3ΐοη 4.1, РЬагзщй! Согрогайоп, Ра1о Ά1ΐο, СА). Конечную константу для крыс для исключения из плазмы (β) оценивают, используя линейную регрессию концевой части полулогарифмической кривой концентрации плазмы от времени. Кажущийся конечный период полувыведения (11/2) рассчитывают как 0,693, деленное на β. Площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени с момента ноль до времени последней измеримой концентрации (АИС0-1) после одной дозы определяют, используя линейно-логарифмический метод трапеций. Площадь от нуля до бесконечности (АИС0-да) рассчитывают как сумму АИС0-1 и площади, экстраполированной от последней измеримой концентрации до бесконечности (Класт/β). Предполагают, что все концентрации до дозирования равны нулю для целей расчета АИС. Любую концентрацию, которая выходит за пределы количественных результатов (Вй-О)
- 20 029706
после последнего поддающегося измерению времени отбора образца рассматривают как холостое значение для целей расчета АиС; его рассматривают как ноль для расчета средней концентрации для данного момента отбора образца.
Результаты фармакокинетических исследований представлены в табл. 4-17.
Таблица 4
Плазма | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | С12 эфир | Бендамустин | С12 эфир | |
Τι/2, час | 5,7 | Νϋ | 6, 0 | Νϋ |
АиСо-Е, нг*час/мл | 66885 | Νϋ | 55296 | Νϋ |
АиСо-со, нг*час/мл | 67131 | Νϋ | 55417 | Νϋ |
Данные табл. 4 также изображены на фиг. 8.
Таблица 5
Кровь | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | С12 эфир | Бендамустин | С12 эфир | |
Т1/2, час | 6, 3 | Νϋ | 5,7 | Νϋ |
АиСо-Ъ, нг*час/мл | 91549 | 4424 | 58021 | 951 |
АиСо-“, нг*час/мл | 91856 | Νϋ | 58112 | Νϋ |
Данные табл. 5 также изображены на фиг. 9.
Таблица 6
МОЗГ | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | Οΐ2 эфир | Бендамустин | Οΐ2 эфир | |
Т1/2, час | Νϋ | Νϋ | Νϋ | Νϋ |
АиСо-Ъ, нг*час/мл | 9284 | 299 | 1010 | 149 |
АиСо-“, нг*час/мл | Νϋ | Νϋ | Νϋ | Νϋ |
Данные табл. 6 также изображены на фиг. 10.
Таблица 7
печень | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | С12 эфир | Бендамустин | С12 эфир | |
Т1/2,час | 4,2 | 0,8 | 2,6 | 4,5 |
АиСо-Ч нг*час/мл | 13901 | 2564 | 43785 | 13355 |
АиСо—, нг*час/мл | 14111 | 2586 | 44713 | 13586 |
Данные табл. 7 также изображены на фиг. 11.
Таблица 8
Легкие | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | С12 эфир | Бендамустин | С12 эфир | |
Т1/2, час | 2,0 | 7,6 | 5,1 | 8,5 |
АиСо-Ъ, нг*час/мл | 22229 | 12619 | 15075 | 28327 |
АиСо-со, нг*час/мл | 22286 | 13246 | 15590 | 32297 |
Данные табл. 8 также изображены на фиг. 12.
Таблица 9
Селезенка | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | С12 эфир | Бендамустин | С12 эфир | |
Т1/2, час | 2,3 | 3,1 | 1,6 | 5,4 |
АиСо-Ъ, нг*час/мл | 10201 | 25874 | 2598 | 13111 |
АиСо-“, нг*час/мл | 10362 | 25927 | 2735 | 13578 |
Данные табл. 9 также изображены на фиг. 13.
- 21 029706
Таблица 10
Почки | Жидкая композиция | Композиция наночастиц | ||
Бендамустин | С12 эфир | Бендамустин | С12 эфир | |
Τι/2, час | 6,4 | 5,3 | 7,0 | 4,9 |
АиСо-% нг*час/мл | 19489 | 2383 | 9665 | 1766 |
АиСо-со, нг*час/мл | 19 96 6 | 2605 | 10725 | 1802 |
Данные табл. 10 также изображены на фиг. 14.
Таблица 11. Уровни содержания бендамустина в плазме, крови и органах у крыс
после введения жидкой композиции С12 эфира бендамустина, 30 мг/мл, 1 мл/кг, фиг. 15
Плазма | Кровь | Мозг | Печень | Легкие | Селезенка | Почки | |
Т1/2, час | 5,7 | 6,3 | Νϋ | 4,2 | 2,0 | 2,3 | 6, 4 |
АиСо-% нг*час/мл | 66885 | 91549 | 9284 | 13901 | 22229 | 10201 | 19489 |
АиСо-со, нг*час/мл | 67131 | 91856 | Νϋ | 14111 | 22286 | 10362 | 199 66 |
Данные табл. 11 также изображены на фиг. 15.
Таблица 12. Уровни содержания С12 эфира бендамустина в плазме, крови и органах у крыс
после введения жидкой композиции С12 эфира бендамустина, 30 мг/мл, 1 мл/кг, фиг. 16
Плазма | Кровь | Мозг | Печень | Легкие | Селезенка | Почки | |
Т1/2, час | Νϋ | Νϋ | Νϋ | 0,8 | 7,6 | 3,1 | 5,3 |
АиСо-б, нг*час/мл | Νϋ | 4424 | 299 | 2564 | 12619 | 25874 | 2383 |
АиСо-“, нг*час/мл | Νϋ | Νϋ | Νϋ | 2586 | 13246 | 25927 | 2605 |
Данные табл. 12 также изображены на фиг. 16.
