CN114791496A - 一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法 - Google Patents

一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114791496A
CN114791496A CN202111521284.5A CN202111521284A CN114791496A CN 114791496 A CN114791496 A CN 114791496A CN 202111521284 A CN202111521284 A CN 202111521284A CN 114791496 A CN114791496 A CN 114791496A
Authority
CN
China
Prior art keywords
colloidal gold
solution
gold
test strip
preparing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111521284.5A
Other languages
English (en)
Inventor
杨凌
韩旭
任莹
张乐颖
冯鹏飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei University of Engineering
Original Assignee
Hebei University of Engineering
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei University of Engineering filed Critical Hebei University of Engineering
Priority to CN202111521284.5A priority Critical patent/CN114791496A/zh
Publication of CN114791496A publication Critical patent/CN114791496A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，包括以下步骤：S1、制备胶体金，将氯金酸水溶液100mL加热至沸腾，加入0.1mol/L柠檬酸三钠水溶液1.5mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小30nm；S2、制备金标抗体溶液，取适量红色胶体金溶液于离心管中，加K2CO3溶液，加入后搅拌均匀；S3、向调整好pH的胶体金溶液中逐滴加入C1q抗体以胶体金标记。本发明检测奶牛早期妊娠，不仅可以检测胎儿是否存在，同时还可以了解胎儿是否发育正常，另外具有操作简单、检测时间短、结果清晰、可通过肉眼判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、无污染且携带方便等优点。

Description

一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法
技术领域
本发明涉及C1q胶体金试纸条技术领域，尤其涉及一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法。
背景技术
提高奶牛的繁殖率，尽量缩短空怀期是奶牛饲养管理的目标之一，如果奶牛配种后不能及时诊断是否妊娠，就可导致产犊间隔延长、繁殖率降低，饲养管理成本增高，大大影响经济效益。
目前我国奶牛的第一情期受孕率仅40-60％，多数奶牛需配种(或人工授精)2-3次才能受孕，以延误1-2个发情周期计算，就相当于每头/只繁殖奶牛多饲养20-40多天，增加了饲养成本，可见，奶牛早期妊娠诊断技术的研究，对缩短空怀期，提高繁殖率，进一步促进奶牛业的发展具有重要的经济意义。
目前在奶牛早期妊娠诊断中常用的几种方法有：直肠诊断法，超声波诊断法，孕酮的放射免疫法、孕酮的酶标免疫法和妊娠相关糖蛋白(PAG)酶标免疫法。其中直肠诊断法要求操作者必须具有一定的临床经验，而且35天以后才能做出正确的诊断。超声波诊断法需专业技术人员操作，目前最早28天才能做出正确的诊断。孕酮的放射免疫法和孕酮的酶标免疫法，可以直接检测奶牛血液或奶中的孕酮含量，由于奶牛在发情周期的黄体期，奶牛血液或奶中的孕酮含量也很高(朱士恩，家畜繁殖学，2009)，孕酮不是妊娠特异性因子，这样检测孕酮含量并不能非常准确确定奶牛妊娠与否。美国爱德士生物科技有限公司和美国biotracking公司生产的奶牛妊娠诊断试剂盒，是运用酶标免疫法检测血液中PAG，最早在人工授精(或配种)后28天，才能准确确定奶牛妊娠与否。奶牛再次配种需要有1个发情周期的间隔(21天左右)，虽然我们前期研究发现检测，检测奶牛血液细胞ISG15表达，可以在配种后18-20天进行妊娠诊断，但是ISG15，即干扰素刺激基因15(interferon-stimulatedgene 15)，是由干扰素引起的，干扰素可以来源于奶牛早期妊娠胎儿，也可以由病毒感染引起机体分泌干扰素，起到抗病毒感染的作用。因此，病毒感染也会引起奶牛ISG15增加，使检测奶牛血液细胞ISG15表达进行早期妊娠诊断准确率降低，有必要开发一种可以在配种后18-20天进行妊娠诊断的其它方法，即既可以达到及时配种的目的，又准确率较高的早期妊娠诊断试剂盒。
