KR101722794B1 - 약물 전달을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표면-변형 입자 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 표면-변형 입자는 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 여기에서 입자 코어는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 하기 화학식 I을 가진 계면활성제 또는 그의 염을 포함하며, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
<화학식 I>

Description

약물 전달을 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR DRUG DELIVERY}
본 발명은 일반적으로 코팅된 입자를 포함한 조성물 및 표적 약물 전달을 위한 이러한 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
통합적으로 여기에서 "입자"로서 언급되는 나노입자 (나노구 포함) 및 마이크로입자 (마이크로구 포함)는 약 1 nm 내지 약 10,000 nm (10 마이크로미터), 바람직하게는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm (2 마이크로미터)의 직경을 가진 고체 또는 반-고체 입자이다. 이러한 입자는 단백질, 합성 중합체, 다당류, 핵산, 소 분자 및 이들의 조합을 포함하는 다양한 물질로부터 형성될 수 있고, 많은 상이한 응용, 주로 분리, 진단 및 약물 전달에 사용되어 왔다.
이러한 입자를 포함하는 조성물은 약물 전달에 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 미국 특허 공보 2006/0073199는 활성 약제를 포함하는 입자가 수성 현탁액으로서 제형될 수 있고, 입자 위 또는 입자 주위에 계면활성제 코팅물을 제공함으로써 응집 및 입자 성장에 대해 안정화된다는 것을 개시하고 있다.
입자를 포함한 조성물 및 조성물의 제조 및 사용, 특히 주된 약물을 전달함에 있어서 사용 방법을 개발하는 것에 대한 요구가 계속되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 측면은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 표면-변형 입자에 관한 것이다. 입자 코어는 활성 약제, 예컨대 치료제 또는 진단제 (예, 작은 유기 분자 또는 생체거대분자)를 포함한다. 코팅물은 하기 화학식 I을 가진 계면활성제 또는 그의 염을 포함한다.
<화학식 I>
Figure 112011099292333-pct00001
[상기 식에서, n 및 m은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고; R1, R2 및 R3은 C1-C8 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R4 및 R5는 C6-C40 알킬, C6-C40 알케닐, C6-C40 알키닐, C(=O)(C5-C39 알킬), C(=O)(C5-C39 알케닐) 및 C(=O)(C5-C39 알키닐)로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다]
본 발명에 따른 표면-변형 입자는 일반적으로 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 표면-변형 입자의 세포 흡수를 증진시키기에 충분한 조건 하에서 세포를 표면-변형 입자와 접촉시키는 것을 포함한다. 입자는 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 여기에서 입자 코어는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다. 이러한 방법은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 활성 약제의 세포내 흡수를 증진시키는 각각의 방법은 생체외, 즉 수술 또는 요법에 의한 인체 또는 동물체의 어떠한 처리 없이 수행될 수도 있다. 대안적으로, 본 발명의 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키는 방법은 또한 생체내에서 수행될 수 있다. 세포는 대식 세포, 단핵구, 과립구, 무과립구, 호중구 및 이들의 조합과 같은 포식 세포일 수도 있다. 추가로, 세포는 종양 세포일 수도 있다.
본 발명의 다른 측면은 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키기 위한 약제의 제조에서 다수의 세포-변형 입자의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키는 데 사용하기 위한 다수의 세포-변형 입자에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 염증성 질병 또는 질환을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 질병 또는 질환을 가진 대상체의 치료 방법에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-염증제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 가지며, 상기 투여가 상기 염증성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다.
본 발명의 다른 측면은, 염증성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 약제의 제조에서 다수의 표면-변형 입자의 용도에 관한 것이며, 여기에서 약제가 염증성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 표면-변형 입자를 포함하고, 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-염증제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 염증성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 다수의 표면-변형 입자 또는 그의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-염증제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 증식성 질병 또는 질환을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 증식성 질병 또는 질환을 가진 대상체의 치료 방법에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-신생물제와 같은 항-증식제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖고, 상기 투여가 증식성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다.
본 발명의 다른 측면은 증식성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 약제의 제조에서 다수의 표면-변형 입자의 용도에 관한 것이며, 여기에서 약제가 증식성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 표면-변형 입자를 포함하고, 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 관련된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-신생물제와 같은 항-증식제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 증식성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 다수의 표면-변형 입자 또는 그의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-신생물제와 같은 항-증식제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 감염성 질병 또는 질환을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 감염성 질병 또는 질환을 가진 대상체의 치료 방법에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-감염제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 가지며, 상기 투여가 상기 감염성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다.
본 발명의 다른 측면은, 감염성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 약제의 제조에서 다수의 표면-변형 입자의 용도에 관한 것이며, 여기에서 약제가 감염성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 표면-변형 입자를 포함하고, 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 관련된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-감염제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 감염성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 다수의 표면-변형 입자 또는 그의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-감염제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 신경변성 질병 또는 질환을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 신경변성 질병 또는 질환을 가진 대상체의 치료 방법에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-신경변성제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖고, 상기 투여가 신경변성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다.
본 발명의 다른 측면은 신경변성 질병 또는 질환의 치료를 위해 사용되는 약제의 제조에서 다수의 표면-변형 입자의 용도에 관한 것이고, 여기에서 약제는 신경변성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 표면-변형 입자를 포함하고, 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-신경변성제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 입자를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 신경변성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 다수의 표면-변형 입자 또는 그의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제 (예, 항-신경변성제)를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 대상체에게 질병 또는 염증 부위를 가진 체강 내에 투여하는 것을 포함하는 감염성 질병 또는 질환, 염증성 질병 또는 질환, 신경변성 질병 또는 질환, 또는 증식성 질병 또는 질환을 가진 대상체의 치료 방법에 관한 것이며, 여기에서 입자 코어가 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 가지며, 상기 투여가 상기 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다.
본 발명의 다른 측면은, 감염성 질병 또는 질환, 염증성 질병 또는 질환, 신경변성 질병 또는 질환, 또는 증식성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 약제의 제조에서 다수의 표면-변형 입자의 용도에 관한 것이며, 여기에서 약제는 상기 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 표면-변형 입자를 포함하고, 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 다른 측면은, 감염성 질병 또는 질환, 염증성 질병 또는 질환, 신경변성 질병 또는 질환, 또는 증식성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 다수의 표면-변형 입자 또는 그의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 표면-변형 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하고, 입자 코어가 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
각각의 상기 언급된 치료 방법은, 표면-변형 입자가 체강 내에 위치한 질병 세포 또는 염증 세포에 의해 흡수될 수 있도록, 대상체의 표적 조직에 표면-변형 입자를 전달하기 위한 세포 수송을 사용함으로써, 또는 대상체에서 질병 부위 (예, 암, 감염) 및/또는 염증을 가진 체강 내에 표면-변형 입자를 국소 투여함으로써 실행될 수 있다.
도 1은 오레곤 그린 (Oregon Green)으로 표식된 DSPE-mPEG2000/폴록사머 188-코팅 파클리탁셀 입자 (DOTAP 없음) 및 오레곤 그린으로 표식된 DOTAP-코팅 파클리탁셀 입자 (DOTAP)의 흡수를 나타내는 그래프를 제공한다.
도 2는 DSPE-mPEG2000/폴록사머 188-코팅 파클리탁셀 입자 (DSPE-mPEG2000/폴록사머 188), 오레곤 그린으로 표식되고 3개월 동안 보관된 DOTAP-코팅 파클리탁셀 입자 (DOTAP 샘플 1), 오레곤 그린으로 표식된 새로 제조된 DOTAP-코팅 파클리탁셀 입자 (DOTAP 샘플 2), 및 오레곤 그린으로 표식된 프로타민-코팅 파클리탁셀 입자 (프로타민)의 흡수를 나타내는 그래프를 제공한다.
도 3은 DSPE-mPEG2000/폴록사머 188-코팅 파클리탁셀 입자의 흡수를 나타내는 그래프를 제공한다. 오레곤 그린 코팅된 입자는 DOTAP를 함유하거나 DOTAP를 함유하지 않았다 (DOTAP 없음). 파클리탁셀 입자에 세포를 노출하기 전에 세포를 1, 2 또는 6일 동안 배양하였다.
도 4는 오레곤 그린으로 표식된 DSPE-mPEG2000/폴록사머 188-코팅 파클리탁셀 입자 (DSPE-mPEG2000/폴록사머 188), 오레곤 그린으로 표식된 DOTAP-코팅 파클리탁셀 입자 (DOTAP/DSPE-mPEG2000/폴록사머 188), 오레곤 그린으로 표식된 폴리락트-코-글리콜산-코팅 파클리탁셀 입자 (PLGA/폴록사머 188), 및 오레곤 그린으로 표시된 포스파티딜세린-코팅 파클리탁셀 입자 (PS/DSPE-mPEG2000/폴록사머 188)의 흡수를 나타내는 그래프를 제공한다.
도 5는 오레곤 그린으로 표식된 DSPE-mPEG2000/폴록사머 188-코팅 파클리탁셀 입자 (DSPE-mPEG2000/폴록사머 188), 오레곤 그린으로 표식된 DOTAP-코팅 파클리탁셀 입자 (DOTAP/DSPE-mPEG2000/폴록사머 188), 및 오레곤 그린으로 표식된 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드-코팅 파클리탁셀 입자 (CTAB/DSPE-mPEG2000/폴록사머 188)의 흡수를 나타내는 그래프를 제공한다.
본 발명은 많은 상이한 형태의 실시양태가 가능하다. 여기에 개시된 바람직한 실시양태는 본 발명의 원리의 일례로 간주되어야 하고, 따라서 본 발명의 넓은 측면을 예시된 실시양태로 제한해서는 안 된다.
본 발명의 하나의 측면은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 표면-변형 입자를 제공한다. 입자 코어는 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 전형적으로 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 하기 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다.
<화학식 I>
Figure 112011099292333-pct00002
[상기 식에서, n 및 m은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고; R1, R2 및 R3은 C1-C8 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R4 및 R5는 C6-C40 알킬, C6-C40 알케닐, C6-C40 알키닐, C(=O)(C5-C39 알킬) C(=O)(C5-C39 알케닐) 및 C(=O)(C5-C39 알키닐)로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다]
여기에서 사용된 용어 "알킬"은 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소 기를 가리키고, 이것의 비제한적 예는 메틸, 에틸 및 직쇄 및 분지쇄 프로필 및 부틸 기를 포함한다. 알킬 기는 임의로 예를 들어 하나 이상의 히드록시 (-OH), 옥소 (=O), 할로(-F, -Cl, -Br 또는 -I) 및 티오(-SH) 기 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄 및 분지쇄 탄화수소 기를 가리키고, 이것의 비제한적 예는 직쇄 및 분지쇄 헥사데세닐 및 옥타데세닐 기를 포함한다. 알케닐 기는 임의로 예를 들어 하나 이상의 히드록시 (-OH), 옥소 (=O), 할로(-F, -Cl, -Br 또는 -I) 및 티오(-SH) 기 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄 및 분지쇄 탄화수소 기를 가리키고, 이것의 비제한적 예는 직쇄 및 분지쇄 헥사데시닐 및 옥타데시닐 기를 포함한다. 알키닐 기는 임의로 예를 들어 하나 이상의 히드록시 (-OH), 옥소 (=O), 할로(-F, -Cl, -Br 또는 -I) 및 티오(-SH) 기 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있다.
화학식 I의 R1, R2 및 R3 알킬 기는 예를 들어 1 내지 8개 탄소 원자, 1 내지 6개 탄소 원자 및/또는 1 내지 4개 탄소 원자를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, R1, R2 및 R3는 메틸 및 에틸로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 R4 및 R5 알킬 기는 예를 들어 6 내지 40개 탄소 원자, 10 내지 24개 탄소 원자, 14 내지 18개 탄소 원자, 5 내지 39개 탄소 원자, 9 내지 23개 탄소 원자, 및/또는 13 내지 17개 탄소 원자를 가질 수 있다.
화학식 I의 R4 및 R5 알케닐 기는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 이중 결합을 가질 수 있다. R4 및 R5 알케닐 기는 예를 들어 6 내지 40개 탄소 원자, 10 내지 24개 탄소 원자, 14 내지 18개 탄소 원자, 5 내지 39개 탄소 원자, 9 내지 23개 탄소 원자, 및/또는 13 내지 17개 탄소 원자를 가질 수 있다.
화학식 I의 R4 및 R5 알키닐 기는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 삼중 결합을 가질 수 있다. R4 및 R5 알키닐 기는 예를 들어 6 내지 40개 탄소 원자, 10 내지 24개 탄소 원자, 14 내지 18개 탄소 원자, 5 내지 39개 탄소 원자, 9 내지 23개 탄소 원자, 및/또는 13 내지 17개 탄소 원자를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, R4 및 R5는 옥틸, 2-에틸헥실, 노닐, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 시스-9-헥사데세닐, 옥타데실, 16-메틸헵타데실, 트랜스-9-옥타데세닐, 시스-9-옥타데세닐, 시스,시스-9,12-옥타데카디에닐, 트랜스,트랜스-9,12-옥타데카디에닐, 시스,시스,시스-9,12,15-옥타데카트리에닐, 트랜스,트랜스,트랜스-9,12,15-옥타데카트리에닐, 12-히드록시-9-옥타데세닐, 에이코사닐, 도코사닐, 시스-13-도코세닐, 테트라코사닐, 헥사코사닐, 옥타코사닐, 트리아콘타닐, 테트라트리아콘타닐, 옥타노일, 데카노일, 도데카노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일, 헵타데카노일, 옥타데카노일, 에이코사노일, 도코사노일, 테트라코사노일, 시스,시스,시스-9,12,15-옥타데카트리에노일, 시스,시스,시스,시스-6,9,12,15-옥타데카테트라에노일, 시스,시스,시스,시스,시스-5,8,11,14,17-에이코사펜테노일, 시스,시스,시스,시스,시스,시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노일, 시스,시스-9,12-옥타데카디에노일, 시스,시스,시스-6,9,12-옥타데카트리에노일, 시스,시스,시스-8,11,14-에이코사트리에노일, 시스,시스,시스,시스-5,8,11,14-에이코사테트라에노일, 시스-9-옥타데세노일, 트랜스-9-옥타데세노일, 시스-13-도코세노일 및 시스-15-테트라코세노일로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일이고, 즉 화학식 I의 계면활성제는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTAP) 또는 그의 염 (예, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 또는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드)이다. 다른 실시양태에서, m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세닐이고, 즉 화학식 I의 계면활성제는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTMA) 또는 그의 염 (예, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드)이다. 일부 실시양태에서, 활성 약제는 파클리탁셀이고; m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일이고, 즉 화학식 I의 계면활성제는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTAP) 또는 그의 염 (예, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 또는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드)이다. 다른 실시양태에서, 활성 약제는 파클리탁셀이고; m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세닐이고, 즉 화학식 I의 계면활성제는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTMA) 또는 그의 염 (예, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드)이다.
본 발명의 다른 측면은, 세포를 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 표면-변형 입자에 노출시키고, 이에 의해 표면-변형 입자와 함께 로딩된 세포를 형성함으로써 포식 또는 비-포식 세포에 의한 활성 약제의 흡수를 증진시키기 위한 방법을 제공한다. 입자 코어는 전형적으로 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는다. 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 코팅물을 갖지 않는 입자와 접촉된 세포에 비하여 적어도 세포에 의한 활성 약제의 흡수 증진이 관찰된다. 이러한 방법은 표면-변형 입자와 함께 로딩된 세포를 형성하기 위해 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 포식 또는 비-포식 세포에 의한 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키기 위한 약제의 제조에서 다수의 표면-변형 입자의 용도를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표면-변형 입자와 함께 로딩된 상기 언급된 세포를 사용하여 세포 수송을 통해 다수의 표면-변형 입자를 포함한 활성 약제 또는 제약 조성물을 포유동물 대상체의 표적 조직에 전달하는 방법을 제공한다. 표면-변형 입자의 효율적인 표적 전달 방법은 낮은 전신 부작용 및 낮은 독성으로 증가된 농도의 치료제를 질병, 종양 또는 감염 부위에 투여할 수 있다. 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경구 투여 등과 같은 다양한 투여 방법이 림프계, 간 및 기타 조직 표적으로 수송하는 세포에 의하여 입자의 흡수 증진을 촉진하는 것으로 해석된다. 예를 들어, 림프샘을 따라 국소영역에 침습하는 두경부암을 포함하여 다양한 질병을 위해 피하 투여가 계획된다.
여기에서 사용된 "표적 조직" 또는 "조직 표적"이란 치료되는 대상체의 특정한 조직을 가리킨다. 이러한 표적 조직의 예는 이에 한정되지 않지만 뇌 및 중추 신경계의 다른 부위, 림프샘계 (예, 림프절, 골수, 비장, 흉선 등), 간, 및 기타 감염, 염증 또는 종양 부위를 포함한다.
세포 수송에 의한 전달에 추가로, 표면-변형 입자를 대상체에서 병 (예, 암, 감염) 및/또는 염증 부위를 가진 체강 내에 국소 투여함으로써 표적 조직으로의 전달을 수행할 수 있으며, 그 결과 질병 조직 표적에 근접하여 활성 약제를 전달하기 위해 표면-변형 입자가 체강 내에 위치한 질병 세포 또는 염증 세포에 의하여 흡수될 수 있다. 예를 들어, 난소암, 복막 중피종, 복막 암종증 등과 같은 복강암은, 입자 또는 입자를 포함한 제약 조성물을 복강 내에 복강내 투여함으로써 치료될 수 있다. 유사하게, 방광암, 감염 및/또는 염증은 입자 또는 입자를 포함한 제약 조성물을 방광강 내에 투여함으로써 치료될 수 있고; 폐암, 감염 및/또는 염증은 입자를 폐강 내에 투여함으로써 (예를 들어, 흡입에 의해) 치료될 수 있고; 흉강암, 감염 및/또는 염증은 입자를 흉강 내에 투여함으로써 치료될 수 있고; 심장강암, 감염 및/또는 염증은 입자 또는 입자를 포함한 제약 조성물을 심장강에 투여함으로써 치료될 수 있고; 안암, 감염 및/또는 염증은 입자 또는 입자를 포함한 제약 조성물을 눈의 수양액 또는 유리액 내에 투여함으로써 치료될 수 있다. 추가로, 위장암, 감염 및/또는 염증은 입자 또는 입자를 포함한 제약 조성물을 위 및/또는 소장에 투여함으로써 (예, 경구 투여를 통해) 치료될 수 있다. 유리하게는, 표면-변형 입자 또는 표면-변형 입자를 포함한 제약 조성물을 질병 또는 염증 부위를 함유하는 체강으로의 투여를 통해 질병 또는 염증 부위에 근접하고/하거나 인접하게 투여할 때, 표면-변형 입자가 질병 또는 염증 부위에 위치한 질병 (예, 암성, 감염) 또는 염증 세포에 의해 흡수될 수 있고, 따라서 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 코팅물을 갖지 않는 입자와 접촉된 세포에 비하여 적어도 질병 또는 염증 세포에 의한 본 발명에 따른 표면-변형 입자의 흡수 증진이 관찰된다.
