KR102554233B1 - 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 - Google Patents
조류 인플루엔자 바이러스 h9n2에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 A11-D1 또는 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 11.4를 이용한 H9N2 인플루엔자 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 종래 항체와 비교하여 분변 검체에서 H9N2에 대한 증진된 검출능을 나타내는 신규한 단클론항체에 관한 것이다.
저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 H9N2의 경우 가금류에 감염되면 산란율의 하락과 함께 폐사율 증가를 야기한다. 1966년에 터키에서 확인된 H9N2 타입의 조류 인플루엔자 바이러스는 세계적으로 가장 광범위하게 분포하고 있으며, 1990년대 이후 중동을 포함한 아시아 지역에서 지속적으로 발생되고 있다. 국내에서는 1996년 3월 처음 보고된 이후 현재는 전국적으로 만연되어 있는 실정이다. 조류독감은 조류와 돼지 사이에서만 전염된다고 생각했으나 1997년 홍콩에서 조류독감에 감염된 조류와 접촉한 사람들 중 18명이 감염되고 그 중 6명이 사망하는 사건이 발생해 사람도 감염되는 것으로 알려졌다. 1998년에는 H9N2 바이러스가 돼지에서도 감염된 사실이 보고 되었으며, 사람에서도 홍콩과 중국에서 발생 보고된 바 있다.
조류 인플루엔자의 신속한 방역을 위해서는 현장에서 빠르고 정확한 진단이 무엇보다 중요하다. 현재 진단에 쓰이는 유전자 증폭, 세포 배양 등의 방법은 전문 인력과 장비가 필요하고 수 시간이 걸리기 때문에 빠른 현장 검사가 어려운 단점이 있다. 이에 빠른 검사가 가능한 신속 진단 키트의 개발이 요구되고 있으며, 현장 검사의 실시를 위해서는 가검물(분변)을 대상으로, 가검물 내 잔류하는 바이러스에 대해 우수한 감도를 나타내는 진단 항체의 개발이 필요하다.
한편, 한국공개특허 제2009-0114486호에는 '조류인플루엔자 바이러스 H9N2 감염예방 및 검출에 유용한 DNA 압타머 및 그 혼합물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0098888호에는 '인플루엔자 헤마글루티닌에 대한 인간 항체'가 개시되어 있으나, 분변 시료 내의 바이러스 검출능이 우수한 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체를 이용한 본 발명의 '조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 포르말린으로 불활화한 H9N2 바이러스를 면역원으로 하여 H9N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 생산하였으며, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체가 종래 개발 항체와 비교하여 조류 분변 내에 존재하는 H9N2에 대한 검출능이 2배 이상 증진된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 개발된 단클론항체는 저병원성 조류 인플루엔자인 H9N2를 신속하게 진단할 수 있는 면역진단키트에 사용될 수 있으므로, 감염예방 모니터링 및 질병 확산 통제에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 열로 불활화한 다양한 조류 인플루엔자 아형에 대한 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4의 반응성을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. Anti-influenza A NP: 양성 대조군(KCTC13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체).
도 2는 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 모식도이다.
도 3A는 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 순수 분리정제하여 SDS-PAGE를 통해 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 확인한 결과이고, 도 3B는 IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 단세포군 항체의 아이소타입(isotype)을 확인한 결과이다.
도 4는 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용한 다양한 조류 인플루엔자 아형에 대한 검출 결과이다. 세로축의 'Ratio of TL/CL'은 검사선(TL) 및 대조선(CL)에서 각각 측정한 유로피움 형광체 파장의 RFU(relative fluorescence units)의 비를 의미한다.
도 5는 H9N2 바이러스 검체를 대상으로 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 검출 한계 분석 결과이다. 비교군은 각각 기탁번호 KCTC14281BP 및 KCTC14282BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단세포군 항체 A39-G10 및 A27-9를 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용하였다.
도 6은 H9N2 바이러스를 혼합한 분변 검체를 대상으로 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 H9N2 검출 한계 분석 결과이다. 비교군은 도 4와 같다.
도 7은 H9N2 바이러스를 인위적으로 감염시킨 닭의 분변을 감염 후 2일(2dpi), 4일(4dpi), 6일(6dpi)에 채취하여, 본 발명의 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 검출능을 분석한 결과이다. 비교 항체군은 도 4와 같으며, H9N2에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 real-time PCR 분석 결과도 함께 비교하였다.