因此，研究一种使用简便的用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条，能够检测母牛子宫内的胚胎是否存在、并且发育正常，同时在奶牛人工授精(或配种)后21天之前确定奶牛妊娠与否，是目前需要解决的技术问题。为此，我们提出了一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，包括以下步骤：
S1、制备胶体金，将氯金酸水溶液100mL加热至沸腾，加入0.1mol/L柠檬酸三钠水溶液1.5mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小30nm；
S2、制备金标抗体溶液，取适量红色胶体金溶液于离心管中，加K2CO3溶液，加入后搅拌均匀；
S3、向调整好pH的胶体金溶液中逐滴加入C1q抗体以胶体金标记；
S4、向上述金标抗体溶液中加入一定量的BSA作稳定剂，使得总溶液中BSA的浓度为1％；
S5、将上述标记好的金标抗体溶液离心机去沉淀，去除未与胶体金结合的抗体蛋白和聚集的胶体金，取上清置入新的离心管中4℃、12000r/min离心30min，弃上清，所得沉淀用混合缓冲液(PB+1％BSA+1％蔗糖)洗涤两次，最终恢复至原体积的10％，所得即为纯化后的金标抗体溶液；
S6、胶体金试纸条的制备，进行样品垫的预处理；
S7、进行金标垫的预处理；
S8、进行硝酸纤维素膜的预处理；
S9、进行胶体金垫的组装，将处理完毕的各部件按从下到上依次为，硝酸纤维素膜到吸水垫到金标垫到样品垫的顺序粘贴在PVC底板上，使彼此重合长度适宜，组装制成检测C1q胶体金试纸条。
优选地，所述步骤S1中氯金酸水溶液的浓度为0.01％。
优选地，所述步骤S3中C1q抗体浓度为9.6μg/mL。
优选地，所述步骤S5中金标抗体溶液离心机中的温度为4℃，转速为5000r/min，离心时间为15min。
优选地，所述步骤S6中样品垫的预处理采用1％的Tween-20与PBS的混合溶液浸润样品垫，在无尘环境且干燥的环境下进行。
优选地，所述样品垫选用无纺布。
优选地，所述步骤S7中金标垫的预处理为将适当长度的玻璃纤维浸泡在PB+2％蔗糖+0.1％Tween20的混合溶液中，浸湿后取出烘干，以10μL/cm2的量均匀喷涂金标抗体，在无尘环境且干燥的环境下进行。
优选地，所述步骤S8中进行硝酸纤维素膜的预处理时，检测线为40μg/mL的C1q抗体，对照线为50μg/mL羊抗鼠二抗，划线宽度为5mm，将已经点好对照线和检测线的硝酸纤维素膜浸泡在5％的BSA+1％蔗糖溶液中2h后，取出干燥。
本发明检测奶牛早期妊娠，不仅可以检测胎儿是否存在，同时还可以了解胎儿是否发育正常，另外具有操作简单、检测时间短、结果清晰、可通过肉眼判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、无污染且携带方便等优点。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种用于检测奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条，由含有金标C1q抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、无纺布样品垫和吸水垫组成。
作为本发明的一种优选方案，羊抗鼠二抗对照线的二抗喷涂浓度为50μg/mL，C1q抗体检测线的C1q抗体的喷涂浓度为40μg/mL。
具体制备步骤如下：
第一步，制备胶体金：将0.01％HAuCl4水溶液100mL加热至沸腾，加入1％枸橼酸三钠水溶液1.5mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小30nm；
第二步，制备金标抗体：采用鼠抗C1q单克隆抗体，胶体金pH值在8.5时与抗体吸附，采用1％的BSA作稳定剂；
第三步，胶体金试纸条的制备：将金标抗体灌注在已处理好的硝酸纤维素膜上，干燥，将C1q抗体和羊抗鼠二抗在硝酸纤维膜上点成2条线，分别为检测线和对照线，组装检测C1q胶体金试纸条，采用5％的BSA+1％蔗糖溶液封闭。
在本发明中，孕体含有来自父方的基因，具有抗原性，然而，母体免疫系统不仅不排斥携带父系抗原的胚胎，母体免疫系统反而形成对胚胎抗原的免疫耐受。母体的免疫耐受是由胎儿诱导的，使母体免疫系统对胚胎的适应性免疫反应进行调整。母牛妊娠建立需要控制母体的免疫反应，首先通过胚胎分泌妊娠信号与母体子宫进行交流，改变母体子宫的免疫环境，牛的早期胚胎会诱导子宫内膜免疫相关基因表达丰度发生改变。同时早期胚胎也会引起牛外周血液单个核细胞免疫相关基因和干扰素刺激基因表达发生改变。我们近期研究发现，早期妊娠会引起牛外周血液单个核细胞干扰素γ、白介素4和10的蛋白表达发生改变，即妊娠会调节子宫和外周血液单个核细胞的免疫功能。
