CN110702927A - 用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，由样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接在PVC底板上构成，硝酸纤维素膜上包被的有划金线、检测线和质控线，其中划金线包被的是胶体金‑抗AMH单克隆抗体1复合物，检测线上包被的是抗AMH单克隆抗体2，质控线上包被的是羊抗鼠多克隆抗体。本发明将胶体金‑抗AMH单克隆抗体1耦连复合物直接包被在硝酸纤维素膜上，不仅提高了试纸条的精密度，也大大缩短了检测时间，实现了5分钟即可检测的突破，从而达到超快速定量检测AMH含量的目的。

Description

用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条及其制备 方法
技术领域
本发明属于体外免疫诊断技术领域，涉及一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
抗缪勒管激素(Anti-Müllerian hormone，AMH)，也被称为缪勒管抑制激素(Müllerian-inhibiting hormone MIH)，是一种结构上与转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员抑制素和激活素相关的糖蛋白激素，其主要作用是调控生长分化和卵泡生成。在男性胚胎中，AMH由男性胎儿的睾丸Sertoli细胞SOX9基因激活，其表达抑制女性生殖道或缪勒管(副中肾管)的发展，从而抑制输卵管、子宫和阴道的产生。AMH的表达在胚胎发育的特定时期对性别分化至关重要。在女性中，AMH由窦前颗粒细胞和小窦状卵泡分泌，直至绝经期逐渐停止。AMH通过抑制卵泡的募集和优势卵泡选择来调节卵泡生长。卵巢内的小窦卵泡数量越多，AMH的浓度便越高；反之，当卵泡随着年龄及各种因素逐渐消耗，AMH浓度也会随之降低。因此AMH可作为预测卵巢储备功能的分子标志物。随着AMH的作用被越来越多的人所认识，AMH在妇科内分泌疾病、生殖医学、性别异常等领域的应用越来越受到关注。具体而言，AMH有以下用途：
①评价大体生育能力方面，比较个人的AMH水平与同年龄段的平均水平在评价生育能力方面是有帮助的。它提供了一个确定女性卵巢储备的指南，能够识别可能需要考虑卵子冷冻或尽快尝试怀孕的女性，而不是等以后她们的长期生育能力变差的时候再考虑尝试生育。
②体外受精方面，AMH是预测体外受精(IVF)中卵巢低反应的有利工具。此外，AMH水平还能用于评价一位女性的剩余卵子供应量。根据NICE体外受精指南，AMH≤5.4pmol/l(0.8ng/mL)预示着卵巢过度刺激低反应，而AMH≥25pmol/l(3.6ng/mL)预示高反应。其次，AMH水平越高，IVF后出生几率越大。因此，AMH可用于合理化制定排卵诱导方案，决定辅助生殖技术中转移胚胎的数量，以最大限度地提高妊娠成功率，同时尽量减少卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生的风险。AMH预测对于OHSS过度反应的敏感性和特异性分别为82％和76％。但AMH水平应结合经阴道卵巢扫描结果综合评估卵泡数量和卵巢体积。
③女性肿瘤方面：放疗和化疗会损伤卵巢储备。在这种情况下，治疗前AMH检测能够预测长期化疗后卵巢功能丧失程度，决定是否采取生育能力保存策略，如卵母细胞的冷冻保存。而治疗后AMH检测往往预示着生育能力下降。颗粒细胞瘤卵巢分泌AMH，AMH测试在诊断这些肿瘤方面的灵敏度在76和93％之间。
④多囊卵巢综合征(PCOS)是一种最常见于育龄期妇女的内分泌疾病，其特点是寡或无排卵、雄激素增多，多囊卵巢。这类患者的AMH高出正常值的二到三倍。越来越多的人认为，AMH是一种诊断或提示PCOS的工具或生物标志物。
AMH是一个崭新的检测指标，相较于现有的性激素检测项目，它具有以下优点：AMH水平不受月经周期内与周期之间的变化影响；AMH可在月经周期内的任何时间抽血检查；AMH不受激素避孕药的影响，便于临床使用；AMH可更早、更准确地反映年龄相关卵巢储备功能的下降。
目前，用于检测抗缪勒氏管激素(AMH)的方法主要有酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)、电化学发光法(electro-chemiluminescenceimmunoassay，ECLI)、化学发光法(chemiluminescent immunoassay，CLI)等，但这些方法都存在以下缺陷：检测设备要求高，成本高；干扰因素较多；检测时间长。因此这些方法都不适合AMH的临床快速诊断。
目前常用于快速诊断的试纸条多基于胶体金、荧光素或时间分辨荧光微球标记的方法。荧光素标记灵敏度为10-10mol/L；背景信号强，有非特异荧光，特异性低；背景信号强，吸收光谱较窄，发射光谱较宽，Strokes位移小，容易发生光谱的交叠，影响结果准确度。而传统上使用喷金方式的胶体金免疫层析法和时间分辨荧光免疫层析法都会存在重复性差、准确度低、检测时间长的问题。所以目前还缺少一种能够更为快速、准确的方法，使其能够满足定量检测AMH的要求。因此，如何解决上述问题，是本领域技术人员着重要研究的内容。
发明内容