여기에서 사용된 "체강"이란 지지 조직에 의해 둘러싸인 비교적 빈 공간 또는 지지 조직에 의해 둘러싸인 유체-충진 공간을 가리킨다. 여기에서 사용된 체강은 구멍을 둘러싼 (그리고 한정하는) 조직 및 구멍의 완전한 내부 양쪽 모두를 포함한다. 일례의 체강은 복강, 방광강, 폐강, 흉강, 심장강, 위장강, 눈의 수양액, 및 눈의 유리액을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 약제에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어는 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 전형적으로 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖고, 상기 투여가 염증성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다. 하나의 측면에서, 대상체는 염증성 질병 또는 질환을 갖고, m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일이다. 하나의 측면에서, 활성 약제는 항-염증제이다. 여기에 기재된 바와 같이 세포 수송을 통해, 또는 염증 부위로의 국소 투여에 의하여 활성 약제의 전달을 실행할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 신경변성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 약제에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어는 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 전형적으로 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖고, 상기 투여가 신경변성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다. 하나의 측면에서, 대상체는 신경변성 질병 또는 질환을 갖고, m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일이다. 하나의 측면에서, 활성 약제는 항-신경변성제이다. 여기에 기재된 바와 같이 세포 수송을 통해 활성 약제의 전달을 실행할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 증식성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 약제에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어는 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 전형적으로 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖고, 상기 투여가 증식성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다. 하나의 측면에서, 대상체는 증식성 질병 또는 질환을 갖고, m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일이다. 하나의 측면에서, 활성 약제는 항-신생물제와 같은 항-증식제이다. 여기에 기재된 바와 같이 세포 수송을 통해, 또는 질병 부위로의 국소 투여에 의해 활성 약제의 전달을 실행할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 다수의 표면-변형 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 감염성 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 약제에 관한 것이고, 여기에서 입자 코어는 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 전형적으로 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고, 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖고, 상기 투여가 감염성 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 치료 및/또는 예방하는 데 효과적이다. 하나의 측면에서, 대상체는 감염성 질병 또는 질환을 갖고, m 및 n은 1이고; R1, R2 및 R3은 메틸이고; R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일이다. 하나의 측면에서, 활성 약제는 항-진균제, 항-바이러스제, 항균제 또는 항-기생충제와 같은 항-감염제이다. 여기에 기재된 바와 같이 세포 수송을 통해, 또는 질병 부위로의 국소 투여에 의해 활성 약제의 전달을 실행할 수 있다.
따라서, 본 발명에 개시된 투여 방법은 상기 표면-변형 입자의 치료학상 유효량의 투여에 관한 것이다. 여기에서 사용된 용어 "치료학상 유효량"이란 본 발명에 개시된 치료 방법에 따른 치료를 위해 계획된 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 병변을 완화, 개선, 제거, 치료 및/또는 예방하기에 충분한 양의 표면-코팅 입자를 가리킨다. 치료학상 유효량의 결정은 특히 여기에 제공된 개시내용에 비추어서 당업자의 능력 범위 내에 있다.
표면-변형 입자의 하기 설명은 여기에 개시된 모든 실시양태에 적용된다. 표면-변형 입자의 활성 약제는 불량한 수용성이거나 수용성일 수 있다. 활성 약제는 치료제 또는 진단제일 수 있다. 활성 약제는 소 분자 또는 생물학적 제제, 예컨대 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 복합체, 접합체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 표면-변형 입자와 함께 사용하기에 적절한 활성 약제가 아니다. 여기에 개시된 조성물 및 방법에 따라 사용되는 활성 약제는, 활성 약제가 포식 또는 비-포식 세포에 의하여 흡수되고 이어서 표적 조직에 전달될 수 있음에도 불구하고, 이러한 활성 약제와 보통 관련된 제약학적 활성을 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, 활성 약제는 포유동물 대상체에서 질병 (예, 암, 감염) 및/또는 염증 부위에 국소적으로 투여될 수 있고, 질병 및/또는 염증 부위에 위치한 질병 세포 (예컨대 감염되거나 암성 세포) 또는 염증성 세포에 의해 흡수된다.
활성 약제는 공지된 다양한 제약 화합물, 예컨대 이에 한정되지 않지만 진통제, 마취제, 각성제, 아드레날린성 약제, 아드레날린 차단제, 아드레날린 억제제, 아드레노코르티코이드, 아드레날린유사작용제, 항콜린제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 알킬화제, 알칼로이드, 알로스테리 억제제, 합성대사 스테로이드, 식욕감퇴제, 제산제, 지사제, 해독제, 항엽산제, 해열제, 항류마티스제, 정신치료제, 신경차단제, 항염증제, 항기생충제(antihelmintics), 항응고제, 항우울제, 항간질제, 항섬유화제, 항감염제 (예, 항진균제, 항바이러스제, 예컨대 항레트로바이러스제, 예컨대 뉴클레오시드 역 전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 항생물질), 항히스타민제, 항무스카린제, 항미코박테리아제, 항-신생물제, 항원충제, 항불안제, 베타-아드레날린수용체 차단제, 코르티코스테로이드, 기침 억제제, 도파민작용제, 지혈제, 혈액작용약, 수면제, 면역학적 제제, 무스카린제, 부교감신경흥분제, 프로스타글란딘, 방사성의약품, 진정제, 자극제, 교감신경흥분제, 비타민, 크산틴, 성장인자, 호르몬, 항프리온제 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
항-신생물제의 예는 이에 한정되지 않지만 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 화합물, 알카로이드, 항대사물질, 효소 억제제, 알킬화제 및 이들의 조합을 포함한다.
활성 약제는 또한 프로테아제 억제제, 예컨대 HIV 프로테아제 억제제일 수 있다. 프로테아제 억제제의 예는 이에 한정되지 않지만 인디나비르, 리토나비르, 사퀴나비르, 넬피나비르, 아타자나비르 및 이들의 조합을 포함한다.
활성 약제는 뉴클레오시드 역 전사효소 억제제일 수 있다. 뉴클레오시드 역 전사효소 억제제의 예는 이에 한정되지 않지만 지도부딘, 디다노신, 스타부딘, 잘시타빈, 라미부딘 및 이들의 조합을 포함한다.
활성 약제는 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제일 수 있다. 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제의 예는 이에 한정되지 않지만 에파비렌즈, 네비라핀, 델라비라딘 및 이들의 조합을 포함한다.
항-염증제의 예는 이에 한정되지 않지만 비-스테로이드성 항-염증 약물, 비-선택성 시클록시게나제 (COX) 억제제, COX-1 억제제, COX-2 억제제, 리폭시게나제 억제제, 코르티코스테로이드, 항-산화제, 종양 괴사 인자 (TNF) 억제제 및 이들의 조합을 포함한다. COX-2 억제제의 예는 이에 한정되지 않지만 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 파레콕시브, 루미라콕시브, 에토리콕시브 및 이들의 조합을 포함한다.
진단제는 x-선 영상화 시약 및 조영제를 포함한다. x-선 영상화 시약의 예는, 디아트라존산의 에틸 에스테르 (EEDA)로서 공지된 WIN-8883 (에틸 3,5-디아세트아미도-2,4,6-트리요오도벤조에이트); WIN 67722, 즉 (6-에톡시-6-옥소헥실-3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조에이트; 에틸-2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도-벤조일옥시)부티레이트 (WIN 16318); 에틸 디아트리족시아세테이트 (WIN 12901); 에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시)프로피오네이트 (WIN 16923); N-에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시 아세트아미드 (WIN 65312); 이소프로필 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시)아세트아미드 (WIN 12855); 디에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시)말로네이트 (WIN 67721); 에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시)페닐아세테이트 (WIN 67585); 프로판디온산, [[3,5-비스(아세틸아미노)-2,4,5-트리요오도벤조일]옥시]비스(1-메틸)에스테르 (WIN 68165); 및 벤조산, 3,5-비스(아세틸아미노)-2,4,6-트리요오도-4-(에틸-3-에톡시-2-부테노에이트) 에스테르 (WIN 68209)를 포함한다. 조영제는 생리학적 조건 하에서 비교적 빨리 붕해되고 이에 의해 염증성 반응과 관련된 입자를 최소화하는 것으로 기대되는 것을 포함한다. 붕해는 효소적 가수분해, 생리학적 pH에서 카르복실산의 가용화 또는 다른 메커니즘으로부터 일어날 수 있다. 따라서, WIN 67721, WIN 12901, WIN 68165 및 WIN 68209와 같은 가수분해적으로 불안정한 요오드화 종과 함께 불량한 가용성 요오드화 카르복실산, 예컨대 요오디파미드, 디아트리존산 및 메트리존산이 포함된다.
다른 조영제는 이에 한정되지 않지만 가돌리늄 킬레이트와 같은 자기 공명 영상화 보조제 또는 기타 상자성체 조영제의 입상 제제를 포함한다. 이러한 화합물의 예는 가도펜테테이트 디메글루민 (마그네비스트 (MAGNEVIST)®) 및 가도테리돌 (프로핸스 (PROHANCE)®)이다.
치료제 및 진단제 부류의 설명 및 각 부류에 속하는 종의 목록은 문헌 [Martindale, The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition, The Pharmaceutical Press, London, 1996] (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에서 찾아볼 수 있다. 기재된 치료제 및 진단제는 통상적으로 입수가능하고/하거나 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 활성 약제는 불량한 수용성 화합물이다. "불량한 수용성"이 의미하는 것은 물에서 약 10 mg/mL 미만, 바람직하게는 약 1 mg/mL 미만의 화합물의 용해성이다. 수성 매질에서 화합물을 제형하는 것의 제한된 대안이 존재하기 때문에, 이러한 불량한 수용성 화합물이 수성 현탁액 제제를 위해 특히 적절하다. 유리하게는, 본 발명에 따른 코팅물을 제공하는 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염은 실질적으로 균일한 코팅물을 형성하기 위하여 불량한 수용성 활성 약제를 포함하는 입자의 표면에 흡착될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염의 소수성 꼬리 부분(tail moiety)이 입자 표면 위의 소수성 부분과 결합할 수 있다. 추가로, 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염이 포지티브 하전되고, 따라서 입자 표면 위에서 계면활성제와 네거티브 하전 영역 사이의 정전 상호작용이 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 코팅물을 안정화할 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 불량한 수용성 활성 약제 화합물은 2500 그램/몰 미만, 2000 그램/몰 미만, 가장 전형적으로 1000 그램/몰 미만, 예를 들어 200 그램/몰 내지 900 그램/몰의 분자량을 가진 유기 화합물이다. 이러한 유기 화합물은 여기에서 "소 분자"라고 일컬어진다.
대안적으로, 본 발명은 수용성 화합물을 가지고 실행될 수 있다. 수용성 화합물의 수성 현탁액을 형성하기 위하여, 수용성 활성 화합물을 고체 담체 기질 (예를 들어, 폴리락테이트-폴리글리콜레이트 공중합체, 알부민, 전분)에 포획할 수 있거나, 또는 활성 약제에 대해 실질적으로 불투과성인 주변 수송체에 캡슐화할 수 있다. 이러한 캡슐화 수송체는 폴리아크릴레이트와 같은 중합체 코팅물일 수 있다. 또한, 입자로부터 화합물의 방출을 조절함으로써 화합물의 화학 안정성을 개선하고 약동학적 성질을 조절하기 위하여 수용성 화합물로부터 제조된 소 입자를 변형할 수 있다. 수용성 화합물의 예는 이에 한정되지 않지만 단순 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 뉴클레오티드 및 탄수화물을 포함한다.
입자의 하기 설명이 여기에 개시된 모든 실시양태에 적용된다. 입자는 시차 주사 열량법 (DSC) 또는 X-선 회절과 같은 적절한 분석 방법에 의해 결정 시에 비결정성, 반결정성, 결정성 또는 이들의 조합일 수 있다. 투여 전에, 입자를 균질화 과정을 통해 균질화할 수 있다. 입자는 또한 마이크로침전/균질화 과정을 통해 균질화할 수 있다.
코팅된 입자는 동적 광 산란 방법 (예, 광자상관 분광법, 레이저 회절, 낮은-각 레이저 광 산란 (LALLS), 중간-각 레이저 광 산란 (MALLS)), 광 차폐 방법 (예를 들어 코울터 방법), 레올로지 또는 현미경 (광 또는 전자)에 의해 측정 시에 일반적으로 약 1 nm 내지 약 2 ㎛ (또는 2000 나노미터)의 평균 유효 입자 크기를 갖는다. 바람직한 평균 유효 입자 크기는 화합물의 투여 경로, 제형, 용해도, 독성 및 생체이용성과 같은 인자에 의존된다. 다른 적절한 입자 크기는 약 10 nm 내지 약 1 ㎛, 약 50 nm 내지 약 500 nm 및/또는 약 100 nm 내지 약 250 nm를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
모든 실시양태에서, 코팅 입자는 활성 약제를 포함하는 고체 또는 반-고체 입자이다. 코팅 입자는 일반적으로 적어도 5％ (w/w) 활성 약제, 예를 들어 적어도 10％ (w/w), 적어도 25％ (w/w), 적어도 50％ (w/w) 및/또는 적어도 75％ (w/w) 또는 그 이상의 활성 약제로 구성된다.
입자 코어의 제조
본 발명에서 사용된 입자의 제조 방법은 다수의 기술을 통해 달성될 수 있다. 입자의 제조 기술의 대표적이지만 비-독점적 언급은 다음과 같다.
I. 소 입자 분산액을 형성하기 위한 에너지 첨가 기술
일반적으로, 에너지 첨가 기술을 사용한 소 입자 분산액의 제조 방법은 활성 약제 또는 제약학적 활성 화합물 (때때로, 약물로서 언급됨)을 벌크 형태로 물 또는 일반적으로 하기 기재된 하나 이상의 계면활성제를 함유하는 수용액, 또는 제약 화합물이 인지가능하게 용해되지 않는 다른 액체와 같은 적절한 수송체에 첨가하여 첫 번째 현탁액 (예비현탁액이라 일컬어짐)을 형성하는 단계를 포함한다. 예비현탁액보다 물리적으로 더욱 안정한 입자 분산액을 형성하기 위하여 에너지를 예비현탁액에 첨가한다. 에너지는 기계적 분쇄 (예, 펄 분쇄, 볼 분쇄, 해머 분쇄, 유체 에너지 분쇄, 제트 분쇄 또는 습식 분쇄)에 의해 첨가된다. 이러한 기술은 미국 특허 5,145,684 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다.
에너지 첨가 기술은 예비현탁액을 마이크로플루이다이저를 사용하여 공동화, 전단 또는 충격 힘을 포함하는 고 전단 조건으로 처리하는 것을 더 포함한다. 본 발명은 또한 미국 특허 5,091,188 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시된 것과 같은 피스톤 갭 호모게나이저 또는 역류 유동 호모게나이저를 사용하여 예비현탁액에 에너지를 첨가하는 것을 더욱 의도한다. 적절한 피스톤 갭 호모게나이저는 상표명 에멀시플렉스 (EMULSIFLEX)TM (아베스틴) 및 프렌치 (FRENCH)® 압력 셀 (서모 스펙트로닉)으로부터 통상적으로 입수가능하다. 적절한 마이크로플루이다이저는 마이크로플루이딕스 코포레이션으로부터 입수가능하다.
에너지 첨가 단계는 또한 초음파처리 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 적절한 초음파처리 장치에 의하여 초음파처리 단계를 수행할 수 있다. 적절한 장치는 브랜슨 모델 S-450A 및 콜-파머 500/750 와트 모델을 포함한다. 이러한 장치는 당 산업에 공지되어 있다. 전형적으로, 초음파처리 장치는 초음파처리 혼 또는 탐침을 갖는다. 본 발명의 바람직한 형태에서 초음파처리 장치는 약 1 kHz 내지 약 90 kHz의 주파수, 더욱 바람직하게는 약 20 kHz 내지 약 40 kHz 또는 이들 내의 어느 범위 또는 조합의 주파수에서 작동된다. 탐침 크기는 다양할 수 있고 바람직하게는 1/2 인치 또는 1/4 인치 등과 같은 뚜렷한 크기이다.
투여에 앞서서 소 입자의 분산액을 살균할 수 있다. 살균은 가열 살균, 감마선 조사, 여과 (200 nm 이하의 입자 크기를 가진 분산액으로서 직접적으로 또는 고체 분산액을 형성하기 전에 침전 과정에서 사용되는 용액의 살균 여과에 의해), 그리고 매우 높은 압력의 적용에 의해 (2000 대기압 초과) 또는 높은 압력 및 높은 온도의 조합에 의해 달성될 수 있다.
II . 서브마이크로미터 크기 입자 분산액의 제조를 위한 침전 방법
또한, 침전 기술에 의해 소 입자 분산액을 제조할 수 있다. 다음은 침전 기술의 예를 설명한 것이다.
