CN112326962B - 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法。本申请涉及一种制备胶体金检测试剂的方法及由此制备的胶体金检测试剂。本申请还涉及一种制备抗体标记的胶体金检测试剂的方法。本申请还涉及一种用于检测新型冠状病毒的诊断试剂盒，其包含本申请方法制备的胶体金检测试剂，或者由本申请方法制备的抗体标记的胶体金检测试剂。

Description

一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及病原体检测领域。具体而言，本申请涉及一种新型冠 状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法。本申请涉及一种制 备胶体金检测试剂的方法及由此制备的胶体金检测试剂。本申请还涉 及一种制备抗体标记的胶体金检测试剂的方法。本申请还涉及一种用 于检测新型冠状病毒的诊断试剂盒，其包含本申请方法制备的胶体金 检测试剂，或者由本申请方法制备的抗体标记的胶体金检测试剂。

背景技术

由新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的非典型肺炎病例，重症患者多在发病 一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难 以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。因此对于疾病的预防和早期诊断对 于控制新型冠状病毒疫情蔓延尤为重要。

目前已经公布的几个新冠抗原检测试剂盒，主要是针对新型冠状 病毒NP抗原进行检测。由于NP抗原属于核蛋白，隐藏于病毒内部， 检出困难，影响了试剂盒的检出率。

为了提高新型冠状病毒的早期诊断效率，本发明公开一种新型冠 状病毒混合抗原(NP及S1)胶体金快速诊断试剂盒，同时检测新型 冠状病毒NP抗原，以及膜蛋白S1抗原。由于膜蛋白S1位于病毒表 面，因此大大提高了试剂盒的检出率和灵敏度，该试剂盒操作简单， 能够快速诊断出患者是否感染SARS-CoV-2，利于疫情的有效控制。 然而，针对S1抗原的抗体制备非常困难，目前以S1抗原为主体的疫 苗无法产生抗体。

舒文祥等(胶体金免疫层析法快速检测赭曲霉素A研究，粮食与 油脂，2011年第10期20-22页)公开了一种制备胶体金检测试剂的 方法，获得的胶体金用抗-赭曲霉素A抗体进行标记从而用于检测。 在现有技术中，少量柠檬酸三钠加入到大量氯金酸中，需要很长时间 柠檬酸三纳才能分散均一，其间反应器中将出现浓度明显高低不等的 小区域，这种情况将使得反应速率不一，进而导致晶核形成速度不一， 因此，胶体金的质量就差。

需要一种胶体金试剂的制备方法提供更均一、稳定且质量更好的 胶体金。还需要提供一种用于制备新型冠状病毒抗原标记的胶体金的 方法，其能够以高度准确率检测出患者是否感染SARS-CoV-2。特别 地，需要制备出针对S1抗原和NP抗原，特别是S1抗原的胶体金检 测试剂。

发明内容

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果.

本发明为一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒，能同时 检测新型冠状病毒核蛋白NP抗原，以及膜蛋白S1抗原。S1抗原是 新型冠状病毒的表面结构蛋白，针对S1抗原的单克隆抗体，比较目 前的核蛋白NP抗原的单克隆抗体，具有检测灵敏，不需要充分裂解 病毒颗粒就能轻松捕获病毒表面S1抗原的优势。而同时该试剂盒又 具备了NP抗原检测试剂盒的特异性优势。该试剂盒操作简单，能够 快速诊断出患者是否感染SARS-CoV-2，利于疫情的有效控制。

此外，本申请工艺进一步优化了胶体金反应条件，生产的金颗粒 稳定、均一、批间差小。另外，要实现高产率，就要提高反应物浓度。 但是反应物浓度过高，往往可能出现目标产物产率不够而副产物大量 产生的现象。反应物浓度不够会使得金颗粒大小不对或形状不规则， 本申请采用的金颗粒制备方法中反应物浓度为最优化，制备出的金颗 粒稳定、均一，胶体一旦形成，无论再延长反应时间，金的粒径都不 再变化。