补体系统作为固有免疫的重要组成部分，通过引发一系列酶促反应，从而驱动炎症反应的发生，补体系统的失调可引发过度的炎症反应，并对自身组织产生损害。同时，宫颈重塑、早产、胎膜早破也与补体的激活有关。补体系统主要包括补体成分C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9，其中C1q是补体信号通路的重要组成部分，补体信号通路对于机体的先天免疫具有重大意义。孕体含有来自父方的基因，具有抗原性，然而，母体免疫系统不仅不排斥携带父系抗原的胚胎，母体免疫系统反而形成对胚胎抗原的免疫耐受。我们近期研究发现，在绵羊妊娠早期，胸腺C1q表达明显增加，同时我们也发现妊娠18天奶牛血液中C1q蛋白明显增加，C1q参与妊娠早期母体的免疫调节，可以降低母体对胎儿的免疫排除，使母体免疫系统形成对胚胎抗原的免疫耐受，对于妊娠维持具有重要意义。因此，检测外周血液细胞C1q表达与否，可以十分准确地获悉妊娠与否，采集18-20天的奶牛外周血液，检测血液中C1q的含量，可以直接检测母体免疫免疫耐受的形成情况，判断子宫内的胚胎是否引起母体免疫系统发生改变，即检测子宫内的胚胎是否存在、并且发育正常。因此，检测血液中的C1q，用于妊娠对奶牛早孕诊断是切实可行的，同时也是C1q的一种新的用途。
本发明的使用方法：取奶牛外周血液1mL作为待测样本，使用样品垫直接蘸取或加样至样品垫，5min后，观察结果。
结果判断：检测试纸的检测线和对照线显示为彩带，即显色区为两条线时为阳性，即妊娠；只有一条对照线显色时为阴性，即未妊娠，如果对照线也不显色，即检测试纸失效。
在本发明中，主要试验材料包括：无水碳酸钾(K2CO3)、牛血清白蛋白(BSA)、氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蔗糖、硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维、羊抗鼠IgG抗体、PVC底板、吸水滤纸等。
在本发明中，主要试验试剂包括：1％氯金酸溶液、5％BSA、0.1mol/L柠檬酸三钠、0.2mol/L碳酸钾溶液、PB溶液、2％蔗糖溶液等。
在本发明中，胶体金制备：
(1)将制胶体金所用的玻璃器皿清洗至杯壁没有水珠，烘干后放入酸洗过夜；第二天用蒸馏水冲洗几遍，干燥箱烘干封口；
(2)称取99mL去离子水于制胶体金的烧杯中，均速搅拌，并向烧杯中加入1％氯金酸1mL，使其终浓度为0.01％，保持搅拌并加热至沸腾，一次性快速加入1.5mL的0.1mol/L柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，烧杯中无色的溶液会逐渐变色，当溶液呈红色且稳定不变色后停止加热，继续旋转3-5min，将溶液冷却至室温并恢复至原体积备用，制的胶体金的颗粒直径大小约为30nm。
在本发明中，胶体金标记抗体蛋白：
(1)取适量红色胶体金溶液于离心管中，加入一定量0.2mol/L的K2CO3溶液调整pH至最适，加入后搅拌均匀；
(2)向调整好pH的胶体金溶液中逐滴加入最适稳定量的抗体蛋白以胶体金标记，边加边搅拌，全部加入后再搅拌3min；
(3)向上述金标抗体溶液中加入一定量的BSA作稳定剂，使得总溶液中BSA的浓度为1％，并轻轻搅拌8min使混匀；
(4)将上述标记好的金标抗体溶液在4℃、5000r/min离心15min，弃沉淀，去除未与胶体金结合的抗体蛋白和聚集的胶体金；取上清置入新的离心管中4℃、12000r/min离心30min，弃上清，所得沉淀用混合缓冲液(PB+1％BSA+1％蔗糖)洗涤两次，最终恢复至原体积的10％。所得即为纯化后的金标抗体溶液。
在本发明中，胶体金垫处理和组装：
(1)样品垫的预处理：采用1％的Tween-20与PBS的混合溶液浸润样品垫(样品垫选用无纺布)，无尘环境干燥；
(2)连接垫(胶体金垫)的预处理：将适当长度的玻璃纤维浸泡在2％的蔗糖与PBS的混合溶液中，浸湿后取出烘干；以10μL/cm2的量均匀喷涂金标抗体，无尘环境干燥；
(3)NC膜的预处理：对照线为40μg/mL的一抗，检测线为50μg/mL的二抗，划线宽度为5mm；将已经点好对照线和检测线的NC膜浸泡在5％的BSA溶液或3％的脱脂奶粉溶液中2h后，取出干燥；
(4)胶体金垫的组装：将处理完毕的各部件按从下到上依次为，NC膜-吸水纸-结合垫-上样垫的顺序粘贴在PVC底板上，使彼此重合长度适宜。
在本发明中，制得的胶体金溶液颜色呈明亮的紫红色，透亮度良好，无杂质或沉淀，均一性、稳定性良好。
在本发明中，金标抗体最适蛋白浓度试验：
取5个离心管分别加入胶体金溶液1000μL和0.2mol/L的碳酸钾溶液6μL，按下表分别加入100μg/mL抗体蛋白和PB溶液；5min后加入100μL的10％NaCl溶液，观察颜色变化和沉淀，确定最低标记蛋白浓度。
表1胶体金标记最低蛋白量
1 2 3 4 5
胶体金(mL) 1 1 1 1 1