마이크로침전 방법. 마이크로침전 방법의 한 가지 예를 미국 특허 5,780,062호 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. '062 특허는 (i) 수-혼화성 첫 번째 용매에 유기 화합물을 용해시키고; (ii) 유기 화합물이 실질적으로 불용성인 두 번째 수성 용매 중에 중합체 및 양친매성물질의 용액을 제조하고, 이에 의해 중합체/양친매성물질 착물이 형성되고; (iii) 단계 (i) 및 (ii)로부터 용액을 혼합하여 유기 화합물 및 중합체/양친매성물질 착물의 응집물을 침전시키는 것을 포함하는 유기 화합물 침전 방법을 개시하고 있다.
다른 적절한 침전 방법은 미국 특허 6,607,784, 7,037,528, 6,869,617, 6,884,436 (여기에서 참고문헌으로 인용되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 개시된 방법은 (1) 수 혼화성 첫 번째 유기 용매 중에 유기 화합물을 용해시켜 첫 번째 용액을 형성하고; (2) 첫 번째 용액을 두 번째 용매 또는 물과 혼합하여 유기 화합물을 침전시켜 예비현탁액을 형성하고; (3) 고-전단 혼합 또는 가열 형태로 예비현탁액에 에너지를 첨가하여 소 입자의 분산액을 제공하는 단계를 포함한다. 임의로, 원심분리 또는 여과 방법과 같은 적절한 수단에 의해 혼합물로부터 첫 번째 유기 용매를 제거한다. 또한, 원심분리 및 여과와 같은 방법을 사용하여 첫 번째 연속 상을 제거하고, 두 번째 연속 상을 첨가하고 이어서 고체 물질을 두 번째 연속 상에 재분산함으로써 분산액의 연속 상을 다른 연속 상에 의해 임의로 대체할 수 있다. 하기 기재된 하나 이상의 임의의 계면활성제를 첫 번째 유기 용매에, 두 번째 수성 용액에, 또는 첫 번째 유기 용매와 두 번째 수성 용액 양쪽 모두에 첨가할 수 있다.
에멀젼 침전 방법. 한 가지 적절한 에멀젼 침전 기술이 미국 특허 2005/0037083 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 이 접근법에서, 방법은 (1) 유기 상 및 수성 상을 가진 다중상 계를 제공하고, 유기 상이 그 안에 제약학적 활성 화합물을 가지며; (2) 유기 상의 일부를 증발시키기 위해 계를 초음파처리하여 수성 상에 화합물을 침전시키고 소 입자의 분산액을 형성하는 단계를 포함한다. 다중상 계를 제공하는 단계는 (1) 수 불혼화성 용매를 제약학적 활성 화합물과 혼합하여 유기 용액을 한정하고, (2) 하나 이상의 표면 활성 화합물을 가진 수성계 용액을 제조하고, (3) 유기 용액을 수성 용액과 혼합하여 다중상 계를 형성하는 것을 포함한다. 유기 상과 수성 상의 혼합 단계는 피스톤 갭 호모게나이저, 콜로이드 밀, 고속 교반 장치, 압출 장치, 수동 교반 또는 진탕 장치, 마이크로플루이다이저, 또는 고 전단 조건을 제공하기 위한 기타 장치 또는 기술을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 조(crude) 에멀젼은 물에 직경이 대략 1 ㎛ 미만인 크기의 유적(oil droplet)을 가질 것이다. 조 에멀젼을 초음파처리하여 마이크로에멀젼을 형성하고 결과적으로 소 입자의 분산액을 제공한다.
소 입자의 분산액을 제조하기 위한 다른 접근법은 미국 특허 6,835,396 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 이 방법은 (1) 유기 상 및 수성 상을 가진 다중상 계의 조 분산액을 제공하고, 유기 상이 그 안에 제약 화합물을 가지며; (2) 조 분산액에 에너지를 제공하여 미세 분산액을 형성하고; (3) 미세 분산액을 동결시키고; (4) 미세 분산액을 동결건조하여 제약 화합물의 소 입자를 수득하는 단계를 포함한다. 소 입자는 하기 기재된 기술에 의해 살균될 수 있거나 또는 소 입자가 수성 매질에서 재구성되고 살균될 수 있다.
다중상 계를 제공하는 단계는 (1) 수 불혼화성 용매를 제약학상 유효 화합물과 혼합하여 유기 용액을 한정하고; (2) 수성계 용액을 하나 이상의 표면 활성 화합물과 함께 제조하고; (3) 유기 용액을 수성 용액과 혼합하여 다중상 계를 형성하는 단계를 포함한다. 유기 상과 수성 상의 혼합 단계는 피스톤 갭 호모게나이저, 콜로이드 밀, 고속 교반 장치, 압출 장치, 수동 교반 또는 진탕 장치, 마이크로플루이다이저, 또는 고 전단 조건을 제공하기 위한 기타 장치 또는 기술의 사용을 포함한다.
용매- 반용매 침전. 미국 특허 5,118,528 (Fessi et al.) 및 미국 특허 5,100,591 (Leclef et al.) (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시된 용매-반용매 침전 기술을 사용하여 소 입자 분산액을 제조할 수 있다. 양쪽 방법은 (1) 용매 또는 용매 혼합물에 생물학적 활성 물질의 액체 상을 제조하고, 여기에 하나 이상의 계면활성제를 첨가할 수도 있고; (2) 비-용매 또는 비-용매의 혼합물의 두 번째 액체 상을 제조하고, 비-용매는 물질을 위한 용매 또는 용매 혼합물과 혼화성이고; (3) (1) 및 (2)의 용액을 교반하면서 함께 첨가하고; (4) 원하지 않는 용매를 제거하여 소 입자의 분산액을 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은, 고 전단 혼합 또는 가열의 형태로 에너지를 현탁액에 첨가하는 마지막 단계를 제공하지 않는다는 점에서, 상기 항목, "마이크로침전 방법"에 기재된 것과는 구별된다.
상전환 침전. 미국 특허 6,235,224, 6,143,211 및 6,616,869 (각각이 본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시된 상전환 침전을 사용하여 소 입자 분산액을 형성할 수 있다. 상전환은 연속 상 용매 계에 용해된 중합체를 중합체가 연속 상인 고체 거대분자 망상으로 전환시키는 물리적 현상을 설명하기 위해 사용되는 용어이다. 상전환을 유도하는 한 가지 방법은 비용매를 연속 상에 첨가하는 것이다. 중합체는 단일 상으로부터 불안정한 2개 상 혼합물: 중합체 다량 분획 및 중합체 소량 분획으로의 전이를 겪는다. 중합체 다량 상에서 비용매의 교질입자 소적은 핵형성 부위로 작용하고 중합체로 코팅된다. '224 특허는, 특정한 조건 하에서 중합체 용액의 상전환이 나노입자를 포함한 별개의 마이크로입자를 자발적으로 형성할 수 있다는 것을 개시하고 있다. '224 특허는 용매에 중합체를 용해하거나 분산하는 것을 개시하고 있다. 제약학적 약제를 용매에 용해시키거나 분산시킨다. 결정 접종 단계가 이 방법에서 효과적이기 위해서는, 약제를 용매에 용해시키는 것이 바람직하다. 중합체, 약제 및 용매는 함께 연속 상을 가진 혼합물을 형성하고, 여기에서 용매는 연속 상이다. 이어서, 혼합물을 적어도 10배 과량의 혼화성 비용매에 도입하여 10 nm 내지 10 ㎛의 평균 입자 크기를 가진 약제의 마이크로캡슐화 마이크로입자를 자발적으로 형성시킨다. 입자 크기는 용매:비용매 부피 비, 중합체 농도, 중합체-용매 용액의 점도, 중합체의 분자량 및 용매-비용매 쌍의 특징에 의해 영향을 받는다.
pH 변화 침전. pH 변화 침전 기술에 의하여 소 입자 분산액을 형성할 수 있다. 이러한 기술은 전형적으로 약물이 가용성인 pH를 가진 용액에 약물을 용해시킨 다음 pH를 약물이 더 이상 가용성이 아닌 점까지 변화시키는 단계를 포함한다. pH는 특정한 제약 화합물에 의존하여 산성이거나 염기성일 수 있다. 이어서, 용액을 중화시켜 소 입자의 분산액을 형성한다. 하나의 적절한 pH 변화 침전 방법은 미국 특허 5,665,331 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 이 방법은 제약학적 약제를 알칼리성 용액 중에서 결정 성장 변형제(CGM)와 함께 용해시킨 다음, 적절한 표면-변형 표면 활성제의 존재 하에서 용액을 산으로 중화시켜 제약학적 약제의 소 입자 분산액을 형성하는 단계를 포함한다. 침전 단계에 이어서 분산액의 정용여과 세정 단계를 수행한 다음 분산액의 농도를 원하는 수준으로 조절할 수 있다.
pH 변화 침전 방법의 다른 예는 미국 특허 5,716,642; 5,662,883; 5,560,932; 및 4,608,278 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다.
주입 침전 방법. 소 입자 분산액을 형성하기 위해 적절한 주입 침전 기술이 미국 특허 4,997,454 및 4,826,689 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 먼저, 적절한 고체 화합물을 적절한 유기 용매에 용해시켜 용매 혼합물을 형성한다. 이어서, 약 -10 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도에서 50 ml 부피 당 약 0.01 ml/분 내지 약 1000 ml/분의 주입 속도로 유기 용매와 혼화성인 침전 비용매를 용매 혼합물에 주입하여, 10 ㎛ 미만의 실질적으로 균일한 평균 직경을 가진 화합물의 침전된 비-응집 고체 입자의 현탁액을 제조한다. 침전 비용매로 주입되는 용액의 휘저음 (예, 교반)이 바람직하다. 응집에 대해 입자를 안정화하기 위하여 비용매는 계면활성제를 함유할 수도 있다. 이어서 용매로부터 입자를 분리한다. 고체 화합물 및 원하는 입자 크기에 의존하여, 온도, 비용매 대 용매 비율, 주입 속도, 교반 속도 및 부피의 매개변수를 본 발명에 따라 바꿀 수 있다. 입자 크기는 비용매:용매 부피의 비율 및 주입 온도에 비례하고, 주입 속도 및 교반 속도에 반비례한다. 침전 비용매는 화합물의 상대 용해도 및 바람직한 현탁 수송체에 의존하여 수성 또는 비-수성일 수 있다.
온도 변화 침전. 소 입자 분산액을 형성하기 위해 온도 변화 침전 기술을 또한 사용할 수 있다. 이러한 기술은 미국 특허 5,188,837 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 본 발명의 실시양태에서, (1) 전달하고자 하는 약물과 같은 물질을 용융된 수송체에 용융시키거나 용해시켜 전달되는 물질의 액체를 형성하고; (2) 물질 또는 수송체의 융점보다 높은 온도에서 용융된 물질 또는 수송체에 수성 매질과 함께 인지질을 첨가하고; (3) 균질한 미세 제제가 수득될 때까지 수송체의 용융 온도보다 높은 온도에서 현탁액을 혼합한 후; (4) 제제를 실온 이하로 빨리 냉각시키는 단계에 의해 제조된다.
용매 증발 침전. 용매 증발 침전 기술이 미국 특허 4,973,465 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. '465 특허는 (1) 일반적인 유기 용매 또는 용매의 조합에 용해된 제약 조성물 및 인지질의 용액을 제공하고, (2) 용매 또는 용매들을 증발시키고, (3) 용매 또는 용매들의 증발에 의해 수득된 필름을 격렬한 교반에 의하여 수용액 중에서 현탁시켜 소 입자의 분산액을 형성하는 단계를 포함하는 마이크로결정의 제조 방법을 개시하고 있다. 충분한 양의 용매를 증발시킴으로써 용매를 제거하여 화합물의 침전을 유발한다. 용매는 기타 공지된 기술에 의해, 예컨대 용액에 진공을 적용하거나 용액 위에 질소를 불어넣음으로써 제거될 수 있다.
반응 침전. 반응 침전은 제약 화합물 및 임의로 기타 부형제를 적절한 용매에 용해시켜 용액을 형성하는 단계를 포함한다. 화합물을 화합물의 포화점 또는 그 이하의 양으로 용매에 첨가할 수 있다. 화학 시약과의 반응에 의하여 또는 가열 또는 UV 광 등과 같은 에너지를 첨가하는 것에 대한 반응에서의 변형에 의하여 화합물 또는 어떠한 부형제라도 용액으로부터 침전되고, 그 결과 변형된 화합물이 용매 중에서 낮은 용해도를 갖고, 용액으로부터 침전되어 소 입자 분산액을 형성한다. 부형제의 침전은 약물이 흡수된 고체 기질을 제공한다.
압축된 유체 침전. 압축된 유체에 의한 침전을 위해 적절한 기술은 WO 97/14407 (Johnston) (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 이 방법은 수-불용성 약물을 용매에 용해시켜 용액을 형성하는 단계를 포함한다. 이어서 용액을 기체, 액체 또는 초임계 유체일 수 있는 압축된 유체에 분무한다. 압축된 유체를 용매 중 용질의 용액에 첨가하면 용질이 초포화 상태를 달성하거나 근접할 수 있고 미립자로서 침전된다. 이러한 경우에, 압축된 유체가 반용매로서 작용하고 이것이 약물을 용해시키는 용매의 응집 에너지 밀도를 낮춘다.
대안적으로, 약물을 압축된 유체에 용해시킨 다음 수성 상에 분무할 수 있다. 압축된 유체의 빠른 팽창은 유체의 용매력을 감소시키고, 이것은 용질이 수성 상에서 소 입자로서 침전될 수 있도록 한다. 이러한 경우에, 압축된 유체가 용매로서 작용한다.
입자를 응집에 대해 안정화하기 위하여, 계면활성제와 같은 표면-변형제가 이 기술에 포함된다.
극저온 유체로의 분무. 압축된 유체에 의한 적절한 침전 기술이 미국 특허 공고 2004/0022861 (Williams et al.) (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 이 방법은 활성 성분을 물, 하나 이상의 용매, 또는 이들의 조합과 혼합하고 얻어진 혼합물을 극저온 유체의 표면 또는 그 아래에 분무하는 소 입자를 제조하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 이에 의해 동결된 입자가 제공된다. 동결된 입자가 생성되도록 고체 입자를 캡슐화하기 위한 물질을 첨가할 수 있고, 여기에서 캡슐화제가 활성 약제를 둘러싼다.
단백질 나노구 /마이크로구 침전. 본 발명에서 사용된 입자는 단백질과 같은 거대분자를 수용성 중합체와 함께 혼합하거나 용해시키는 것을 포함하는 방법으로부터 제조될 수 있다. 이 방법은 미국 특허 5,981,719, 6,090,925, 6,268,053, 6,458,387 및 미국 특허 공고 2004/0043077 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 개시되어 있다. 본 발명의 실시양태에서, 거대분자의 등전점 근처의 pH에서 용액 중의 거대분자를 용액 중의 중합체 또는 중합체의 혼합물과 혼합함으로써 입자를 제조한다. 혼합물을 에너지 공급원, 예컨대 열, 복사선 또는 이온화의 존재 하에서 소정의 시간 동안 항온처리한다. 얻어진 입자를 물리적 분리 방법에 의해 용액에 존재하는 비혼입 성분으로부터 제거할 수 있다.
본 발명에 따라 사용할 수 있는 소 입자 분산액을 제조할 수 있는 다수의 다른 적절한 방법이 존재한다.
III . 제약 조성물의 입자 분산액을 제조하기 위한 추가의 방법
본 발명에서 사용된 제약 조성물 (즉, 활성 약제 또는 유기 화합물)의 입자를 제조하기 위한 추가의 방법을 4개의 일반적인 범주로 나눌 수 있다. 이 방법의 범주의 각각은 하기 단계: (1) 유기 화합물을 첫 번째 수 혼화성 용매에 용해시켜 첫 번째 용액을 생성하고, (2) 첫 번째 용액을 두 번째 물 용매와 혼합하여 유기 화합물을 침전시켜 예비-현탁액을 생성하고, (3) 고-전단 혼합 또는 가열 또는 이들의 조합의 형태로 예비현탁액에 에너지를 첨가하여 상기 정의된 바람직한 크기 범위를 가진 유기 화합물의 안정한 형태를 제공하는 단계를 공유한다. 혼합 단계 및 에너지 첨가 단계를 연속 단계로 또는 동시에 수행할 수 있다.
이 방법의 범주는 x-선 회절 연구, 시차 주사 열량법 (DSC) 연구, 또는 에너지-첨가 단계 전 및 에너지-첨가 단계 후에 수행되는 다른 적절한 연구를 통해 결정되는 유기 화합물의 물리적 성질을 기초로 하여 구별된다. 첫 번째 방법 범주에서, 에너지-첨가 단계 전에, 예비현탁액 중의 유기 화합물은 비결정성 형태, 반-결정성 형태 또는 과다냉각된 액체 형태를 갖고, 평균 유효 입자 크기를 갖는다. 에너지-첨가 단계 후에, 유기 화합물은 예비현탁액과 필수적으로 동일하거나 그 미만의 평균 유효 입자 크기를 가진 결정성 형태이다.
두 번째 방법 범주에서, 에너지-첨가 단계 전에, 유기 화합물은 결정성 형태이고, 평균 유효 입자 크기를 갖는다. 에너지-첨가 단계 후에, 유기 화합물은 에너지-첨가 단계 이전과 필수적으로 동일한 평균 유효 입자 크기를 가진 결정성 형태이지만, 에너지-첨가 단계 후에 결정은 응집되거나 큰 결정을 형성하기 쉽지 않다.
레이저 동적 광 산란 및 광 현미경에 의하여 유기 화합물이 응집되거나 큰 결정을 형성하는 경향이 낮은 것으로 관찰된다.
세 번째 방법 범주에서, 에너지-첨가 단계 이전에 유기 화합물은 부서지기 쉽고 평균 유효 입자 크기를 갖는 결정성 형태이다. 여기에서 용어 "부서지기 쉬운"은 입자가 무르고 더 작은 입자로 더욱 쉽게 파괴되는 것을 의미한다. 에너지-첨가 단계 후에, 유기 화합물은 예비-현탁액의 결정보다 작은 평균 유효 입자 크기를 가진 결정성 형태이다. 유기 화합물을 부서지기 쉬운 결정성 형태로 만드는 데 필요한 단계를 취함으로써, 덜 부서지기 쉬운 결정성 형태의 유기 화합물에 비하여, 이후의 에너지-첨가 단계를 더욱 빠르게 그리고 효율적으로 수행할 수 있다.