在一个方面，本发明涉及一种制备胶体金检测试剂的方法。制备 胶体金检测试剂的方法按顺序包括以下步骤：1)在加热条件下加入 抗环血酸钠和枸橼酸三钠；2)在加热条件下加入四氯金酸；和3)在 加热条件下进行反应，从而获得制备的胶体金检测试剂。在一个方面 中，步骤1)在步骤2)之前进行。在一个方面，在完成步骤1)后立 即进行步骤2)。

在一个方面，在步骤1)中，在加热条件下加入按总量计算0.01％ 质量至1％质量的抗环血酸钠和0.05％质量至5％质量的枸橼酸三钠。 在步骤2)中，在加热条件下加入按总量计算0.1％质量至10％质量的 四氯金酸。

在一个方面，抗环血酸钠的加入量按总量计算可为0.01％质量至 1％质量，例如0.02％质量至0.8％质量，例如0.05％质量至0.5％质量， 优选0.1％质量。例如，抗环血酸钠的加入量按总量计算可为0.01％、 0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、 0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、 0.6％、0.7％、0.8％或0.9％，或者这些值之间的任何范围。

在一个方面，枸橼酸三钠的加入量按总量计算可为0.05％质量至 5％质量，例如0.1％质量至2％质量，优选0.5％质量。例如，枸橼酸 三钠的加入量按总量计算可为0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.15％、 0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、 0.65％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、 4.5％、5％，或者这些值之间的任何范围。

在一个方面，四氯金酸的加入量按总量计算可为0.1％质量至10％ 质量，例如0.5％质量至5％质量，优选1％质量。例如，四氯金酸的 加入量按总量计算可为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％， 或者这些值之间的任何范围。

在一个方面，步骤1)、2)和/或3)的加热条件为80℃至100℃， 例如90℃至100℃，例如80℃、85℃、95℃、95℃、100℃，或者 这些值之间的任何范围。在一个方面，步骤1)、2)和/或3)中，使 反应溶液加热至沸腾。

在一个方面，步骤1)、2)和/或3)在搅拌下进行。

在一个方面，步骤3)中反应持续1分钟至60分钟，例如5分钟 至50分钟，例如10分钟至30分钟，优选15分钟。在一个方面，反 应可以持续20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟或更长。例 如，反应可持续1.5小时、2小时、2.5小时、3小时或更长。或者， 反应可持续5、10、15、20、25、30、40、50或60秒。

在一个方面，本发明涉及一种胶体金检测试剂，其本文描述的方 法制备。

在一个方面，本发明涉及一种制备抗体标记的胶体金检测试剂的 方法。在一个方面，所述抗体识别并结合新型冠状病毒抗原。用于制 备抗体标记的胶体金检测试剂的方法可包括：本文所述方法中的步骤 1)至3)，从而获得制备的胶体金检测试剂。在一个方面，用于制备 抗体标记的胶体金检测试剂的方法还可包括以下步骤：7)任选地制 备新型冠状病毒抗原；8)任选地使用所述新型冠状病毒抗原在哺乳 动物中诱导所述抗体；和9)使用所述抗体标记所述胶体金检测试剂。

在一个方面，本文所述新型冠状病毒抗原是NP蛋白和/或S1蛋 白。

在一个方面，本文所述抗体是抗-NP蛋白的抗体和/或抗-S1蛋白 的抗体。

在一个方面，本发明涉及本文所述的方法制备的抗体标记的胶体 金检测试剂。

在一个方面，本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒的诊断试剂 盒，其包含由本文所述方法制备的胶体金检测试剂，或者由本文所述 方法制备的抗体标记的胶体金检测试剂。

在一个方面，本发明方法包括步骤4)制备新型冠状病毒抗原，所 述步骤4)包括以下的子步骤：

4i)发酵NP蛋白及S1蛋白，包括：取-80℃保存工作种子库中甘 油菌保，1:100接种于培养基中，200rpm，30℃摇床培养16hr，OD600 生长至2-3，转接至种子液；

4ii)种子液培养，包括：上述活化培养液，1:100转接于培养基中， 200rpm，30℃摇床培养18hr，OD600生长至2-3，转接上罐；4iii)接 种与培养，包括：罐上培养基，灭菌后pH为6.8，上述种子液1:10 (v/v)上罐，通气量为0.5VVM；溶氧转速联动，控制溶氧不低于20％； 上罐后12hr，溶氧上升，流加15％补料，初始流加速度选择为1rpm/10L 罐体积，调节转速维持溶氧20％-30％之间，逐步提高补料流加速率， 上罐15hr；

4iv)诱导，包括：上罐培养18hr，测定OD600生长至15，补加 终浓度0.5-0.8％甲醇诱导72小时；诱导期间，每12hr取样上清用HPLC 检测蛋白表达量；

4v)下罐离心，包括：诱导结束后，发酵液内依体积补入1M (NH4)2SO4，离心上清4℃放置，移入纯化工艺；

4vi)纯化工艺流程，和

4vii)保存样品。

在一个方面，本发明方法包括步骤5)使用所述新型冠状病毒抗原 在哺乳动物中诱导所述抗体，所述步骤5)包括以下的子步骤：

5i)抗原预处理，包括：取抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注 射器抽吸乳化成油包水状态即可免疫小鼠；

5ii)免疫，包括：首免之后一周进行二免，用不完全佐剂代替完 全佐剂，其余同上；第三次免疫：二免之后两周进行三免，用不完全 佐剂代替完全佐剂，其余同上；加强免疫；

5iii)小鼠血清效价检测，包括：小鼠三免后一周，小鼠经断尾采 血分离血清，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价大于 10000的小鼠用于细胞融合；

5iv)细胞融合，包括：骨髓瘤细胞制备，从液氮罐中取出SP2/0细 胞冻存管，迅速解冻，1200r，2min离心，弃上清；用完全培养液10ml 重悬SP2/0细胞，并加入细胞培养皿中，置于37℃，5％的CO2培 养箱中培养；

5v)免疫脾细胞制备，包括：融合当天，取加强免疫小鼠摘除眼 球取血，离心，取上清做阳性对照；颈椎脱臼法处死后浸泡于75％的 酒精中5min；转至超净工作台，无菌取出脾脏，置于200目铜网上研 磨，制备脾细胞悬液并收集于50ml离心管内；1200rpm，离心5min， 弃上清，重悬于DMEM中，放于37℃培养箱备用；

5vi)细胞融合，包括：将脾细胞与骨髓瘤细胞按比例混合于50ml 离心管中，将细胞悬浮液加于铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板， 每孔100ul，置37℃，5％CO2培养箱内培养；

5v)阳性杂交瘤细胞克隆化，包括：为了得到由同一杂交瘤细胞 分泌的单克隆抗体，对杂交瘤细胞进行亚克隆；和 5vi)腹水制备，包括：腹水采集，对腹部明显膨大，以手触摸时皮肤 有紧张感的小鼠，即可用12号针头采集腹水，针头刺入腹腔；连续 采集3-4次，每只小鼠采3-5ml腹水；将腹水离心，吸去最上层的脂 肪组织，除去细胞成分和沉淀物，收集上清。

附图说明

图1显示本发明的三次制备的金颗粒检测结果。在实际工作中， 一般以吸收峰(λ)、峰宽(Δλ)、吸收峰处的吸光度值(λOD)三 个指标来评价胶体金溶液：

吸收峰(λ)：根据目的制备的胶体金颗粒大小，可以建立该目 的粒径对应的吸收峰(如使用400-600之间全波长扫描)，此指标用 来评价制备的胶体金溶液是否符合预期要求。在现实工作中即使所有 的条件均能够做到足够均一和稳定，依然每次制备的胶体金颗粒进行 扫描时，得到的最大吸收峰会有微小的偏移，这个偏移就代表了与目 的粒径的差异，因此建立的这个指标是一个范围，当然这个范围是越 小越好(比如在±3nm之内)。

峰宽(Δλ)：本申请所需要的胶体金溶液，理想中的颗粒粒径是 大小均一的，但实际上不能做到，一定是处于某个可接受范围内的粒 径分布，因此可以建立能接受的粒径分布范围，当然这个范围越小越 好，表明所制备的胶体金溶液粒径越均匀。

吸光度值(ODλ峰)：所制备的胶体金溶液在最大吸收峰处的吸 光度值代表的是目的粒径的浓度，吸光度值越大，目的粒径浓度越高， 反之则越低。该浓度也影响到胶体金本身的稳定性，以及后续标记蛋 白时的效率。最佳值在1±0.1。

具体实施方式

实施例

一.NP及S1真核表达pPICZαA载体构建

以SARS-CoV-2NP蛋白及S1蛋白所对应的核苷酸序列为模板， 设计引物。经过PCR扩增、双酶切PCR产物及载体，将SARS-CoV-2 NP及S1蛋白对应的核苷酸序列克隆至pPICZαA载体中，将所得载 体转化毕赤酵母，再进行诱导培养。

二.真核表达NP蛋白及S1蛋白

重组工程酵母菌构建(NP蛋白及S1蛋白)表达及筛选： pPICZα-NP/X-33工程菌株以及pPICZα-S1/X-33工程菌株已经构建成 功，发酵工艺已经确定。研究技术路线如下：

·NP蛋白及S1蛋白发酵工艺

取-80℃保存工作种子库中甘油菌保，1:100接种于YPD培养基 中，200rpm，30℃摇床培养约16hr，OD600生长至2-3，转接至种子 液。

·种子液培养

上述活化培养液，1:100转接于YPD培养基中，200rpm，30℃摇 床培养约18hr，OD600生长至2-3，转接上罐。

·接种与培养

罐上BSM培养基，灭菌后pH为6.8左右，上述种子液1:10(v/v) 上罐，通气量为0.5VVM；溶氧转速联动，pH检测不控，控制溶氧不 低于20％。

上罐后约12hr，溶氧上升，流加15％YT补料，初始流加速度选 择为1rpm/10L罐体积即可，调节转速维持溶氧20％-30％之间，逐步 提高YT补料流加速率。上罐15hr左右。

·诱导

上罐培养约18hr，测定OD600生长至15左右，补加终浓度 0.5-0.8％甲醇诱导72小时；诱导期间，每12hr取样上清用HPLC检 测蛋白表达量。

·下罐离心

诱导结束后，发酵液内依体积补入1M(NH4)2SO4，离心上清4 ℃放置，移入纯化工艺。

·纯化工艺流程

纯化水冲洗管路至气泡排尽，连接层析柱；

柱清洗：色谱柱依次用纯化水冲洗2CV，0.5mol/L氢氧化钠溶液 冲洗2CV、纯化水冲洗3CV、1mol/L氯化钠溶液冲洗2CV、纯化水 冲洗3CV；

柱平衡：色谱柱用平衡缓冲冲洗2CV至电导、紫外吸收稳定，紫 外检测归零；

上样平衡：按目的蛋白载量20±5mg/ml上样；色谱柱用平衡液冲 冲洗2CV至UV280nm基线稳定

洗脱1：洗脱液Ⅰ冲洗层析柱3-5CV；平衡缓冲冲洗层析柱2-4CV 至UV280nm基线稳定；

洗脱2：洗脱液Ⅱ冲洗层析柱，当UV280nm吸收高于100mV后 开始收集流出液，UV280nm吸收低于100mV时，停止收集；

·柱清洗与保存

洗脱2样品-20度保存，备用。

三.NP蛋白及S1蛋白单克隆抗体的制备

抗原预处理，取适量抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注射器 抽吸乳化成油包水状态即可免疫小鼠。

免疫，首免之后一周进行二免，用不完全佐剂代替完全佐剂，其 余同上；第三次免疫：二免之后两周进行三免，用不完全佐剂代替完 全佐剂，其余同上；加强免疫。

小鼠血清效价检测，小鼠三免后一周，小鼠经断尾采血分离血清， 采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价大于10000的小鼠 用于细胞融合。

细胞融合，骨髓瘤细胞制备。从液氮罐中取出SP2/0细胞冻存 管，迅速解冻。1200r，2min离心，弃上清。用完全培养液10ml重悬 SP2/0细胞，并加入细胞培养皿中，置于37℃，5％的CO2培养箱中 培养。

免疫脾细胞制备，融合当天，取加强免疫小鼠摘除眼球取血，离 心，取上清做阳性对照；颈椎脱臼法处死后浸泡于75％的酒精中5min； 转至超净工作台，无菌取出脾脏，置于200目铜网上研磨，制备脾细 胞悬液并收集于50ml离心管内；1200rpm，离心5min，弃上清，重 悬于DMEM中，放于37℃培养箱备用。

细胞融合，将脾细胞与骨髓瘤细胞按比例混合于50ml离心管中， 将细胞悬浮液加于铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板，每孔100ul， 置37℃，5％CO2培养箱内培养。

阳性杂交瘤细胞克隆化，因在筛选中得到的阳性孔可能含有多个 杂交瘤克隆,因此孔中含有的不是单克隆抗体。为了得到由同一杂交瘤 细胞分泌的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进行亚克隆。

腹水制备，腹水采集。对腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张 感的小鼠，即可用12号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有 腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。一般可 连续采集3-4次，通常每只小鼠可采3-5ml腹水。将腹水离心(2000rpm 离心5min)，吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物， 收集上清，将上清冻存于-20℃冰箱。

四.胶体金试剂的制备和NP及S1蛋白快速检测试剂盒开发

胶体金标记工艺优化，调整抗体的用量，调整各个步骤中反应时 间，调整样品垫，结合物垫，复溶液的成分，最终筛选出最优的标记 参数。本申请工艺进一步优化了胶体金反应条件，生产的金颗粒稳定、 均一、批间差小。反应物的添加顺序很重要。如果少量柠檬酸三钠加 入到大量氯金酸中，需要很长时间柠檬酸三纳才能分散均一，其间反 应器中将出现浓度明显高低不等的小区域，这种情况将使得反应速率 不一，进而导致晶核形成速度不一，因此，胶体金的质量就差。相反， 如果氯金酸快速加入到柠檬酸三钠溶液中，形成浓度不均小区域的机 率就很小。工艺中按照如下描述的上样顺序进行反应：超纯水搅拌至沸腾，先加入0.1％总体积抗坏血酸钠及0.5％枸橼酸三钠，继续加热 至沸腾，再加入1％总体积四氯金酸，继续加热15分钟。另外反应物 浓度低，则产率低。因此，要实现高产率，就要提高反应物浓度。但 是反应物浓度过高，往往可能出现目标产物产率不够而副产物大量产生的现象。反应物浓度不够会使得金颗粒大小不对或形状不规则，本 申请采用的金颗粒制备方法中反应物浓度为最优化，制备出的金颗粒 稳定、均一，胶体一旦形成，无论再延长反应时间，金的粒径都不再 变化。获得的胶体金质量检测结果如图1所示。

抗体筛选，将制备的抗体按照NP蛋白及S1蛋白的工艺要求分 别包被和标记，然后将包被和标记的抗体两两配对检测一定浓度的抗 原溶液和空白。检测抗原溶液产生阳性信号与空白溶液信号比值最大 即为最优的配对抗体。

包被工艺优化，调整包被浓度，调整包被液成分，调整烘干条件， 最终筛选出最优的包被参数。

试剂盒性能指标调试，通过调整工艺，使试剂盒的灵敏度特异性， 阳性符合率，阴性符合率等符合要求。

批量试生产，对工艺进行放大，试产三批试剂盒。

五.NP及S1蛋白蛋白检测试剂盒临床评价

选取从重庆医科大学附属第二医院感染科收集的20人份核酸检 测阳性，以及16人份核酸检测阴性的咽拭子和鼻拭子标本，按照医 院生物安全管理制度。从质量管理体系下连续生产三批：202003001、 202003002、202003003内随机抽取检测卡，进行检测，实验结果见如 下。检测结果与临床结果一致。

表1样本相容性研究检测结果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详 细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属 技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可 以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权 利要求书确定专利保护范围。

Claims (1)

1.一种制备用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原NP蛋白和S1蛋白的胶体金检测试剂的方法，其包括以下步骤：

1)构建NP及S1真核表达pPICZαA载体，包括：

以SARS-CoV-2的NP蛋白及S1蛋白所对应的核苷酸序列为模板，设计引物；和

经过PCR扩增、双酶切PCR产物及载体，将SARS-CoV-2的NP及S1蛋白对应的核苷酸序列克隆至pPICZαA载体中，将所得载体转化毕赤酵母，再进行诱导培养；

