CN111551745A - 禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法 - Google Patents

禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体胶体金检测试纸及方法，属于H7N9 IgY抗体快速检测技术领域，所述试纸包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG‑胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和H7N9重组抗原包被的检测线。与现有技术相比，本发明的试纸可迅速检测H7N9 IgY抗体水平，尤其选择了2种纯化的H7N9重组抗原，相比较常规禽流感病毒抗体检测方法，本发明更加的方便快捷，灵敏度和线性范围更高更大。

Description

禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法
技术领域
本发明属于禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体快速检测的技术领域，尤其涉及一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法。
背景技术
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。
H7N9是禽流感的一种亚型。流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一H7N9型为血细胞凝集素(即H)，一型为神经氨酸酶(即N)，H又分15个亚型，N分9个亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。H3为人犬共患，依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。
临床表现：患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。
病原学检测：核酸检测，对患者呼吸道标本(如鼻咽分泌物、口腔含漱液、气管吸出物或呼吸道上皮细胞)采用real time PCR(或RT-PCR)检测到H7N9禽流感病毒核酸。
胶体金免疫层析技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它是继传统三大免疫标记技术之后又一较为成熟的、得到广泛应用的免疫标记技术。当待测样品加入到样品膜上后，由于微孔滤膜的毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，检测一般只要5～10min就会出结果，相比其它方法，如ELISA需1～2h大大的缩短了检测时间，相比RT-PCR不仅节省了时间还节约了成本。其测试结果以肉眼可见的显色条带来判断，不需要特别仪器设备，只需要试纸或渗滤试剂盒，样品只要做非常简单的处理或不需要做前处理。且具有成本较低、操作简单、试剂稳定不受温度等外界因素影响、方便快捷、特异敏感、稳定性强、结果判断直观等优点，因而特别适合于现场快速检查，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，代表了诊断试剂简单快速、便于普及的发展方向。
中国专利文献CN201320384852.6公开了一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸，所述试纸由样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接在底板上构成，所述硝酸纤维素膜的检测区包被有H7亚型禽流感病毒外模血凝素抗原的单克隆抗体，硝酸纤维素膜的质控区包被有抗鼠IgG抗体，所述玻璃纤维膜(结合垫)上包被胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体。
中国专利文献CN201410052927.X公开了一种检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试纸，该试纸的检测线包被有H7亚型禽流感病毒多克隆抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG，所述结合垫包被胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。
上述两篇文献均是针对禽流感亚型病毒的检测，对于禽流感亚型病毒抗体的检测，中国专利文献CN201220334257.7也有报道，具体公开了一种检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸，其中所述检测线包被H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原，质控线包被羊抗兔IgG抗体，结合垫上包被胶体金颗粒标记的兔抗鸡IgG抗体。但目前针对H7N9亚型的抗体检测没有相关报道。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法，以提高禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测的灵敏度和线性范围。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和H7N9重组抗原包被的检测线。
作为本发明的进一步优化方案，由于H7N9亚型N蛋白序列不同地方有一定差异，本发明在检测线上包被2种H7N9重组抗原，以提高检测的线性范围和灵敏度。
本发明还提供了上述禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备纯化的H7N9重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的H7N9重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)制备胶体金；
(4)胶体金标记兔抗鸡IgG：取兔抗鸡IgG，将胶体金与兔抗鸡IgG混合，离心，用胶体金稀释液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物；
(5)制备胶体金垫：将兔抗鸡IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；
(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入一定量的活化剂，例如PEG6000、PEG8000、Tween20以及曲拉通100中的一种，用量一般为1％～2％质量百分比；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；
(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切后，获得试纸。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)包括制备2种纯化的H7N9重组抗原H7N9-A，H7N9-B，步骤包括：根据H7N9重组抗原H7N9-A，H7N9-B蛋白基因序列制备H7N9亚型N蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的H7N9-A，H7N9-B重组抗原。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的H7N9重组抗原分别以50mM的Tris-NaCl缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中，制备胶体金的方法为柠檬酸三钠还原法，步骤包括：
(Ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸；
(Ⅱ)迅速加入质量分数为0.5％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸，溶液由淡黄色变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，制成胶体金溶液。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(4)中，胶体金标记兔抗鸡IgG的步骤包括：
(i)取兔抗鸡IgG溶于0.1-0.2ml 10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；
(ii)每20-50mg兔抗鸡IgG中，加入10ml胶体金溶液；
(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；
(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；
(v)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物。
作为本发明的进一步优化方案，所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液或Hepes缓冲液。
作为本发明的进一步优化方案，兔抗IgG-胶体金复合物在玻璃纤维素膜上的喷量为10μL/cm。
本发明还提供了利用上述禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体试纸检测禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体的方法，包括以下步骤：
步骤一、将试纸平放，取待测血清样品50-100μL，加入样品垫；
步骤二、室温静置15min后，判断：若质控线出现紫红色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现紫红色线，为阳性；检测线的颜色深浅与抗体滴度成正比。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种H7N9 IgY抗体胶体金检测试纸及方法，利用检测试纸检测后，阳性结果说明所检测样本H7N9 IgY抗体阳性且达到了要求的抗体水平，阴性结果说明样本H7N9 IgY抗体阴性或未达到要求的抗体水平，该试纸可迅速检测H7N9 IgY抗体水平，尤其是为了提高检测的灵敏度和线性范围，特制备了2种纯化的H7N9重组抗原。相比较常规ELISA抗体检测方法，本发明更加的方便快捷。
附图说明
图1是H7N9 IgY抗体免疫胶体金检测试纸结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
本实施例提供的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸的制备方法，步骤包括：
(1)两种纯化的H7N9重组抗原的制备
从GENBANK(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取2种有差异的H7N9的N蛋白基因序列H7N9-A和H7N9-B(H7N9-A和H7N9-B是从GENBANK基因登录号:NC_026426.1中截取获得的，其中NC_026426.1基因编码蛋白的信号肽后60个氨基酸对应的基因序列作为H7N9-A，60个氨基酸后面剩下的氨基酸对应的基因序列作为H7N9-B)，送华大基因公司制备H7N9-A和H7N9-B蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的H7N9-A、H7N9-B重组抗原。
(2)制备硝酸纤维素膜
将山羊抗兔IgG和2种纯化后的H7N9重组抗原(H7N9-A,H7N9-B)分别以50mM的Tris稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线C和检测线T，喷量均为0.75μL/cm，充分干燥。
(3)制备胶体金
采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金，具体操作方法如下：
(Ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。
(Ⅱ)迅速加入质量分数为1％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min；
(Ⅲ)制成粒径10-40nm金颗粒后，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色；
(Ⅳ)冷却至室温后4℃避光保存。
(4)胶体金标记兔抗鸡IgG
(i)取高纯度兔抗鸡IgG溶于0.1-0.2ml的10mM的Tris缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；
(ii)按以下组合将兔抗鸡IgG与胶体金混合：每20-50mg兔抗鸡IgG，加入10ml40nm胶体金溶液；
(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；
(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；
(v)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的Tris缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物。
(5)制备胶体金垫3
将上述制备的兔抗鸡IgG-胶体金复合物按照10μL/cm的喷量均匀喷在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫3。
(6)样品垫2的处理
为提高检测的准确度和稳定性，使检测样本时的C线和T线颜色更加均一，特将样品垫2进行处理。处理方式为：将样品垫2泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入1％Tween20。浸泡结束后，将样品垫2放入烘箱中烘干，本实施例中，烘干的温度为37℃，时间14小时。
(7)试纸的组装
在干燥间内准备好吸水垫5、样品垫2、PVC底板1，在PVC底板1中央贴上步骤2.2包被好的硝酸纤维素膜4，硝酸纤维素膜4上缘粘贴吸水垫5，硝酸纤维素膜4下缘粘贴步骤2.5制备的胶体金垫3，胶体金垫3下缘粘贴步骤2.6处理后的样品垫2，各组分相互叠加部分为1-2mm，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4.1mm宽的试纸，结构如图1所示。将切好的试纸装入卡壳中，再将试纸和干燥剂密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
实施例2
从GENBANK(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取H7N9-A的N蛋白基因序列，送华大基因公司制备H7N9-A蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的H7N9-A重组抗原。
将山羊抗兔IgG和纯化的H7N9-A重组抗原分别以25-80mmol/L的Tris缓冲液(缓冲液中含有0.9％NaCl，Tween20和pc300)稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线C和检测线T，喷量均为0.75μL/cm，充分干燥。
采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金。
制备胶体金标记兔抗鸡IgG，将胶体金标记兔抗鸡IgG均匀喷洒在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫。
将样品垫用含有活化剂和抗干扰物质的PBS缓冲液浸泡处理，烘干。
在干燥间内将吸水垫、样品垫、PVC底板、包被有质控线和检测线的硝酸纤维素膜、胶体金垫进行组装，裁切后，获得试纸。
实施例3
从GENBANK(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取H7N9-B的N蛋白基因序列，送华大基因公司制备H7N9-B蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎，并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的H7N9-B重组抗原。
将山羊抗兔IgG和纯化的H7N9-B重组抗原分别以25-80mmol/L的Tris缓冲液(缓冲液中含有0.9％NaCl，Tween20和pc300)稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜上的质控线C和检测线T，喷量均为0.75μL/cm，充分干燥。
采用柠檬酸三钠还原法，制备10-40nm胶体金。
制备胶体金标记兔抗鸡IgG，将胶体金标记兔抗鸡IgG均匀喷洒在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得胶体金垫。
将样品垫用含有活化剂和抗干扰物质的PBS缓冲液浸泡处理，烘干。
在干燥间内将吸水垫、样品垫、PVC底板、包被有质控线和检测线的硝酸纤维素膜、胶体金垫进行组装，裁切后，获得试纸。
试验例1
参照实施例1的方法制备试纸，不同之处在于采用未经含活化剂和抗干扰物质的缓冲液浸泡处理。
试验例2
参照中国专利CN201220334257.7所述方法制备试纸，不同之处在于用H7亚型禽流感病毒的蛋白抗原代替H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原。
试纸检测效果验证：
分别利用本发明的试纸和酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体浓度，步骤包括：将试纸平放于桌面上，根据H7N9 IgY抗体出厂时要求的抗体水平，取H7N9 IgY抗体，用50mM的Tris溶液稀释至50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml，作为检测样品，同时设置空白对照。分别取检测样品和空白对照50-100μL，加入样品垫2，室温静置15min，根据质控线和检测线的颜色读取结果：若质控线出现紫红色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现紫红色线，为阳性；检测线的颜色深浅与抗体滴度成正比。酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体浓度按照常规酶联免疫吸附法进行。
结果如下表1所示：
表1：不同方法检测H7N9 IgY抗体浓度结果
样品浓度 50ng/ml 100ng/ml 200ng/ml 400ng/ml 800ng/ml 空白
实施例1 阳性(色浅) 阳性(色浅) 阳性(正常) 阳性(正常) 阳性(色深) 阴性
实施例2 阴性(无线) 阳性(色浅) 阳性(色浅) 阳性(正常) 阳性(正常) 阴性
实施例3 阴性(无线) 阳性(色浅) 阳性(色浅) 阳性(正常) 阳性(正常) 阴性
试验例1 阴性(无线) 阳性(色浅) 阳性(色浅) 阳性(正常) 阳性(色深) 阴性
试验例2 阴性(无线) 阳性(色浅) 阳性(色浅) 阳性(正常) 阳性(色深) 阴性
ELISA 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性
表1可以看出，本发明的胶体金试纸的检测结果与ELISA检测结果具有高度一致性，说明本发明胶体金试纸的准确率为100％，利用本申请的胶体金试纸检测H7N9 IgY抗体及其含量是可行的。由于色线深浅与抗体滴度成正比，抗体滴度越高，色线越深，可由此来检测市售的H7N9 IgY抗体产品是否达到了出厂抗体水平，以判断购买的产品质量，进一步地本发明实施例1使用了2种H7N9重组抗原明显优于其它实施例，并且检测50ng/ml抗体浓度，能够看到色浅的一条线。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和H7N9重组抗原包被的检测线。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述检测线上包被2种H7N9重组抗原。
3.一种如权利要求1-2任一所述的禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备纯化的H7N9重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的H7N9重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)制备胶体金；
(4)胶体金标记兔抗鸡IgG：取兔抗鸡IgG，将胶体金与兔抗鸡IgG混合，离心，用胶体金稀释液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物；
(5)制备胶体金垫：将兔抗鸡IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；
(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；
(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切后，获得试纸。
4.根据权利要求3所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述步骤(1)包括制备2种纯化的H7N9重组抗原H7N9-A，H7N9-B，步骤包括：根据H7N9重组抗原H7N9-A，H7N9-B蛋白基因序列制备H7N9亚型N蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的H7N9-A，H7N9-B重组抗原。
5.根据权利要求3所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的H7N9重组抗原分别以50mM的Tris-NaCl缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。
6.根据权利要求3所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述步骤(3)中，制备胶体金的方法为柠檬酸三钠还原法，步骤包括：
(Ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸；
(Ⅱ)迅速加入质量分数为0.5％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸，溶液由淡黄色变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，制成胶体金溶液。
7.根据权利要求3所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述步骤(4)中，胶体金标记兔抗鸡IgG的步骤包括：
(i)取兔抗鸡IgG溶于0.1-0.2ml 10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；
(ii)每20-50mg兔抗鸡IgG中，加入10ml胶体金溶液；
(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；
(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；
(v)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物。
8.根据权利要求3所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液或Hepes缓冲液。
9.根据权利要求3所述的一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，兔抗IgG-胶体金复合物在玻璃纤维素膜上的喷量为10μL/cm。
10.一种利用如权利要求1-2任一所述的禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体试纸检测禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将试纸平放，取待测血清样品50-100μL，加入样品垫；
步骤二、室温静置15min后，判断：若质控线出现紫红色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现紫红色线，为阳性；检测线的颜色深浅与抗体滴度成正比。
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