도 2는 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 모식도이다.
도 3A는 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 순수 분리정제하여 SDS-PAGE를 통해 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 확인한 결과이고, 도 3B는 IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 단세포군 항체의 아이소타입(isotype)을 확인한 결과이다.
도 4는 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용한 다양한 조류 인플루엔자 아형에 대한 검출 결과이다. 세로축의 'Ratio of TL/CL'은 검사선(TL) 및 대조선(CL)에서 각각 측정한 유로피움 형광체 파장의 RFU(relative fluorescence units)의 비를 의미한다.
도 5는 H9N2 바이러스 검체를 대상으로 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 검출 한계 분석 결과이다. 비교군은 각각 기탁번호 KCTC14281BP 및 KCTC14282BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단세포군 항체 A39-G10 및 A27-9를 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용하였다.
도 6은 H9N2 바이러스를 혼합한 분변 검체를 대상으로 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 H9N2 검출 한계 분석 결과이다. 비교군은 도 4와 같다.
도 7은 H9N2 바이러스를 인위적으로 감염시킨 닭의 분변을 감염 후 2일(2dpi), 4일(4dpi), 6일(6dpi)에 채취하여, 본 발명의 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 검출능을 분석한 결과이다. 비교 항체군은 도 4와 같으며, H9N2에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 real-time PCR 분석 결과도 함께 비교하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 '단클론항체(monoclonal antibody)'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 '단세포군 항체' 또는 '단일클론항체'라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체(polyclonal antibody)와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마(hybridoma) 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascite fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단클론항체는 한국생명공학연구원에 2021년 2월 16일자로 기탁된, 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주(Hybridoma cell clone: #A11-D1-lgG2a kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 A11-D1 또는 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주(Hybridoma cell clone: #11.4-lgG1 kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 11.4인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 하이브리도마 세포주는 기탁번호가 KCTC14473BP 또는 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 하이브리도마 세포주는 포르말린으로 불활화한 A/chicken/Korea/KNUSWR09/2009(H9N2) 바이러스를 사용하여 면역된 마우스 비장세포로부터 세포융합기술에 의해 획득한 하이브리도마 세포이다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 H9N2 인플루엔자 바이러스 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 포함하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 포함되는 단클론항체는 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 A11-D1 또는/및 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 11.4일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출용 키트는 본 발명의 단클론항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 스트립 형태의 FICT(fluorescent immunochromatographic test) 키트가 될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출용 키트는, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 A11-D1이 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 11.4가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에 사용될 수 있는 형광체는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명의 단클론항체는 유로피움(europium)으로 표지될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 혼용되어 사용되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적인 단클론항체의 제조
0.02% 포르말린으로 불활화한 Influenza-A/chicken/Korea/KNUSWR09/2009(H9N2) 바이러스(원광대 인수공통감염병연구센터 보유)를 면역원으로 하여 마우스의 복강에 2주 간격으로 총 3회 면역시켰다. 면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)를 얻은 다음, 골수종 세포(myeloma cells)와 세포융합기술(cell fusion technique)을 시행하고, HAT(hypoxanthine/aminopterin/thymidine) 배지에서 생존한 융합세포(하이브리도마) 클론의 세포 배양 상징액(supernatant)을 이용하여 ELISA 실험을 통해 H9N2 바이러스에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 선별하였다. 단클론항체의 대량생산은 최종적으로 선별된 하이브리도마 클론 각각을 마우스 복강 내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 칼럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다.
제조예 2. 단세포군 항체 A11-D1 및 11.4를 이용한 신속 진단 키트 제작
2-1. 형광체-항체 복합체 제조
단세포군 항체 A11-D1을 PS-COOH 유로피움 나노파티클(이하, Eu NP) 비드(0.1 μm)에 결합시켜 Eu NP-항체 복합체를 만들었다. 간단하게, 20㎕의 Eu NP를 754㎕의 0.05M MES 버퍼(pH 6.1, Sigma-Aldrich)에 첨가하고, Eu NP 표면의 -COOH기를 활성화하기 위해 26㎕의 5mM EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 200㎕의 50mM sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt) 존재하에, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 후, 과량의 EDC와 sulfo-NHS는 27,237xg에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. 활성화된 Eu NP는 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 8.0) 940㎕ 및 60㎕의 1 ㎎/㎖ 농도의 A11-D1 항체와 혼합한 후 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 27,237xg에서 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하고, 세척한 후, 0.1% 소혈청알부민을 포함하고 있는 400㎕의 2mM Borax 버퍼(pH 8.0)에 현탁시켜, 4℃ 암실에서 보관하였다.