为克服上述现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种检测重复性高、准确度搞、检测时间快的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板，还包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次搭接置于所述PVC底板上；所述样品垫设置在所述PVC底板的一端上，且与所述PVC底板固定连接；所述样品垫的中心位置设置有样品滴入区；所述样品垫的一端搭设在所述金标垫上，所述金标垫与所述PVC底板固定连接，所述金标垫的底部远离样品垫的一端搭设在所述硝酸纤维素膜上，所述硝酸纤维素膜固定连接在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜上包被有划金封闭液线、检测线和质控线，所述划金封闭液线、检测线和质控线沿水平方向平行设置；所述划金封闭液线包被有胶金体标记的抗AMH单克隆抗体1；所述检测线包被有与所述胶体金标记的AMH单克隆抗体1处于不同表位的另一种AMH单克隆抗体2，所述质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜远离所述金标垫的一端设置有吸水垫，所述吸水垫的一端搭设在所述硝酸纤维素膜上，所述吸水垫固定连接在所述PVC底板上。
进一步地，所述胶体金为0.02％的大粒径胶体金，最大吸收峰处波长为528～530nm，吸光度为1.8～2.0A。该种粒径胶体金既能够在保障线性的同时，又能够提高试纸条的灵敏度，从而可以检测低至0.1ng/ml的AMH含量。
进一步地，所述划金封闭液的包被量为1～3μl/cm，胶体金标记AMH单克隆抗体1的标记比例为每ml胶体金抗体使用量为6-10μg，胶体金-AMH单克隆抗体1耦连复合物浓缩倍数为20-30倍，即每20-30ml胶体金浓缩至1ml，划金量为0.5-1.0μl/cm。
进一步地，所述硝酸纤维素膜检测线上包被的AMH单克隆抗体2的浓度为0.8-1.0mg/ml，包被量为1.0-1.5μL/cm；所述质控线上包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为1.0-1.5mg/mL，包被量为1.0-1.5μL/cm。
本发明还提供一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括下列步骤：
(1)胶体金溶液的制备
①玻璃器皿的清洁：
胶体金制备过程中使用的容器、烧杯要泡重铬酸钾-浓硫酸溶液处理6小时以上，然后用纯化水、超纯水依次反复冲洗，烘干备用；
②溶液的配制：
2％氯金酸(批量50ml)：取一支1g/支氯金酸，用超纯水润溶解并定容至50ml，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，并置于2～8℃保存；
2％柠檬酸三钠(批量50ml)：称量1g柠檬酸三钠用超纯水溶解并定容至50ml，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，并置于2～8℃保存；
③烧制0.02％胶体金(批量100ml)：
称取100ml纯化水至烧杯内，取1.0ml 2％氯金酸至烧杯中混匀，加热至沸腾时，迅速加入2％柠檬酸三钠1.1～1.4ml，观察溶液颜色变化，带颜色稳定不变后，继续加热5分钟，然后停止加热，将溶液冷却至室温，再定容至100ml；
④胶体金的检测：
使用紫外分光光度计检测，波长400nm～650nm，检测范围0～2.5A；
(2)胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连物的制备
取2ml的胶体金，加入3～10μl的0.1M K2CO3溶液，在磁力搅拌器上混匀，加入12～20μg的抗体，磁力搅拌1h，再加入200-500μl的1～10％BSA进行封闭，再磁力搅拌30min，4℃，10000r离心10～20min，弃上清液，沉淀用金标稀释液复溶；每20-30ml胶体金最后浓缩为1ml，4℃储存备用；所述的金标稀释液含有PH为7.0-8.5，10～100mM Tris的缓冲液，1～5％PVP 10，1～5％海藻糖；
(3)包被质控线C、检测线T
①质控线C、检测线T线包被液的制备：取羊抗鼠IgG二抗，用PH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成0.8-1.0mg/ml的抗体溶液；取抗AMH单克隆抗体2，用PH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成1-1.5mg/ml的抗体溶液；
②划膜：将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5-8mm，包被量均为为0.8-1.5μl/cm；将点好膜的PVC底板置于37℃烘箱中，烘12-24小时后，于4-30℃加入干燥剂封口备用；
(4)划金
在划金前首先划封闭液，封闭液线距离检测线T线4-6mm，所述封闭液含有PH7.4的10-100mM PB缓冲液、1-5％PVP10、1-10％蔗糖、0.1-0.5％Tween20、1-5％BSA及0.05-0.2％Proclin300，包被量为1-3μl/cm，然后置于37℃烘箱内干燥0.5-1小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
将胶体金-抗体复合物以1～3μl/cm划量包被在硝酸纤维素膜上的划金线位置，然后置于37℃烘箱内干燥2-4小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
(5)样品垫的预处理