K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>(μL) 6 6 6 6 6
抗体蛋白(μL) 0 20 50 80 100
PB(μL) 100 80 50 20 0
NaCl(μL) 100 100 100 100 100
由图表上可得，胶体金标记的最低蛋白稳定量为8μg/mL，最适蛋白稳定量为最低蛋白稳定量的1.2倍，所以最适抗体蛋白浓度为9.6μg/mL。
在本发明中，金标抗体最适pH值试验：
取5个离心管，分别加入500μl的胶体金溶液、抗体蛋白和PB溶液，再按下表2加入不同量的0.2mol/L碳酸钾溶液；5min后加入50μL的10％NaCl溶液，静置过夜，观察颜色变化和沉淀，确定最适标记pH值为8.5。
表2胶体金标记最适pH值
1 2 3 4 5
胶体金(μL) 500 500 500 500 500
K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>(μL) 1 2 3 4 5
抗体蛋白(μL) 40 40 40 40 40
PB(μL) 10 10 10 10 10
NaCl(μL) 50 50 50 50 50
在本发明中，胶体金试纸条检测稳定性试验：
分别用保存3天、7天和14天的胶体金试纸条对试验奶牛血清进行检测，其中37℃保存3天的试纸条反应强度下降，保存7天的试纸条阳性线模糊，质控线颜色变浅，4℃保存14天的试纸条反应强度下降，仍可以正常使用，试纸条的稳定性有待提高。
在本发明中，胶体金试纸条检测准确性试验：
在奶牛妊娠18天时使用胶体金试纸条对未妊娠奶牛组和妊娠奶牛组进行妊娠检测，妊娠检测结果与妊娠35天后的B超检测结果进行比较。
表3配种18天奶牛妊娠诊断结果
妊娠诊断 试剂盒检出(头) B超检出(头) 准确率
未妊娠奶牛 8 9 88.9％
妊娠18天奶牛 11 12 91.7％
结果表明，胶体金试纸条检出的未妊娠奶牛为8头，妊娠35天B超检测检出的未妊娠奶牛为9头，检测准确率为88.9％，胶体金试纸条检出妊娠18天奶牛为11头，妊娠35天的B超检测检出22头，检测准确率为91.7％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备胶体金，将氯金酸水溶液100mL加热至沸腾，加入0.1mol/L柠檬酸三钠水溶液1.5mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小30nm；
S2、制备金标抗体溶液，取适量红色胶体金溶液于离心管中，加K2CO3溶液，加入后搅拌均匀；
S3、向调整好pH的胶体金溶液中逐滴加入C1q抗体以胶体金标记；
S4、向上述金标抗体溶液中加入一定量的BSA作稳定剂，使得总溶液中BSA的浓度为1％；
S5、将上述标记好的金标抗体溶液离心机去沉淀，去除未与胶体金结合的抗体蛋白和聚集的胶体金，取上清置入新的离心管中4℃、12000r/min离心30min，弃上清，所得沉淀用混合缓冲液(PB+1％BSA+1％蔗糖)洗涤两次，最终恢复至原体积的10％，所得即为纯化后的金标抗体溶液；
S6、胶体金试纸条的制备，进行样品垫的预处理；
S7、进行金标垫的预处理；
S8、进行硝酸纤维素膜的预处理；
S9、进行胶体金垫的组装，将处理完毕的各部件按从下到上依次为，硝酸纤维素膜到吸水垫到金标垫到样品垫的顺序粘贴在PVC底板上，使彼此重合长度适宜，组装制成检测C1q胶体金试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述步骤S1中氯金酸水溶液的浓度为0.01％。
3.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述步骤S3中C1q抗体浓度为9.6μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述步骤S5中金标抗体溶液离心机中的温度为4℃，转速为5000r/min，离心时间为15min。
5.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述步骤S6中样品垫的预处理采用1％的Tween-20与PBS的混合溶液浸润样品垫，在无尘且干燥的环境下进行。
6.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述样品垫选用无纺布。
7.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述步骤S7中金标垫的预处理为:将适当长度的玻璃纤维浸泡在PB+2％蔗糖+0.1％Tween20的混合溶液中，浸湿后取出烘干，以10μL/cm2的量均匀喷涂金标抗体，在无尘且干燥的环境下进行。
8.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法，其特征在于：所述步骤S8中进行硝酸纤维素膜的预处理时，检测线为40μg/mL的C1q抗体，对照线为50μg/mL羊抗鼠二抗，划线宽度为5mm；将已经点好对照线和检测线的硝酸纤维素膜浸泡在5％的BSA+1％蔗糖溶液中2h后，取出干燥。