2-2. 신속 형광 면역진단키트용 스트립 제조
상기 제조한 유로피움-항체(A11-D1) 복합체를 포함하는 H9N2 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제작하였다. 이때 11.4 단클론항체는 검사선(test line)에 점적하는(coating) 항체이고, A11-D1 단클론항체는 유로피움과 축합된 항체 복합체로서 시료 내 H9N2 바이러스 검출(detection)용으로 사용되었다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 상기 유로피움-항체(A11-D1) 복합체 6 ㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체(11.4)를 3 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.5 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 최종적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다(도 2). 스트립에 시료(검체)를 적용한 후 20분 안에 소형 형광측정장비로 형광을 측정할 수 있고, 유로피움 형광체의 파장은 하기와 같다: Excitation: 355 nm, Emission: 612 nm.
실시예 1. 단세포군 항체의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 진단 성능 특성
상기 제조예 1을 통해 다수의 하이브리도마 클론을 확보하였고, 이들의 배양 상징액을 이용하여 H9N2 바이러스에 대한 반응성을 검증하여 H9N2 바이러스에 대한 반응성이 우수한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 상기 H9N2 바이러스에 대한 반응성 검사는 100 HAU/㎖의 H9N2 바이러스를 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 코팅한 뒤 5% BSA로 블로킹한 뒤 1:200의 희석배율로 희석한 각 하이브리도마 클론 배양 상징액을 처리하여 반응성을 검정하였다. 상기 검정을 통해 반응성이 우수한 A11-D1 및 11.4 클론을 선택하였고, 각 클론 유래 단클론항체의 H9N2 바이러스에 대한 결합력을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 열로 불활화한 H1N1, H3N2, H5N3, H7N1, H7N7 및 H9N2 바이러스를 각각 1,000 HAU/lane으로 웨스턴 블롯용 겔에 로딩시킨 이후 1차 항체로 A11-D1 및 11.4를 각각 1 ㎍/㎖로 반응시킨 결과, 두 항체 모두 H9N2 바이러스에만 특이적으로 반응하고, 다른 아형의 인플루엔자 바이러스에는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다(도 1). 상기 결과를 통해 A11-D1 및 11.4 모두 선형의(linear) 에피토프를 인식함을 알 수 있었다.
또한, 상기 A11-D1 및 11.4 단클론항체를 순수 분리정제하고, IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 면역글로불린의 이소타입을 분석한 결과, A11-D1는 IgG2a 중쇄 및 Kappa 경쇄를 가지고 있고, 11.4는 IgG1 중쇄 및 Kappa 경쇄로 구성되어 있음을 알 수 있었다(도 3).
실시예 2. A11-D1 및 11.4 단클론항체가 이용된 진단 키트를 활용한 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출능
본 발명자는 제조예 2에서 제조한 신속 형광 면역진단키트(도 2)를 이용하여 다른 아형의 인플루엔자 바이러스를 테스트하였으나, 높은 역가(1,280 HAU/㎖)에서도 다른 아형의 인플루엔자 바이러스에 대해서는 반응성이 확인되지 않아, 본 발명의 단클론항체 및 이를 이용한 진단키트는 H9N2에 특이성이 매우 높음을 알 수 있었다(도 4).
또한, 본 발명자는 도 2의 신속 형광 면역진단키트를 이용하여 바이러스 검출한계를 분석하였다. 또한, 이전의 연구에서 개발한 H9N2 특이적 단클론항체[기탁번호 KCTC14281BP 및 KCTC14282BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단세포군 항체 A39-G10 및 A27-9]를 이용하여 제조한 형광 면역진단키트를 비교군으로 사용하였다.
먼저, H9N2 바이러스를 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 HAU/㎖로 단계희석해서 신속 형광 면역진단키트용 스트립에 테스트한 결과, 본 발명의 단클론항체[A11-D1 및 11.4]를 이용하여 제조한 스트립의 경우와 이전 연구에서 개발한 단클론항체[A39-G10 및 A27-9]를 이용하여 제조한 스트립 모두 H9N2 바이러스에 대해 2.5 HAU/㎖의 검출한계를 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 20, 40, 80, 160, 320, 640 HAU/㎖의 H9N2 바이러스를 닭의 분변과 혼합한 후, 상기 바이러스와 분변의 혼합 시료를 신속 형광 면역진단키트용 스트립에 테스트하였다. 간단하게 분변 0.3 g과 바이러스를 혼합한 후 면봉을 상기 혼합물에 담군 후 상기 면봉을 0.5 ㎖의 용해 버퍼를 포함하고 있는 튜브에 옮겨 반응시켰다. 그 후, 원심분리를 통해 상층액을 취하여 새로운 튜브에 옮긴 후 스트립을 담궈 반응시켰다. 그 결과, 본 발명의 단클론항체[A11-D1 및 11.4]를 이용하여 제조한 스트립의 경우는 40 HAU/㎖의 검출한계를 보였으나, 이전 연구에서 개발한 단클론항체[A39-G10 및 A27-9]를 이용하여 제조한 스트립의 경우는 80 HAU/㎖의 검출한계를 보여, 본 발명에서 개발된 단클론항체가 이전에 개발된 단클론항체에 비해 분변과 혼합된 시료 내의 H9N2 바이러스를 2배 이상의 높은 감도로 검출해 낼 수 있음을 알 수 있었다(도 6).
실시예 3. A11-D1 및 11.4 단클론항체가 이용된 진단 키트의 H9N2 감염 닭의 분변 검체 내 바이러스 검출능
본 발명자는 H9N2 바이러스를 인위적으로 닭에 감염시키고, 감염된 닭의 분변을 채취하여 이를 검체로 사용하여 본 발명에 따른 단클론항체의 바이러스 검출능을 분석하였다. 구체적으로, 5주령의 SPF leg-horn 품종의 닭에 107 EID50 (50% egg infective dose)/㎖의 역가를 확인한 바이러스를 마리당 500 ㎕씩 비강으로 감염시키고 감염 2일, 4일 및 6일 후의 분변을 채취하여 검체로 사용하였다. 본 동물실험은 충북대 인수공통감염병연구센터에서 보유한 조류 인플루엔자 바이러스[H9N2 (H9_L429)]를 이용하여 진행하였다.
또한, 검출 감도 비교를 위해 동일한 검체로부터 총 RNA를 분리한 후, TOPrealTM One-step RT qPCR Kit (SYBR Green, low Rox) (Enzynomics, Daegeon, KOREA)와 H9N2 바이러스에 특이적인 프라이머 세트[정방향 5'-GCTGACACACAAGA-3'(서열번호 1) 및 역방향 5'-GGTCCTATCACAGGTTTGA-3'(서열번호 2)]를 사용하여 real-time PCR을 진행하였다. 상기 PCR 반응은 역전사 반응 42℃/30 분, DNA 변성 95℃/10 분 수행 후 DNA 변성 95℃/30초, 프라이머 어닐링 60℃에서 30초, 신장반응 72℃에서 30초의 과정을 35회 반복 후 72℃에서 5분의 신장반응 조건으로 수행되었다.
감염된 닭의 분변을 대상으로 한 분석 결과, 도 7과 같이, 본 발명의 단클론항체[A11-D1 및 11.4]를 이용하여 제조한 스트립의 경우는, real-time PCR을 이용한 방법 및 이전 연구에서 개발한 단클론항체[A39-G10 및 A27-9]를 이용하여 제조한 스트립보다 H9N2 바이러스를 감염 초기부터 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 본 발명에서 개발된 신규한 단클론항체[A11-D1 및 11.4]는 저병원성 조류 인플루엔자인 H9N2를 특이적으로 검출할 수 있으며, 분변 등의 시료에서도 정확하게 H9N2 바이러스를 검출할 수 있으므로, 현장 검사에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation
Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Monoclonal antibody specific to avian influenza virus H9N2 and
uses thereof
<130> PN21091
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gctgacacac aaga 14
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggtcctatca caggtttga 19
Claims (5)
- 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
- 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체 또는 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
- 제1항의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출방법.
- 제1항의 단클론항체를 포함하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14473BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 A11-D1이 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14472BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 11.4가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 키트.
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| CN106198970A (zh) | 2016-07-06 | 2016-12-07 | 聊城大学 | 一种快速检测h9n2亚型禽流感病毒的试剂盒 |
| CN106771173A (zh) | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 抗h9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 |
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-
2021
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Patent Citations (2)
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