清洗烘网烘干，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4-6小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
所述样品垫预处理液含有PH7.5-8.5的10-100mM Tris缓冲液、0.1-0.5％S9和0.1-0.5％Tween20；
(6)膜材的组装与切割
取吸水垫、已处理的样品垫和金标垫，按照(15～22mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的金标垫、样品垫、吸水垫置于4-30℃加入干燥剂封口备用；
取已切割好的金标垫、样品垫、吸水垫和点过膜的PVC底板，贴上金标垫，使金标垫压着硝酸纤维素膜1-2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压着金标垫3-5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜1-2mm；组装好的PVC底板切割成3-5mm的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的有益效果如下：
本发明不同于传统方式的将胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连复合物喷涂在所述金标垫上，而是直接将胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连复合物包被在硝酸纤维素膜上，这种方法可以提高耦连复合物的均一性，进而提高试纸条的精密度，将变异系数CV值控制在5％以内。本发明试纸条的检测由传统上的10-15分钟缩短至5分钟，真正意义上实现超快速定量检测AMH含量。
附图说明
图1为本发明的胶体金免疫层析试纸的结构示意图；
上述图中：1、PVC底板；2、样品垫；3、样品滴入区；4、金标垫；5、硝酸纤维素膜；6、划金封闭液线；7、检测线；8、质控线；9、吸水垫。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例结合附图说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例
如图1所示，一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板1，还包括样品垫2、金标垫4、硝酸纤维素膜5及吸水垫9；所述样品垫2、金标垫4、硝酸纤维素膜5及吸水垫9顺次搭接置于所述PVC底板1上；所述样品垫2设置在所述PVC底板1的一端上，且与所述PVC底板1固定连接；所述样品垫2的中心位置设置有样品滴入区3；所述样品垫2的一端搭设在所述金标垫4上，所述金标垫4与所述PVC底板1固定连接，所述金标垫4的底部远离样品垫2的一端搭设在所述硝酸纤维素膜5上，所述硝酸纤维素膜5固定连接在PVC底板1上，所述硝酸纤维素膜5上包被有划金封闭液线6、检测线7和质控线8，所述划金封闭液线6、检测线7和质控线8沿水平方向平行设置；所述划金封闭液线6包被有胶金体标记的抗AMH单克隆抗体1；所述检测线7包被有与所述胶体金标记的AMH单克隆抗体1处于不同表位的另一种AMH单克隆抗体2，所述质控线8包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜5远离所述金标垫4的一端设置有吸水垫9，所述吸水垫9的一端搭设在所述硝酸纤维素膜5上，所述吸水垫9固定连接在所述PVC底板1上。
进一步地，所述胶体金为0.02％的大粒径胶体金，最大吸收峰处波长为528～530nm，吸光度为1.8～2.0A。该种粒径胶体金既能够在保障线性的同时，又能够提高试纸条的灵敏度，从而可以检测低至0.1ng/ml的AMH含量。
进一步地，所述划金封闭液的包被量为1～3μl/cm，胶体金标记AMH单克隆抗体1的标记比例为每ml胶体金抗体使用量为6-10μg，胶体金-AMH单克隆抗体1耦连复合物浓缩倍数为20-30倍，即每20-30ml胶体金浓缩至1ml，划金量为0.5-1.0μl/cm。
进一步地，所述硝酸纤维素膜检测线上包被的AMH单克隆抗体2的浓度为0.8-1.0mg/ml，包被量为1.0-1.5μL/cm；所述质控线上包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为1.0-1.5mg/mL，包被量为1.0-1.5μL/cm。
本发明还提供一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括下列步骤：
(1)胶体金溶液的制备
①玻璃器皿的清洁：
胶体金制备过程中使用的容器、烧杯要泡重铬酸钾-浓硫酸溶液处理6小时以上，然后用纯化水、超纯水依次反复冲洗，烘干备用；
②溶液的配制：
2％氯金酸(批量50ml)：取一支1g/支氯金酸，用超纯水润溶解并定容至50ml，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，并置于2～8℃保存；
2％柠檬酸三钠(批量50ml)：称量1g柠檬酸三钠用超纯水溶解并定容至50ml，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，并置于2～8℃保存；
③烧制0.02％胶体金(批量100ml)：
称取100ml纯化水至烧杯内，取1.0ml 2％氯金酸至烧杯中混匀，加热至沸腾时，迅速加入2％柠檬酸三钠1.1～1.4ml，观察溶液颜色变化，带颜色稳定不变后，继续加热5分钟，然后停止加热，将溶液冷却至室温，再定容至100ml；
④胶体金的检测：
使用紫外分光光度计检测，波长400nm～650nm，检测范围0～2.5A；
(2)胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连物的制备
取2ml的胶体金，加入3-10ul的0.1M K2CO3溶液，在磁力搅拌器上混匀，加入12-20ug的抗体，磁力搅拌1h，再加入200-500ul的1～10％BSA进行封闭，再磁力搅拌30min，4℃，10000r离心10～20min，弃上清液，沉淀用金标稀释液复溶；每20-30ml胶体金最后浓缩为1ml，4℃储存备用；所述的金标稀释液含有PH为7.0-8.5，10～100mM Tris的缓冲液，1～5％PVP 10，1～5％海藻糖；
(3)包被质控线C、检测线T
①质控线C、检测线T线包被液的制备：取羊抗鼠IgG二抗，用PH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成0.8-1.0mg/ml的抗体溶液；取抗AMH单克隆抗体2，用PH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成1-1.5mg/ml的抗体溶液；
②划膜：将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5-8mm，包被量均为为0.8-1.5μl/cm；将点好膜的PVC底板置于37℃烘箱中，烘12-24小时后，于4-30℃加入干燥剂封口备用；
(4)划金
在划金前首先划封闭液，封闭液线距离检测线T线4-6mm，所述封闭液含有PH7.4的10-100mM PB缓冲液、1-5％PVP10、1-10％蔗糖、0.1-0.5％Tween20、1-5％BSA及0.05-0.2％Proclin300，包被量为1-3μl/cm，然后置于37℃烘箱内干燥0.5-1小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
将胶体金-抗体复合物以1～3μl/cm划量包被在硝酸纤维素膜上的划金线位置，然后置于37℃烘箱内干燥2-4小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
(5)样品垫的预处理
清洗烘网烘干，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4-6小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
所述样品垫预处理液含有PH7.5-8.5的10-100mM Tris缓冲液、0.1-0.5％S9和0.1-0.5％Tween20；
(6)膜材的组装与切割
取吸水垫、已处理的样品垫和金标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的金标垫、样品垫、吸水垫置于4-30℃加入干燥剂封口备用；
取已切割好的金标垫、样品垫、吸水垫和点过膜的PVC底板，贴上金标垫，使金标垫压着硝酸纤维素膜1-2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压着金标垫3-5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜1-2mm；组装好的PVC底板切割成3-5mm的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条。
本发明不同于传统方式的将胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连复合物喷涂在所述金标垫上，而是直接将胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连复合物包被在硝酸纤维素膜上，这种方法可以提高耦连复合物的均一性，进而提高试纸条的精密度，将变异系数CV值控制在5％以内。本发明试纸条的检测由传统上的10-15分钟缩短至5分钟，真正意义上实现超快速定量检测AMH含量。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板，其特征在于：还包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次搭接置于所述PVC底板上；所述样品垫设置在所述PVC底板的一端上，且与所述PVC底板固定连接；所述样品垫的中心位置设置有样品滴入区；所述样品垫的一端搭设在所述金标垫上，所述金标垫与所述PVC底板固定连接，所述金标垫的底部远离样品垫的一端搭设在所述硝酸纤维素膜上，所述硝酸纤维素膜固定连接在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜上包被有划金封闭液线、检测线和质控线，所述划金封闭液线、检测线和质控线沿水平方向平行设置；所述划金封闭液线包被有胶金体标记的抗AMH单克隆抗体1；所述检测线包被有与所述胶体金标记的AMH单克隆抗体1处于不同表位的另一种AMH单克隆抗体2，所述质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜远离所述金标垫的一端设置有吸水垫，所述吸水垫的一端搭设在所述硝酸纤维素膜上，所述吸水垫固定连接在所述PVC底板上。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述胶体金为0.02％的大粒径胶体金，最大吸收峰处波长为528～530nm，吸光度为1.8～2.0A。
3.根据权利要求1所述的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述划金封闭液的包被量为1～3μl/cm，胶体金标记AMH单克隆抗体1的标记比例为每ml胶体金抗体使用量为6-10μg，胶体金-AMH单克隆抗体1耦连复合物浓缩倍数为20-30倍，即每20-30ml胶体金浓缩至1ml，划金量为0.5-1.0μl/cm。
4.根据权利要求1所述的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜检测线上包被的AMH单克隆抗体2的浓度为0.8-1.0mg/ml，包被量为1.0-1.5μL/cm；所述质控线上包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为1.0-1.5mg/mL，包被量为1.0-1.5μL/cm。
5.一种根据权利要求1所述的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)胶体金溶液的制备
①玻璃器皿的清洁：
胶体金制备过程中使用的容器、烧杯要泡重铬酸钾-浓硫酸溶液处理6小时以上，然后用纯化水、超纯水依次反复冲洗，烘干备用；
②溶液的配制：
2％氯金酸：取一支1g/支氯金酸，用超纯水润溶解并定容至50ml，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，并置于2～8℃保存；
2％柠檬酸三钠：称量1g柠檬酸三钠用超纯水溶解并定容至50ml，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，并置于2～8℃保存；
③烧制0.02％胶体金：
称取100ml纯化水至烧杯内，取1.0ml 2％氯金酸至烧杯中混匀，加热至沸腾时，迅速加入2％柠檬酸三钠1.1～1.4ml，观察溶液颜色变化，带颜色稳定不变后，继续加热5分钟，然后停止加热，将溶液冷却至室温，再定容至100ml；
④胶体金的检测：
使用紫外分光光度计检测，波长400nm～650nm，检测范围0～2.5A；
(2)胶体金-抗AMH单克隆抗体1耦连物的制备
取2ml的胶体金，加入3～10μl的0.1M K2CO3溶液，在磁力搅拌器上混匀，加入12～20ug的抗体，磁力搅拌1h，再加入200～500μl的1～10％BSA进行封闭，再磁力搅拌30min，4℃，10000r离心10～20min，弃上清液，沉淀用金标稀释液复溶；每20-30ml胶体金最后浓缩为1ml，4℃储存备用；所述的金标稀释液含有PH为7.0-8.5，10～100mM Tris的缓冲液，1～5％PVP 10，1～5％海藻糖；
(3)包被质控线C、检测线T
①质控线C、检测线T线包被液的制备：取羊抗鼠IgG二抗，用PH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成0.8-1.0mg/ml的抗体溶液；取抗AMH单克隆抗体2，用PH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成1-1.5mg/ml的抗体溶液；
②划膜：将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5-8mm，包被量均为为0.8-1.5μl/cm；将点好膜的PVC底板置于37℃烘箱中，烘12-24小时后，于4-30℃加入干燥剂封口备用；
(4)划金
在划金前首先划金封闭液线，划金封闭液线距离检测线T线4-6mm，所述封闭液含有PH7.4的10-100mM PB缓冲液、1-5％PVP10、1-10％蔗糖、0.1-0.5％Tween20、1-5％BSA及0.05-0.2％Proclin300，包被量为1-3μl/cm，然后置于37℃烘箱内干燥0.5-1小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
将胶体金-抗体复合物以1～3μl/cm划量包被在硝酸纤维素膜上的划金线位置，然后置于37℃烘箱内干燥2-4小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
(5)样品垫的预处理
清洗烘网烘干，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4-6小时后于4-30℃加入干燥剂封口备用；
所述样品垫预处理液含有PH7.5-8.5的10-100mM Tris缓冲液、0.1-0.5％S9和0.1-0.5％Tween20；
(6)膜材的组装与切割
取吸水垫、已处理的样品垫和金标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的金标垫、样品垫、吸水垫置于4-30℃加入干燥剂封口备用；
取已切割好的金标垫、样品垫、吸水垫和点过膜的PVC底板，贴上金标垫，使金标垫压着硝酸纤维素膜1-2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压着金标垫3-5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜1-2mm；组装好的PVC底板切割成3-5mm的用于检测抗缪勒氏管激素的胶体金免疫层析试纸条。
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