CN202111521284.5A 2021-12-13 2021-12-13 一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法 Pending CN114791496A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111521284.5A CN114791496A (zh) 2021-12-13 2021-12-13 一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111521284.5A CN114791496A (zh) 2021-12-13 2021-12-13 一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114791496A true CN114791496A (zh) 2022-07-26

Family

ID=82460571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111521284.5A Pending CN114791496A (zh) 2021-12-13 2021-12-13 一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114791496A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wallach et al. Clinical tests of sperm fertilizing ability
US5514557A (en) Method and kit for detecting antibodies specific for HLA and/or platelet glycoproteins
CN110531091B (zh) 一种促黄体生成素检测试纸、试纸卡及其制备方法和应用
JPH06503645A (ja) 胎児制限抗原の決定のための試薬及びキット
CN106248975A (zh) 一种h‑hcg快速免疫诊断层析试纸及其制备方法
JPH06504841A (ja) 胎児膜の破裂を検出する方法およびその方法を利用する試験キット
JP3014451B2 (ja) 分娩感受性を決定する診断方法およびその方法に使用する試薬キット
PT88615B (pt) Equipamento e metodo de dosagem imunometrica aplicavel a celulas completas
CN114935656A (zh) 一种优生优育十项抗体联合检测试剂盒及其制备方法
CN111596075B (zh) 一种检测牛早期妊娠的方法
CN111596073B (zh) 一种检测羊早期妊娠的方法
CN108152189B (zh) 一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法
US20020012953A1 (en) Methods for separation and isolation of subpopulations of cells in biological samples
CN114791496A (zh) 一种用于奶牛早期妊娠诊断的C1q胶体金试纸条制作方法
Wango et al. Progesterone and 5β-pregnanediol production by isolated fetal placental binucleate cells from sheep and goats
CN103267851B (zh) 一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法
CN103134935A (zh) 一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法
CN107202896B (zh) 一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法
CN111596074B (zh) 一种检测牛生育能力的方法
CN103235134B (zh) 一种检测胎膜早破的免疫层析试纸及其制备方法
CN103941009B (zh) 用于牛羊早期妊娠诊断的isg15胶体金试纸条及其制作方法
CN113281525A (zh) 一种检测母猪排卵量的方法
CN206300957U (zh) 一种可同时检测血清和尿液样本的早孕试纸条
CN111596076B (zh) 一种检测羊生育能力的方法
CN111537730A (zh) 检测布鲁氏菌抗体的检测试纸

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination