CN105548541A - 一种禽流感病毒检测试剂盒 - Google Patents

一种禽流感病毒检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒检测试剂盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述吸水垫放置于所述塑料小盒的凹槽处，所述硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间。本发明利用禽流感病毒的囊膜具备抗原特性为基础，制出禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜，再以纳米金标记兔抗鸡IgY抗体作为检测探针，应用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，检测速度快，灵敏度高，且整个检测试剂盒制备简单，成本低。

Description

一种禽流感病毒检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体是涉及一种禽流感病毒检测试剂盒。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，同时某些亚型禽流感病毒也能感染人类。禽流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原关系差异，可将其分为16种HA亚型和9种NA亚型。根据其致病性可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亚型。特别是近年来频繁爆发的H5亚型禽流感疫情给许多国家和地区的养禽业带造成了巨大的经济损失。
目前，检测禽流感病毒的方法主要有：荧光定量PCR检测病毒核酸、ELISA方法检测病毒颗粒或者抗病毒抗体、胶体金检测试剂、血凝抑制(HI)试验检测抗血凝素(HA)抗体、琼脂免疫扩散(AGP)试验检测抗核蛋白的抗体、病毒中和、补体结合、神经氨酸酶抑制和单辐射溶血等方法。每种方法都有一定的缺陷，如荧光定量PCR检测技术虽然最灵敏，但成本高，操作要求复杂，不容易推广。胶体金检测试剂存在敏感度低等缺点。AGP、HI和病毒中和等结果准确，但都需要制备纯化、浓缩完整的病毒作为检测抗原，而禽流感病毒是高致病性病毒，需在P3实验室完成(生物安全防护三级实验室)，不易生产、纯化、成本较高，且存在感染性和容易散毒，在应用中存在很大的局限性。此外机体感染禽流感病毒，第10天后开始出现保护性抗体，检测抗体不能达到早期检出病毒的目的。
因此，需要制备出一种制备简单，检测速度快，检测灵敏度高的禽流感检测试剂盒。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种禽流感病毒检测试剂盒，能够简单快速检测出禽流感病毒。
本发明的技术方案是：一种禽流感病毒检测试剂盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述塑料小盒的盒盖中央有边长约0.6～1.0cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水垫的面积比硝酸纤维素膜小1/3到1/2。
所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：
(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于10～12日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；
(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，38～40℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min，超声频率为12.8～24.6MHz；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；
(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.23～1.35μg/mL，即得抗原浓缩液，-10～-5℃保存；
(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置40～60min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15～-5℃低温保存。
进一步地，所述的禽流感病毒囊膜抗原浓度为1.75～1.85μg/mL。
进一步地，所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的浓度为0.82～0.86μg/mL。
进一步地，所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.80～0.90mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育30～35min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针。
更进一步地，所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的按1:9的混合液。
本发明的原理是：应用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因吸水垫置于硝酸纤维素膜底部，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水垫的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
本发明的有益效果是：本发明利用禽流感病毒的囊膜具备抗原特性为基础，制出禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜，再以纳米金标记兔抗鸡IgY抗体作为检测探针，应用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因吸水垫置于硝酸纤维素膜底部，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水垫的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点，灵敏度高，且整个检测试剂盒制备简单，成本低。
具体实施方式
实施例1：
一种禽流感病毒检测试剂盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述塑料小盒的盒盖中央有边长约0.6cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水垫的面积比硝酸纤维素膜小1/3；所述的禽流感病毒囊膜抗原浓度为1.75μg/mL；所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的浓度为0.82μg/mL。
所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：
(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；
(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，38℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min，超声频率为12.8MHz；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；
(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.23μg/mL，即得抗原浓缩液，-10℃保存；
(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置40min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15℃低温保存。
所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的按1:9的混合液。继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.80mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育30min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针。
检测方法为:用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因吸水垫置于硝酸纤维素膜底部，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水垫的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
实施例2：
一种禽流感病毒检测试剂盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述塑料小盒的盒盖中央有边长约0.8cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水垫的面积比硝酸纤维素膜小5/12；所述的禽流感病毒囊膜抗原浓度为1.80μg/mL；所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的浓度为0.84μg/mL。
所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：
(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于11日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；
(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，39℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min，超声频率为18.7MHz；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；
(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.29μg/mL，即得抗原浓缩液，-7.5℃保存；
(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置50min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-10℃低温保存。
所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的按1:9的混合液。继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.85mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育32.5min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针。
检测方法为:用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因吸水垫置于硝酸纤维素膜底部，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水垫的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
实施例3：
一种禽流感病毒检测试剂盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述塑料小盒的盒盖中央有边长约1.0cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水垫的面积比硝酸纤维素膜小1/2；所述的禽流感病毒囊膜抗原浓度为1.85μg/mL；所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的浓度为0.86μg/mL。
所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：
(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于12日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；
(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，40℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min，超声频率为24.6MHz；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；
(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.35μg/mL，即得抗原浓缩液，-5℃保存；
(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置60min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-5℃低温保存。
所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的按1:9的混合液。继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.90mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育35min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针。
检测方法为:用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因吸水垫置于硝酸纤维素膜底部，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水垫的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
试剂盒检测试验:
1、试验样品：待测标本(标本为鼻咽试子、鼻洗液或咽漱液)、阳性样品、阴性样品。
2、检测方法：将收集到的待测样品用PBS做1：10稀释，用移液器将100μl该稀释样品滴加到本发明实施例2制备的试剂盒中，待渗滤30s后，继续滴加100μlPBS缓冲液冲洗,渗滤30s；滴注50μl纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针，渗滤30s，滴加100μlPBS缓冲液冲洗；观测斑点显色。阳性样品和阴性样品对照并行检测作为质量控制。
3、检测结果：对50阳性样品和50例阴性样品的检测结果显示：本发明禽流感病毒检测试剂盒的灵敏度为98％，特异性为100％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述吸水垫放置于所述塑料小盒的凹槽处，所述硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间；
所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：
(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于10～12日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；
(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，38～40℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；
(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.23～1.35μg/mL，即得抗原浓缩液，-10～-5℃保存；
(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置40～60min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15～-5℃低温保存。
2.如权利要求1所述的一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的禽流感病毒囊膜抗原浓度为1.75～1.85μg/mL。
3.如权利要求1所述的一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的浓度为0.82～0.86μg/mL。
4.如权利要求1～3任意一项所述的一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.80～0.90mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇-20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育30～35min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针。
5.如权利要求4所述的一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的混合液。
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