2)真核表达NP蛋白及S1蛋白，包括

构建表达NP蛋白的重组工程酵母菌pPICZα-NP/X-33和表达S1蛋白的重组工程酵母菌pPICZα-S1/X-33；

取-80℃保存的工作种子库中甘油保存的上述重组工程酵母菌，1:100接种于YPD培养基中，200rpm，30℃摇床培养16hr，OD600生长至2-3，转接至种子液；

将上述活化培养液以1:100转接于YPD培养基中，200rpm，30℃摇床培养18hr，OD600生长至2-3，转接上罐；

罐上BSM培养基，灭菌后pH为6.8，上述种子液1:10v/v上罐，通气量为0.5VVM；溶氧转速联动，pH检测不控，控制溶氧不低于20％；

上罐后12hr，溶氧上升，流加15％YT补料，初始流加速度选择为1rpm/10L罐体积即可，调节转速维持溶氧20％-30％之间，逐步提高YT补料流加速率，上罐15hr；

上罐培养18hr，测定OD600生长至15，补加终浓度0.5-0.8％甲醇诱导72小时，诱导期间每12hr取样上清用HPLC检测蛋白表达量；和

诱导结束后，发酵液内依体积补入1M(NH4)2SO4，离心上清4℃放置，移入纯化工艺；

纯化水冲洗管路至气泡排尽，连接层析柱；

柱清洗：色谱柱依次用纯化水冲洗2CV，0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗2CV、纯化水冲洗3CV、1mol/L氯化钠溶液冲洗2CV、纯化水冲洗3CV；

柱平衡：色谱柱用平衡缓冲液冲洗2CV至电导、紫外吸收稳定，紫外检测归零；

样平衡：按目的蛋白载量20±5mg/ml上样；色谱柱用平衡液冲液冲洗2CV至UV280nm基线稳定

洗脱1：洗脱液Ⅰ冲洗层析柱3-5CV；平衡缓冲冲洗层析柱2-4CV至UV280nm基线稳定；

洗脱2：洗脱液Ⅱ冲洗层析柱，当UV280nm吸收高于100mV后开始收集流出液，UV280nm吸收低于100mV时，停止收集；

柱清洗与保存；

洗脱2样品-20度保存，备用；

3)制备NP蛋白及S1蛋白单克隆抗体，包括

取适量NP蛋白及S1蛋白抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注射器抽吸乳化成油包水状态即可免疫小鼠，以进行抗原预处理；

首免之后一周进行二免，用不完全佐剂代替完全佐剂，其余同上；第三次免疫：二免之后两周进行三免，用不完全佐剂代替完全佐剂，其余同上；

小鼠三免后一周，小鼠经断尾采血分离血清，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价大于10000的小鼠用于细胞融合；

从液氮罐中取出SP2/0细胞冻存管，迅速解冻，1200r，2min离心，弃上清，用完全培养液10ml重悬SP2/0细胞，并加入细胞培养皿中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养，以制备骨髓瘤细胞；

融合当天，取加强免疫小鼠摘除眼球取血，离心，取上清做阳性对照；颈椎脱臼法处死后浸泡于75％的酒精中5min；转至超净工作台，无菌取出脾脏，置于200目铜网上研磨，制备脾细胞悬液并收集于50ml离心管内；1200rpm，离心5min，弃上清，重悬于DMEM中，放于37℃培养箱备用，以制备免疫脾细胞；

将脾细胞与骨髓瘤细胞按比例混合于50ml离心管中，将细胞悬浮液加于铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板，每孔100ul，置37℃，5％CO2培养箱内培养，以进行细胞融合；

对杂交瘤细胞进行亚克隆，以得到由同一杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；

4)制备胶体金和NP蛋白及S1蛋白快速检测试剂，包括

超纯水搅拌至沸腾，先加入0.1％总体积抗坏血酸钠及0.5％枸橼酸三钠，继续加热至沸腾，再加入1％总体积四氯金酸，继续加热15分钟；

将制备的针对NP蛋白及S1蛋白的抗体分别包被和标记，然后将包被和标记的抗体两两配对检测一定浓度的抗原溶液和空白，检测抗原溶液产生阳性信号与空白溶液信号比值最大即为最优的配对抗体。

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