네 번째 방법 범주에서, 첫 번째 용액 및 두 번째 용매를 에너지-첨가 단계로 동시에 처리한다. 따라서, 에너지 첨가 단계 전 및 후에 유기 화합물의 물리적 성질을 측정하지 않았다.
예비현탁액 또는 첫 번째 용액 및 두 번째 용매를 공동화, 전단 또는 충격 력에 노출시키는 방식으로 에너지-첨가 단계를 수행할 수 있다. 하나의 형태에서, 에너지-첨가 단계는 어닐링 단계이다. 본 발명에서 어닐링은 단일 또는 반복 에너지 적용 (직접적인 가열 또는 기계적 응력)한 후 열 이완시킴으로써 열역학적으로 불안정한 물질을 더욱 안정한 형태로 전환시키는 과정으로서 정의된다. 이렇게 에너지를 낮추는 것은, 고체 형태를 덜 정렬된 구조로부터 더욱 정렬된 격자 구조로 전환시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 고체-액체 계면에서 계면활성제 분자를 재정렬시킴으로써 안정화가 발생할 수 있다.
이러한 네 가지 방법 범주를 이하에서 별도로 나타낸다. 그러나, 약물이 이하 언급된 범주의 어느 하나로 처리될 수 있도록, 계면활성제 또는 계면활성제의 조합의 선택, 사용된 계면활성제의 양, 반응의 온도, 용액의 혼합 속도, 침전 속도 등과 같은 공정 조건을 선택할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
첫 번째 방법 범주뿐만 아니라 두 번째, 세 번째 및 네 번째 방법 범주를 2개의 소범주, 방법 A 및 B로 더 나눌 수 있다.
하기 방법에 따른 첫 번째 용매는 주된 유기 화합물이 비교적 용해되고 두 번째 용매와 혼화성인 용매 또는 용매의 혼합물이다. 이러한 용매는 이에 한정되지 않지만 분자 내의 수소 원자가 산소, 질소 또는 원소 주기율표의 기타 군 VA, VIA 및 VIIA와 같은 음전자 원자에 결합되는 수-혼화성 양성자성 화합물을 포함한다. 이러한 용매의 예는 이에 한정되지 않지만 알콜, 아민 (1급 또는 2급), 옥심, 히드록삼산, 카르복실산, 술폰산, 포스폰산, 인산, 아미드 및 우레아를 포함한다.
첫 번째 용매의 다른 예는 비양성자성 유기 용매를 포함한다. 이러한 비양성자성 용매의 일부는 물과 수소 결합을 형성할 수 있지만, 효과적인 양성자 공여 기가 부족하기 때문에 단지 양성자 수용체로서만 작용할 수 있다. 비양성자성 용매의 한 가지 부류는, 국제 순수 및 응용 화학 협회 (International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 2nd Ed., 1997))에 의해 정의되는 이극성 비양성자성 용매; 약 15 초과의 비교적 높은 상대 유전율 (또는 유전 상수) 및 강한 수소 결합을 형성하는 불안정한 수소 원자를 적절히 제공할 수 없는 상당히 큰 영구 이극 모멘트를 가진 용매, 예를 들어 디메틸 술폭시드이다.
이극성 비양성자성 용매는 다른 것들 중에서 아미드 (부착된 수소 원자가 부족한 질소로 완전히 치환됨), 우레아 (질소에 부착된 비 수소 원자로 완전히 치환됨), 에테르, 시클릭 에테르, 니트릴, 케톤, 술폰, 술폭시드, 완전 치환된 포스페이트, 포스포네이트 에스테르, 포스포르아미드, 니트로 화합물 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 디메틸술폭시드 (DMSO), N-메틸-2-피롤리디논 (NMP), 2-피롤리디논, 1,3-디메틸이미다졸리디논 (DMI), 디메틸아세트아미드 (DMA), 디메틸포름아미드 (DMF), 디옥산, 아세톤, 테트라히드로푸란 (THF), 테트라메틸렌술폰 (술포란), 아세토니트릴, 및 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 니트로메탄이 이러한 부류의 요소이다.
일반적으로 수-불혼화성이지만, 감소된 부피에서 수-혼화성 첫 번째 용매로서 작용하기 위해 낮은 부피 (10％ 미만)에서 충분한 수 용해성을 갖는 용매가 선택될 수 있다. 그의 예는 방향족 탄화수소, 알켄, 알칸 및 할로겐화 방향족, 할로겐화 알켄 및 할로겐화 알칸을 포함한다. 방향족은 이에 한정되지 않지만 벤젠 (치환 또는 비치환), 및 단일고리 또는 다중고리 아렌을 포함한다. 치환된 벤젠의 예는 이에 한정되지 않지만 크실렌 (오르소, 메타 또는 파라) 및 톨루엔을 포함한다. 알칸의 예는 이에 한정되지 않지만 헥산, 네오펜탄, 헵탄, 이소옥탄 및 시클로헥산을 포함한다. 할로겐화 방향족의 예는 이에 한정되지 않지만 클로로벤젠, 브로모벤젠 및 클로로톨루엔을 포함한다. 할로겐화 알칸 및 알켄의 예는 이에 한정되지 않지만 트리클로로에탄, 메틸렌 클로라이드, 에틸렌디클로라이드 (EDC) 등을 포함한다.
첫 번째 용매로서 사용하기 위해 적절한 용매의 다른 특정한 예는 이에 한정되지 않지만 N-메틸-2-피롤리디논 (또한 N-메틸-2-피롤리돈), 2-피롤리디논 (2-피롤리돈이라 불림), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 (DMI), 디메틸술폭시드, 디메틸아세트아미드, 아세트산, 락트산, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 3-펜탄올, n-프로판올, 벤질 알콜, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 (부탄디올), 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 모노아실화 및 디아실화 모노글리세리드 (예컨대 글리세릴 카프릴레이트), 디메틸 이소소르비드, 아세톤, 디메틸술폰, 디메틸포름아미드, 1,4-디옥산, 테트라메틸렌술폰 (술포란), 아세토니트릴, 니트로메탄, 테트라메틸우레아, 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 테트라히드로푸란 (THF), 디옥산, 디에틸에테르, tert-부틸메틸 에테르 (TBME), 방향족 탄화수소, 알켄, 알칸, 할로겐화 방향족, 할로겐화 알켄, 할로겐화 알칸, 크실렌, 톨루엔, 벤젠, 치환된 벤젠, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 클로로벤젠, 브로모벤젠, 클로로톨루엔, 트리클로로에탄, 메틸렌 클로라이드, 에틸렌디클로라이드 (EDC), 헥산, 네오펜탄, 헵탄, 이소옥탄, 시클로헥산, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, 예를 들어 PEG-4, PEG-8, PEG-9, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-120, PEG-75, PEG-150), 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 (예를 들어 PEG-4 디라우레이트, PEG-20 디라우레이트, PEG-6 이소스테아레이트, PEG-8 팔미토스테아레이트, PEG-150 팔미토스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 (예를 들어 PEG-20 소르비탄 이소스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 모노알킬 에테르 (예를 들어 PEG-3 디메틸 에테르, PEG-4 디메틸 에테르), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리프로필렌 알기네이트, PPG-10 부탄디올, PPG-10 메틸 글루코스 에테르, PPG-20 메틸 글루코스 에테르, PPG-15 스테아릴 에테르, 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 프로필렌 글리콜 라우레이트, 및 글리코푸롤 (테트라히드로푸르푸릴 알콜 폴리에틸렌 글리콜 에테르)를 포함한다. 바람직한 첫 번째 용매는 N-메틸-2-피롤리디논이다. 다른 바람직한 첫 번째 용매는 락트산이다.
두 번째 용매는 수성 용매이다. 이러한 수성 용매는 물 자체일 수도 있다. 이러한 용매는 완충액, 염, 계면활성제(들), 수용성 중합체 및 이러한 부형제의 조합을 함유할 수도 있다.
방법 A. 방법 A에서, 유기 화합물 ("활성 약제" 또는 "약물)을 먼저 첫 번째 용매에 용해시켜 첫 번째 용액을 형성한다. 첫 번째 용매 중의 유기 화합물의 용해도에 의존하여 유기 화합물을 약 0.1％ (w/v) 내지 약 50％ (w/v)로 첨가할 수도 있다. 첫 번째 용매에 화합물이 완전히 용해되도록 약 30 ℃로부터 약 100 ℃로 농축물을 가열하는 것이 필요할 수도 있다.
두 번째 수성 용매에 하나 이상의 임의의 표면-변형제, 예컨대 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 생물학적 표면 활성 분자를 제공한다. 적절한 음이온성 계면활성제는 이에 한정되지 않지만 알킬 술포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬 포스포네이트, 포타슘 라우레이트, 트리에탄올아민 스테아레이트, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 도데실술페이트, 알킬 폴리옥시에틸렌 술페이트, 소듐 알기네이트, 디옥틸 소듐 술포숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노신, 포스파티딜이노시톨 디포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딘산 및 이들의 염, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 콜린산 및 기타 담즙산 (예, 콜린산, 데옥시콜린산, 글리콜콜린산, 타우로콜린산, 글리코데옥시콜린산) 및 이들의 염 (예, 소듐 데옥시콜레이트 등)을 포함한다.
양쪽이온성 계면활성제는 전기적 중성이지만 동일한 분자 내에 국소 포지티브 및 네거티브 전하를 갖는다. 적절한 양쪽성이온 계면활성제는 이에 한정되지 않지만 양쪽성이온 인지질을 포함한다. 적절한 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 디아실-글리세로-포스포에탄올아민 (예컨대 디미리스토일-글리세로-포스포에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일-글리세로-포스포에탄올아민 (DPPE), 디스테아로일-글리세로-포스포에탄올아민 (DSPE) 및 디올레오릴-글리세로-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다. 음이온성 및 양쪽이온성 인지질을 포함하는 인지질의 혼합물이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 혼합물은 이에 한정되지 않지만 리소인지질, 계란 또는 대두 인지질 또는 이들의 조합을 포함한다. 인지질은, 음이온성, 양쪽이온성 또는 인지질의 혼합물이든지, 염 또는 탈염될 수도 있고, 수소화 또는 부분 수소화될 수도 있거나, 천연, 반합성 또는 합성일 수도 있다. 인지질을 수용성 또는 친수성 중합체와 접합시켜 본 발명에서 대식 세포로의 전달을 특이적으로 표적화할 수도 있다. 그러나, 기타 응용에서 다른 세포 또는 조직을 표적화하기 위하여 공액 인지질을 사용할 수도 있다. 바람직한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이고, 이것은 모노메톡시 폴리에틸렌글리콜 (mPEG)로 공지되어 있다. PEG의 분자량은 예를 들어 200 내지 50,000으로 다양할 수 있다. 통상적으로 입수가능한 일부 일반적으로 사용되는 PEG는 PEG 350, PEG 550, PEG 750, PEG 1000, PEG 2000, PEG 3000 및 PEG 5000을 포함한다. 인지질 또는 PEG-인지질 접합체는 이에 한정되지 않지만 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 항체 또는 제약학적 활성 약제를 포함하여 리간드에 공유 결합될 수 있는 작용기를 포함할 수도 있다. 이러한 작용기는 예를 들어 아미드 결합 형성, 디술피드 또는 티오에테르 형성 또는 비오틴/스트렙타비딘 결합을 통하여 리간드와 접합할 수 있다. 리간드-결합 작용기의 예는 이에 한정되지 않지만 헥사노일아민, 도데카닐아민, 1,12-도데칸디카르복실레이트, 티오에탄올, 4-(p-말레이미도페닐)부티르아미드 (MPB), 4-(p-말레이미도메틸)시클로헥산-카르복사미드 (MCC), 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (PDP), 숙시네이트, 글루타레이트, 도데카노에이트 및 비오틴을 포함한다.
적절한 양이온성 계면활성제는 이에 한정되지 않지만 4급 암모늄 화합물, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 키토산, 라우릴디메틸벤질암모늄 클로라이드, 아실 카르니틴 히드로클로라이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 디올레오일트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP, 또한 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTMA), 디미리스토일트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 디메틸아미노에탄카르바모일 콜레스테롤 (DC-Chol), 1,2-디아실글리세로-3-(O-알킬)포스포콜린, O-알킬포스파티딜콜린, 알킬 피리디늄 할라이드, 또는 장쇄 알킬 아민, 예를 들어 n-옥틸아민 및 올레일아민을 포함한다. 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염은 적절한 양이온성 계면활성제이다.
적절한 비이온성 계면활성제는 글리세릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르 (MACROGOLTM 및 BRIJTM), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (폴리소르베이트), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 (MYRJTM), 소르비탄 에스테르 (SPANTM), 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 세틸 알콜, 세토스테아릴 알콜, 스테아릴 알콜, 아릴 알킬 폴리에테르 알콜, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (폴록사머), 폴록사민, 메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 비결정성 셀룰로스, 전분 및 전분 유도체를 포함한 다당류, 예컨대 히드록시에틸전분 (HES), 폴리비닐알콜 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 바람직한 형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 바람직하게는 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 블록 공중합체이다. 이러한 중합체는 상표명 폴록사머 (POLOXAMER) (때때로 플루로닉 (PLURONIC)®으로 일컬어짐)으로 시판되고 스펙트럼 케미칼 앤드 루저 (Spectrum Chemical and Ruger)를 포함하는 몇몇 공급업자에 의해 시판된다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 중에 단쇄 알킬 사슬을 가진 것이 포함된다. 이러한 계면활성제의 한 가지 예는 솔루톨 (SOLUTOL)® HS 15, 폴리에틸렌-660-히드록시스테아레이트 (BASF 악티엔게젤샤프트 제조)이다.
표면-활성 생물학적 분자는 알부민, 카제인, 히루딘 또는 기타 적절한 단백질과 같은 분자를 포함한다. 예를 들어, 친수성 및 소수성 도메인을 가진 단백질이 사용될 수 있다. 다당류 표면 활성 생물학적 제제가 포함되고, 이에 한정되지 않지만 전분, 헤파린 및 키토산으로 구성된다. 기타 적절한 계면활성제는 아미노산, 예컨대 류신, 알라닌, 발린, 이소류신, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 메티오닌, 페닐알라닌 또는 이러한 아미노산의 유도체, 예를 들어 아미드 또는 에스테르 유도체 및 이러한 아미노산으로부터 형성된 폴리펩티드를 포함한다.
pH 조절제를 두 번째 용매에 첨가하는 것이 바람직할 수도 있다. 적절한 pH 조절제는 이에 한정되지 않지만 염산, 황산, 인산, 모노카르복실산 (예를 들어 아세트산 및 락트산), 디카르복실산 (예를 들어 숙신산), 트리카르복실산 (예를 들어, 시트르산), THAM (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), 메글루민 (N-메틸글루코사민), 수산화나트륨 및 아미노산, 예컨대 글리신, 아르기닌, 리신, 알라닌, 히스티딘 및 류신을 포함한다. 두 번째 용매는 약 3 내지 약 11 범위의 pH를 가져야 한다. 수성 매질은 추가로 삼투압 조절제, 예컨대 이에 한정되지 않지만 글리세린, 단당류, 예컨대 덱스트로스, 이당류, 예컨대 슈크로스, 삼당류, 예컨대 라피노스, 및 당 알콜, 예컨대 만니톨, 자일리톨 및 소르비톨을 추가로 포함할 수도 있다.
경구 투여 형태를 위하여, 하나 이상의 하기 부형제가 사용될 수도 있다: 젤라틴, 카제인, 레시틴 (포스파티드), 아라비아고무, 콜레스테롤, 트라가칸트, 스테아르산, 벤즈알코늄 클로라이드, 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 세토스테아릴 알콜, 세토마크로골 유화 왁스, 소르비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어 마크로골 에테르, 예컨대 세토마크로골 1000, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 통상적으로 입수가능한 트윈스 (TWEENS)TM, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소, 포스페이트, 도데실황산나트륨, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 비결정성 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알콜 (PVA), 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP). 이러한 부형제의 대부분이 문헌 [the Handbook of Pharmaceutical Excipients, published jointly by the American Pharmaceutical Association and The Pharmaceutical Society of Great Britain, the Pharmaceutical Press, 1986]에 상세히 기재되어 있다. 표면-변형제는 통상적으로 입수가능하고/하거나 당 기술분야에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 2개 이상의 표면-변형제가 조합되어 사용될 수 있다.
바람직한 형태에서, 유기 화합물의 소 입자를 제조하기 위한 방법은 첫 번째 용액을 두 번째 용매에 첨가하는 단계를 포함한다. 첨가 속도는 회분 크기, 및 유기 화합물을 위한 침전 속도에 의존한다. 전형적으로, 소-규모 실험실 공정 (1리터의 제조)을 위하여, 첨가 속도는 1분 당 약 0.05 cc 내지 1분 당 약 10 cc이다. 첨가 동안에, 용액을 일정한 교반 하에 두어야 한다. 광 현미경을 사용하여, 예비-현탁액을 형성하기 위하여 비결정성 입자, 반-결정성 고체 또는 과냉각 액체가 형성되는 것으로 관찰되었다. 이 방법은 예비-현탁액을 에너지-첨가 단계로 처리하여 비결정성 입자, 과냉각 액체 또는 반결정성 고체를 더욱 안정한 결정성 고체 상태로 전환하는 단계를 더 포함한다. 얻어진 입자는 상기 기재된 범위 내에서 동적 광 산란 방법 (예, 광자산란 분광법, 레이저 회절, 저-각도 레이저 광 산란 (LALLS), 중-각도 레이저 광 산란 (MALLS)), 광 차폐 방법 (예를 들어, 코울터 방법), 레올로지 또는 현미경 (광 또는 전자)에 의해 측정되는 평균 유효 입자 크기를 가질 것이다. 공정 범주 4에서, 에너지-첨가 단계를 동시에 수행하면서, 첫 번째 용액 및 두 번째 용매를 조합한다.