Таблица 13. Уровни содержания бендамустина в плазме, крови и органах у крыс после введения композиции наночастиц С12 эфира бендамустина, 30 мг/мл, 1 мл/кг, фиг. 17
Плазма | Кровь | Мозг | Печень | Легкие | Селезенка | Почки | |
Τι/г, час | 6, 0 | 5,7 | Νϋ | 2,6 | 5,1 | 1,6 | 7,0 |
АИСо-с, нг*час/мл | 55296 | 58021 | 1010 | 43785 | 15075 | 2598 | 9665 |
АИСо—, нг*час/мл | 55417 | 58112 | Νϋ | 44713 | 15590 | 2735 | 10725 |
Данные табл. 13 также изображены на фиг. 17.
Таблица 14. Уровни содержания С12 эфира бендамустина в плазме, крови и органах у крыс после введения композиции наночастиц С12 эфира бендамустина, 30 мг/мл, 1 мл/кг, фиг. 18
Плазма | Кровь | Мозг | Печень | Легкие | Селезенка | Почки | |
Т1/2, час | Νϋ | Νϋ | Νϋ | 4,5 | 8,5 | 5,4 | 4,9 |
АиСо-% нг*час/мл | Νϋ | 951 | 149 | 13355 | 28327 | 13111 | 1766 |
АиСф-^, нг*час/мл | Νϋ | Νϋ | Νϋ | 13586 | 32297 | 13578 | 1802 |
Данные табл. 14 также изображены на фиг. 18.
Таблица 15. Уровни содержания в плазме бендамустина у крыс после введения композиции
наночастиц С12 эфира бендамустина в дозе 3 мг-экв/кг, вв. Сравнение различных композиций, фиг. 19
Состав | ТгеапФа | ΗΞΑ | НЗА/РЪСА | РЪСА/РЕЪА | НЗА м/РЕС |
®1/2, ч | 0,16+0,01 | 0,63+0,09 | 0,41+0,04 | 2,1+0,3 | 1,6+0,3 |
АЛСо-ь, нг*час/мл | 1609+77 | 773+58 | 1120+113 | 856+93 | 1194+186 |
АиСо-», нг*час/мл | 1631+81 | 781+58 | 1132+115 | 959+92 | 1250+203 |
νά, л/кг | 0,42+0,04 | 3,6+0,7 | 1,6+0,2 | 10,0+2,2 | 6,1+1,8 |
СП, мл/мин/кг | 31±2 | 65±5 | 4 6±4 | 54±5 | 4 4±7 |
Среднее ± 5Р, п=4 | Наночастицы С12 эфира бендамустина |
Данные табл. 15 также представлены на фиг. 5.
- 22 029706
Таблица 16. Уровни содержания в плазме С12 эфира бендамустина у крыс после введения композиции наночастиц С12 эфира бендамустина в дозе 3 мг-экв/кг, вв. Сравнение различных композиций, фиг. 20
Еогти1аЫоп | Н5А | НЗА/РЬСА | РЬСА/РЕЬА | Н5А м/РЕС |
У/2, ч | Νϋ | 0,1210,01 | 2,310,0 | 0,2010,01 |
АиСо-ъ, нг*час/мл | 2112 | 1815 | 1713 | 5514 |
АиСо-·, нг*час/мл | Νϋ | 2117 | 3 6±5 | 5 614 |
νά, л/кг | Νϋ | 47115 | 428159 | 23,312,5 |
СЬ, мл/мин/кг | Νϋ | 419411071 | 21091252 | 1335199 |
Среднее ± Ξϋ, п=4 |
Данные табл. 16 также представлены на фиг. 6.
Таблица 17. Уровни содержания в плазме у крыс С16 эфира бендамустина, циклогексилового эфира и 5-деканилового эфира у крыс после введения раствора композиций в дозе 3 мг-экв/кг вв
Бенда- | Эфир | Бенда- | Эфир | Бенда- | Эфир | |
мустин | мустин | мустин | ||||
Плазма | Схб | эфир | 5-деканиловый эфир | Циклогексиловый | ||
бендамустина | эфир бендамустина | |||||
У/2, ч | 0,46 | 0,28 | 0, 16 | 0,20 | ||
АиСо-ъ, | 505 | 1208 | 633 | 504 | ||
нг*час/мл | ||||||
лисо-, | 617 | 1214 | 642 | А11<МфЬ | 517 | А11<МфЬ |
нг*час/мл | ||||||
νά, л/кг | 3,3 | 1,0 | 1,1 | 1,6 | ||
СЬ, | 82 | 41 | 78 | 96 | ||
мл/мин/кг | ||||||
1, | 85% | 1, | 6% | ι,ζ | % | |
растворителя | растворителя | растворителя | ||||
Среднее, п=3 | Разбавления в солевом растворе из 1/1/1 | |||||
БМРА/РС/солитола |
В других вариантах настоящего изобретения, БЕНДАМУСТИН С4 эфир бендамустина приготавливают в виде композиций наночастиц для внутривенного введения в соответствии с раскрытыми выше способами и вводят СО-! мышам. Количество бендамустина (ΒΜΙ) и С14 эфира бендамустина определяют в плазме мышей. Результаты указанных экспериментов суммированы в табл. 18.
Таблица 18
Плазма | ВМ1 | С14 эфир | ВМ1 | Οΐ4 эфир | ΒΜΙ | Οΐ4 эфир |
30 мг-экв/кг | 55 мг-экв/кг | 80 мг-экв/кг | ||||
У/2, ч | 1,17 | 1,52 | 0, 92 | 0, 98 | 0, 95 | 1,09 |
АиСо-6, нг*час/мл | 4507 | 31693 | 4152 | 48934 | 6007 | 46335 |
АиСо—, нг*час/мл | 4524 | 31741 | 4188 | 49020 | 6068 | 46485 |
νά, л/кг | Νϋ | 3,2 | Νϋ | 2,5 | Νϋ | 5,2 |
СЬ, мл/мин/кг | Νϋ | 24 | Νϋ | 29 | Νϋ | 56 |
Среднее, п=3 | Наночастицы альбумина |
Также были тестированы пегилированные эфиры бендамустина. Результаты для РЕС-2000 и РЕО5000 эфиров бендамустина представлены далее в табл. 19 и 20. Эти результаты также представлены на фиг. 19.
- 23 029706
Таблица 19. Уровни содержания в плазме бендамустина у крыс, дозированных как ΡΕΘ-2000 эфир бендамустина, 3 мг-экв/кг, вв, 1 мл/кг
Бендамустин | Крыса 1 | Крыса 2 | Крыса 3 | Крыса 4 | Среднее значение | Станд. отклонение | зет |
+ 1/2, ч | 0,46 | 0,23 | 0,50 | 0, 22 | 0,36 | 0,15 | 0,07 |
АиСо-ъ, нг*час/мл | 2100 | 2866 | 1494 | 1379 | 1960 | 682 | 341 |
АиСо-, нг*час/мл | 2109 | 2868 | 1506 | 1382 | 1966 | 680 | 340 |
νά, л/кг | 0,95 | 0,35 | 1, 46 | 0, 70 | 0,87 | 0,46 | 0,23 |
СЬ, мл/мин/кг | 24 | 17 | 33 | 36 | 28 | 9 | 4 |
РЕС-2000 эфир бендамустина | 3 мг-экв/кг, вв, 1 мл/кг |
Таблица 20. Уровни содержания в плазме бендамустина у крыс, дозированных как ΡΕΘ-5000 эфир бендамустина, 3 мг-экв/кг, вв, 1 мл/кг
Бендамустин | Крыса 1 | Крыса 2 | Крыса 3 | Крыса 4 | Среднее значение | Станд. отклонение | зет |
+ 1/2, ч | 0, 16 | 0, 48 | 0, 47 | 0,48 | 0, 40 | 0,16 | 0,08 |
АиСо-ъ, нг*час/мл | 808 | 1735 | 1572 | 1050 | 1291 | 435 | 217 |
АиСо-, нг*час/мл | 817 | 1741 | 1579 | 1058 | 1299 | 434 | 217 |
νά, л/кг | 0, 84 | 1, 19 | 1,29 | 1,99 | 1,32 | 0,48 | 0,24 |
СЬ, мл/мин/кг | 61 | 29 | 32 | 48 | 42 | 15 | 8 |
РЕС-5000 эфир бендамустина | 3 мг- | экв/кг, | вв, 1 мл/кг |
Анализ ίιι-νίΐΐΌ стабильности эфиров бендамустина.
Получение опухоли 89. Умерщвляют безтимусных голых мышей от Сйаг1е§ Κί+ег ЬаЬ§ с раком молочной железы (МВ-231) или немелкоклеточным раком легких (Н460). Опухоли немедленно удаляют, промывают охлажденным льдом 1,15% КС1. Опухоли взвешивают, нарезают и измельчают. Измельченные ткани смешивают с 4х (об./мас.) охлажденным льдом 8ΕΤ буфером (250 мМ сахарозы, 5,4 мМ Ν/κΙΌΤΑ и 20 мМ трис, рН 7,4) и гомогенизируют, используя гомогенизатор для тканей. Гомогенаты переносят в чистые поликарбонатные ультрацентрифужные ампулы и вращают при 10000 г при 4°С в течение 20 мин. Липид из верхней части ультрацентрифужной ампулы удаляют ватным тампоном и аликвоты надосадочной жидкости (89) хранят в морозильнике при -80°С.
Ιη νϊίΓΟ инкубирование. Инкубационную смесь, содержащую 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), ΝΑΏΡΗ- (восстановленного никотинамид аденозиндифосфата) регенерационную систему и 1 мг/мл опухоли 89 предварительно нагревают на водяной бане при 37°С. Реакцию инициируют, добавляя 1 мкЕд С6, С8, С12 или С14 эфира бендамустина в отдельные инкубационные смеси до получения конечных концентраций каждого из эфиров бендамустина 10 мкМ. В определенные моменты времени, аликвоты по 100 мкл инкубационных смесей отбирают и смешивают с 400 мкл стоп-реагента (4 или 8 мкМ тиагабина [Ι8] в растворе 0,1% муравьиная кислота/ацетонитрил). Все образцы перемешивают при вращении и помещают на лед по крайней мере на 10 мин, и затем белок осаждают центрифугированием в центрифуге Эппендорфа (НррепсклТ 5417К) при 14000 об/мин х 8 мин. Надосадочную жидкость переносят в ампулы ВЭЖХ и 10 мкл вводят инъекцией для анализа, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию в тандеме с масс-спектрометрическим детектированием.
ЖХ-МС/МС способ. Используют систему ЖХ-МС/МС, состоящую из хроматографа 81ιίηκκ1/ιι НРЬС и масспектрометра 8с1е\ ΑΡΙ 4000 М8. Хроматографическую обработку осуществляют на колонке РНепотепе\ 00В-4448-В0, кипа РРР(2) (50х2 мм, 5 мкм размер частиц). Скорость потока подвижной фазы составляет 0,5 мл/мин. Градиентное элюирование начинают с 70% подвижной фазы А (0,1% водной трифторуксусной кислоты) и 30% мобильной фазы В (100% ацетонитрила). Затем долю мобильной фазы
- 24 029706
В линейно повышают до 95% за 0,5 мин и выдерживают указанное соотношение в течение 1,3 мин, восстанавливая равновесие до начальных условий за 1 мин. Масс-спектрометр устанавливают в соответствующем оптимальном режиме для каждого из эфиров бендамустина, регистрируя переходы 442,2/340,1 (С6), 470,2/340,1 (С8), 526,3/340,1 (С12) и 554,3/340,1 (С14).
Результаты исследования ίη νίίτο стабильности представлены далее на фиг. 3 и 4.
Экспериментальная электронная микроскопия.
Подготовка образцов для с-ТЕМ исследований. Образец солюбилизируют, добавляя 7,8 мл воды для инъекций (^ΕΙ) к образу и перемешивают, переворачивая рукой. Смешанный образец быстро растворяется, ~2-5 мин, причем в растворе не остается видимых частиц. Образец хранят в стеклообразном льду на подложке сетчатой углеродной пленки на 400 мешей медной решетке. Образец приготавливают, нанося каплю 3 мкл неразбавленного раствора образца для очистки решетки, удаляя фильтровальную бумагу и немедленно осуществляют остекленение в жидком этане. Решетки хранят в жидком азоте до переноса в электронный микроскоп для получения изображения.
с-ТЕМ параметры получения изображения. Электронную микроскопию осуществляют, используя электронный микроскоп ΕΕΙ Теспа1 Т12, с рабочим напряжением 120 кэВ, снабженный камерой ΕΕΙ Еад1е 4К χ 4К СС1). Решетку переносят в электронный микроскоп, используя криостат, который поддерживает температуру решетки ниже -170°С. Изображения решетки накапливают при множестве шкал для оценки полного распределения образца. После определения потенциально подходящих мишеневых участков для получения изображения при малом увеличении, накапливают изображения с большим увеличением при номинальных увеличениях 52000χ (0,21 нм/пиксель) и 21000χ (0,50 нм/пиксель). Изображения накапливают при номинальной недофокусировке -4 мкм (52000χ) и -5 мкм (21000χ) и электронных дозах -10-15 е/А2.
Результаты экспериментов электронной микроскопии представлены на фиг. 7.
Эксперименты по сшивке композиций эфиров бендамустина с Н8А наночастицами.
Времена циркуляции бендамустина и эфиров бендамустина настоящего изобретения можно продлить, используя лекарственные композиции на основе Н8А наночастиц, в которых белковые фрагменты ковалентно сшиты после образования структур наночастиц. См., например, К. I лицее е1 а1. 1п1еепа11опа1 1оитпа1 о£ РЕагтасеиЕсз 347 (2008) 109-117. Такой подход позволяет обеспечить большее количество структур с поверхностным покрытием, дает возможность предотвратить быстрое высвобождение содержания наночастиц. Это может также обеспечить "малозаметную" защиту наночастиц за счет введения РЕО группы в сшивающий агент. Эффективное инкапсулирование и отверждение Н8Л наночастиц демонстрируют, используя коммерчески доступный диальдегид, глутаральдегид. Введение соответствующего размера РЕО фрагмента можно осуществить, используя, например, трехфункциональный РЕО сшивающий агент, который получают, как показано далее:
Процедура. Н8А наночастицы разбавляют деионизированной водой до концентрации 1,5 мг/мл С14 эфира бендамустина, что соответствует концентрации 6 мг/мл Н8А. Затем отбирают аликвоты полученной суспензии наночастиц и помещают их 1 мл порциями в пять стеклянных ампул, снабженных магнитной мешалкой. В каждую ампулу добавляют соответствующее количество 50% глутаральдегидного раствора и каждую ампулу закрывают и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем каждый образец разбавляют 1 к 10 Ν-метилпирролидоном (ΝΜΡ) и образец вращают в течение ~2 мин, используя микроцентрифугу для удаления Н8А и сшитых Н8А наночастиц. Затем надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ и определяют концентрацию (площадь пика) С14 эфира бен- 25 029706
дамустина для подтверждения инкапсулирования наночастиц. В приведенной далее таблице представлены концентрации неинкапсулированного С14 эфира бендамустина как функция мкл глутаральдегида.
Представленные результаты показывают, что добавление глутаральдегида в количестве 3,33 мкл/мг I ΙδΛ соответствует результатам в системе сшитых наночастиц, содержащих эфир бендамустина.
Ιη νίνο модель множественной миеломы.
Материалы и способы.
КРМ1 8226 (человеческая плазмацитома, В клетки миеломы) АТСС №ССЬ-155;
ЕСМ Гель (Ма1п§е1), 51§та-АШпей, Са1 №Е1270, 5 мл;
КРМ1 (ВеП Наетек, лот: 1110235);
Уе1еабе® (Бог^отЛ) 3,5 мг лиофилизированные в ампуле, лот №ΒΙΖδϋ00;
Бендамустин (лот №ΤΠ-Ώ0815, АР1 лот №00039Р0012);
Наночастицы С12 эфира бендамустина (Ο12ΝΡ), лот №2861-242-22, 17,6 мг/в ампуле;
Хлорид натрия;
Вода для инъекций (0ЕМ0 δ.Λ.).
Тестируемые животные.
80 самок мышей СВ.17 δΟΙλ возраста 4-6 недель, 16-20 г, полученные из центра выращивания Наг1ап ашта1.
Клеточный препарат.
Клетки (полученные из АТСС) культивируют в КРМ1 среде. Клеточную суспензию центрифугруют и снова суспендируют в смеси 50% Μаί^^§е1/НБδδ до конечной концентрации 7х107 клеток/мл. Полученную суспензию имплантируют подкожно в правый бок анестезированной мыши в объеме 100 мкл.
Получение соединений.
УЕЕСАОЕ® приготавливают раз в неделю. 7 мл солевого раствора добавляют в исходную ампулу, содержащую 3,5 мг порошка, получая 0,5 мг/мл. 3 мл указанного раствора добавляют к 27 мл солевого раствора, получая концентрацию 0,05 мг/мл.
Получение бендамустина: 13,5 мг растворяют в 3,6 мл смеси 1:1 смесь 0,9% солевой раствор/5% маннит непосредственно перед обработкой. 1,05 мл полученного раствора добавляют к 0,95 мл растворителя для получения раствора 2 мг/мл.
Получение Ε12ΝΡ: 3,1 мл δ^ΡΙ добавляют в ампулу с образцом, содержащую 17,62 мг, непосредственно перед обработкой. 1,05 мл полученного раствора добавляют к 0,95 мл разбавителя для получения раствора 2 мг/мл.
Схема эксперимента.
Мышам подкожно имплантируют 7х106 КРМ1 8226 клеток/мышь (в 50% Μа^ΐ^§е1/НБδδ) в день 0. В 21 день мышей сортируют по оптимальному среднему объему опухоли (~150 мм3) и разделяют на восемь групп по 9 мышей в каждой.
Гр. | N | Агент | Способ | Доза/схема |
1 | 9 | ИИ | вв | День 1 и 2 |
2 | 9 | Уе1сас1е | вв | 0,5мг/кг раз в 2 недели |
3 | 9 | Бендамустин | вв | 20 мг/кг в день 1 и 2 |
4 | 9 | Бендамустин | вв | 37,5 мг/кг в день 1 и 2 |
5 | 9 | Ο12ΝΡ | вв | 20 мг/кг в день 1 и 2 |
б | 9 | Ο12ΝΡ | вв | 37,5 мг/кг в день 1 и 2 |
Следует заметить, что природа δϋΙΏ мышей (т.е. мышей с серьезно нарушенным иммунитетом) делает их более слабыми/восприимчивыми животными, и поэтому менее способными выдержать дозы ϋ12ΝΡ, которые используют для безтимусных мышей (у которых сравнительно менее нарушен иммунитет). Конкретно, дозирование δϋΙΏ мышей в дозе 100 и 70 мг/кг выявило неприемлемые проблемы толерантности (т.е. потерю более 20% массы)(результаты не представлены). Считают, что это (различие толерантности у безтимусных и δϋΙΏ мышей) является феноменом, зависящим от штамма. Таким образом, исследования проводили, используя дозы 37,5 и 20 мг/кг ϋ12ΝΡ.
Статистический анализ.
Объем опухоли рассчитывают следующим образом:
- 26 029706
[ширина)
ях1 2 I хдлина
Анализ увеличения массы и увеличения объема опухоли проводят, используя однофакторный дисперсионный анализ с последующими апостериорными сравнениями Токи.
Результаты.
Реакции на обработку суммированы на фиг. 23 и 24. Все обработки, за исключением Ο12ΝΡ 20 мг/кг, значительно ингибируют рост опухоли по сравнению с контрольной группой (см. результаты в табл. 21). В дозах 37,5 мг/кг эффективности бендамустина и Ο12ΝΡ были аналогичными, с 81 и 70% ингибирования роста опухоли. Однако, как видно на фиг. 24, переносимость Ο12ΝΡ была выше, чем для бендамустина, о чем свидетельствует меньшая потеря массы у животных, которых обрабатывали Ο12ΝΡ.
Таблица 21. Суммарные результаты (день 46)
Соединение | Схема | средний объем опухоли (среднее! зе) | %ТС1 | №РК | №СК | Макс. ВУУ (среднее) уменьшение | №ΤΚϋ | № η ΤΚϋ |
1. Носитель | вв вдень 1 и2 | 597 ± 71 | ||||||
2. Уе1сас1е® 0,5 мг/кг | вв дважды в неделю | 226 ± зе | 62*** | 0 | 0 | -0,4% 4ау20 | 0 | 0 |
3 Бендамустин 20 мг/кг | вввдень1 и 2 | 205 ±44 | 66* | 0 | 0 | -2,7% <1ау22 | 0 | 0 |
4. Бендамустин 37,5 мг/кг | вввдень 1 и 2 | 113±23 | 81*** | 0 | 0 | -6,2% 4ау25 | 0 | 0 |
5. Ο12ΝΡ 20 мг/кг | вв в день 1 и 2 | 408 ±49 | 32 | 0 | 0 | -1,5% 4ау25 | 0 | 0 |
6. Ο12ΝΡ 37,5 мг/кг | вв в день 1 и2 | 180 ±31 | 70*** | 0 | 0 | -3,1% 0ау25 | 0 | 0 |
*** р < 0.001 (однофакторный дисперсионный анализ Лпоуа, апостериорный критерий Тикеу)
1. Соединение формулы I
Claims (36)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯгде К1 представляет собой С8-С24алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
- 2. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С10-С24алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
- 3. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С12-С24алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
- 4. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С14-С24алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
- 5. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С16-С24алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
- 6. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С18-С24алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
- 7. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С10алкил, или его фармацевтически приемлемаясоль.
- 8. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С15алкил, или его фармацевтически приемлемаясоль.
- 9. Соединение по п.1, где К1 представляет собой С18алкил, или его фармацевтически приемлемаясоль.
- 10. Соединение по п.1, где соединение формулы I представляет собой- 27 029706или его фармацевтически приемлемая соль.
- 11. Соединение по п.1, где соединение формулы I представляет собойили его фармацевтически приемлемая соль.
- 12. Соединение по п.1, где соединение формулы I представляет собойили его фармацевтически приемлемая соль.
- 13. Фармацевтическая композиция для лечения хронической лимфоцитарной лейкемии, болезни Ходжкина, индолентной неходжскинской лимфомы, агрессивной неходжскинской лимфомы, множественной миеломы, острой лимфоцитарной лейкемии, рака молочной железы, рака легких, саркомы, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, рака яичек, меланомы, глиобластомы, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака яичников или рака простаты, включающая соединение в соответствии с формулой ΙΑгде К представляет собой С8-С24алкил или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
- 14. Фармацевтическая композиция по п.13, где К представляет собой С10-С24алкил.
- 15. Фармацевтическая композиция по п. 13, где К представляет собой С^алкил.
- 16. Фармацевтическая композиция по п.13, где К представляет собой С^алкил.
- 17. Фармацевтическая композиция по п.13, где К представляет собой С^алкил.
- 18. Фармацевтическая композиция по п.13, где К представляет собой С^алкил.
- 19. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-18, где фармацевтически приемлемый носитель содержит альбумин.
- 20. Фармацевтическая композиция по п.19, где соединение формулы (I) и альбумин составлены в виде наночастиц.
- 21. Фармацевтическая композиция по п.20, где наночастицы имеют средний размер частиц около 248 нм или менее.
- 22. Фармацевтическая композиция по п.19, где массовое отношение альбумина к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 2 до примерно 4.
- 23. Фармацевтическая композиция по п.19, где альбумин представляет собой альбумин сыворотки человека.
- 24. Фармацевтическая композиция по п.13, где фармацевтическая композиция находится в твердой форме.
- 25. Фармацевтическая композиция по п.13, где фармацевтическая композиция находится в жидкой форме.
- 26. Фармацевтическая композиция по п.25, где фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для внутривенного введения нуждающемуся пациенту.
- 27. Способ лечения хронической лимфоцитарной лейкемии, болезни Ходжкина, индолентной не- 28 029706ходжскинской лимфомы, агрессивной неходжскинской лимфомы, множественной миеломы, острой лимфоцитарной лейкемии, рака молочной железы, рака легких, саркомы, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, рака яичек, меланомы, глиобластомы, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака яичников и рака простаты у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, вклю-где К1 представляет собой С8-С24алкил, или его фармацевтически приемлемой соли, и носитель.
- 28. Способ по п.27, где рак находится в виде солидной опухоли.
- 29. Способ по п.28, где рак представляет собой саркому, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак яичек, меланому, глиобластому, рак прямой кишки, рак головы и шеи, рак яичников, рак простаты, рак молочной железы или рак легких.
- 30. Способ по п.27, отличающийся тем, что рак находится в виде несолидной опухоли.
- 31. Способ по п.30, где рак представляет собой хроническую лимфоцитарную лейкемию, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому или острую лимфоцитарную лейкемию.
- 32. Способ по любому из пп.27-31, где К1 представляет собой С10-С24алкил.
- 33. Способ по любому из пп.27-31, где К1 представляет собой С10алкил.
- 34. Способ по любому из пп.27-31, где К1 представляет собой С12алкил.
- 35. Способ по любому из пп.27-31, где К1 представляет собой С14алкил.
- 36. Способ по любому из пп.27-31, где К1 представляет собой С16алкил.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261725213P | 2012-11-12 | 2012-11-12 | |
US201361776951P | 2013-03-12 | 2013-03-12 | |
PCT/US2013/069550 WO2014075035A1 (en) | 2012-11-12 | 2013-11-12 | Bendamustine derivatives and methods of using same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201590925A1 EA201590925A1 (ru) | 2015-09-30 |
EA029706B1 true EA029706B1 (ru) | 2018-05-31 |
Family
ID=49667594
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201590925A EA029706B1 (ru) | 2012-11-12 | 2013-11-12 | Сложные алкиловые эфиры бендамустина и способы их применения |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US9452988B2 (ru) |
EP (1) | EP2917183A1 (ru) |
JP (1) | JP6262246B2 (ru) |
KR (1) | KR20150086308A (ru) |
AR (1) | AR093457A1 (ru) |
AU (1) | AU2013342015B2 (ru) |
BR (1) | BR112015010501A2 (ru) |
CA (1) | CA2890462A1 (ru) |
CL (1) | CL2015001246A1 (ru) |
EA (1) | EA029706B1 (ru) |
HK (2) | HK1215701A1 (ru) |
IL (1) | IL238662A (ru) |
MX (1) | MX2015005805A (ru) |
PH (1) | PH12015501024A1 (ru) |
SG (1) | SG11201503560TA (ru) |
TW (1) | TWI598341B (ru) |
WO (1) | WO2014075035A1 (ru) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LT3205654T (lt) | 2010-05-20 | 2019-05-27 | Array Biopharma, Inc. | Makrocikliniai junginiai kaip trk kinazės slopikliai |
CA2890462A1 (en) | 2012-11-12 | 2014-05-15 | Ignyta, Inc. | Bendamustine derivatives and methods of using same |
