CN103275965A - 一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有自恢复多功能软包埋细胞固载体系及其制备方法。该细胞固载体系的制备方法包括以下步骤：1）将纳米粒子与生物活性分子复合形成纳米生物杂化复合物；2）将步骤1）得到的复合物与细胞复合，使细胞表面包埋一层纳米生物杂化层；3）加入培养液，将固载后的细胞在适合生长的条件下培养，即得到所述具有自恢复多功能软包埋细胞固载体系。本发明所构建的细胞固载体系具有保护细胞、延长细胞寿命、抗酸碱、防紫外的功能。并且工艺简单，重现性好，所用原料价廉易得，低成本，符合环境要求。

Description

一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系及其制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料与生物技术交叉领域，尤其涉及一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系及其制备方法。

背景技术

自然界中的微生物，如酵母菌、大肠杆菌、光合细菌等以其来源广、环境无污染、易获取等优势已经广泛运用于食品工业、能源环境、生物化工等多个研究领域。由于暴露在外界环境的微生物容易受到多种外界不利因素的影响，稳定性较差，不利于重复利用，严重制约其应用和发展。实际上在自然界中，比如硅藻和放射虫等具有结构精致的硅质外壳，能够起到保护细胞的作用。所以从大自然中得到启发，在细胞表面构建无机外壳能够起到保护细胞的作用。

近年来，逐渐发展起来的细胞固载技术由于具有高稳定性和可控性，已经引起了人们的极大关注，在生物传感器、生物反应器、生物燃料电池等领域已经得到广泛应用。目前报道较多的细胞固载材料集中于：二氧化硅[参见Sung Ho Yang,et.al.,Angew Chem.Int.Ed.2009,48,9160-9163]、磷酸钙[参见Ben Wang,et.al.,Angew Chem.Int.Ed.2008,47,3560-3564]、聚电解质[参见Alberto Diaspro,et.al.,Langmuir2002,18,5047-5050]、石墨烯[参见Sung Ho Yang et.al.,Macromol.Biosci.2012,12,61–66]等。尽管二氧化硅、磷酸钙等材料具有较好的生物适应性，能够固载细胞形成“人工孢子”结构，用于抵抗外界不利因素对细胞的影响起到保护细胞的功能，但是较高的机械强度而且能够与细胞壁作用导致生物硅化、不可逆性且功能单一等缺点影响了细胞分裂以及可循环性的应用。利用软物质对细胞进行固载成为细胞固载技术进一步研究的重点，而常用的软物质，如聚电解质[参见Alberto Diaspro,et.al.,Langmuir2002,18,5047-5050]、聚多巴胺[参见Sung Ho Yang,et.al.,J.Am.Chem.Soc.2011,133,2795-2797]等对细胞的活性有影响,不利于固载材料与细胞相结合。而且，目前报道的固载材料都存在功能单一的弱点，限制了细胞固载体系应用的进一步拓展，所以设计一种具有自恢复多功能的生物适应性外壳对于保护细胞和实现多功能化有着重大科学意义，并成为细胞固载技术的重大需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够提高细胞活性、防紫外和抗酸碱的具有自恢复多功能软包埋细胞固载体系及其制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：

一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系，其特征在于，它包括细胞及包埋细胞表面的自组装纳米生物杂化层，所述纳米生物杂化层为纳米粒子与生物活性分子复合而成。

上述方案中，所述纳米粒子为金属纳米粒子、氧化物纳米粒子、或纳米碳，所述金属纳米粒子为金、银、铂、钒、钛、钪、铁、镍、铝、或钴；所述氧化物纳米粒子为氧化钛、四氧化三铁或氧化钴。

上述方案中，所述生物活性分子为氨基酸、多肽、核酸、或蛋白质。

上述方案中，所述氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸、或天冬氨酸。

上述方案中，所述细胞为Synechococcus7942、Escherichia coli BL21、或Saccharomycescerevisiae。

一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）将纳米粒子与生物活性分子复合形成纳米生物杂化复合物；

2）将步骤1）得到的复合物与细胞复合，使细胞表面包埋一层纳米生物杂化层；

3）加入培养液，将固载后的细胞在适合生长的条件下培养，即得到所述具有自恢复多功能软包埋细胞固载体系。

上述方案中，所述生物活性分子为氨基酸、多肽、核酸、或蛋白质。

上述方案中，所述氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸、或天冬氨酸。

上述方案中，所述细胞为Synechococcus7942、Escherichia coli BL21、或Saccharomycescerevisiae。

本发明的有益效果为：本发明工艺简单，重现性好，且所用原料价廉易得，低成本，制备中不用到毒性的化学药品，符合环境要求。本发明的开发具有功能界面的细胞固载体系有利于生物反应器、生物传感器、生物燃料电池的进一步研究和开发。

附图说明

图1中a）为实施例1的纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的超薄切片TEM图，b）为所述纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的线扫描金元素图。

图2为实施例1的纳米金生物杂化层包埋的细胞分裂过程及SEM图。（标尺为1微米）

图3为实施例1的纳米金生物杂化层包埋的分裂细胞的超薄切片TEM图。

图4为实施例1的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞(以B示意)相对活性分析图。

图5为实施例1的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以a和c示意）和裸细胞(以b和d示意)1天（以a和b示意）和20天（以c和d示意）的荧光显微镜图。

图6为实施例1的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞（以B示意）暴露在紫外光下不同时长细胞相对活性分析图。

图7为不同的pH值环境下，实施例1的细胞固载体系（以A示意）和裸细胞(以B示意)的相对活性分析图。

图8中a）为实施例2的纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的超薄切片TEM图，b）为所述纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的线扫描金元素图。

图9为实施例2的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞(以C示意)相对活性分析图。

图10为实施例2的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以a和c示意）和裸细胞(以b和d示意)1天（以a和b示意）和20天（以c和d示意）的荧光显微镜图。

图11为实施例2的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞（以B示意）暴露在紫外光下不同时长细胞相对活性分析图。

图12为不同的pH值环境下，实施例2的细胞固载体系（以A示意）和裸细胞(以B示意)的相对活性分析图。

图13中a）为实施例3的纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的超薄切片TEM图，b）为所述纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的线扫描金元素图。

图14为实施例3的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞(以C示意)相对活性分析图。

图15为实施例3的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以a和c示意）和裸细胞(以b和d示意)1天（以a和b示意）和20天（以c和d示意）的荧光显微镜图。

图16为实施例3的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞（以B示意）暴露在紫外光下不同时长细胞相对活性分析图。

图17为不同的pH值环境下，实施例3的细胞固载体系（以A示意）和裸细胞(以B示意)的相对活性分析图。

图18中a）为实施例4的纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的SEM图，b）为所述的纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的超薄切片TEM图，c）为所述的纳米金生物杂化层包埋聚球藻细胞的TEM图，d）为c)图放大后TEM图。

图19为实施例4的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以B示意）和裸细胞(以A示意)相对活性分析图。

图20为实施例4的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞（以B示意）暴露在紫外光下不同时长细胞相对活性分析图。

图21中a）为实施例5的纳米金生物杂化层包埋酵母细胞的超薄切片TEM图，b）为所述纳米金生物杂化层包埋酵母细胞的可见光显微镜图，内图为裸细胞可见光显微镜图，标尺为10微米。

图22为实施例5的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞(以B示意)相对活性分析图。

图23为实施例5的纳米金生物杂化层包埋的细胞分裂过程及SEM图。

图24为实施例5的纳米金生物杂化层包埋的分裂细胞的超薄切片TEM图。

图25为实施例5的纳米金生物杂化层包埋的细胞（以A示意）和裸细胞（以B示意）暴露在紫外光下不同时长细胞相对活性分析图。

图26为不同的pH值环境下，实施例5的细胞固载体系（以B示意）和裸细胞(以A示意)的相对活性分析图。

图27为溶菌酶存在的环境下不同时长，实施例5的细胞固载体系（以B示意）和裸细胞（以A示意）的相对活性分析图。

图28为溶菌酶存在的环境下不同时长，实施例5的细胞固载体系（以B示意）和裸细胞（以A示意）的可见光显微镜图，标尺为5微米。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对本发明的限制。

实施例1

本实施例提供一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系的制备方法，它包括如下步骤：

1）制备金纳米粒子：50-100mL去离子水中加入0.4-1.5mL1%的氯金酸储液，接着加入1-3mL38.8mM的柠檬酸钠溶液。1-5分钟后加入新鲜配制的1.25mg/ml的硼氢化钠和38.8mM柠檬酸钠的混合溶液，继续搅拌得到酒红色溶胶。

2）制备纳米金生物杂化复合物：将0.01g-0.1g半胱氨酸粉末加入到30-90mL的上述纳米金溶胶中，搅拌5-20分钟，静置后离心，用去离子水清洗一次。

3）取0.5-2毫升细胞悬浮液，2500rpm离心后溶于0.85%-0.90%的氯化钠溶液，并与步骤2）中产物充分混合、离心后分散在BG11培养基中，置于30-100mL培养瓶中摇床培养，光照条件2000lx，温度20-25°C。

本实施例中的Synechococcus7942藻种购自中国科学院水生生物研究所，由本发明人根据本领域常规方法来培养。

从图1中a）和b）可以看出纳米金生物杂化层包埋在聚球藻细胞表面，形成疏松多孔结构，有利于营养物质的运输和太阳光的吸收；c）可以看出聚球藻细胞被纳米金生物杂化层所包埋；d）可以看出包埋在细胞表面的金元素含量很高，说明细胞被纳米金生物杂化层所包埋。

本发明制备的纳米金生物杂化层具有自恢复的功能，见图2。a)所示为纳米金生物杂化层修饰的母细胞，细胞分裂初期DNA复制，细胞体积变大，然后细胞中部细胞膜和细胞壁向内生长（以b示意），形成隔膜将细胞质分成两半，形成两个子细胞（以c示意）。从SEM图中可以看出在细胞分裂的整个过程中，纳米金生物杂化层能够保护细胞，具有自恢复功能。超薄切片图也说明了分裂中的细胞表面包埋纳米金生物杂化层。由于细胞结构的复杂性，细胞表面一般不容易被修饰，但是利用带有氨基和羧基以及R基的基团的生物活性分子能够和细胞壁的外膜糖蛋白的氨基、巯基等结合，能够使生物杂化层包埋在细胞表面。和传统的硬物质材料相比，选用的软物质材料能够随着细胞的分裂，对分裂中和分裂后细胞进行再一次包埋。

本发明制备的具有多功能外壳的细胞固载体系的功能：延长细胞寿命（图4和图5），防紫外（图6），抗酸碱（图7）。本发明所构建的纳米金生物杂化层具有多孔结构，有利于太阳光吸收和营养物质的运输，并能够保持细胞处于稳定的，亲水性生长环境。如图4所示包埋后的聚球藻细胞在培养35天后能够保持一定活性，而悬浮细胞只能保持20天的活性。由于半胱氨酸分子具有氨基和羧基，能够在一定范围内起到缓冲培养体系酸碱的作用，具有抗酸碱的功能。另外，利用纳米金生物杂化层对紫外有很强的吸收能力，包埋细胞后能够在一定程度上保护细胞免受紫外辐射的影响，具有防紫外的功能。

实施例2

本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤2）生物活性分子选用天冬氨酸，加入到纳米金溶胶中。同样的，所构建的细胞固载体系（图8）具有延长细胞寿命（图9和图10）、防紫外（图11）、抗酸碱（图12）的功能。

实施例3

本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤2）生物活性分子选用赖氨酸，将其溶解在pH为5的溶液中，然后加入到纳米金溶胶中。同样的，所构建的细胞固载体系（图13）具有延长细胞寿命（图14和图15）、防紫外（图16）、抗酸碱（图17）的功能。

实施例4

本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤2）生物活性分子选用谷胱甘肽，加入到纳米金溶胶中。同样的，所构建的细胞固载体系（图18）具有延长细胞寿命（图19）和防紫外（图20）的功能。

实施例5

本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于选用Saccharomyces cerevisiae细胞（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心），培养基选用YPD培养基。所构建的细胞固载体系（图21）具有提高细胞活性（图22）、保护细胞防止溶菌酶侵害（图27）和（图28）、抗酸碱（图26）、防紫外（图25）的功能。

本发明制备的纳米金生物杂化层具有自恢复的功能。图23所示为纳米金生物杂化层修饰的G0期细胞，然后细胞分裂进入S期，形成芽体与母细胞相连，然后细胞进入G2期由体侧突出形成球形芽体和M期由母细胞相接触形成新的体壁，最后进入G1期与母细胞分离形成新的细胞。从SEM图中可以看出在细胞分裂的整个过程中，纳米金生物杂化层能够保护细胞，具有自恢复功能。超薄切片图也说明了分裂中的细胞表面包埋纳米金生物杂化层。

实施例6

本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤2）生物活性分子选用牛血清蛋白，在牛血清蛋白溶液中加入纳米金溶胶。所构建的细胞固载体系具有延长细胞寿命、抗酸碱、防紫外的功能。

实施例7

本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于选用Escherichia coli BL21细胞，培养基选用LB培养基。所构建的细胞固载体系具有延长细胞寿命、抗酸碱、防紫外的功能。

可以理解的是，本发明的纳米粒子并不局限于实施例所选，还可以为银、铂、钒、钛钪、铁、镍、铝、或钴等金属纳米粒子、纳米碳、及氧化钛、四氧化三铁或氧化钴等氧化物纳米粒子。

本发明所述的氨基酸为所有的天然氨基酸，其并不局限于本发明实施例中的半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸。

本发明所述的细胞为所有的原核细胞，其并不局限于本发明实施例中的Synechococcus7942及Escherichia coli BL21，以及所有真核细胞，其并不局限于本发明实施例中的Saccharomyces cerevisiae。

需要说明的是，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系，其特征在于，它包括细胞及包埋细胞表面的自组装纳米生物杂化层，所述纳米生物杂化层为纳米粒子与生物活性分子复合而成。

2.如权利要求1所述的细胞固载体系，其特征在于，所述纳米粒子为金属纳米粒子、氧化物纳米粒子、或纳米碳，所述金属纳米粒子为金、银、铂、钒、钛、钪、铁、镍、铝、或钴；所述氧化物纳米粒子为氧化钛、四氧化三铁或氧化钴。

3.如权利要求1所述的细胞固载体系，其特征在于，所述生物活性分子为氨基酸、多肽、核酸、或蛋白质。

4.如权利要求1所述的细胞固载体系，其特征在于，所述氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸、或天冬氨酸。

5.如权利要求1所述的细胞固载体系，其特征在于，所述细胞为Synechococcus7942、Escherichia coli BL21、或Saccharomyces cerevisiae。

6.一种自恢复多功能软包埋细胞固载体系的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）将纳米粒子与生物活性分子复合形成纳米生物杂化复合物；

2）将步骤1）得到的复合物与细胞复合，使细胞表面包埋一层纳米生物杂化层；

3）加入培养液，将固载后的细胞在适合生长的条件下培养，即得到所述具有自恢复多功能软包埋细胞固载体系。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述生物活性分子为氨基酸、多肽、核酸、或蛋白质。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸、或天冬氨酸。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为Synechococcus7942、Escherichiacoli BL21、或Saccharomyces cerevisiae。

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