에너지-첨가 단계는 초음파처리, 균질화, 역류 균질화, 미세유동화 또는 충격, 전단 또는 공동화를 제공하는 기타 방법을 통하여 에너지를 첨가하는 것을 포함한다. 이 단계 동안에 샘플을 냉각하거나 가열할 수도 있다. 하나의 형태에서, 아베스틴 인코포레이티드 (Avestin Inc.)에 의하여 상표명 에멀시플렉스 (EmulsiFlex)-C160으로 시판되는 것과 같은 피스톤 갭 호모게나이저에 의하여 에너지-첨가 단계를 시행한다. 다른 형태에서, 초음파 프로세서, 예컨대 바이브라-셀 (Vibra-Cell) 초음파 프로세서 (600W) (Sonics and Materials, Inc.)를 사용하여 초음파처리에 의하여 에너지-첨가 단계를 달성한다. 또 다른 형태에서, 미국 특허 5,720,551 (본원에 참고로 포함되고 본 발명의 일부를 형성함)에 기재된 바와 같이 유화 장치를 사용하여 에너지-첨가 단계를 실행한다.
에너지 첨가 속도에 의존하여, 대략 -30 ℃ 내지 30 ℃의 범위 내로 처리된 샘플의 온도를 조절하는 것이 바람직할 수도 있다. 대안적으로, 처리된 고체에서 원하는 상 변화를 실행하기 위하여, 예비-현탁액을 에너지-첨가 단계 동안에 약 30 ℃ 내지 약 100 ℃의 범위의 온도로 가열하는 것이 필요할 수도 있다.
방법 B. 방법 B는 하기 측면에서 방법 A와는 상이하다. 첫 번째 차이는 계면활성제 또는 계면활성제의 조합을 첫 번째 용액에 첨가하는 것이다. 계면활성제는 상기 기재된 음이온성, 비이온성, 양이온성 계면활성제 및 표면-활성 생물학적 변형제로 구성된 군에서 선택될 수도 있다.
방법 A 및 방법 B 및 미국 특허 5,780,062의 비교예
미국 특허 5,780,062는 적절한 수-혼화성 첫 번째 용매에 화합물을 먼저 용해시킴으로써 유기 화합물의 소 입자를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 두 번째 용액은 중합체 및 양친매성물질을 수성 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 이어서 첫 번째 용액을 두 번째 용액에 첨가하여 유기 화합물 및 중합체-양친매성물질 착물로 구성된 침전물을 형성한다. '062 특허는 방법 A 및 B에서 이러한 방법의 에너지-첨가 단계를 이용하는 것을 개시하지 않는다. 안정성의 부족은 전형적으로 빠른 응집 및 입자 성장에 의해 증명된다. 일부 경우에, 비결정성 입자는 큰 결정으로서 재결정화된다. 상기 개시된 방법으로 예비-현탁액에 에너지를 첨가하는 것은 전형적으로 입자 응집 및 성장 속도의 저하뿐만 아니라 생성물 보관 동안에 재결정화 부재를 나타내는 입자를 제공한다.
방법 A 및 B는, 침전에 앞서서 중합체-양친매성물질 착물의 형성 단계가 부재한다는 점에서 '062 특허의 방법과는 더 구별된다. 이 방법 A에서, 중합체가 희석제 (수성) 상에 첨가되지 않을 때 이러한 착물은 형성될 수 없다. 이 방법 B에서, 양친매성물질로서 작용할 수도 있는 계면활성제 또는 중합체를 첫 번째 용매에 유기 화합물과 함께 용해시킨다. 이것은 침전에 앞서서 양친매성물질-중합체 착물의 형성을 배제한다. '062 특허에서, 소 입자의 성공적인 침전은 침전에 앞서서 양친매성물질-중합체 착물의 형성에 의존된다. '062 특허는 수성 두 번째 용액에서 양친매성물질-중합체 착물이 응집체를 형성한다는 것을 개시하고 있다. '062 특허는 소수성 유기 화합물이 양친매성물질-중합체 착물과 상호작용하고, 이에 의해 이러한 응집체의 용해도를 감소시키고 침전을 유발한다는 것을 설명하고 있다. 본 방법에서, 계면활성제 또는 중합체를 첫 번째 용매에 포함시키고 (방법 B), 이어서 두 번째 용매에 첨가할 때, '062 특허에 의해 제시되는 방법에 의해 부여되는 것에 비하여 더욱 균일하고 더욱 미세한 입자가 형성된다는 것이 증명되었다.
입자의 코팅
본 발명에 의해 제조되는 입자의 코팅 방법이 당업자에게 공지된 다양한 기술을 통해 달성될 수 있다. 코팅물을 공유 및/또는 비-공유 결합 (예를 들어, 공유 결합, 이온성 상호작용, 정전 상호작용, 이극-이극 상호작용, 수소 결합, 반데르 발스 힘, 소수성/소수성 도메인 상호작용, 가교, 및/또는 기타 상호작용)을 포함하여 다양한 결합을 통해 입자와 결합시킬 수 있다.
비-공유 결합 코팅물은, 입자를 제조하기 위하여 화학식 I에 따른 계면활성제 또는 그의 염이 사용되는 한, 예를 들어 여기에 개시된 입자 코어를 제조하기 위한 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 다수의 예비-조립된 입자를 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함한 용액과 혼합하여 본 발명에 따른 표면-변형 입자를 형성함으로써 제조될 수 있다. 용액을 예를 들어 마이크로플루이다이저, 피스톤 갭 호모게나이저, 역 전류 호모게나이저 또는 초음파 프로세서를 사용하여 고-전단 조건 하에서 혼합할 수 있다. 코팅물이 입자에 성공적으로 흡착되었는지를 확인하기 위하여, 코팅 방법 전 및 후에 제타 포텐셜을 측정함으로써 입자의 표면 전기 포텐셜을 결정할 수 있다. 코팅물의 흡착을 측정하기 위해 공지된 다른 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 형광 표지로 변형시킬 수 있거나 형광-표지된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염의 흡수를 형광 현미경에 의해 검출할 수 있다. 유리하게는, 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 코팅물을 예를 들어 입자의 표면에 흡착시킴으로써 입자 코어와 결합시킬 수 있으며, 이것이 화학식 I에 따른 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 코팅물을 입자 코어, 특히 상기 설명된 것과 같은 불량한 수용성 활성 약제를 포함하는 입자에 결합시키기 위해 효과적인 방법이다.
코팅물은 추가의 계면활성제를 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함한 용액에 첨가한 다음 예비-조립된 입자를 상기 용액과 혼합함으로써 화학식 I의 추가의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 하나 이상의 추가의 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 이러한 추가의 계면활성제(들)는 다양한 공지된 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 표면 활성 생물학적 변형제로부터 선택될 수 있다. 적절한 추가의 계면활성제는 여기에 앞서 기재된 계면활성제를 포함한다. 일례의 추가의 계면활성제는 이에 한정되지 않지만 폴록사머, 인지질, 폴리에틸렌 글리콜-공액 인지질, 및 폴리소르베이트를 포함한다. 추가의 계면활성제의 일례의 조합은 이에 한정되지 않지만 폴록사머 및 인지질, 폴록사머 및 폴리에틸렌 글리콜-공액 인지질 및 폴록사머 및 폴리소르베이트를 포함한다.
코팅된 입자의 세포 흡수
본 발명의 한 가지 실시양태는, 세포를 다수의 표면-변형 입자와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 것인, 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 세포는 포식 세포, 약한 포식 세포, 또는 비-포식 세포일 수 있다. 입자 코어는 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 전형적으로 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물은 여기에 정의된 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하고 표면-변형 입자는 약 1 nm 내지 약 2000 nm의 평균 크기를 갖는다. 이에 의해, 상기 언급된 코팅물을 포함하지 않는 입자가 사용될 때 적어도 활성 약제의 흡수에 비하여 세포에 의한 활성 약제의 흡수가 증진된다.
본 개시내용에 따른 코팅된 입자의 흡수 증진을 가능하게 하는 다양한 세포 유형이 질병 (예, 암성, 감염) 또는 염증 조직에 수송되기 때문에, 세포에 의한 흡수는 치료가 필요한 표적 조직에 활성 약제가 전달될 수 있도록 한다. 예를 들어, 감염 또는 염증에서 조기에 호중구가 우세하고, 이어서 혈관 맥관구조에서 나와서 감염된 조직으로 들어가는 단핵구-유래 식세포가 우세하며, 이러한 세포들은 화학식 I에 따른 계면활성제 또는 그의 염을 포함한 코팅물을 갖지 않은 입자에 비하여 적어도 본 발명에 따른 표면-변형 입자의 흡수 증진을 나타낸다. 고정된 대식 세포 (조직구)가 간, 신경계, 폐, 림프절, 골수 및 몇 개의 다른 조직에 결합되고, 이러한 세포는 화학식 I에 따른 계면활성제 또는 그의 염을 포함한 코팅물을 갖지 않는 입자에 비하여 적어도 본 발명에 따른 표면-변형 입자의 흡수 증진을 나타낸다. 세균, 바이러스 또는 진균 병원체에 의해 가장 영향을 받고 염증을 일으키는 조직은, 주화성에 의해 염증 부위로 향하는 성향을 가진 약물-로딩 세포 (예를 들어, 과립구)의 전달에 의해 표적화될 수 있다. 따라서, 상기 언급된 세포에 의한 흡수를 촉진함으로써, 이러한 세포로부터 제약학적 약제가 치료가 가장 필요한 영역으로 방출된다. 따라서, 질병 또는 질환의 치료를 위해 표적 조직으로의 약제의 전달은 본 발명에 따른 코팅된 입자와 함께 로딩된 세포에 의해 촉진된다. 이러한 질환 및 질병은 이에 한정되지 않지만 감염성 질병 또는 질환, 염증성 질병 또는 질환, 신경변성 질병 또는 질환, 및 증식성 질병 또는 질환을 포함한다.
코팅된 입자의 흡수를 증진시킬 수 있는 다수의 포식 세포 유형이 존재한다. 이러한 세포는 이에 한정되지 않지만 대식 세포, 단핵구, 과립구, 무과립구 및 호중구를 포함한다. 본 발명은 약한 포식 세포 및 비-포식 세포를 또한 포함한다. 따라서, 기타 적절한 세포 유형은 이에 한정되지 않지만 T-림프구, B-림프구, 눌세포, 자연 살해 세포, 림프구, 적혈구, 근육 세포, 골수 세포, 줄기 세포, 뼈 세포, 혈관 세포, 기관 조직 세포, 뉴런 세포, 호염기구, 호산구, 수지상 세포 및 내피 세포를 포함한다. 대상체에게 제약학적 활성 화합물을 전달하기 위하여 또 다른 세포가 사용될 수 있다. 입자를 흡수할 수 있는 이상 본 발명에서 어떠한 다른 세포라도 사용될 수 있다. 입자의 세포에 의한 흡수는 식세포 작용, 또는 세포내섭취 또는 세포 표면 위로 입자의 부착/흡착을 포함할 수도 있다. 세포 표면과 결합된 입자는 음세포작용에 의하여 세포 내로 흡수될 수 있고, 이것은 입자 주위에서 세포내 캡슐을 형성하기 위한 세포막의 함입이다. 음세포작용 ("포음작용")에서, 삼켜지는 입자는 비교적 작다 (예를 들어, 20 nm) [Watts et al., Endocytosis: what goes in and how?, Journal of Cell Science, 1992, volume 103(1), pages 1-8]. 음세포작용은 거의 모든 진핵세포에서 계속해서 일어난다.
질병 세포, 예를 들어 암성 세포는, 화학식 I의 계면활성제 또는 그의 염을 포함하는 코팅물을 갖지 않은 입자와 접촉된 세포에 비하여, 본 발명에 따른 표면-변형 입자의 증진된 흡수를 나타낼 수 있다. 종양 세포는 통상적으로 식세포 작용인 것으로 간주되지 않는다. 그러나, 실시예 7에 설명된 바와 같이, 표면-변형된 입자는 생쥐의 복강 내에서 난소 종양 세포에 의해 흡수되었다. 증진된 흡수의 실제 메커니즘은 공지되어 있지 않지만, 식세포 작용, 세포내섭취, 음세포작용 또는 기타 세포 흡수 메커니즘과 관련될 수 있다.
여기에 설명된 바와 같이, 입자는 유리하게는 세포 흡수를 촉진하는 코팅물을 포함한다. 특히, 코팅물은 단핵구, 대식 세포 및 T-림프구와 같은 세포에 의한 흡수를 촉진할 수 있고, 이것은 염증, 감염 및/또는 종양 부위로 화학주성과 같은 공지된 메커니즘에 의해 수송될 수 있고, 이에 의해 특정한 표적 조직으로 입자를 전달한다.
본 발명의 하나의 측면에서, (활성 약제로 로딩된 세포를 형성하기 위해) 표면-변형 입자로의 세포 접촉을 생체외 (즉, 포유동물 대상체의 밖에서) 수행한다. 대안적으로, 또는 추가로, 표면-변형 입자로의 세포 접촉을 생체내 (즉, 포유동물 대상체의 안에서) 수행할 수 있다. 접촉 단계 동안에 질병 또는 질환을 치료하는 데 효과적인 표면-변형된 입자의 양을 사용한다. 당업자라면, 특정한 양의 입자가 주요 표적 조직으로 수송되지 않거나 또는 주요 표직 조직에서 세포에 의해 방출되지 않는 세포 유형에 의해 흡수될 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 당업자라면, 이러한 양이 확립된 투여 프로토콜 범위 내에 있는 한, 투여된 입자의 양이 일반적인 프로토콜에 의해 최적화될 수 있다는 것을 이해한다.
생체외 투여를 위하여, 세포 분리장치 또는 성분채집술 장치를 사용하여 포유동물 대상체로부터 세포를 단리할 수 있다. 예를 들어, 다양한 세포를 단리하기 위하여 CS-3000TM 세포 분리장치 (펜월 인코포레이티드 (Fenwal Inc.), 미국 일리노이주 레이크 주리히) 또는 이소렉스 (ISOLEX)TM 세포 분리장치 (박스터 헬쓰캐어 코포레이션, 미국 일리노이주 디어필드)를 사용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 세포를 수득하기 위하여 생체외 세포 단리 기술의 숙련가에게 공지된 다른 방법이 사용될 수도 있다. 이러한 방법은, 이에 한정되지 않지만 말초 혈액의 성분채집술, 예를 들어 G-CSF, M-CSF 또는 GM-CSF를 통한 골수 세포의 가동술, 또는 척추, 흉골, 허리 또는 엉덩이뼈 능선 천자에 의한 골수 세포의 직접 제거를 포함한다. 생체외 세포는 세포 배양 배지 또는 당업자에게 공지된 기타 단리 시스템에 유지될 수 있다. 이러한 배지의 예는 알서버 (Alserver's) 용액, 에임스 (Ames') 배지, 이글스 (Eagle's) 기본 배지, CHO (챠이니즈 햄스터 난소) 세포 배양 배지, 클릭 (Click) 배지, 둘베코 변형 이글스 배지, 포스페이트-완충 염수, 포스페이트-완충 덱스트로스 또는 슈크로스, 이글스 밸런스 염 용액, 유전자 요법 배지-3, 게이스 (Gey's) 밸런스 염 용액, 글라스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, 행크스 (Hanks') 밸런스 염 용액, 히브리도마 배지, 이스코브스 (Iscove's) 변형 둘베코 배지, 당류를 가진 크렙스-헨셀레이트 (Krebs-Henseleit) 완충액, 레이보비츠 (Leibovitz) 배지 (L-15), M16 배지, 맥코이스 (McCoy's) 배지, MCDB, MDBK (매딘-다비 (Madin-Darby) 소 신장), MDCK (매딘-다비 개 신장), 배지 199, NCTC, 햄스 (Ham's) 배지 (예를 들어, 영양소 혼합물 F-10), 쿤스 (Coon's) 변형 햄스 배지, RPMI, 및 문헌 [Biochemicals & Reagents for Life Science Research, Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo., USA)]에 기재된 기타 배지를 포함한다. 이렇게 기재된 배양의 목적은 세포의 손실 없이 단순히 저장하거나 또는 세포 팽창을 조장하기 위한 성장 인자, 사이토카인 및 영양소의 적절한 첨가에 의하여 세포를 증식 또는 팽창하기 위한 것이다. 이러한 팽창은 환자가 세포 샘플의 제거를 위해 준비되어야 하는 시간을 최소화한다.
일단 단리되면, 세포를 코팅된 입자와 접촉시키거나 단시간 동안 입자의 세포 흡수를 위해 배양할 수 있다. 생체외 절차에서 사용된 입자의 농도는 이에 한정되지 않지만 사용된 세포의 유형, 세포의 농도, 사용된 활성 약제, 소 입자 분산액의 크기, 치료되는 질병 등을 포함하여 몇 가지 요인에 기인하여 변할 수도 있다. 그러나, 일반적으로 세포 단리물을 약 1 내지 약 300 mg/ml의 본 발명의 입자와 접촉시킨다. 세포와 입자의 접촉 동안에, 입자는 열역학적 포화 용해도보다 높은 농도이고, 이에 의해 입자를 포유동물 대상체로의 흡수 및 전달 동안에 입자 형태로 유지할 수 있도록 한다. 세포를 24시간까지 또는 그 이상 동안 입자와 함께 배양하여 약물 입자의 충분한 세포 흡수를 가능하게 한다.
이 방법이 세포를 파괴하지 않거나 세포를 대상체에게 투여하기에 유용하지 않게 하지 않는다는 요건 하에서, 생체외 세포에 의한 활성 약제의 입자를 흡수하기 위해 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체인식 분자를 통한 입자의 부위-특이적 전달이 사용될 수 있다. 예를 들어, 중공 나노입자를 통해 유전자를 특정한 세포 또는 조직으로 전달하는 것을 개시하는, 미국 특허 공고 2003/0092069 (여기에서 참고문헌으로 포함됨) 참조. 생체외 세포를 로딩하는 다른 방법은 일렉트로포레이션, 세포초음파처리 (sonoporation), 및 세포막을 파괴하고 (예를 들어, 초음파) 세포 내에 고체 입자를 삽입할 수 있는 기타 기계적 수단을 포함한다. 세포막을 일시적으로 붕괴시키고 이에 의해 DNA를 생육 세포 내에 로딩하는 것을 촉진하기 위하여, Zarnitsyn 등 (Zarnitsyn et al., Physical parameters influencing optimization of ultrasound-mediated DNA transfection, Ultrasound Med. Biol., 2004, volume 30(4), pages 527-538)에 의하여 초음파가 성공적으로 사용되었다. 기타 기계적 절차가 당업자에게 공지되어 있고 이 개시내용의 일부로서 포함된다. 세포막을 일시적으로 불안정화하기 위한 화학적 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 트랜스펙션 시약은 표면 활성 시약을 함유하고, 293펙틴 (FECTIN)TM 트랜스펙션 시약 및 리포펙타민 (LIPOFECTAMINE)TM을 포함하고, 양쪽 모두 인비트로겐 코포레이션 (미국 캘리포니아 칼스배드)의 제품이다. 세포 내로 DNA를 전달하기 위해 사용되는 계면활성제의 다른 예는 SAINTTM 시약 (신볼룩스 서라퓨틱스 (Synvolux Therapeutics) B.V.L.J. (네델란드 그로닌겐))이고, 피리디늄 계면활성제를 기초로 한다.
하기 입자의 설명이 여기에 개시된 모든 실시양태에 적용된다. 난용성 약물을 위하여, 세포가 경쟁 용해 과정보다 더 빠른 속도로 코팅된 활성 약제 입자를 흡수할 수 있는 한 세포 로딩 절차가 사용될 수 있다. 입자는 세포가 코팅된 입자를 흡수하도록 하고 입자의 완전한 용해 전에 이것을 표적 조직으로 전달할 수 있도록 하는 적절한 크기이어야 한다. 주요 표적 조직으로 수송하는 것으로 공지된 세포가 입자를 흡수할 수 있기 때문에, 활성 약제는 궁극적으로 세포로부터 방출되거나 또는 다른 방법으로 표적 조직 근처에 전달된다. 또한, 입자가 흡수 동안에 결정성 상태로 유지될 수 있도록, 활성 약제 조성물의 농도는 조성물의 포화 용해도보다 높게 유지되어야 한다.
하기 입자 설명이 여기에 개시된 모든 실시양태에 또한 적용된다. 입자를 투여하기 위해 당 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의하여 표면-변형 입자의 투여를 수행할 수 있다. 투여는 표면-변형 입자를 포유동물 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 표면-변형 입자 또는 그의 제약 조성물을 투여하기 위해 적절한 방법은, 이에 한정되지 않지만, 입자를 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 피내, 관절내, 경막내, 경막외, 대뇌내, 구강내, 직장내, 국소, 경피, 경구, 비내, 폐 경로를 통해, 복강내 및/또는 안내 투여하는 것을 포함한다. 투여 단계는 일시주사, 간헐 주입 또는 연속 주입에 의할 수 있다. 표면-변형 입자의 양 및 전달 방법은 숙련된 임상의사에 의해 결정될 수 있다. 사용되는 세포의 유형 (생체외 투여 방법), 치료되어지는 대상체의 성별, 체중 및 연령, 질병의 유형 및 성숙도, 투여되는 활성 약제 등을 포함하여 다양한 인자가 전달 양 및 방법에 영향을 미칠 것이다. 일반적으로, 활성 약제는 1일 투여량으로 1 pg 화합물/kg 체중 내지 1000 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 및 1 내지 20 mg/kg의 범위의 투여량으로 또는 더 장기간 또는 단기간, 예를 들어 격일, 매주 2회, 매주 또는 매일 2 내지 3회로 동등한 양으로 제공될 수도 있다.
이에 한정되지 않지만 감염성 질병 또는 질환, 염증성 질병 또는 질환, 신경변성 질병 또는 질환, 및 증식성 질병 또는 질환을 포함하여 다양한 질병 또는 질환이 본 방법에 의해 치료될 수 있다. 이러한 측면에서, 이러한 질병 또는 질환의 증세는 본 방법에 의해 완화될 수 있다.
여기에서 사용된 "감염성 질병 또는 질환"이란 병원성 미생물, 예컨대 세균, 바이러스, 기생충 또는 진균에 의해 유발된 상태를 가리킨다. 개시된 방법으로부터 이점을 얻을 수 있는 감염성 질병 또는 질환은, 이에 한정되지 않지만 바이러스 감염 (레트로바이러스 감염 포함), 예컨대 뎅기열, 엔테로바이러스 감염, HIV, B형 간염, C형 간염 및 인플루엔자; 진균 감염; 기생충 감염, 예컨대 아프리카 트리파노소마증 및 말라리아, 및 세균 감염, 예컨대 콜레라, 수막염 및 결핵을 포함한다.
여기에서 사용된 "염증성 질병 또는 질환"은 전형적으로 조직 손상 또는 파괴와 관련된 붉어짐, 열, 팽윤 및 통증 (즉, 염증)을 특징으로 하는 상태를 가리킨다. 염증성 질병 또는 질환은 특히 백혈구의 유입 및/또는 백혈구 화학주성과 관련된다. 염증성 상태는 병원성 미생물 또는 바이러스로의 감염, 및 이에 한정되지 않지만 외상 또는 심근경색 또는 발작 후의 재관류를 포함한 비감염성 사건, 외래 항원에 대한 면역 반응, 및 자가면역 반응으로부터 비롯될 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법 및 화합물로의 치료에 순종하는 염증성 상태는 특정한 방어 체계, 비-특이적 방어 체계의 반응과 관련된 상태, 및 염증성 세포 활성화와 관련된 상태를 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "특정한 방어 체계"는 특정한 항원의 존재에 반응하는 면역 체계의 성분을 가리킨다. 특정한 방어 체계의 반응으로부터 비롯된 염증성 상태의 예는 이에 한정되지 않지만 외래 항원에 대한 전통적인 반응, 자가면역 질환, 및 B-세포 및/또는 T-세포에 의해 매개되는 지연된 유형 과민 반응 (즉, B-림프구 및/또는 T-림프구)을 포함한다. 만성 염증성 질환, 이에 한정되지 않지만 신장 및 골수 이식을 포함한 고형 이식 조직 및 기관의 거부, 및 이식 편대 숙주병 (GVHD)이 특정한 방어 체계의 반응으로부터 비롯된 염증성 상태의 추가의 예이다.
여기에서 사용된 용어 "비-특이적 방어 체계"는 면역학적 기억이 불가능한 백혈구 (예를 들어, 이에 한정되지 않지만 호중구, 호산구 및 호염기구, 거대 세포, 단핵구, 대식 세포를 포함한 과립백혈구)에 의해 매개되는 염증성 상태를 가리킨다. 적어도 부분적으로 비-특이적 방어 체계의 반응으로부터 비롯되는 염증성 상태의 예는 이에 한정되지 않지만 성인(급성) 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 다발성 기관 손상 증후군, 재관류 손상, 급성 사구체신염, 반응성 관절염, 급성 염증성 성분을 가진 피부염, 급성 화농성 수막염, 이에 한정되지 않지만 발작, 열 손상, 염증성 장 질환, 과립세포 수혈 관련 증상, 및 사이토카인-유도 독성을 포함하여 기타 중추 신경계 염증성 상태를 포함한다.
본 발명의 치료 방법은 염증성 세포 활성화와 관련된 상태의 완화 방법을 포함한다. "염증성 세포 활성화"란 증식성 세포 반응의 자극 (이에 한정되지 않지만 사이토카인, 항원 및 자가-항체 포함), 가용성 매개체의 생성 (이에 한정되지 않지만 사이토카인, 산소 라디칼, 효소, 프로스타노이드 및 혈관작용 아민 포함), 또는 새롭거나 증가된 수의 매개체의 세포 표면 발현 (이에 한정되지 않지만 주 조직적합성 항원 및 세포 부착 분자 포함), 염증성 세포 (이에 한정되지 않지만 단핵구, 대식 세포, T 림프구, B 림프구, 과립구 (호중구, 호염기구 및 호산구를 포함한 다형핵 백혈구), 거대세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 및 내피 세포 포함)에 의한 유도를 가리킨다. 당업자라면, 이러한 세포에서 이러한 표현형의 하나 또는 조합의 활성화가 염증성 상태의 개시, 영구화 또는 악화에 기여할 수도 있다는 것을 이해할 것이다.
성공적으로 치료될 수 있는 다른 질병 또는 질환은, 이에 한정되지 않지만 류마티스 관절염, 그레이브병, 중증근육무력증, 갑상샘염, 당뇨병, 염증성 장 질환, 자가면역 난소염, 전신 홍반루푸스, 및 쇼그렌 증후군을 포함하는, 염증 또는 감염을 특징으로 하는 질병 또는 질환을 포함한다.
성공적으로 치료될 수 있는 신경변성 질병 또는 질환의 예는 이에 한정되지 않지만 파킨슨병, 알쯔하이머병, 다발성 경화증, 뇌척수염, 뇌염 (HIV 뇌염 포함), 헌팅톤 무도병, 근위축측삭경화증 (루게릭 병으로 알려짐), 전측두엽 치매, 프리온 질환, 크로이펠츠-야콥병, 및 부신백질형성장애증을 포함한다. 성공적으로 치료될 수 있는 기타 신경변성 질병 또는 질환은 픽병, 전두측두엽 변성, 진행성 언어상실증 및 의미 치매를 포함한다. 전염성 해면상뇌증 (TSE)으로 알려진 프리온 질병은 크로이펠츠-야콥병, 신규 변형 크로이펠츠-야콥병, 게스트만-슈트로이슐러-샤잉커병, 치명적 가족성 불면증 및 쿠루를 포함한다. 신경변성 질병 또는 질환은 알렉산더병, 알퍼스병, 모세관 확장실조, 배튼병 (또한, 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병), 캐너번병, 코케인 증후군, 피질기저핵 변성, HIV-관련 치매, 케네디병, 크라베병, 레비 소체 치매, 마카도-조셉병 (척수 소뇌성 실조증 유형 3), 다계통 위축, 신경보렐리아증, 펠리제우스-메르츠바흐병, 원발성 측 경화증, 레프슴병, 잔트호프병, 실러병, 정신분열병, 척수 소뇌성 실조증, 척수근위축증, 스틸-리차드슨-올스제위스키병 및 척수 매독을 포함한다.
개시된 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 증식성 질병 또는 질환은 이에 한정되지 않지만 결장암, 신장암, 비 소 세포 폐암, 소 세포 폐암, 폐 선암종, 두경부암, 복강암 (예컨대 난소암, 위장암, 복부암 및 중피종), 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 뇌암 (예컨대 신경아교종, 수막종, 별아교세포종), 위암, 소장암, 육종, 흑색종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수종 및 아교모세포종을 포함한다. 갑상샘염은 하시모토 갑상샘염, 아급성 갑상샘염 (또한, 드 퀘르뱅 갑상샘염으로 알려짐), 무증상성 갑상샘염 (또한, 무통 갑상샘염으로 알려짐), 산후 갑상샘염, 약물-유도 갑상샘염, 방사선-유도 갑상샘염 및 급성 화농성 갑상샘염을 포함한다.
개시내용은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 잘 이해될 것이며, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않지만 개시내용에 따라 일례의 실시양태를 설명한다.
실시예
실시예 1
DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 제조
마이크로침전/균질화 절차를 사용하여 파클리탁셀 입자를 제조하였다. 구체적으로, 파클리탁셀 (0.5 g)을 N-메틸 피롤리돈(NMP) (3 g)에 용해시키고 회전자-고정자 혼합과 함께 수성 계면활성제 수용액 A (25 mL)에 첨가하였다. 용액 A (pH ~7.8 내지 8.0)는 물 100 mL 중에 인산나트륨, 이염기성 무수 (0.13 g), 인산나트륨, 일염기성, 일수화물 (0.01 g), 글리세린 (2.2 g), DSPE-mPEG 2000 (0.2 g), 및 폴록사머 188 (0.5 g)을 함유하였다 (표 1).
Figure 112011099292333-pct00003
얻어진 현탁액을 호모게나이저 (아베스틴 C5)로 옮기고 현탁액 온도가 적어도 50 ℃에 이를 때까지 정압에서 순환시켰다. 현탁액을 20,000±2,000 psi의 표적 압력 및 60 ℃의 표적 온도에서 60분 동안 균질화하였다. 현탁액을 수집하고 10,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리 주기의 완결 시에, 상층액을 경사분리하고 동일 부피의 수성 계면활성제 B로 대체하였다. 용액 B (pH ~7.8 내지 8.0)는 용액 A와 동일한 성분을 함유하였고, 추가로 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP, 0.1 g)를 함유하였다 (표 1). 펠릿을 재현탁하고, 매회 대체 계면활성제로서 용액 B를 사용하여 원심분리를 2회 이상 반복하였다. 세 번째 재현탁 후에, 나노현탁액을 20,000 ± 2,000 psi의 표적 압력 및 60 ℃의 표적 온도에서 30분 동안 균질화하였다. 최종 현탁액은 ~160 내지 170 nm의 크기를 가진 입자를 함유하였다.
형광-표지화 파클리탁셀을 약물 농축물에 첨가함으로써 상기 절차에 따라 형광-표지화 파클리탁셀 입자를 제조하였다. 구체적으로, 상기 기재된 약물 농축물에 400 ㎍ 오레곤 그린-표식 파클리탁셀 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드)을 상기 기재된 약물 농축물에 첨가하여 유동 세포측정법 및 형광 현미경에서 검출되는 적절한 형광 강도를 가진 형광-표지화 파클리탁셀 입자를 얻었다.
실시예 2
DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 인간 단핵구에 의한 흡수
인간 단핵구에 의한 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수를 프로타민-코팅된 파클리탁셀 입자 및 DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수와 비교하였다. 0.08 mL의 25 mg/mL 프로타민 용액을 0.01 mL의 오레곤 그린-표지화 파클리탁셀 현탁액에 10 mg/mL로 첨가함으로써 프로타민-코팅된 파클리탁셀 입자를 제조하였다.
DOTAP-코팅된 입자 및 프로타민-코팅된 입자 양쪽 모두를 흡수 실험을 위해 사용되는 조건 하에서 약 포지티브 하전시켰다. 따라서, 파클리탁셀 입자의 흡수 증진이 코팅된 입자의 포지티브 전하에만 기인할 수 있는지의 여부를 평가하기 위하여 프로타민-코팅된 파클리탁셀 입자를 사용한 비교 실험을 설계하였다.
10 mL의 10 mM HEPES 완충액 pH 7.38에 30 ㎕ 현탁액을 첨가함으로써 도 2 (및 표 2)에 나타낸 세포 흡수 실험에서 사용되는 파클리탁셀 제제에서 제타 포텐셜 측정을 수행하였다. DOTAP- 및 프로타민-코팅된 파클리탁셀 나노입자는 약 포지티브 제타 포텐셜을 갖는 반면, DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188-코팅된 파클리탁셀 나노입자 (DOTAP 또는 프로타민 부족)는 시험된 조건 하에서 네거티브 제타 포텐셜을 가졌다 (데이터를 나타내지 않음).
인간 공여체의 전 혈액으로부터 흡수 실험에서 사용하기 위한 인간 단핵구를 정제하였다. 이러한 세포를 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트 (BD 바이오사이언스)에서 배지 A에서 매 2 내지 3일 마다 배지를 바꾸면서 5 내지 7일 동안 배양하였다. 배지 A는 1L를 만들기 위하여 다음으로 보충된 DMEM (기브코 BRL 목록 번호 11960-051)을 함유하였다: 1000 U/ml 재조합 인간 대식 세포-콜로지 자극 인자-1 (rhM-CSF-1) (케미콘), 100 mL 열-불활성화 인간 혈청, 10 mL 200 mM L-글루타민 (기브코 BRL 촉매 번호 25030-081), 2 mL 50 mg/ml 젠타마이신 (시그마 목록 번호 G1397) 및 400 ㎕ 25 mg/mL 시프로플록사신 (바이엘 코드 번호 89-001-1). 현미경 적용을 위하여 세포를 유리 커버슬립에서 배양하였다.
부착성 단핵구-유래 대식 세포를 37 ℃에서 다양한 기간 동안 파클리탁셀 제제 (DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자, 프로타민 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자, 또는 DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188 코팅물을 가진 파클리탁셀) 입자로 처리하였다. 현탁액 제제는 ~10 μM의 최종 농도로 파클리탁셀 (오레곤 그린-표식 파클리탁셀로 도핑됨)을 함유하였다. 배양 후에, 세포를 2 mL/웰 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 적어도 3회 세척하였다. 세포를 PBS에 모으고 마이크로퓨지 관으로 옮겼다 (또는 세포가 커버슬립에 부착성이라면 고정되고 장착됨).
파클리탁셀 입자의 흡수를 평가하기 위하여, 세포를 CD14 발현에 대해 염색하고 유세포분석법을 통해 분석하였다. 아이소타입 대조 (CD14+ 선택 게이트 설정) 및 비처리 세포 (오레곤 그린 선택 게이트 설정) 양쪽 모두를 위하여 점 그래프를 기초로 하여 게이트를 설정하였다. 오레곤 그린 형광 (％ 파클리탁셀+/CD14+)에 대해 포지티브인 CD14+ 세포의 비율 (단핵구-유래 대식 세포), 즉 내재화되거나 흡착된 파클리탁셀 입자를 가진 세포의 퍼센트, 및 평균 형광 강도 (MFI) 양쪽 모두에 의하여 파클리탁셀 흡수를 평가하였다. MFI 값은 세포의 집단 내에 함유된 파클리탁셀의 농도와 직접적으로 상관관계가 있다.
파클리탁셀 현탁액의 흡수 속도를 도 1 및 도 2에 나타낸다 (결과를 나노현탁액 흡수 후 파클리탁셀 포지티브 세포의 퍼센트 및 세포-관련/내재화 입자의 MFI 양쪽 모두로서 나타냄). 도 1에서, 세포를 0, 3, 5 시간 동안 파클리탁셀 입자에 노출시키는 반면, 도 2에서 세포를 0, 0.25, 0.5 및 1시간 동안 파클리탁셀 입자에 노출시켰다. DOTAP 코팅물은 DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188-코팅된 입자 (도 1 및 2) 및 프로타민-코팅된 입자 (도 2)에 비하여 파클리탁셀 입자의 흡수를 실질적으로 개선시켰다. 이러한 결과는 파클리탁셀 입자의 흡수 증진이 코팅된 입자의 포지티브 전하에만 기인하지 않는다는 것을 제시한다.
추가로, 도 2는 저장 시에 파클리탁셀 제제의 안정성을 증명한다. DOTAP 샘플 1을 흡수 실험 이전에 대략 3개월 동안 저장하였다. 제조 직후에 흡수 실험에서 DOTAP 샘플 2를 사용하였다. 이러한 결과는 몇 개월 동안에 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 저장이 입자 흡수 속도에 상당한 영향을 미치지 않음을 나타내었다.
파클리탁셀 입자의 흡수는 역상 HPLC에 의해 정량화되었다. 세포를 15분, 30분 및 60분 동안 파클리탁셀 현탁액과 배양한 후에 파클리탁셀 흡수를 측정하였다. 아세토니트릴 (500 ㎕)을 각각의 세포 현탁액의 500 ㎕ 분취액에 첨가하고 와류 혼합함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플을 10,000 rpm에서 25 ℃에서 30분 동안 원심분리하고, 역상 HPLC에 의해 상층액을 분석하여 샘플에서 파클리탁셀의 양을 결정하였다 (표 2).
Figure 112011099292333-pct00004
도 3은 1, 2 또는 6일 배양 후에 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 나노현탁액의 단핵구-유래 대식 세포에 의한 흡수를 나타낸다. 세포를 0 내지 3.5 시간의 다양한 시간 동안 파클리탁셀 입자에 노출하였다. 결과는, 세포가 오랫동안 배양될수록, 이들이 DOTAP-코팅된 입자에 덜 반응성임을 나타낸다. 세포가 단핵구로부터 대식 세포로 성숙함에 따라 모든 식세포 작용이 증가할 것으로 예상되고, 따라서 DOTAP 코팅물이 더 어린 세포 (비교적 단 시간 동안 시험관내 배양된 세포)에 비하여 더 성숙한 세포에서 세포 흡수를 증진시키기 위한 장점을 제공하지 못할 수도 있다는 것이 이론화되었다. 다른 한편, 이러한 단핵구가 순환 단핵구인 경향이 있는 반면 더 성숙한 세포는 (예를 들어, 비장 및 간에서) 고정된 대식 세포로 분화되는 경향이 있기 때문에, 비교적 어린 단핵구에 의한 DOTAP-코팅된 입자의 증진/촉진된 흡수에 의하여 치료제가 더욱 효율적으로 전달될 수도 있다.
실시예 3
PLGA 또는 포스파티딜세린 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 인간 단핵세포에 의한 흡수
DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수를, 폴리락트-코-글리콜산 (PLGA)-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수 및 포스파티딜세린 (PS)-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수와 비교하였다. PLGA 입자를 균질화보다는 초음파처리하고, 포스페이트 완충액, 글리세린, PLGA 및 폴록사머 188을 함유하는 용액을 사용하여 제형하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 절차에 따라 PLGA-코팅된 파클리탁셀 입자 및 PS-코팅된 파클리탁셀 입자를 제조하고, 포스페이트 완충액, 글리세린, DSPE-mPEG 2000, 폴록사머 188 및 포스파티딜세린을 함유하는 용액을 사용하여 PS 입자를 제형하였다.
파클리탁셀 현탁액의 흡수 속도를 도 4에 나타낸다 (결과를 나노현탁액 흡수 후에 파클리탁셀 포지티브 세포의 퍼센트 및 세포 결합/내재화 입자의 MFI 양쪽 모두로서 나타내었다). DOTAP 코팅물은 PLGA-코팅되거나 포스파티딜세린-코팅된 입자에 비하여 입자의 흡수를 실질적으로 개선하였다. 이러한 결과는, 파클리탁셀 입자의 흡수 증진이 중합체 또는 계면활성제 코팅물의 존재에만 기인하지 않는다는 것을 제안한다.
실시예 4
CTAB 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 인간 단핵 세포에 의한 흡수
DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수를 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)-코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수와 비교하였다. 포스페이트 완충액, 글리세린, DSPE-mPEG 2000, 폴록사머 188 및 CTAB를 함유하는 용액을 사용하여 CTAB 입자를 제형하는 것 이외에는, CTAB-코팅된 파클리탁셀 입자를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
파클리탁셀 현탁액의 흡수 속도를 도 5에 나타낸다 (결과를 나노현탁액 흡수 후에 파클리탁셀 포지티브 세포의 퍼센트 및 세포 결합/내재화 입자의 MFI 양쪽 모두로서 나타내었다). DOTAP 코팅물은 CTAB-코팅된 입자에 비하여 입자의 흡수를 실질적으로 개선하였다. 이러한 결과는, 파클리탁셀 입자의 흡수 증진이 포지티브 하전된 기 및 소수성 기 양쪽 모두를 가진 코팅물의 존재에만 기인하지 않는다는 것을 제안한다.
실시예 5
전 혈액에서 DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 흡수
건강한 인간 공여자로부터 전 혈액을 EDTA 배큐테이너 (BD 바이오사이언스) 내로 빼내었다. 오레곤 그린-표식된 파클리탁셀로 도핑된 파클리탁셀 나노현탁액을 관 회전장치에서 1.7 mL 마이크로퓨지 관에서 전 혈액 (~ 10 μM 최종 농도)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 전 혈액의 분획을 저장 (hypotonic) 용혈 용액 (BD 바이오사이언스)에 노출시켜 적혈구를 용혈시켰다. 용혈된 샘플을 CD14 발현을 위해 염색하였다. 전 혈액 및 염색된 세포 양쪽 모두를 유세포분석법을 통해 분석하였다.
적혈구 (RBC) 또는 혈소판 집단에서 오레곤 그린 형광의 명백한 증가가 관찰되지 않았다. DOTAP 제형된 파클리탁셀 현탁액을 사용하여 용혈된 샘플에서 CD14+ 단핵구 집단에서 실질적인 형광 증가가 관찰되었다. DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188 코팅물을 가진 파클리탁셀 제형은 CD14+ 단핵구 집단에서 흡수를 나타내지 않았다. 오레곤 그린 형광에 의해 평가되는 다른 주 세포 집단에서 명백한 흡수가 없었다 (데이터 나타내지 않음). 이러한 결과는 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자가 적혈구, 혈소판 및 혈액에 존재하는 기타 세포 유형에 비하여 단핵구에 의해 선택적으로 흡수됨을 시사한다. 단핵구에 의한 DOTAP-코팅된 입자의 이러한 선택적 흡수는 질병, 종양 또는 감염 부위에 치료제를 더욱 효율적으로 지정 전달함을 시사한다.
실시예 6
DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 생쥐 복막 대식 세포에 의한 흡수
생쥐로부터 복막 대식 세포를 단리하고 DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자 및 이러한 코팅물을 갖지 않은 파클리탁셀 입자에 노출시켰다. 형광 영상은 DOTAP-코팅된 입자에 노출된 복막 대식 세포가 DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188-코팅된 입자에 노출된 것에 비하여 다량의 파클리탁셀을 흡수하였음을 나타내었다 (데이터 나타내지 않음). 이 실시예는 DOTAP가 복막 대식 세포에 의하여 입자의 흡수를 증진시킴을 뒷받침한다.
실시예 7
DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 인간 OVCAR-3 세포에 의한 흡수
적색 형광 단백질 (RFP)로 인간 OVCAR-3 세포를 트랜스펙트하여 이들을 적색으로 형광을 발하였다. 이러한 세포를 DOTAP 코팅물을 가진 오레곤 그린-파클리탁셀을 사용하여 제조된 파클리탁셀 입자 및 DOTAP 코팅물을 갖지 않은 파클리탁셀 입자에 노출시켰다. 형광 영상은, 입자가 DOTAP로 코팅되었을 때에만, RFP-OVCAR-3 세포가 입자를 흡수한다는 것을 나타내었다 (데이터 나타내지 않음). DSPE-mPEG 2000/폴록사머 188로 코팅된 입자의 흡수가 눈에 보이지 않았다. 이 실시예는 DOTAP가 인간 난소암 세포에 의한 입자의 흡수를 증진시킨다는 것을 뒷받침한다. OVCAR-3 세포에 의한 DOTAP 코팅된 파클리탁셀 입자의 흡수 속도는, 종양 세포가 입자를 직접적으로 흡수하지만 실제 메커니즘을 알려져 있지 않음을 시사한다.
실시예 8
DOTAP 코팅물을 가진 파클리탁셀 입자의 생쥐에서의 체류 시간
DOTAP 코팅물을 가진 오레곤 그린-표식 파클리탁셀 입자를 생쥐에 피하 주사하였다. 입자 체류 시간을 증명하기 위하여 형광 영상을 시간에 걸쳐 획득하였다. 30일에서의 녹색 형광 지속은, 파클리탁셀 입자가 피하 주사될 때 적어도 30일 동안 유지됨을 나타내었다 (데이터 나타내지 않음).
별도의 실험에서, DOTAP 및 로다민-표식 계면활성제 (리사민 (Lissamine) 로다민 B 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염 (rDHPE); 미국 캘리포니아주 칼스배드 인브트로겐)를 함유하는 코팅물을 가진 오레곤 그린-표식 파클리탁셀 입자를 건강한 생쥐에 복강내 (IP) 주사하였다. 입자 체류 시간을 증명하기 위하여 시간에 걸쳐 형광 영상을 획득하였다. 데이터는 파클리탁셀 나노입자가 건강한 생쥐에서 복강 공간으로부터 빠르게 (약 24 시간 이내) 제거되었음을 나타내었다 (데이터 나타내지 않음).
시험 생쥐에 RFP-OVCAR-3 세포를 이식하고 종양이 자라게 하는 생쥐 모델을 설정하였다. 종양은 RFP를 발현하였고 적색 형광을 가졌다. DOTAP 코팅물을 가진 오레곤 그린-표식 파클리탁셀 입자를 복강내 주사에 의해 RFP-발현 종양을 가진 생쥐에 투여하였다. 형광을 사용한 종양에 대해 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 존재 및 위치를 검출하였다.
형광 현미경에 의하여 종양 및 파클리탁셀 입자를 관찰하였다 (종양에 대해 적색 형광, 입자에 대해 녹색 형광). 입자가 복강으로부터 빠르게 제거되는 건강한 생쥐와는 달리, DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자는 주사 후 30일까지 종양-포함 생쥐에 존재하며, 이것은 생쥐의 복강에 존재하는 종양이 체류 시간의 증가에 부분적으로 책임이 있음을 나타낸다. 또한, DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자는 종종 종양과 공동-국소화된다. 따라서, 이 실시예는 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자가 건강한 조직에 비하여 종양 부위를 표적화하고, 치료 약물의 지속된 방출을 효과적으로 전달할 수 있도록 상당한 기간 동안 표적화 종양 부위에서 지속될 수 있음을 뒷받침한다.
추가로, DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자가 존재할 때, 적색 형광 강도가 시간에 걸쳐 감소하고 종양 세포 사멸과 일치한다. 역으로, 파클리탁셀 입자의 부재 하에서 적색 형광이 시간에 걸쳐 강해진다. 따라서, 이러한 실시예는 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 투여가 생체내에서 암을 효과적으로 치료함을 증명한다.
생쥐 모델에서 난소 종양 세포 사멸을 유도하는 데 효과적인 투여량을 확인하기 위하여 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자 (15 mg/kg 및 25 mg/kg)의 다양한 투여량을 사용한 투여량 범위 연구를 수행하였다. 다양한 투여량의 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 투여에 대한 반응에서, 주어진 투여량의 효능을 결정하기 위하여 종양 크기를 측정하였다. 1일에 투여된 25 mg/kg 투여량이 투여 후 25일에 종양의 크기를 감소시켰다. 2회 (1일 및 14일) 투여된 15 mg/kg 투여량은 25일까지 종양을 근절하였고, 녹색 형광 약물의 잔류물을 남겼다. 이 연구는 DOTAP-코팅된 파클리탁셀 입자의 투여가 생체내에서 암을 효과적으로 치료함을 더욱 뒷받침한다.
실시예 9
DOTAP 코팅물을 가진 프로테아제 억제제 입자의 제조
마이크로침전/균질화 절차 (앞서 설명됨)를 사용하여 프로테아제 억제제 인디나비르 (IDV) 및 리토나비르 (RTV)의 입자를 제조하였다. 이어서, 입자를 DOTAP를 포함한 다양한 계면활성제로 코팅하였다. 상이한 프로테아제 억제제 입자 제제의 흡수 및 효과를 비교하였다. 이 연구에서 사용된 프로테아제 억제제 제제를 표 3에 나타낸다.
Figure 112011099292333-pct00005
입자를 코팅하기 위하여 리포이드 E80 (1.4％), P-188 (0.5％), DSPE-mPEG2000 (0.2％) 및/또는 DOTAP (0.1％)를 포함하는 용액에 입자를 현탁시켰다. 입자를 대략 2％의 중량-대-부피로 용액에 첨가하였다. 입자를 코팅 용액에 첨가하고 울트라-튜랙스 (Ultra-Turrax) T-18 (IKA 웍스 인코포레이티드, 미국 노쓰캐롤라이나 윌밍톤) 회전자-고정자 믹서를 사용하여 4 내지 7분 동안 혼합하여 초기 입자 크기를 감소시킴으로써 표면-변형 입자의 현탁액을 제조하였다. 이어서 현탁액을 20,000 파운드/제곱인치로 대략 30회 통과 동안 또는 원하는 입자 크기에 이를 때까지 균질화하였다. DOTAP-함유 현탁액을 위하여, 균질화된 현탁액을 원심분리 (5 ℃에서 30분 동안 12,100×g)하여 약물 입자를 펠릿화하였다. 울트라-튜랙스 T-18과 혼합함으로써 DOTAP를 함유하는 계면활성제에 약물을 재현탁하였다. 완충액으로서 10 mM 인산나트륨 또는 10 mM HEPES를 사용하여 약 알칼리성 pH 7.8에서 나노현탁액을 제형하였다. 글리세린 (2.25％) 또는 슈크로스 (9.25％)로 탄력성을 조절하였다. 입자를 표식하기 위하여 적색 형광 표식, 리사민 로다민 B 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염 (rDHPE; 미국 캘리포니아주 칼스배드 인비트로겐)을 사용하였다.
모든 제형을 위하여, HORIBA LA 920 광 산란 장치 (HORIBA 인스트루먼츠 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 어바인; RRI = IDV를 위해 1.08 및 RTV를 위해 1.20)를 사용하여 입자 크기를 측정하였다. 말번 제타사이저 나노 시리즈 장치 (말번 인스트루먼츠 인코포레이티드, 미국 메사츄세츠주 웨스트보로우)에서 0.1 ml의 현탁액을 10 mM HEPES (pH 7.4)의 9.9 ml에 희석함으로써 제타-포텐셜을 측정하였다. RP-HPLC에 의하여 제형의 최종 약물 함량을 결정하였다.
실시예 10
인간 단핵구 유래 대식 세포에 의한 DOTAP 코팅물을 가진 프로테아제 억제제 입자의 흡수
HIV-1 및 간염 혈청음성 공여자로부터 백혈구성분채집술에 의해 인간 단핵구를 수득하고 문헌 [Dou et al. (Blood, 108(8): 2827-2835, 2006)]에 기재된 바와 같이 역류 원심분리 세정에 의하여 정제하였다. 라잇트(Wright)-염색된 사이토신을 준비하고 항-CD68 (클론 KP-1)으로 면역표지화함으로써 세포 순도를 분석하였다. 단핵구를 습윤 대기 (5％ CO2) 중에서 10％ 열-불활성화되고 모여진 인간 혈청, 1％ 글루타민, 50 ㎍/ml 젠타마이신 10 ㎍/ml 시프로플록사신 및 1000 U/ml 재조합 인간 대식 세포 콜로니 자극 인자가 보충된 둘베코 변형 이글 배지 중에서 1 × 106 세포/ml의 농도로 37 ℃에서 배양하였다. 대식 세포로의 분화를 유도하기 위하여, 문헌 [Gendelman et al., J. Exp. Med. 167; 1428-1441, 1988]에 기재된 바와 같이 대식 세포 콜로니 자극 인자의 존재 하에서 7일 동안 단핵구를 배양하였다.
MDM (웰 당 2 × 106)을 1, 10 및 100 μM의 농도에서 표면-변형 프로테아제 억제제 입자와 함께 배양하였다. 시간 당 세포 수집을 수행하면서 24시간 동안 배지를 바꾸지 않은 채로 입자의 흡수를 평가하였다. 1 ml의 포스페이트-완충 염수로 3회 세척하고, 이어서 세포를 1 ml 포스페이트-완충 염수로 문지름으로써 부착성 MDM을 수집하였다. 샘플을 950 × g에서 10분 동안 4 ℃에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿을 200 ㎕의 메탄올에서 초음파처리하고 10,000 × g에서 10분 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. RP-HPLC 분석을 수행할 때까지 메탄올 추출물을 -80 ℃에서 보관하였다.
RTV의 2개의 상이한 제형을 개발하였다 (표 3 참조). 가장 느린 속도 및 가장 낮은 절대 흡수 량을 가진 RTV 제형은 RTV-1이었고, 이것을 DSPE-mPEG2000 단독으로 코팅하였고, 200 nm의 크기 및 -25.6 mV의 제타-포텐셜을 가졌다 (표 3). 가장 빠른 흡수 속도 및 가장 높은 RTV 축적을 가진 RTV 제형은 RTV-4였고, 이것을 P-188, DSPE, mPEG2000 및 DOTAP의 조합으로 코팅하였고, 620 nm의 크기 및 +15.5 mV의 제타-포텐셜을 가졌다. 최대 흡수가 RTV-4에 대해 8시간에서, 그리고 RTV-1에 대해 12시간에서 발생하였다. 절대 흡수 량은 RTV-1 (24.68 ㎍/1 × 106 세포)에 대해서 보다 RTV-4 (40.98 ㎍/1 × 106 세포)에 대하여 대략 1.5배 더 컸다. RTV-4의 물리적 성질은 IDV-4와 유사하고, 이것은 DOTAP를 함유하였다. 이것은 IDV 입자의 흡수를 최적화하는 물리적 성질이 또한 RTV 입자의 흡수를 최적화한다는 것을 시사한다.
표면-코팅된 입자로의 초기 12시간 노출 후에, 배지를 격일마다 반씩 바꾸면서 MDM으로부터 약물 방출을 2 주일에 걸쳐 평가하였다. 복제 세포와 함께 배지 샘플을 모으고, 문헌 [Dou et al. (Virology 358: 148-158, 2007)]에 기재된 방법의 변형을 사용하여 RP-HPLC 분석을 수행할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다. 메탄올-추출된 세포 현탁액을 21,800 × g에서 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하였다; 배지 샘플을 해동시키고 메탄올의 첨가에 의해 단백질 제거하였다. 샘플을 21,800 × g에서 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 진공 하에 건조상태로 증발시키고 70 ㎕의 100％ 메탄올에 재현탁하였다. C8 가드 카트리지를 가진 YMC 팩 옥틸 C8 컬럼 (워터스 인코포레이티드, 미국 메사츄세츠주 밀포드)을 사용하여, 가공된 배지 또는 세포의 3개 20 ㎕ 샘플을 RP-HPLC에 의해 평가하였다. 47％ 아세토니트릴/53％ 25mM KH2PO4, pH 4.15 (1N HCl로 조절됨)로 구성된 이동상을 212 nm에서 UV/Vis 검출과 함께 0.4 ml/분으로 펌프질하였다. 모든 프로테아제 억제제 제조를 위하여, 메탄올 중에 만들어진 자유 약물 (0.025 - 100 ㎍/ml)의 표준 곡선에 비교하여 정량화를 평가하였다.
각각의 약물 및 제형을 위하여 다양한 방출 프로파일이 나타났다. 세포 내에 여전히 함유되고 배지로 방출된 약물의 양을 평가하였다. IDV-1 또는 IDV-4로 처리된 MDM을 비교할 때, 모든 시점에서 세포 약물 함량은 상당히 (p < 0.05) 상이하였다. 11일까지 IDV-1로 처리된 세포에서 약물이 검출되지 않았지만, IDV-4에 대해 15일에서 약물이 존재하였다 (1.61 ㎍/1 × 106 세포). 배지 내의 약물 농도는 3 내지 15일에서 상당히 상이하였다 (p < 0.05). IDV-1로 처리된 세포에서 13일까지 배지에서 약물이 검출되지 않는 반면, IDV-4 처리된 MDM에서 약물이 쉽게 존재하였다 (16.37 ㎍/ml).
RTV-1 또는 RTV-4로 처리된 MDM을 비교할 때, 모든 시점에서 세포 및 배지 양쪽의 약물 함량이 상이하였다 (p < 0.05). 약물이 15일에서 RTV-1 (0.19 ㎍/1 × 106 세포) 및 RTV-4 (8.69 ㎍/1 × 106 세포) 양쪽 모두에 대하여 15일에서 세포 내에 존재하였다. 또한, 약물이 15일에서 RTV-1 (0.28 ㎍/ml) 및 RTV-4 (11.62 ㎍/ml) 양쪽 모두에 대하여 배지 내에 존재하였다. MDM은 DOTAP (IDV-1 및 RTV-1)로 코팅되지 않은 입자에 비해 훨씬 길게 DOTAP-코팅된 입자 (IDV-1 및 RTV-1)를 보유하였다.
실험은 DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자가 MDM에 의해 더욱 효율적으로 흡수되고 이러한 DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자가 비-DOTAP 코팅된 프로테아제 억제제 입자에 비교할 때 더 장시간 동안 MDM에 보유됨을 증명한다. 따라서, DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자가 로딩된 MDM이 감염된 조직으로의 효과적인 약물 담체이다.
실시예 11
DOTAP를 함유하는 입자와 함께 로딩된 세포의 기능성 평가
단핵구 및 표면-변형 입자와 함께 로딩된 MDM에서 세포 기능이 영향을 받는지의 여부를 평가하기 위하여 연구를 수행하였다. 단핵구 및 MDM을 12시간 동안 100 μM의 입자로 처리하고, 알라마르블루 (ALAMARBLUE)TM 분석 (AbD 세로텍, 미국 노쓰캐롤라이나 롤리)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 24시간 동안 세포독성을 평가하였다. 알라마르블루 시약은 세포 성장으로부터 비롯된 생육 배지의 화학적 환원에 대한 반응으로 형광을 발하고 색을 변화시키는 산화-환원 지시약을 포함한다. 따라서, 산화-환원 지시약의 강도는 세포 성장 및 세포 생육에 비례한다.
결과는, 각각의 IDV 입자 제형이 사용된 최고 농도 (100 μM)에서 단핵구 또는 MDM의 생육력을 상당히 변화시키지 않았음을 나타낸다. 추가로, 100 μM에서 시험된 모든 RTV 입자 제제는 대식 세포 생육력을 변화시키지 않지만 15％만큼 단핵구 생육력을 저하시켰다.
혈액-뇌 장벽을 가로지른 단핵구 이동은 문헌 [Gendelman et al. (J. Exp. Med. 167(4): 1428-1441, 1988)] 및 [Chaudhuri et al. (J. Cereb. Blood Flow Metab. 28(4): 697-711)]에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이러한 분석을 위하여, BD 바이오사이언스 (플랭클린 레이크스, 미국 뉴저지)로부터의 콜라겐-코팅된 플루오로블록 (FLUOROBLOK)TM 염색된 조직 배양액 삽입물 (3 ㎛ 공극 크기)에 2×104 개 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (HBMECs)를 접종하였다. HBMEC 단층이 이러한 삽입물에서 보이지 않기 때문에, 단층 형성 및 융합을 입증하기 위하여 EVOM 볼트미터 (월드 프리시젼 인스트루먼츠, 미국 플로리다주 사라소타)를 사용하여 경상피 전기 저항성의 수동 판독을 평가하였다. 단핵구를 칼세인-AM (인비트로겐)으로 5 μM/1×106 세포로 45분 동안 표식하고, 포스페이트-완충 염수로 세척하였다. 이동을 위하여, 2.5×105 표식 단핵구를 HBMEC 단층 (플루오로블록 삽입물의 상부 챔버)에 놓아 두고, 단층을 가로질러 2시간 동안 이동시켰다 (37 ℃, 5％ CO2). 형광 플레이트 판독기 (흡광도: 494 nm, 여기: 517 nm)를 사용하여 하부 챔버로 이동하는 단핵구를 정량화하고, 공지된 수의 칼세인-표식 세포의 연속 희석으로부터 유래된 표준 곡선과 비교하였다. 입자 로딩이 로딩되지 않은 단핵구 및 MDM에 비하여 IDV-4 및 RTV-4 양쪽 모두에 대하여 인공 혈액-뇌 장벽 모델을 가로질러 단핵구 이동을 증가시키긴 하지만, 이러한 증가는 통계적으로 의미가 없다.
이러한 연구는 DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자로 MDM을 로딩하는 것이 세포에 독성이 없고 MDM이 세포 기능을 보유함을 증명한다. 따라서, DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자와 함께 로딩된 MDM이 감염된 조직으로의 약물 전달을 위해 효과적이다.
실시예 12
항레트로바이러스 효능 DOTAP 함유 입자 제제
MDM에 의해 흡수된 프로테아제 억제제 표면-변형 입자의 시험관내 항레트로바이러스 효과를 결정하기 위하여, 세포를 12시간 동안 1, 10 및 100 μM의 농도에서 각각의 표면-변형 입자 제제로 처리하고, 약물 처리 후 1, 5, 10 및 15일에 0.01 감염성 바이러스 입자/세포의 감염 중복도로 HIV-1 (단리 ADA)로 시험감염하였다. 바이러스 감염 후에, 격일마다 배지를 반씩 바꾸면서 10일 동안 세포를 배양하였다. RT 활성에 의해 분석되는 바와 같이, 자손 비리온 생성의 측정을 위하여 5, 7 및 10일에 배지 샘플을 세포 배양액으로부터 수집하였다. 감염 후 10일에 면역염색에 의하여 감염된 세포에 의한 HIV-1 p24 항원의 발현에 관해 병렬 분석을 수행하였다.
RT 활성을 측정하기 위하여, 배지 샘플 (10 ㎕)을 100mM 트리스-HCl (pH 7.9), 300 mM KCl, 10 mM 디티오트레이톨 (DTT), 0.1％ 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올-40 및 물을 함유하는 용액 10 ㎕와 혼합하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 15분 동안 배양하고, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl2, 0.05％ 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올-40, 10 ㎍/ml 폴리(A), 0.250 U/ml 올리고 d(T)12-18 및 10 μCi/ml 3H-티미딘 5'-트리포스페이트(TTP)를 함유하는 용액 25 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고; 플레이트를 37 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 50 ㎕의 냉 10％ TCA를 각각의 웰에 첨가하고, 웰을 유리 섬유 필터 위에 수집하고 탑카운트 (TopCount) NXT 카운터 (퍼킨엘머 인코포레이티드, 미국 메사츄세츠 왈탐)를 사용한 3-섬광 분광법에 의해 3H-TTP 혼입에 대하여 필터를 평가하였다.
일련의 데이터들을 확실히 비교할 수 있도록 항레트로바이러스 활성에 대해 실시예 10에 기재된 흡수 및 여기 연구를 위해 사용된 것과 동일한 농도에서 동일한 제형을 시험하였다. 시험된 모든 시점에서 IDV-4에 대해 RT 활성을 위한 투여량-의존적 효과가 관찰된 반면, IDV-1은 단지 1일 및 5일에 잠재적인 투여량-의존적 반응을 나타내었다. 투여량을 1일에 100 μM로 투여할 때, 5일에 시작하여 2개의 제형 간에 상당한 차이 (p<0.05)가 관찰되었다. 15일까지, IDV-1 처리 군은 감염된 대조와 다르지 않은 반면, IDV-4 처리군은 상당한 (p<0.05) 바이러스 억제를 유지하였으며, 이에 의해 DOTAP를 포함하는 제형의 증가된 효능을 증명하였다.
RTV-1 및 RTV-4에 대한 RT 활성 억제의 비교는 모든 시점에서 양쪽 약물에 대한 잠재적인 투여량-의존적 경향을 나타내었다. RTV-4로 처리된 세포에 대해 시간에 걸쳐 감소된 RT 활성이 유지된 반면, RTV-1으로 처리된 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 15일까지, RTV-1은 대조에 비해 RT 활성에서 34.84％ 감소를 나타내는 반면, RTV-4는 98.42％만큼 RT 활성을 억제하였고, 이것은 DOTAP를 포함하는 제형의 증가된 효능을 증명하였다.
표면-변형된 입자로 처리되고 이어서 HIV-1으로 감염된 MDM에서 항레트로바이러스 활성을 구체화하기 위하여 HIV-1 p24 항원의 발현을 사용하였다. HIV-1 감염 후 10일에 4％ 포스페이트-완충 파라포름알데히드로 세포를 고정시켰다. HIV-1 감염된 세포의 밀도를 결정하기 위하여 HIV-1 p24에 대한 생쥐 단클론성 항체 (1:10, 다코, 미국 캘리포니아 카르핀테리아)를 사용하였다. 이미지-프로 플러스, v.40 (미디어 사이버네틱스 (Media Cybernetics Inc.) 미국 미들랜드 베테스다)를 사용하여 밀도측정법에 의해 면역염색의 정량화를 수행하였다. 현미경 시야 당 전체 영상 면적의 퍼센트로서 포지티브 면적 (인덱스)을 결정함으로써 p24의 발현을 정량화하였다.
IDV-1 및 IDV-4로 처리된 감염된 MDM에 의한 p24 발현의 평가는, IDV-4로 처리된 세포에 대하여 모든 시점에서 p24의 발현에서의 투여량-반응 효과를 나타낸 반면, IDV-1로 처리된 세포에 대해서는 단지 1일에서만 나타내었다. 2개의 제제 간의 의미있는 차이 (p<0.05)가 1일에 시작하여 모든 농도에서 나타났다. 15일에, 100 μM의 IDV-1로 처리된 세포는 감염된 대조와는 상이하지 않은 반면, 100 μM의 IDV-4로 처리된 세포는 상당한 차이를 나타내었다 (p=0.0003). RTV-1 또는 RTV-4로 처리된 군에서 HIV-1 p24 항원 밀도의 비교는, 모든 농도에서 양쪽 제제에 대해 모든 시점에서 잠재적인 투여량-반응 효과를 나타내었다. 100 μM의 RTV 입자로 처리된 세포에 대해 1일에 시작하여 HIV-1 p24의 밀도의 의미있는 차이 (p=0.0156)가 관찰되었다. 15일까지, RTV 제형 간에 모든 처리 농도가 상당히 상이하였다 (p<0.021)
결론적으로, IDV-4 및 RTV-4는 15일 동안 감염된 세포에서 HIV-1 자손 비리온 생성을 억제하는 반면, IDV-1 및 RTV-1은 그렇지 않았다. 이것은 p24 표식의 증가된 밀도에 의해 증명되는 바와 같이 p24 억제의 점진적인 손실뿐만 아니라 시간 경과에 따른 바이러스 분산의 성공에 의해 증명되었다. 이러한 일련의 데이터는 RT 분석의 데이터를 반영하고, 시간 경과에 따라 RT 활성 및 HIV-1 p24에서의 감소를 나타냄으로써 IDV-4 및 RTV-4에 대한 바이러스 복제의 감소된 속도를 증명하였다. 따라서, DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자는 레트로바이러스 활성을 유지하고, DOTAP-코팅된 프로테아제 억제제 입자와 함께 로딩된 MDM이 HIV 감염을 치료하는 데 효과적이다.
특정한 실시양태를 예증하고 설명하였으나, 본 발명의 의도에서 벗어나지 않는 한 다수의 변형이 가능하고, 본 발명의 보호 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정된다.

Claims (71)

  1. 입자 코어가 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 하기 화학식 I을 가진 계면활성제 또는 그의 염을 포함하며, 표면-개질 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는, 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하는 표면-개질 입자.
    <화학식 I>
    Figure 112015045779574-pct00030

    [상기 식에서, n 및 m은 1이고;
    R1, R2 및 R3은 메틸이고;
    R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일 및 시스-9-옥타데세닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다]
  2. 제1항에 있어서, R4 및 R5가 시스-9-옥타데세노일인 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 코팅물이 폴록사머 및 인지질 중 적어도 하나를 포함하는 제2 계면활성제를 더 포함하는 입자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 약제가 진통제, 마취제, 각성제, 아드레날린성 약제, 아드레날린 차단제, 아드레날린 억제제, 아드레노코르티코이드, 아드레날린유사작용제, 항콜린제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 알킬화제, 알칼로이드, 알로스테리 억제제, 합성대사 스테로이드, 식욕감퇴제, 제산제, 지사제, 해독제, 항엽산제, 해열제, 항류마티스제, 정신치료제, 신경차단제, 항-염증제, 항기생충제(antihelmintics), 항생물질, 항응고제, 항우울제, 항간질제, 항진균제, 항섬유화제, 항-감염제, 항-기생충제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항미코박테리아제, 항-신생물제, 항원충제, 항바이러스제, 항불안제, 베타-아드레날린수용체 차단제, 코르티코스테로이드, 기침 억제제, 도파민작용제, 지혈제, 혈액작용약, 수면제, 면역학적 제제, 무스카린제, 부교감신경흥분제, 프로스타글란딘, 방사성의약품, 진정제, 자극제, 교감신경흥분제, 비타민, 크산틴, 성장인자, 호르몬, 항프리온제 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 치료제인 입자.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 약제가 파클리탁셀인 입자.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 약제가 프로테아제 억제제, 뉴클레오시드 역 전사효소 억제제, 및 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제로 구성된 군에서 선택되는 입자.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 약제가 항-염증제인 입자.
  8. 제1항 또는 제2항의 다수의 입자를 포함하는 제약 조성물.
  9. 다수의 표면-개질 입자를 포함하고 활성 약제의 세포 흡수를 증진시키기 위한 약제이며, 상기 표면-개질 입자가 입자 코어 및 입자 코어와 결합된 코팅물을 포함하며, 입자 코어가 소 분자, 펩티드 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 활성 약제를 포함하고, 코팅물이 하기 화학식 I을 가진 계면활성제 또는 그의 염을 포함하며, 표면-개질 입자가 약 1 nm 내지 약 2,000 nm의 평균 크기를 갖는, 약제.
    <화학식 I>
    Figure 112015045779574-pct00031

    [상기 식에서, n 및 m은 1이고;
    R1, R2 및 R3은 메틸이고;
    R4 및 R5는 시스-9-옥타데세노일 및 시스-9-옥타데세닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다]
  10. 제9항에 있어서, 세포가 포식 세포인 약제.
  11. 제9항에 있어서, 세포가 종양 세포인 약제.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 피내, 관절내, 경막내, 경막외, 대뇌내, 구강내, 직장내, 국소, 경피, 경구, 비내, 폐 경로를 통해, 복강내, 안내 또는 이들의 조합에 의해 투여될 수 있는 약제.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스 관절염, 그레이브병, 중증근육무력증, 갑상샘염, 당뇨병, 염증성 장 질환, 자가면역 난소염, 전신 홍반루푸스, 및 쇼그렌 증후군으로 구성된 군에서 선택되는 염증성 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약제.
  14. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 바이러스 감염, 엔테로바이러스 감염, HIV 감염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 진균 감염, 아프리카 트리파노소마증, 말라리아, 콜레라, 수막염 및 결핵으로 구성된 군에서 선택되는 감염성 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약제.
  15. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 결장암, 신장암, 비 소 세포 폐암, 소 세포 폐암, 두경부암, 복강암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 뇌암, 육종, 흑색종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수종 및 아교모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 증식성 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약제.
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