WO2014164957A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Cephalon, Inc. | Nanoparticulate and macroparticulate formulations |
CA2992586A1 (en) | 2015-07-16 | 2017-01-19 | Array Biopharma, Inc. | Substituted pyrazolo[1,5-a]pyridine compounds as ret kinase inhibitors |
EP3484519A1 (en) * | 2016-07-13 | 2019-05-22 | Cephalon, Inc. | Pharmaceutical prodrugs and methods of their preparation and use |
JOP20190077A1 (ar) | 2016-10-10 | 2019-04-09 | Array Biopharma Inc | مركبات بيرازولو [1، 5-a]بيريدين بها استبدال كمثبطات كيناز ret |
TWI704148B (zh) | 2016-10-10 | 2020-09-11 | 美商亞雷生物製藥股份有限公司 | 作為ret激酶抑制劑之經取代吡唑并[1,5-a]吡啶化合物 |
WO2018136661A1 (en) | 2017-01-18 | 2018-07-26 | Andrews Steven W | SUBSTITUTED PYRAZOLO[1,5-a]PYRAZINE COMPOUNDS AS RET KINASE INHIBITORS |
WO2018136663A1 (en) | 2017-01-18 | 2018-07-26 | Array Biopharma, Inc. | Ret inhibitors |
JOP20190213A1 (ar) | 2017-03-16 | 2019-09-16 | Array Biopharma Inc | مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1 |
TWI791053B (zh) | 2017-10-10 | 2023-02-01 | 美商亞雷生物製藥股份有限公司 | 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之結晶形式及其醫藥組合物 |
TW202410896A (zh) | 2017-10-10 | 2024-03-16 | 美商絡速藥業公司 | 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之調配物 |
WO2019143991A1 (en) | 2018-01-18 | 2019-07-25 | Array Biopharma Inc. | SUBSTITUTED PYRAZOLO[3,4-d]PYRIMIDINE COMPOUNDS AS RET KINASE INHIBITORS |
TWI802635B (zh) | 2018-01-18 | 2023-05-21 | 美商亞雷生物製藥股份有限公司 | 作為ret激酶抑制劑之經取代吡咯并[2,3-d]嘧啶化合物 |
CA3087972C (en) | 2018-01-18 | 2023-01-10 | Array Biopharma Inc. | Substituted pyrazolyl[4,3-c]pyridinecompounds as ret kinase inhibitors |
KR102653681B1 (ko) | 2018-07-31 | 2024-04-03 | 록쏘 온콜로지, 인코포레이티드 | (s)-5-아미노-3-(4-((5-플루오로-2-메톡시벤즈아미도)메틸)페닐)-1-(1,1,1-트리플루오로프로판-2-일)-1h-피라졸-4-카르복스아미드의분무-건조된 분산물 및 제제 |
CA3111984A1 (en) | 2018-09-10 | 2020-03-19 | Array Biopharma Inc. | Fused heterocyclic compounds as ret kinase inhibitors |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010063493A1 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Astellas Deutschland Gmbh | Oral dosage forms of bendamustine |
EP2468716A1 (de) * | 2010-12-22 | 2012-06-27 | Heraeus Precious Metals GmbH & Co. KG | Prozess zur Herstellung von Bendamustinalkylester, Bendamustin sowie Derivaten davon |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5681964A (en) * | 1990-10-23 | 1997-10-28 | University Of Kentucky Research Foundation | Permeable, non-irritating prodrugs of nonsteroidal and steroidal agents |
US5834025A (en) | 1995-09-29 | 1998-11-10 | Nanosystems L.L.C. | Reduction of intravenously administered nanoparticulate-formulation-induced adverse physiological reactions |
US7089218B1 (en) | 2004-01-06 | 2006-08-08 | Neuric Technologies, Llc | Method for inclusion of psychological temperament in an electronic emulation of the human brain |
US8853260B2 (en) | 1997-06-27 | 2014-10-07 | Abraxis Bioscience, Llc | Formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof |
WO2002043663A2 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Enzon, Inc. | Tetrapartate prodrugs |
WO2003086369A2 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Valorisation-Recherche, Societe En Commandite | Stealthy polymeric biodegradable nanospheres and uses thereof |
CN104587479A (zh) | 2002-12-09 | 2015-05-06 | 阿布拉西斯生物科学有限责任公司 | 组合物和传递药剂的方法 |
US8436190B2 (en) * | 2005-01-14 | 2013-05-07 | Cephalon, Inc. | Bendamustine pharmaceutical compositions |
PT1853250E (pt) | 2005-02-18 | 2012-02-03 | Abraxis Bioscience Llc | Combinações e modos de administração de agentes terapêuticos e terapia de combinação |
DE102005062440B4 (de) * | 2005-12-27 | 2011-02-24 | Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag | Proteinbasiertes Trägersystem zur Resistenzüberwindung von Tumorzellen |
CN101878024B (zh) * | 2007-11-28 | 2014-04-09 | 塞拉特药物股份有限公司 | 改良的紫杉烷递送系统 |
AR072777A1 (es) | 2008-03-26 | 2010-09-22 | Cephalon Inc | Formas solidas de clorhidrato de bendamustina |
CN104224703A (zh) * | 2008-09-25 | 2014-12-24 | 赛福伦公司 | 苯达莫司汀的液体配制品 |
WO2010037142A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | The Corporation Of Mercer University | Nanospheres encapsulating bioactive material and method for formulation of nanospheres |
EP2346836B1 (en) * | 2008-10-08 | 2018-03-07 | Cephalon, Inc. | Processes for the preparation of bendamustine |
JP6209446B2 (ja) | 2010-06-02 | 2017-10-04 | アステラス ドイチュランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ベンダムスチンの経口投与形 |
TWI455722B (zh) | 2010-06-04 | 2014-10-11 | Pfizer Vaccines Llc | 用於預防或治療菸鹼成癮之共軛體 |
CN101966158A (zh) | 2010-09-28 | 2011-02-09 | 上海丽思化工科技有限公司 | 一种注射用盐酸苯达莫司汀冻干粉针剂及其制备方法 |
WO2012059935A1 (en) | 2010-11-01 | 2012-05-10 | Shilpa Medicare Limited | Process for preparing bendamus tine hydrochloride monohydrate |
US9427477B2 (en) | 2011-05-09 | 2016-08-30 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Cancer treatments |
US9308276B2 (en) | 2011-05-17 | 2016-04-12 | University Of South Alabama | Combination therapy for treatment of cancer |
CN104011029B (zh) | 2011-09-26 | 2016-06-08 | 费森尤斯卡比肿瘤学有限公司 | 一种制备盐酸苯达莫司汀的改进方法 |
DK2656843T3 (en) | 2012-04-26 | 2015-04-20 | Helmut Schickaneder | Esters of bendamustine and related compounds, and medical use thereof |
RU2695383C2 (ru) | 2012-06-19 | 2019-07-23 | Синбиас Фарма АГ | Производные бендамустина, родственные соединения и их медицинское применение для лечения рака |
WO2014025890A1 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | University Of North Texas Health Science Center | Drug delivery vehicle comprising conjugates between targeting polyamino acids and fatty acids |
CA2890462A1 (en) * | 2012-11-12 | 2014-05-15 | Ignyta, Inc. | Bendamustine derivatives and methods of using same |
-
2013
- 2013-11-12 CA CA2890462A patent/CA2890462A1/en not_active Abandoned
- 2013-11-12 JP JP2015541995A patent/JP6262246B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-12 SG SG11201503560TA patent/SG11201503560TA/en unknown
- 2013-11-12 US US14/442,088 patent/US9452988B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-12 MX MX2015005805A patent/MX2015005805A/es unknown
- 2013-11-12 EP EP13795940.9A patent/EP2917183A1/en not_active Withdrawn
- 2013-11-12 EA EA201590925A patent/EA029706B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-11-12 AU AU2013342015A patent/AU2013342015B2/en not_active Ceased
- 2013-11-12 AR ARP130104160A patent/AR093457A1/es unknown
- 2013-11-12 BR BR112015010501A patent/BR112015010501A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-11-12 TW TW102140964A patent/TWI598341B/zh not_active IP Right Cessation
- 2013-11-12 KR KR1020157015682A patent/KR20150086308A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-11-12 WO PCT/US2013/069550 patent/WO2014075035A1/en active Application Filing
-
2015
- 2015-04-29 US US14/699,965 patent/US9150517B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-05-06 IL IL238662A patent/IL238662A/en not_active IP Right Cessation
- 2015-05-07 PH PH12015501024A patent/PH12015501024A1/en unknown
- 2015-05-08 CL CL2015001246A patent/CL2015001246A1/es unknown
- 2015-05-13 US US14/711,747 patent/US9149464B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-09-28 US US14/868,278 patent/US20160016912A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-01-06 HK HK16100090.1A patent/HK1215701A1/zh unknown
- 2016-01-27 HK HK16100891.2A patent/HK1212977A1/zh unknown
- 2016-06-16 US US15/184,968 patent/US9630926B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-03-10 US US15/456,439 patent/US9913827B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-01-24 US US15/879,130 patent/US20180147186A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010063493A1 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Astellas Deutschland Gmbh | Oral dosage forms of bendamustine |
EP2468716A1 (de) * | 2010-12-22 | 2012-06-27 | Heraeus Precious Metals GmbH & Co. KG | Prozess zur Herstellung von Bendamustinalkylester, Bendamustin sowie Derivaten davon |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA029706B1 (ru) | Сложные алкиловые эфиры бендамустина и способы их применения | |
JP7032583B2 (ja) | アルギナーゼ活性を阻害する組成物及び方法 | |
JP7018949B2 (ja) | アルギナーゼ活性を阻害するための組成物及び方法 | |
KR102533599B1 (ko) | 단백질 티로신 포스파타제 억제제 및 이의 사용 방법 | |
JP2019508371A (ja) | 薬剤の細胞内送達のための化合物および組成物 | |
CN115175894B (zh) | 纳米材料 | |
CN112672744B (zh) | 抑制二氢乳清酸脱氢酶的方法和组合物 | |
JP2012522790A (ja) | 組成物および使用の方法 | |
BR122023025347A2 (pt) | Sal de meglumina ou trometamina de um composto, formas cristalinas e formulações farmacêuticas dos mesmos e seus usos | |
WO2021150885A1 (en) | Cannabinoid derivatives | |
JP2022517740A (ja) | サイクリン依存性キナーゼ7のインヒビターおよびそれらの使用 | |
JP2023016867A (ja) | トランス-[テトラクロロビス(1h-インダゾール)ルテニウム酸(iii)]及びその組成物の製造 | |
WO2015117136A1 (en) | Boronic acid esters and pharmaceutical formulations thereof | |
KR20230153952A (ko) | 지질 나노입자 | |
EP3478288A1 (en) | Method of treating immunoglobulin light chain amyloidosis | |
KR20230154402A (ko) | 이온화 가능한 지질 화합물 | |
TWI786579B (zh) | 包含藥物二聚體的奈米粒子及其用途 | |
JP2021514955A (ja) | プロテアソーム関連ユビキチン受容体rpn13機能を阻止する低分子およびその使用法 | |
CN102149432A (zh) | 用于治疗癌症的有机砷化合物和方法 | |
TW201922690A (zh) | 環-amp反應元素結合蛋白的抑制劑 | |
JP2012515171A (ja) | 組成物および使用の方法 | |
DE10201228A1 (de) | 10-Benzyliden-9(10H)anthracenone als neue Inhibitoren der Tubulinpolymerisation | |
JP2009527466A (ja) | ファルネシルジベンゾジアゼピノンの結晶形 | |
KR20130130802A (ko) | 보르트만닌 유사체의 결정질 형태의 조성물 및 이의 사용 방법 | |
EP4241837A2 (en) | Nicotinamide mononucleotide derivatives in the treatment and prevention of sickle cell disease |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU |