JPH06503645A - 胎児制限抗原の決定のための試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

胎児制限抗原の決定のための試薬及びキット筈這良鳳匁朋ｎ！ 本願は、１９８８年１１月１８日付は出願の米国特許願第０７／２７４　、２６ ８号、１９８８年９月１５日付は出願の米国特許願第０７／２４４．９６９号、 １９８８年１１月１８日付は出願の米国特許願第０７／２７４　、２６７号、お よび１９８８年１２月１２日付は出願の米国特許願第０７／２８２．４２６号の 一部継続出願である。上記出願の発明者はＡｎｄｒｅｗ　Ｅ、　５ｅｎｙｅｉお よびＮｅ１ｓｏｎ　Ｎ、　Ｈ，ＴｅｎＧである。 これらの各出願は全体を本願に組込むものとする。 則頴ｉ野 本発明は、正常妊娠と子宮外妊娠；妊娠の終了；および早期分娩と羊膜破裂の危 険が増大していること；を免疫学的に検出するのに用いる試薬とキットに関する 。 発刊−９背景 妊娠を決定する多種類の試験法が開発されている。商業的な妊娠の早期決定法に は尿もしくは血清の検定法が含まれている。尿中のｈＣＧ　（ヒト絨毛性ゴナド トロピン）を測定する家庭妊娠試験法としては、各種の酵素検定法、血球凝集阻 止反応法、および月経が停止してから７日間までの間に妊娠を指示するのに有効 な抗体インジケーター凝集試験法がある。特に、子宮外妊娠のような異常妊娠を 決定するには医師によるｉ認が推奨される。 ｈｃｃは胎児栄養芽層によって産生され、胎盤中の絨毛開腔を通して胎児血液か ら母親の血液へと流れる。母親の血液と尿中のｈｃｃの濃度は約３週間後から検 出可能になる場合が多い、血清もしくは尿のｈｃｃ試験法の感度は、産生される ｈｃｃの量が胎児栄養芽層組織の置および母親の体液中のｈＣＧを希釈すること によって測定されるので、制限がある。β−ｈＣＧに特異的に結合する抗体が開 発されるまテハ、ＬＨ（１体化ホルモン）との交差反応があるので感度のレベル に制限がある。 本発明の発明者らは、子宮頚管、子宮頚ＯＳもしくは膣の後部円蓋、好ましくは 外側子宮ｇｏｓもしくは後部円蓋の近傍から取出した試料を、胎児制限抗原類、 すなわち胎盤組織で産生されかつ実質的な量では母親の血液中に流れることがな い化合物もしくは物質の存在について試験することによって、正常な子宮妊娠を 、妊娠サイクル中、早期に、確実に決定できることを発見したのである。この種 の抗原としては胎児フィブロネクチンがある。 本発明の発明者らは、子宮頚管もしくは子宮ｉｏｓの近傍から取出した試料を、 胎児制限抗原１１（ｆｅｔａｌ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）、 すなわち胎盤組織で産生され、実質的な量では母親の血液に流れることがない化 合物もしくは物質の存在について試験することによって、子宮外妊娠を決定でき ることを発見した。この種の物質としては胎児フィブロネクチンが含まれる。血 液もしくは尿による妊娠試験によって妊娠について陽性という試験結果が得られ た被検者由来の試料中の胎児制限抗原が著しく少ない場合は、子宮外妊娠を示し ている。 治療的流産または自然流産中に排出される子宮組織中の、受胎によるｅｘシｉシ ０産物の存在を測定することは、子宮妊娠の存在とその終了を確認しかつ子宮外 妊娠が存在しないと判定するのに極めて重要である。母親の血清または尿中の胎 児関連抗原の濃度が妊娠を表示し、かつ治療的流産中に排出された子宮組織が受 胎産物を含有していない場合は、子宮外妊娠の可能性があることを示している。 自然流産の指示物質と関連がある受胎産物が子宮排泄物中に存在することによっ て流産が確認され、一方このような物質が存在しない場合は妊娠が継続している ことを示している。膣腔由来の試験試料中に胎児関連抗原が存在することを測定 する通常の免疫検定法は、これらの試料が一般に母親の血液を含有しているので 、受胎産物が存在することを指示するには確実ではない、妊娠抗原類と胎児抗原 類は、通常、胎児と胎盤の組織中のみならず母親の血液中にも存在している。 早期出産が迫っていることを決定することは、早期出産児の新生児生存を増大さ せるのに重要である。羊膜の破裂を検出することは、真の分娩と擬似分娩を識別 するのに重要である。羊膜の破裂が小さくかつ羊水の漏出量が少ない場合は羊膜 破裂が検出されない場合が多い。破裂した羊膜を検出する方法で容認されている 方法は、主観的であり、感度が不充分でかつ特異的でない。妊娠２０週間後に、 早期分娩および羊膜破裂の危険が増大していることを検出する本発明の実施態様 は、後部円蓋、子宮頚管、または子宮頚ＯＳの近傍から取出した試験試料の検定 法に関する。 登囲夏１拾 本発明の方法は、妊娠の存在および／または状態を決定するのに用いる０本発明 の方法は、膣腔由来の試料中に診断指示物質が存在することを決定するのに用い られ、下記の方法で構成されている。 すなわち、 （ａ）子宮頚管または子宮頚Ｏ３の近傍の試験試料を採取し、次いで試料中に胎 児制限抗原が存在することを決定することからなる妊娠の最初の２０週間中に正 常な子宮妊娠を決定する方法；（ｂ）妊娠の最初の２０週間中、妊娠患者から子 宮頚管または子宮頚ＯＳの近傍の試験試料を採取し、次いで試料中に胎児制限抗 原が存在しないことを決定することからなる卵管妊娠を決定する方法；（ｃ）子 宮から排泄もしくは取出された試験試料を採取し、次いで試料中に胎児制限抗原 が存在することを決定することからなる受胎のｅｘ　ｖｉｖｏ産物を決定する方 法；または（ｄ）妊娠してから２０週間後、患者から後部円蓋、子宮頚管または 子宮５ｏｓの近傍の試験試料を採取し、次いで試料中に胎児制限抗原が存在する ことを決定することからなる早期分娩もしくは胎児膜破裂の危険が増大している ことを決定する方法である。 本発明の検定法で使用する試薬としては、標識付きおよび標識なしの抗（被検体 ）抗体類すなわち抗（胎児フィブロネクチン）抗体類のような抗（胎児制限抗原 ）抗体類；抗（被検体クラス）抗体類すなわち抗（フィブロネクチン）抗体類の ような抗（胎児制限抗原クラス）抗体類などがある０本発明の検定法で使用する 他の試薬としては、抗（被検体）抗体類すなわち抗（胎児フィブロネクチン）抗 体類のような抗（胎児制限抗原）抗体類；抗（被検体クラス）抗体類すなわち抗 （フィブロネクチン）抗体類のような抗（胎児制限抗原クラス）抗体類などを付 着させた不溶性の支持体がある。標識付きもしくは標識なしの試薬の胎児制限抗 原類も本発明の試薬である。本発明の検定法で使用される試薬には、試薬被検体 を付着させた不溶性支持体、すなわち胎児制限抗原類を付着させた不溶性支持体 も含まれる０本発明の検定法に使用する試薬には、標識付き二次抗体のような免 疫構法用試薬、陽性と陰性の対照、酵素基質のような標識発現試薬、および洗浄 緩衝液も含まれる。 本発明には、上記試薬の中の１つのみ、他の試薬を組合わせたもの、または試料 調製用具のような補給物を組合わせたキットが含まれる、試薬類は、キット中に 、適切ないがなる形態で入っていてもよく、例えば容器、包装物などの形態でも よい。 見所９罫ＪＩｌｉＭ３ 妊娠の存在および／または状態を決定する本発明の方法は、膣腔から取出された 、後部円蓋、子宮頚管または子宮ｉｏｓ、特に子宮頚管もしくは子宮頚Ｏ８の近 傍の試験試料中、胎児制限抗原の存在を決定することからなる方法である０本発 明の具体的な実施態様は、正常な子宮妊娠、子宮外妊娠、治療的もしくは自然の 流産の発生、および早期分娩もしくは羊膜破裂の危険が増大していることを決定 するのに利用される。 本発明の方法を実施するのに有用な試薬とキットについても説明する。 胎逼１１限１０

【試眉」１ＪＫ１ 胎児制限抗原試験法は、後部円蓋、子宮頚管または子宮頚ＯＳの近傍の取出され た試験試料中の胎児制限抗原、すなわち特に胎児もしくは胎盤にのみ集中した物 質の検出を行う。本発明の発明者らは、検出可能な量のこれらの物質が上記の試 料中に存在するということを発見した。胎児制限抗原は、母親の血液中には有意 な量で存在しないので、試料中に母親の血液が存在していても試験は妨害されな い。 本願で用いる“胎児制限抗原”という用語は、胎児もしくは胎盤にのみ由来する 物質であって、母親の血清、血漿もしくは尿中には存在しないか、または母親の 血清、血漿もしくは尿中に有意な量では存在しない物質を意味すると定義する。 この定義に合致するいずれの物質も、上記用語の意味の範囲内に含まれることを 意味し、これらの物質としては、免疫原性の物質とタンパク質、および純品の形 態では免疫原性ではないが、それらに対して特異的もしくは選択的な抗体と選択 的に結合できる独得のエピトープを有する他の物質の両者が含まれる。胎児制限 抗原の例は、Ｈ，Ｍａｔｓｕｕｒａ　ａｒｉｄ　Ｓ。 Ｈａｋｏｓ＋ｏｒｊ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＩ Ｓ＾、８２巻、　６５１７〜６５２１頁。 １９８５年に報告されたＦＤＣ−６モノクローナル抗体と特異的に結合する胎児 フィブロネクチンである。またＦＤＣ−６抗体を産生ずるハイプリドーマ（ｔｈ ｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受 託番号ＡＴＣＣＨＢ９０１８で寄託されている）の製造は、１９９０年１月１６ 日付けでＭａｔｓｕｕｒａらに発光された米国特許第４，８９４，３２６号に詳 細に記載されている。 本願で用いられる“胎児制限抗原クラス”という用語は、胎児制限抗原がメンバ ーである抗原類のクラスもしくはグループを意味すると定義する。例えば、胎児 フィブロネクチンは、ヒトフィブロネクチンのグループもしくはクラスの胎児制 限メンバーである。 本願で用いる“抗体”という用語は、クラスＩｇＧ、　ＩｇＭ、　Ｉｇ＾、　Ｉ ｇＤおよびＩｇＥの抗体、ならびに抗体のフラグメントであるＦａｂとＦ（ａｂ ’）を含む、優先的に結合する、抗体のフラグメントとハイブリッドの誘導体を 含むと定義する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。 本発明の検定法に使用するには、一般にモノクローナル抗体の方が好ましい。 免疫学的方法は、特異性を有するので本発明の検定法を実施するのに最も便利で ある９本願で用いる“免疫検定法”という用語は、抗原のエピトープと優先的に 結合する第２物質（すなわち結合パートナ−１つまり通常は抗原結合部位を有す る抗体もしくは抗体フラグメント）と抗原が優先的に結合することを利用する方 法を意味すると定義する。本願で用いる優先的結合という用語は、選択的および 一般に特異的であり、かつ交差反応性の非特異的結合が一般に１０％より少なく 好ましくは５％より少ない結合パートナ−間の結合を意味する。例えば、被検体 が胎児フィブロネクチンの場合、抗（胎児フィブロネクチン）抗体は、成人のフ ィブロネクチン類との交差反応性は１０％より小さく、好ましくは５％より小さ い。 限定されないが上記のステップを含むすべての検定法は本発明の通用範囲に含ま れる。その検定法には、例えばサンドイッチ、競合、計量棒（ｄｉｐ　５ｔｉｃ ｋ）凝集、沈澱、トランジスターブリッジプローブ、粒子選別、光妨害、光散乱 、および超音波プローブによる免疫検定法が含まれる。適切な免疫検定法は、標 識として、例えば放射性同位元素類、酵素類、または蛍光原性、クロモゲン原性 もしくは化学発光性の物質を使ってもよい。 検定される試料は、後部円蓋、子宮頚管または子宮頚ＯＳの近傍から取出し、そ の試料を検定して、試料中に胎児制限抗原が存在することまたはその量が決定さ れる。該抗原が存在することを決定する方が好ましい。試料は一般に流体と粒状 固体を含有し、膣もしくは子宮頚の粘液、膣もしくは子宮頚の他の分泌物、細胞 類もしくは細胞の破片、羊水、または胎児もしくは母親の他の物質を含有してい てもよい。試料は、ダクロンなどの繊維製先端を有するスワブ、アスピレータ、 吸引用具、洗浄用具などで取出され、適切な容器に移し、で保管し試験室に送ら れる。 試験試料は、試料として採取された組成物中では不安定で敏感なタンパク質の被 検体を保護する液体中に分散させておくことが大切である。貯蔵と移送に用いる 媒体は、貯蔵と移送中にタンパク質の被検体の濃度が低下するのを防止しなけれ ばならない。貯蔵と移送に用いる適切な保存溶液は、０．０５Ｍ　）リス−ＨＣ ｌ、　ｐＨ７，４ｉ　０．１５ＭＮａＣ１；　０．０２％ＮａＮ５　；　１％Ｂ ＳＡ　；　５００力リクレイン単位／ｗａ　Ｉのアプロチニン；１ｗＭフェニル メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）　、および５ｍＭ　ＥＤＴＡで構成さ れ、１９９０年４月２４日に発行された米国特許第４，９１９．８８９号に記載 されている。上記の溶液は、胎児フィブロネクチンを検出する際に最も好ましい 試料希釈溶液である。 胎児制限抗原の検出は、試験試料中の胎児制限抗原を、胎児制限抗原のエピトー プと優先的に結合する抗体と結合させ、次いでこの結合反応があるかないかを決 定することによって達成することができる。 胎児制限抗原の１つのサンドインチ検定法では、試験試料を、抗（胎児制限抗原 ）抗体を付着させた不溶性の支持体と接触させて、試料中の胎児制限抗原を不溶 性支持体に結合させる。次にその不溶性支持体を、二次抗体である標識なしまた は標識付きの抗（胎児制限抗原）抗体と接触させると、その抗体は不溶性支持体 に付着している胎児制限抗原と結合し、捕獲された胎児制限抗原が検出測定され る。 被検体の胎児制限抗原を含むクラスの物質と結合する抗体は、特異的な抗（胎児 制限抗原）抗体捕獲抗体または特異的な抗（胎児制限抗原）抗体サンドイツチン グ抗体の代わりに用いることができる。 例えば、抗（胎児フィブロネクチン）抗体は不溶性支持体に付着させることがで き、および標識付きもしくは標識なしの抗（フィブロネクチン）抗体は、捕獲さ れた抗原を検出するのに使用することができる。あるいは、抗（フィブロネクチ ン）抗体は不溶性支持体に付着させることができるので、標識付きもしくは標識 なしの抗（胎児フィブロネクチン）抗体は、捕獲された抗原に標識を付けるのに 使用される。抗（胎児制限抗原）抗体は、捕獲抗体として使用して、胎児制限抗 原が、そのクラスの他の抗原に比較して、試料中に少量しか存在していないとき に確実に検出することが好ましい。 二次抗体は、不溶性支持体上で直接測定することができる物理的に検出可能な標 識をもっていてもよい、あるいは二次抗体は標識なしでもく、その場合、その二 次抗体は、不溶性支持体を、二次抗体と選択的に結合するＩＩ識付きの抗体もし くは抗体フラグメント（すなわち三次抗体）と接触させ、未結合の標識付き三次 抗体を支持体から除き、次いで不溶性支持体上の標識の存在を測定することによ って測定することができる。膜基質を用いるサンドインチ免疫検定法を使用する のが適切である。 また試料は、競合免疫検定法で試験することもできる。この場合、試験試料は標 識を付けた試薬である抗体もしくは抗原と混合し、次いで抗（胎児制限抗原）抗 体もしくは試薬の胎児制限抗原が付着している不溶性支持体とともインキュベー トして、試薬間に試料被検体との結合について競合を起こさせる。このような免 疫検定法を達成する方法と手順は、免疫検定法の技術分野の当業者によく知られ ている。最終的に、不溶性支持体に付着しているか、または溶液中に残っている 標識を測定する。 抗（胎児制限抗原）抗体は、胎児制限抗原類、好ましくは高度に精製した胎児制 限抗原から、通常の抗血清法またはモノクローナル法で得ることができる。本発 明は、本願では、明確にするために、胎児制限抗原としての胎児フィブロネクチ ンの検出について述べるが、これには限定されることなく、いずれの胎児制限抗 原の検出法も本発明の適用範囲内にあることを意味する。胎児フィブロネクチン は、Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ＋　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎ ｃｅｒ＋　２０巻、１〜５頁。 １９７７年に記載されているようにして羊水から精製される。抗（胎児フィブロ ネクチン）抗体は、胎児フィブロネクチンから、通常の抗血清法またはモノクロ ーナル抗体法によって誘導することができる。 モノクローナルとポリクローナルの両方の抗（胎児制限抗原）抗体類、または抗 （胎児制限抗原クラス）抗体類は、胎児制限抗原類、好ましくは高度に精製され た抗原類から、通常の抗血清法またはモノクローナル法で誘導することができる 。 本発明の検定法に有用な主要な抗体は、抗体のＩｇＧとＩｇＭであるが、抗体の Ｉｇ［ｌ、　ＩｇＢおよびＩｇ＾も充分な量で入手できれば使用できる。使用時 これらの抗体は、Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉ、　５ＥＬＥＣＴＥＤ 　ＭＥＴＨＯＤＳＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＩＪＮＯＬＯＧＹ、Ｓａｎ　Ｆ ｒａｎｃｉｓｃｏ　Ｆｒｅｅ＋＊ａｎ＋　１９８０　年　；　Ｇｏｄｉｎｇ＋Ｊ 、、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　：　ＰＲＴＮＣＩＰＬＥＳ 　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ＋　１１１−１１４頁、　１９８３年およびＰａｒｉｋｈら、Ｃ＆　ＥＮ 　（１９８５年８月２６日）に記載されているような通常のアフィニティークロ マトグラフィーを用いてアフィニティー精製される。 本発明のキットと方法に使用するのに通した優先的に結合する抗体フラグメント は、それぞれのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体から、通常の酵素 的または化学的フラグメント化法によって製造することができる。適切な方法は 、例えばＴｉｊｓｓｅｎ、　Ｐ、。 ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　ＩＮ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　：ＰＲＡＣＴＩＣＥ　ＡＮＤ 　ＴＨＥＯＲＩＥＳ　ＯＦ　ＥＮＺＹＭＥ　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　１９８５年に記載されている。 ポリクローナル抗（胎児制限抗原）抗体は、ウサギ、モルモット、ラットまたは ヤギのような動物を、胎児フィブロネクチンのような胎児制限抗原の濃縮物で免 疫化し、その免疫化された動物から血清を取出し、次いで例えば硫酸アンモニウ ム沈澱法によって該血清から免疫グロブリン類を分離することによって得ること ができる。 アフィニティークロマトグラフィーに用いるのに適切な吸収剤としては、胎児制 限抗原の抗体が共有結合する架橋アガロースと架橋ポリアクリルアミド類が挙げ られる。成人フィブロネクチンと交差反応を行う抗体を除くために、抗体の血清 は、成人フィブロネクチンを結合させるカラムを通過させる。残留抗体を含有す る溶離液の一部を次いで胎児フィブロネクチンのカラムを通過させ、次いで溶離 してアフィニティ精製がなされた抗体を得ることができる。 これらの手順では、リン酸緩衝食塩水溶液による抗体溶液をカラムに加え、次い でその抗体を２．５　Ｍ　Ｎａ５ＣＮ溶液ｐｏｓ、ｏでｍＨすることができる。 所望により、抗体の濃縮は、減圧透析法もしくは限外濾過法によって実施するこ とができる。抗体の溶液は４°Ｃ以下の温度では安定である。所望の分離と純度 が得られるまでカラム分離法を繰返し続ける。 胎児フィブロネクチン抗原と抗体類を製造するために、Ｈ，Ｍａｔｓｕｕｒａａ ｎｄ　Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳ＾、８２巻、　６５１７−６５２１Ｌ　１９８５年に記載されている 手順を、その腫瘍フィブロネクチンの代わりに胎児フィブロネクチンを用いて実 施してもよい。最も好ましい抗（胎児フィブロネクチン）抗体は、ｔｈｅ　Ａ＋ ＊ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号Ａ ＴＣＣ）ＩＢ　９０１Ｂで寄託され、１９９０年１月１６日付けでＭａｔｓｕｕ ｒａらに付与された米国特許第４，８９４，３２６号に詳細に記載されているハ イプリドーマによって製造される。そのモノクローナル抗体はＦＤＣ−６と命名 されている。上記ハイプリドーマの培養と、免疫検定法に使用する抗体の製造に ついては実施例で詳細に述べる。 ポリクローナルとモノクローナルの両方の変種の抗（胎児制限抗原クラス）抗体 は一般によく知られており、市販されているか、または公げに入手できるハイプ リドーマの寄託品から入手できる０例えば抗（フィブロネクチン）モノクローナ ル抗体類は、ＡＴＣＣＨＢ　９１（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　ｌ１ｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ米国）由来のクロー ン試料から誘導することができる。他のこのような抗体類は、日本特許願第６０ ０９１２６４号（ＤＩＡＬＯＧ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｆｉｌｅ　３５１＋　ＷＰ Ｉ　Ａｃｃ、　Ｎｏ。 ８５−１６１６１７／２７　）および米国特許第４，３２５，８６７号に記載さ れている。 ポリクローナル抗フィブロネクチン抗体類をヤギとウサギ中に製造する好ましい 手順は実施例で述べる。 サンドインチ免疫検定法：試料中の胎児制限抗原を測定する本発明のサンドイン チ法の実施態様では、抗（胎児制限抗原）抗体を付着させた不溶性支持体を、水 性緩衝溶液で希釈した試験試料と充分な時間接触させて、試験試料中の胎児制限 抗原を、不溶性支持体上の抗（胎児制限抗原）抗体と結合させ、次いで支持体か ら試料が取出される。適切な免疫検定法の溶液は公知であり、ｐｔ＋が６〜８好 ましくは７．２〜７．６のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）のような緩衝溶液が挙げら れる。試料は、先に述べた試料希釈溶液で希釈する方が好ましい。 インキュベーション時間は実質的な結合を起させるのに充分な時間でなければな らず、その時間は温度依存性である。適切なインキュベーション時間は１６〜４ ０°Ｃの範囲内の温度下で３０〜２４０分間であり、好ましい接触時間は２０〜 ２６°Ｃの範囲の温度下で少なくとも６０分間である。 次に残留試料溶液を、リンス溶液を用いて支持体から取出す０通常のリンス溶液 を使用することができる。適切なリンス溶液は米国特許第４，５２８，２６７号 に記載されている。そのリンス溶液は、リン酸塩のモル濃度がｏ、ｏｏｏｔ〜０ ．０５で、ｐｎが６〜８で、０．００１〜０．１重量％の非イオン界面活性剤を 含有する水性リン酸緩衝溶液である。適切な非イオン界面活性剤としては、ポリ オキシエチレンエーテル類（ラウリル、セチル、オレイル、ステアリルおよびト リデシルのポリオキシエチレンエーテル類のようなりＲＩＪ）　ｉポリオキシエ チレンソルビタン類（ポリオキシエチレンソルビタールのモノラウレート、モノ パルミテート、モノステアレート、モノオレエートおよびトリオレエート）；お よび他のポリオキシエチレンエーテル類（例えばＴＲＩＴＯＮ）が挙げられる。 好ましい非イオン界面活性剤としては、４０のエチレンオキシド単位を有するオ クチルフエノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−４０５，Ｒｏｈ ｓ　ａｎｄ　１ａｓｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ）およびポリオキシエチレンソルヒ゛タ ールモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ　２０＋　ＳｉｇｌｌａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙから市販されている）がある、最も好ましいリンス溶液は、０．０ ２Ｍ　トリス、０．０８Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および ０．０２％アジ化ナトリウムを含有する溶液である。 次に不溶性支持体を、その支持体上の捕獲された胎児制限抗原と結合する抗体、 すなわちサントイツチング抗体と接触させる。このサントイツチング抗体は、抗 （胎児制限抗原）抗体でもよく、または抗（胎児制限抗原クラス）抗体でもよい 。このサンドイツチング抗体は標識付きまたは標識なしでもよい。Ｉｌｋなしの サントイツチング抗体を使用する場合は、サントイツチング抗体と結合し、かつ 物理的に検出可能な標識を有する三次抗体を通常の方式で用いてサントイツチン グ抗体を測定することができる。 ここで各種の標識について述べる。明確にするために、限定することなく、工程 の次のステップでは、酵素、好ましくはクロモゲン原性もしくは蛍光原性の酵素 でｔ！識をつけた抗（胎児制限抗原）抗体について述べる。“クロモゲン原性酵 素”という用語は、本願では、適切な基質によって発色団産物を生成する酵素を 意味すると定義する。“蛍光原性酵素°′という用語は、本願では、適切な基質 によって発蛍光団産物を生成する酵素を意味すると定義する。 上記のサントイツチング抗体は、水溶液で不溶性支持体に加える。 その溶液は、反応物を保護し、結合反応を容易にするのに適した塩類と緩衝剤類 を含有する方が好ましい０例えばその溶液は、ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）、 リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、および上記のリンス溶液中に用いたポリオキシエチ レンソルビタンエステルのような緩和な界面活性剤を含有していてもよい。酵素 複合抗体に対する好ましい希釈剤は、０．０５Ｍ　）リス緩衝液ｐ）１７．２． ２％Ｄ−ソルビトール。 ２％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム、　０．０１％Ｔｔｎｅｅｎ−２０，１ ｍＭ塩化マグネシウム、および０．１％塩化亜鉛からなる希釈剤である。 インキュベーションは、サンドイツチング抗体を、存在している場合に不溶性支 持体に付着している露出胎児制限抗原のエピトープと結合させるのに充分な時間 続ける。好ましいインキュベーションの時間と温度は、不溶化試薬の抗（胎児制 限抗原）抗体と試験試料の胎児制限抗原との結合について先に述べたのと同じで ある。 次にサントイツチング抗体溶液を不溶性支持体から除き、次いで支持体を先に記 載したようなリンス溶液ですすぎ残っている未結合物質を除く。 サントイツチング抗体に標識を付けていない場合、サントイツチング抗体と選択 的に結合する、酵素で標識を付けた抗体などの結合試薬を、水溶液にして、不溶 性支持体に加える。その溶液は、反応物を保護しかつ上記のような結合反応を容 易にする適切な塩類と緩衝剤類を含有している方が好ましい、インキュベーショ ンは、標識を付けた抗（サントイツチング抗体）抗体が、存在している場合不溶 性支持体に付着しているサントイツチング抗体の露出エピトープと結合できるよ うに充分な時間続ける。好ましいインキュベーションの時間と温度は、不溶化試 薬の抗（胎児制限抗原）抗体と試験試料の胎児制限抗原との結合について述べた のと同じである。 次に１［を付けた抗体溶液を不溶性支持体から除き、次いでその支持体を上記の ようなリンス溶液でリンスし、残留している未結合の標識付き物質を除く。 次のステップでは、不溶性支持体を、酵素の存在下で反応を受ける基質の水溶液 と接触させて、溶液中に蛍光化合物またはクロモゲン化合物を放出させる。適切 な基質と、その基質を変換させることができる酵素とは、例えば米国特許第４， １９０，４９６号と同第４．５２８，２６７号に記載されＣいる。支持体は１０ ４〜ｉｏ−”モル濃度の基質を含有する基質水溶液と接触させる。１０−４〜１ ０−５の基質のモル濃度が好ましい。基質溶液に添加する好ましい試薬と緩衝剤 としては例えば２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール緩衝剤と塩化マグネ シウムがある。 上記の基質溶液は、発蛍光団もしくは発色団を生成する反応が起るのに充分な時 間、不溶性支持体とともにインキュベートする。　１８〜４０°Ｃの温度下で、 ５〜２４０分間のインキュベーション時間を使用できる。２０〜２６°Ｃの範囲 内の温度と１０〜９０分間のインキュベーション時間が好ましい。 次に溶液中の発蛍光団もしくは発色団のレベルを測定する。基質溶液中の発蛍光 団もしくは発色団のレベルを測定するのに用いる装置と手順は、当該技術分野で 従来用いられているものと同じである。 溶液中の発蛍光団もしくは発色団のレベルは、不溶性支持体上の酵素濃度の関数 であるが、この酵素の濃度は順に試験試料中の胎児制限抗原の量の関数である。 試験試料中の胎児制限抗原の濃度は、上記溶液中の発蛍光団もしくは発色団のレ ベルを、既知の濃度の胎児制限抗原を含有する対照溶液で得られたそれぞれの発 蛍光団もしくは発光団のレベルと比較することによって測定することができる。 バックグランドとは統計学的に有意に異なる濃度の胎児制限抗原を含有する対照 を用いることが好ましい、胎児フィブロネクチンについては、対照は、既知濃度 の胎児フィブロネクチンを含有する羊水でもよい、その羊水は、所望により、使 用する前に精製してもよい。 その胎児フィブロネクチンの濃度は、約１〜約１，０００　ｎｇ／ｍｌＯ間を変 動してもよく、好ましくは約１０〜１００　ｎｇ／ｍｌで最も好ましいのは約５ ０ｎｇ／ｍｌである。対照の吸光度より大きいかまたは等しい吸光度を有する試 料は陽性とみなされる。好ましいサンドインチ検定法については実施例で詳細に 述べる。 サンドイツチ法は、胎児制限抗原クラス結合抗体を、捕獲抗体または好ましくは サントイツチング抗体として用いるために改変することができる。これらの実施 態様では、抗（フィブロネクチン）抗体のような抗（胎児制限抗原クラス）抗体 を不溶性支持体に付着させ、次に標識付きもしくはｔＩｍなしの抗（胎児制限抗 原）抗体をサントイツチング抗体として加える。好ましくは、抗（胎児制限抗原 ）抗体は不溶性支持体に付着させ、標識付きもしくは標識なしの抗（胎児制限抗 原クラス）抗体は捕獲抗原をサンドイッチするのに用いる。 メンプラン免疫検定法：試験試料中の胎児制限抗原を測定する本発明のメンプラ ン法の実施態様では、抗（胎児制限抗原）抗体を付着させた不溶性支持体を、試 料中の胎児制限抗原と不溶性支持体上の抗（胎児制限抗原）抗体とを結合させる のに充分な時間、ｐＨが６〜８好ましくは７．２〜７．６のリン酸緩衝溶液（Ｐ ＢＳ）のような水性緩衝溶液で希釈した試験試料と接触させる。結合させるのに 必要な時間は、流動系では非常に短かい。適切なインキュベーション時間は、１ ６〜４０°Ｃの範囲内の温度下で１秒〜２０分間で、好ましい接触時間は１分間 より短かく、１０秒〜２分間が最適である。 次に不溶性支持体を、不溶性支持体上の捕獲された胎児制限抗原と結合する抗体 、すなわちサントイツチング抗体と接触させる。このサンドイツチング抗体は標 識付きまたは標識なしでもよい、標識なしのサントイツチング抗体を使用する場 合は、このサントイツチング抗体と結合しかつ物理的に測定可能な標識を有する 三次抗体を、通常の方式で用いてサンドイツチング抗体を測定することができる 。 ここで各種の標識について述べる。明確にするため、限定することなしに、酵素 好ましくは蛍光原性もしくはクロモゲン原性の酵素で標識を付けた抗（胎児制限 抗原）抗体について、工程の次のステップを説明する。 サントイツチング抗体は、水溶液で、不溶性支持体に加える。その７８Ｗ１．は 、反応物を保護し結合反応を容易にする適切な塩類と緩衝剤類を含有している方 が好ましい。例えば該溶液は、ウシ血清アルブミン（８５＾）リン酸緩衝溶液（ ＰＢＳ）、および上記のリンス溶液中に用いたポリオキシエチレンソルビタンエ ステルのような緩和な界面活性剤を含有していてもよい。インキ１ヘーシヨンは 、サントイ・ノチング抗体が、存在している場合に不溶性支持体に付着している 胎児制限抗原の露出エピトープと結合するのに充分な時間続ける。好ましいイン キ、ヘーションの時間と温度は、不溶化試薬の抗（胎児制限抗原）抗体と、試験 試料の胎児制限抗原との結合について述べたのと同しである。 サントイツチング抗体の溶液は不溶性支持体から任意に除去してもよく、その支 持体は前記のようなリンス溶液ですすいで、残留している未結合の４１識付き物 質を除去する。 サントイツチング抗体が標識なしの場合は、サントイツチング抗体と選択的に結 合する、酵素で標識を付けた抗体などの結合試薬を、水ｌ客演で不溶性支持体に 加える。その溶液には反応物を保護し結合反応を容易にする適切な塩類と緩衝剤 類を含有している方が好ましい。例えば８Ｓ溶液は、ウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）、リン酸緩衝溶液（ＰＲＳ）、および前記のリンス溶液に用いたポリオキシ エチレンソルビタンエステルのような緩和な界面活性剤を含有していてもよい。 インキ１ヘーシヨンは、［８１６を付けた抗（サントイツチング抗体）抗体が、 存在している場合に不溶性支持体に付着しているサントイ７チ゛、／グ抗体のエ ピトープと結合できる充分な時間続ける。好ましいインキ１ヘーシヨンの時間と 温度は、不溶化試薬の抗（胎児制限抗原）抗体と、試験試料の胎児制限抗原との 結合について先に述べたのと同しである。 次にｍｓを付けた抗体の溶液を不溶性支持体から除去し、次いでその支持体を先 に述べたようなリンス溶液ですすぎ、残留している未結合の標識付き物質を除去 する。 本発明のメンプランサンドインチ法の次のステップでは、不溶性支持体を、酵素 の存在下で反応を受ける基質の水溶液と接触させて、溶液中に蛍光原性化合物も しくは色原性化合物を放出させる。適切な基質および基質を変換させることがで きる酵素ならびに追加の成分と緩衝剤は先に述べたとおりである。 基質の溶液は、発蛍光団もしくは発色団を生成する反応を起こすのに充分な時間 、不溶性支持体とともにインキュベートされる。１８〜４０°Ｃの温度下で、１ 〜２０分間のインキ二ヘーシゴン時間を使用できる。好ましくは温度は２０〜２ ６°Ｃの範囲内で、インキ１ヘーシヨン時間は２〜５分間である。メンプラン上 の蛍光原体と色原体のレベルは反射率計または濃度計を用いて測定することがで きる。 別のメンプラン法の実施態様では、抗（胎児制限抗原）抗体をメンプランと結合 させる。試料と、標識を付けた抗（胎児制限抗原クラス）抗体とを混合する。抗 体が結合するのに充分な時間が経過してから、試料／複合体の溶液を上記メンプ ランと接触させる。試料中の胎児制限抗原は抗（胎児制限抗原）抗体と結合して 、メンプラン上に抗（胎児制限抗原）抗体／胎児制限抗原／標識付き抗（胎児制 限抗原クラス）抗体のサンドイッチを生成する。好ましい実施態様では、標識は コロイド金である。 競争免疫検定法二標識をつけた試薬の胎児制限抗原を用いる本発明の競合法の実 施態様は、試験試料と、標識を付けた試薬の胎児制限抗原との混合物を、不溶性 支持体に付着させた抗（胎児制限抗原）抗体と接触させ、次いで不溶性支持体と 結合するかまたは溶液相中に残る標識の量を測定することからなる方法である。 ｔｌ識を付けた抗（胎児制限抗原）抗体を用いる本発明の競争法の実施ａ様には １種以」二の形態がある。不溶性支持体に結合させた抗（胎児制限抗原）抗体を 用いる１つの実施態様は、試験試料と、標識を付けた抗（胎児制限抗原）抗体と の混合物を、不溶性支持体に付着させた抗（胎児制限抗原）抗体と接触させ、次 いで不溶性支持体と結合するか、または溶液相中に残る標識の量を測定すること からなる方法である。不溶性支持体に結合させた試薬の胎児制限抗原を用いる他 の実施！！様は、試験試料と、標識を付けた抗（胎児制限抗原）抗体との混合物 を、不溶性支持体に付着させた胎児制限抗原と接触させ、次いで不溶性支持体と 結合するか、または溶液相中に残る標識の量を測定することからなる方法である 。 これらの各方法では、試験試料を緩衝溶液で希釈し、インキュベートし、次いで 標識を、サンドインチ免疫検定法の実施態様について先に述べたのと同様にして 測定する。制限試薬の濃度は、試薬間で競合結合を行うことができるように選択 され、不溶性支持体上または溶液中に残留する標識の量は、試験試料中の被検体 の量の関数の変数である。これらの方法は一般に公知であり、その方法を変更し て手順を最適化する方法は、免疫検定法の技術分野の当業者には充分に知られて いる。 また抗（胎児制限抗原）抗体と、試験試料中の胎児制限抗原との結合は、抗（胎 児制限抗原）抗体が試料中の胎児制限抗原によって付着している粒子の凝集、抗 体抗原反応による抗体の沈澱、または抗原と抗体が結合する際に起こる物理的ま たは電気的変化を半導体ブリッジプローブを用いて行う観察の結果、米国特許第 ４，６４７，５４４号に記載されているような光妨害パターンなどによって測定 することができる。 本発明の適用範囲内に含まれている、試験試料中の胎児制限抗原を測定するのに 用いる胎児制限抗原試験キットには、一般に、不溶性支持体に付着させた抗（胎 児制限抗原）抗体および抗（胎児制限抗原クラス）抗体が入っている。好ましい 実施態様では、抗（胎児制限抗原）抗体はモノクローナル抗体であり、および抗 （胎児制限抗原クラス）抗体はポリクローナル抗体である。さらに好ましくは、 抗（胎児制限抗原クラス）抗体は酵素で好ましくはアルカリホスファターゼで標 識を付けられている０本発明のキットには、さらに、酵素基質、陽性の対照、陰 性の対照、リンス緩衝剤、または試料の濾過用用具のような１つ以上の試料調製 用器具が入っていてもよい。 本発明のキットには、さらに、試験試料中の胎児制限抗原を測定するために下記 のものを組合せて入れてもよい。すなわち、試料の移動、貯蔵および希釈に用い る緩衝剤；バイアルびん、ホイル容器などの本発明の試薬の容器；別個のバイア ルびんなどの容器に入った酵素基質の試薬のような他の任意の試薬；抗体と抗原 の結合の存在と程度を測定するための機械的もしくは光学的機器；およびこれら を組合わせたものである。サンプリング用スワブのようなサンプリング用具およ び移動用と貯蔵用の緩衝剤も入れてもよく、または別個に包装されていてもよい 。キットの個々の部材はバイアルびん、ホイル容器などの容器のような便利な形 態のものに入れられていてもよい。例えばホイル容器中の不溶性支持体構造物は 、バイアルびんなどの容器に入った他の試薬と組合わすことができる。キットの 液体試薬の最も好ましい容器は、適切な量例えば５０μｍもしくは１００μｍの 液滴を正確に放出するポリエチレン製ドロ・ツバ−ボトル容器である。好ましい キットについては実施例で詳細に述べる。 胎児特異抗原による妊娠検査 妊娠診断の具体的内容は、胎児または骨盤に焦点を当てた独特な成分である胎児 特異抗原の検出により構成されており、試験試料は子宮頚管または子宮頚管口の 近くより採取する。本発明者らは、これらの成分が妊娠後２０週の間にこれらの 試料中に存在することを発見した。一方母体血液中には、胎児特異抗原の有意な 量は存在していないので、試験試料中の母体血液の存在は本発明の試験方法を妨 害しない。 試験は上述のように行われ、試験試料中に胎児特異抗原の存在を示す結果が得ら れた場合は妊娠を意味する。 子宮外妊娠の診断 子宮外妊娠を診断する本発明の方法は、子宮頚管または子宮頚管口の近くで採取 した試験試料中の胎児特異抗原の、存在の有無検出により構成されている。これ ら成分の検出可能な量は、正常妊娠の２０週の間に採取されるこれらの試験試料 中に正常に存在する。妊娠２０週の間の妊娠より採取したこれら試験試料中に胎 児特異抗原が存在しない場合は、子宮外妊娠のあることを意味する。胎児特異抗 原は母体血液中に有意な量存在しないので、試験試料中に母体血液が存在するこ とは、本試験法を妨害しない。 試験試料は子宮頚管と子宮頚管口の両者又は頸管口近くで採取され、その試料は 上述のように、試料中の胎児特異抗原の存在、またはその置を確定するため試験 される。一方、血清または尿中の妊娠表示ホルモンの存在性検定により妊娠を判 定することが望まれるかも知れない。これに関連して広範囲の方法が、試験対象 女性の血液または尿を用いて妊娠を診断する分野の熟達者に知られている。信用 できる方法はいずれも使用可能である。例えば、血漿、血清、ならびに尿中、ま たは単独に尿中のｈｃｃを測定する方法の特許としては、Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅ ｎｔｓに、３．１７Ｌ７８３．３，２３４，０９６．３，２３６，７３２゜３． ２９８，７８７．３，３０９，２７５．３，４８５，７５１．３，６５５，８３ ８．３，６８９，６３３゜３．８６２，３０２．３，８７３，６８２．３，７８ ３，６８３．３，８３３，３０４．３，９９１，１７５゜４．００３，９８８． ４，０１４，６５３．４，０１６，２５０．４，０３３，７２３．４，０７１， ３１４゜４．０９４，９６３．４，１２３，２２４．４，１２３，５０９．４， １３８，２１４．４，２０８，１８７゜４．２１０，７２３．４，２３４．５６ Ｌ　４，２５６，６２９．４，２６８，４３５．４，２７０，９２３゜４．３１ ０，４５５．４，３１３，８７１．４，３２０，１１１．４，３４８，２０７． ４，３７１，５１５゜４．４１９，４５３．４，４２１，８９６．４，４９３， ７９３．４，５０８，８２９．　そして４，６６５，０３４がある。その他の妊 娠検査法としては、次記のものがある。即ち、尿中（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ 　３，１４１，７４０）または人乳、血清、または血漿中（Ｈｕｎｇａｒｙ　Ｐ ａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　Ｔ３７０２Ｂ、　ＷＰＩ　Ｎｏ、　８６−０２３３４４１ ０４）のプロゲステロン代謝物の測定；血清または血漿中（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔ ｅｎｔｓ　３，８９２，８４１゜４、３７１．５１５．ならびに４，４９３．７ ９３）のヒトの胎盤のラクトゲンの測定；尿中のニストロジエンステロイド類の 測定（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ３．９５５，９２８）　；血清、血漿または尿 中（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔｓ　４，０１６．２５０゜４．０９４，９６３． ならびに、４，３２０，１１１）の黄体化ホルモン（！、Ｈ）、プロラクチン（ ＰＲＬ）、そしてまたはｈＣＧ樺物質の測定；妊娠時特有のβ。 −糖蛋白（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔｓ　４，０６５，４４５ならびに４．１９ １　、５３３）の測定：ＬＨの測定（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔｓ　４，１３８ ．２１４ならびに４，２０８，１８７）　：ウシの血清または尿中のウシの妊娠 抗原の測定（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ出願１８８．５５１．　ＷＰＩ　 Ｎｏ、　８６−０４２１０８１０６）　：新規な胎盤蛋白質の測定（Ｕ、　Ｓ。 Ｐａｔｅｎｔ　４，５９２，８６３）ならびに、早期妊娠因子Ｎｏ　８６０５４ ９８の測定（ＷＰＩ　Ｎｏ、　８６−２６４９４０／４０）などによる妊娠の診 断法があげられる。 さらに、その他の妊娠を診断する方法としては、尿に染料を添加する方法（Ｕ、 　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　２，５８７，２２１ならびに３，２２６，１９６でのジ ニトロフェニルヒドラジン添加法：　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　３，５９５，６ ２０．ブロモフレプール・パープルまたはクロロフェノール・レッド添加法）、 ヨード試験紙法（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　３，２４８，１７３）　、他の沈 澱剤添加法（Ｕ、　Ｓ。 Ｐａｔｅｎｔ　３．２７８，２７０）　、酸と食塩の混合物で女性の血液を処理 する方法（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　３，８８３，３０４）があげられる。妊 娠は、Ｕ、　Ｓ、出願Ｎｏ、　１２１，９０２　（ｆｉｌｅｄ　：　Ｎｏｖｅｍ ｂｅｒ　１７．１９８７）の特許の方法にしたがい、子宮頚管または子宮頚管口 の近くで採取した試験試料を用いる検査法も可能性がある。上述の方法はいずれ も使用可能であるが、ｈＣＧを測定するような方法が望ましい。 妊娠後２０週の間の試験試料で、胎児特異性抗原が陰性結果を示しているのに妊 娠しているとの結果がある際は、子宮での正常な妊娠でなく、子宮外妊娠が起き ていることを示している。 受胎に伴う生成成分の生体外（ｅｘ　ｖｉν０）試験受胎に伴い生成する成分を 生体外で試験する本発明の内容は、憶測される自然流産により生成、または子宮 内膜掻爬術または治療的流産処理を行っている際に、排出される試料についての 胎児特異性抗原の検出により構成される。胎児特異性抗原は母体の血液中には有 意な量は存在しないので、試験試料中に母体の血液が存在することで、本試験方 法は妨害されない。 受胎に伴い生成する成分の生体外での存在を検査する試験試料は、子宮から排出 される成分を代表すると考えられているものを入手することができる。この様な 試料は、治療的流産または子宮内膜掻爬術施術中に排出される生体組織である。 或いは、その試験試料は、自然流産または流産の徴候と考えられている膣排出物 であることこともある。試験試料は一般に液体と微粒子固形物の両者から構成さ れている。また該試料は、生体組織、膣または子宮頚管粘液、他の膣または子宮 頚管分泌物、細胞または細胞断片、羊水、胎児または母体の他の成分などを含有 している。 一方この試料は膣腔から、ダクロンや他の繊維状の先端を備えた綿棒、アスピレ ータ−１吸引装置、洗浄装置、その他の類似物などを用いて採取することが出来 る。またこの試料は、子宮内膜掻爬術、治療的流産施術中に排出される生体組織 を代表しており、懸念される自然流産の場合には、女性の保護用のあて物を用い て手に入れることもできる。試験試料は上述のように、感受性の高い蛋白系被験 物を保護する液体中に懸独していることが重要な点である。 胎児特異性抗原の検出は上述の方法により行うことができる。妊娠の診断にあた っては、血清または尿中の妊娠表示ホルモンの有無検査を追加して行うことが望 まれる。子宮外妊娠に関連して前述したような方法も含め、信輔できる方法は、 いずれも使用可能である。 子宮内膜掻爬術、治療的流産、懸念される自然流産（流産）の際得られる試験試 料は、胎児特異性抗原の有無の検査用に使用することができる。妊娠の存在があ り、治療的または自然流産を代表していることが期待される試験試料中の胎児特 異性抗原の結果が陰性になることが同時に起きた場合は、妊娠があった徴候で、 検査は継続する。妊娠の存在があり、治療的または自然流産を代表することが期 待されている試験試料中の胎児特異性抗原の結果が陽性になった場合は妊娠があ った徴候で、この場合は検査は打切る。妊娠インディケータ−ならびに、子宮内 膜掻爬術施術中に得た試験試料中の胎児特異性抗原の結果の両者が不存在の結果 となった場合は、妊娠には達していないという結果で、また妊娠も終っていなか ったということである。 早産の危険／膜破裂試験 早産の危険増大を示すための本特許の内容は、妊娠２０ｉ１１後の試験試料中の 胎児特異性抗原の検出を含めている０本発明者らは、これら成分の検出可能な量 は、妊娠２０週後の後膣円蓋、子宮頚管、子宮頚管口の付近から得たもの等の膣 試料には一般に存在しない。妊娠２０週後に採取した試料中に、これら成分の検 出可能量が存在することは、切迫早産の危険増大を示すと共に、または羊膜破裂 の徴候を示している。胎児特異性抗原は母体血液中には有意な量は存在しないの で、試験試料中の母体血液の存在は本試験法を妨害しない。 試験試料は、後膣円蓋、子宮頚管、子宮頚管口の付近から採取され、該試料は前 述の欅に試料中の胎児特異性抗原の存在、または量を検査するべく試験される。 妊娠２０週後の試験試料中に胎児特異性抗原の存在を示す結果が得られた場合は 、羊膜破裂の可能性と、または早産の危険増大の徴候である。 不溶性担体 本発明における抗原および抗体試薬は従来の通常プロセスで不溶性担体類に結合 させることができる０例えば、ＵＳ　ＰＡＴＥＮＴ、　３，２３４，０９６゜３ ．２３６，７３２．３，３０９，２７５．３，８７３，６８３．３，９５１，１ ７５．４，００３，９８８゜４．０１６，２５０．４，０３３，７２３．４，０ ７１，３１４．４，３４８，２０７．４，４１９，４５３に記載されたような不 溶性担体への抗原類の結合用および、ラテックス粒子および赤血球に対する抗原 の結合用に通した抗原結合法が利用できる。不溶性担体に対する抗体の結合法は 、例えば、ＵＳ　ＰＡＴＥＮＴ３．５５１，５５５．３，５５３，３１０．４， ０４８，２９８およびＲＥ−２９，４７４，さらにＴｉｊｓｓｏｎ著”ＰＩ？Ａ ＣＴ［ＣＥ　ＡＮＤ　ＴＨＥＯＲＹ　ＯＦ　ＥＮＺＹ？ＩＥ　ＩＭＭＵＮＯ−Ａ ＳＳＡＹＳ″。 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　（１９８５）　 ｐｐ　２９７−３２６に述べられている。吸着によるポリスチレンに対する抗体 の結合操作は、例えば、Ｉ」ｓ　ＰＡＴＥＮＴ　３．６４６，３４６および４， ０９２，４０８に述べられている０本発明の明確化および制限範囲を越えないこ とを目的として、抗体の不溶性担体類への結合に関する操作を以下に述べる。こ れらの操作は抗体試薬、例えば、抗＝（胎児特異抗原）抗体類のような、および 抗−（胎児特異抗原類）抗体、さらに、胎児特異抗原のような抗原試薬の不溶性 担体類への結合に適している。 抗体の不溶性担体表面への結合および抗原の結合反応に対する妨害のないことま たはその結合反応の存在およびその規模を決定するために利用できる副反応を優 先的に考慮して、種々の材料を不溶性担体として利用できる。天然および合成両 者の有機および無機性の重合体も不溶性担体として利用できる。適当とされる重 合体の例の中には以下の材料が包含される：ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ リブチレン、ポリ（４−メチルブチレン）、ブチルゴム、珪素弾性体重合物、ポ リエステル類、ポリアミド類、セルローズおよびその誘導体（酢酸繊維業、ニト ロセルロズおよびその類縁体等）、アクリル酸エステル類、メタアクリル酸エス テル類、ビニル樹脂（ポリビニル酢酸、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデンクロラ イド、ポリビニルフルオライド等）、ポリスチレン、スチレングラフト共重合体 類、レイヨン、ナイロン、ポリビニル醋酸、ポリフォルムアルデヒドなど。不溶 性担体として利用できるその他の材料としては上記重合体のラテックス類、シリ カゲル、シリコンウェハー、ガラス、紙、不溶性蛋白、金属類、半金属類、金属 酸化物、磁性材料、半導体材料、セルメソトおよび類縁体を挙げることができる 。さらに、蛋白類、ゼラチン類、リボ多ＩｔＩ類、珪酸塩類、アガロース、ポリ アクリルアミド類のようなゲル形成物質、または数層の水和相を形成するデキス トラン類、ポリアルキレングリコールＩ！（２−３の炭素原子を有するアルキレ ン基）または界面活性剤、例えばホスフオリピノドのような親水親油両性物質、 長鎖（１２−２４の炭素原子を有するアルキルアンモニウム塩類および類縁体も 含まれる。 本発明における好ましい不溶性担体はナイロンおよびニトロセルローズ系膜から 成る材料である。これに次ぐ不溶性担体はスチレン、スチレン−アクリルニトリ ル共重合体のようなスチレン共重合体またはポリエチレンまたはポリプロピレン のようなポリオレフィン類およびアクリル酸およびメタアクリル酸重合物とその 類縁体から製造される材料である０本発明における最も好ましい不溶性担体はナ イロン膜またはポリスチレンマイクロホールプレートである。抗体試薬または抗 原試薬は吸着、イオン反応、ファン・デル・ワールス吸着、静電気的または他の 非共有結合的に不溶性担体に結合でき、あるいは共有結合によっても不溶性担体 に結合可能である。 この処理において特に有利な担体は複数の凹部を有するマイクロホールプレート の構成体である。凹部の表面またはプラスティックカップはその中に抗原または 抗体を保持する構造となり得る。定量が蛍光測定を用いる必要があれば、マイク ロホールプレートまたは四部への添加によって、好都合にも、光に対して、ある 凹部に対して加えられた励起光が周辺の凹部の内部にまで到着または影響を及ぼ さない程度に不透明となる。 非共有結合を利用する操作がＵＳ　ＰＡＴＨＮＴ　４，５２８，２６７に記載さ れている。抗体と抗原が不溶性担体と共有結合を行う操作を１．Ｃｈｉｂａｔａ がＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ、　Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ　 ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７８）に、およびＡ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓｓａ がＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４５　：　３０５９　（１９７０）に述べ ている９表面を蛋白で被覆し、例えばカップリング試薬としてゲルタールアルデ ヒドを利用するＵＳ　ＰＡＴＨＮＴ　４，２１０，４１８に述べた操作を用いて 、抗体または抗原と連結させることができる。 これに替わる処理として、凹部をポリエーテルイソシアネートのような遊離イソ シアネート基を有する物質層で被覆し、そこへ水溶液中の抗体または抗原が与え られ、集中的に結合させることができる。さらに別の処理では、ＵＳ　ＰＡＴＥ ＮＴ　３，７２０，７６０に記載されているように、ブロムシアン法によって抗 体または抗原を水酸化された材料に連結させることもできる。 非特異的結合を防ぐために不溶性担体を「ブロック」することが好ましい、適当 な阻害剤の選択は不溶性担体のタイプによって定まる。例えば、ポリスチレン系 担体類に適する阻害剤は水溶性非免疫性の動物蛋白を包含する。水溶性非免疫性 の動物蛋白として仔牛血清アルブミン（Ｏ５＾）；ヒト、ウサギ、ヒツジ、およ びウマ血清アルブミン；カゼインおよび脱脂ミルク；卵白アルブミン；糖蛋白類 ；およびこれらの類縁体が含まれる。最も好ましい阻害／安定剤溶液は４％蔗糖 、１％マンニトール、０．５％カゼイン、０．０１％ＢＳＡである。 同様な阻害剤をナイロンおよびニトロセルローズ担体類に対しても使用できる。 しかし、ニトロセルローズおよびナイロン膜状担体類に対して好ましい阻害剤は 脱脂ミルクまたはカゼインである。これらの膜状担体に最適な阻害剤は１ないし ５重量％の脱脂乾燥粉乳またはカゼインおよびポリオキシエチレンソルビタン誘 導体およびポリオキシエチレンエーテル類のような非イオン界面活性剤である。 標識化試薬 本発明における胎児特異抗原標識化試薬、抗−（胎児特異抗原）抗体、抗−（胎 児特異抗原類）抗体および抗−（サンドライ・シチ抗体）試薬抗体類は、蛋白に 対する従来の接触標識化操作により、好ましくは抗体結合位置に適宜な保護基導 入を加えて、調製できる。 化学的または物理的な結合により蛋白試薬は標識に結合または連結することがで きる０本発明の抗原または抗体類が共軛結合できるリガンドおよび原子団または 配位子には、その試薬が試験試料中で化合物および材料から識別用に利用できる 元素、化合物または生体材料が含まれる。 本発明の明確化および制限範囲を越えないことを目的として、以下に標識化操作 を述べる。またここに述べる操作は、この妊娠抗原類または胎児特異抗原類のよ うなあらゆる蛋白性化合物または蛋白性物質に対しても一般に適用できるもので ある。 同位元素　純同位元素の比放射能　半減期ＩＣ６，２５Ｘ　ｔｏＩ５７２０　年 ’　Ｈ２，９１ｘ　１０’　１２．５年”Ｓ　１．５０Ｘ１０’　８７日 ”’　＋　２．１８Ｘ１０’　６０日 ”Ｐ　３．１６Ｘ１０’　１４．３日 ”’　＋　１．６２ｘｌＯ’　８．１日本発明の放射性標識化抗体類はｉｎ　ｖ ｉｔｒｏの診断試験にも利用できる。標識される抗体の比放射能は半減期、放射 性標識の同位元素的純度、および標識部位がその抗原または抗体に取り込まれる 程度に基づいて決められる。表Ａに数種の汎用同位元素とその比放射能および半 減期を例示した。−船に、インミュノアノセイにおいては比放射能が高い程感度 も改善される。 表へに収載した放射性同位元素による抗体類の標識化は一般に熟知されている操 作である。例えば、トリチウム標識法はＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ４．３０２，４３６ に記載されている。抗体に対し特に採用される沃素化、トリチウム標識化および ３５３１Ｍ５％化ニツイテＧｏｌｄｉｎｇがＪ、　ｌ’１ＯＮＯｃＬＯＮＡＬＡ ＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　：　ＰＲＴＮＣＩＰＬＥ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：＾ｃａｄｅｓ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８３）　ｐｐ　１ ２４−１２６に述べ、また参考文献もその中に引用されている。抗体類の沃素化 のその他の操作はＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄが、Ｎａｔｕｒｅよ４ ４　：　９４５（１９６２）に、Ｄａｖｉｄ　らが旧ｏｃｈｅｍ　１３１０１４ −１０２１（１９７４）にのべている、またＵＳ　ＰＡＴＥＮＴ　３．８６７． ５１７および４，３７６．１１０にも記載されている。適当なシステム、連結操 作の例およびそれに付随する基質の反応は、例えば、ＵＳ　ＰＡＴＥＮＴ　ＲＥ −３１，００６，３，６５４，０９０゜４．２１４，０４８．４，２８９，７４ ７．４，３０２，４３８．４，３１２，９４３．４，３７６．１１０に開示され 、その中に参考文献も引用されている。その他の適当なシステ適切なｔｌ識化に 利用できる酵素類および各類別の特異的な例を以下に示す： ヌクレアーゼ　ポリヌクレオチダーゼ アミダーゼ　アルギナーゼ プリン　デアミナーゼ　アデナーゼ ベプチダーゼ　アミノポリペブチダーゼ鉄酵素　カタラーゼ 銅酵素　チロシナーゼ 補酵素含有酵素　アルコール　デヒドロゲナーゼシトクローム還元酵素　コハク 酸 デヒドロゲナーゼ 黄色酵素　ジアホラーゼ オキシダーゼ　グルコース　オキシダーゼホスファターゼ　アルカリ　ホスファ ターゼ酸性ホスファターゼ デヒドロゲナーゼ　Ｇ６ＰＤＩ（（グルコース６−ホスホデヒドロゲナーゼ） 適切な酵素は、Ｉ（ａｗｋ　ａｔ　ａｌ、　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＰＨＹＳＩＯ ＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　ＭｑＧｒａ＋１−Ｈｉｌｌ　ｐｐ、　３０６−３９７　 （１９５４）に記載されている。 螢光原性及び色原体性酵素（選択された基質が螢光又は色原体生成物を生成する であろうものの存在下での酵素）は、有用なラベリング成分である。抗原と結合 する抗体の能力を弱めないで抗体に酵素を選択的に接合し、そしてタンパク質性 試薬に酵素を接合するための方法は当業界において良く知られている。 適切な酵素及び抗体にそれらを結合するための方法は、１．　Ｃｈｉｂａｔａ。 Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙ＋ｍｅｓ、　Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ　 ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７８）　；　Ａ。 Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｗ、２４５　：　３０５９　（１ ９７０）　；　Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍ、など、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ ｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｌｍ５ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒ ｅｌａｔｅｄＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｌ　Ｋｎａｐｐなど 、ｋＷ集者、＾ｍｓｔｅｒｄａｗ　：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　ｐｐ、　２１５〜２４ ４　（１９７８）　Ｈ５ｕｌｌｉｖａｎ、　Ｍ、など、＾ｎｎ、　Ｃｌ１ｎ。 Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　１６　：　２２１〜２４０　（１９７９）　：　Ｎｙｇｒ ｅｎ、　）１．など＋　Ｍｅｄ、　Ｂｉｏｌ。 ５７　：　１Ｂ７〜１９１　（１９７９）　；　Ｇａｄｋａｒｉ、　Ｄ、など、 　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　１０　：２１５〜２２４　（１９８５）　 ；　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　Ｐ、など、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　１３６　 ；　４５１〜４５７　（１９８４）　；　Ｔｓｕｒｕｔａ、　Ｊ、など、　Ｊ、 　ｔｌｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅ＊、　３３　ニア６７〜７７７　（ １９８５）　；　Ｉｓｈｉｋａｗａ、　Ｅ、、Ｊ、　Ｉ＊＋ｗｕｎｏａｓｓ＋’ ｙ４　：　２０９〜３２７（１９８３）　；及びアメリカ特許第４．１９０．４ ９６号により記載される。 好ましい酵素及びそれに対応する適切な基質は、ホースラディシュペルオキシダ ーゼ及びこのための適切な基質である０−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレン ジアミン、０−ジアニシジン、及び４−クロロ−α−ナフトールである。それら はまた、β−ガラクトシダーゼ及びそれに対応する適切な基質である４−メチル ランへりフェリルーβ−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ クトース、ｐ−二トロフェノール、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース 及び０−二トロフェノールを包含する。それらは、アルカリホスファターゼ及び それに対応する適切な基質であるｐ−二トロフェニルホスフェート、インドキシ ルホスフェート及び５−プロ千−３−クロロインドキシルホスフェートを包含す る。ｉつとも好ましい酵素基質の組合せは、アルカリホスファターゼ及びフェノ ールフタ１／インモノホスフエートである。 抗体を酵素ラベリングするための適切な方法の例は、カルボジイミド、ジアルテ ヒド及び二官能価カップリング試薬の使用を包含する。アミド基を通しての酵素 の結合は、無水溶媒、たとえばジメチルホルｌ、アミド、ジオキサン、ジメチル スルホキシド、テトラヒドロフラン又は同様のものにおいて、塩化チオニル、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド又は類似する試薬によりタンパク質を処理すること によって達成され得る。他のカップリング剤は、カルボジイミド、たとえば１− エチル−３−（３−（Ｎ、Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピル）−カルボジイミド 、ｌ−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル− ｐ−トルエンスルホネート、スクシンイミジル−４〜（Ｎ−メレイミドエチル） −シクロヘキサン−１−カルボキンレート及びスクシンイミジル−３−（２−ピ リジルジチオ）−プロピオネートを包含する。 酵素の炭水化物成分はまた、アルデヒドに酸化され、そして免疫グ【】プリンの リシルアミノ基と反応され、シッフ塩基が形成される。 硼水素化ナトリウムによる還元は、酵素及び抗体の適切な結合をもたら撲゛。ホ ースラディシュベルオキシダーゼ及び抗体は、Ｗｉｌｓｏｎ。 −９など、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　［ｍ＋ ｌ１ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎ ｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｉｌ、　Ｋｎａｐｐなど１編集者、　Ａｍｓｔｅ ｒｄａｍ　：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　ｐｐ　２１５〜２４４の方決により、免疫グロ ブリンに効果的に結合され得る。 螢光団及び発色閏によりラヘルされた抗体は、当業界において知られている標準 の螢光成分から調製され得る。抗体及び他のタンパク質は、約３１０　ｎｍまで の波長を有する光を９収するので、螢光成分は、約３１０　ｎｍ及び好ましくは 約４００ｎ−の波長で実質的な吸光性を有するように選択されるべきである。 種々の適切な螢光体及び発色体は、５ｔｒｙｅｒ＋　５ｃｉｅｎｃｅ　１６２　 ：　５２６（１９６Ｂ）及びＢｒａｎｄ、　Ｌ、など、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４１　：　８４３〜８６８（１９７２）により記載される。 抗体は、従来の方法、たとえばアメリカ特許第３，９４０，４７５号、第４．２ ８９，７４７号及び第４，３７６、１１０号に開示される方法により螢光発光団 グループによりラヘルされ得る。 上記の所望する多くの性質を有する螢光体の１つのグループは、キサンチン色素 であり、これは３．６−シヒドロキシー９−フェニルキサンチドロール及びレサ ミンに由来するフルオレセイン及び３゜６−ジアミツー９−フェニルキサンチド ロール及びリスサニムロダミンＢに由来するロダミンを包含する。９−０−カル ポキシフェニルキサンチドロールのロダミン及びフルオレセイン誘導体は、９− ０−カルボキシフェニル基を有する０反応性カンブリング基、たとえばアミノ及 びイソチオシアネート基を有するフルオレセイン化合物、たとえばフルオレセイ ンイソチオミアネート及びフルオレサミンは容易に入手できる。 螢光化合物のもう１つのグループは、α又はβ位置にアミノ基を有するナフチル アミンである。ナフチルアミノ化合物の中には、１−シメチルアミノナフチル− ５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−Ｐ−ト ルインニル−６−ナフタレンスルホネートが包含される。他の色素は、３−フェ ニル−７−イソシアネートクマリン；アクリジン、たとえば９−イソチオシアネ ートアクリジン及びアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル） フェニル〕マレイミド；ヘンゾキサジオゾール、たとえば４−クロロ−７−ニド ロヘンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾール及び７−（ｐ−メトキンヘンシルア ミノ）−４−ニトロヘンジ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；スチルベン、た とえば４−ジメチルアミノ−４′−イソチオシアネート−スチルベン及び４−ジ メチルアミノ−４′〜フ１／イミドスヂルヘン；Ｎ、Ｎ’　−ジオクタデシルオ キサカルポキンアミンーｐ−トルエンスルホネート；ピレン、たとえば８−ヒド ロキシ−１，３，６−ピレントリスルホンＭ、１−ピレン酪酸、メロシアニン５ ４０、ローズヘンガル、２．４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン、０−フタ ルデヒド、及ヒ（Ｔｏの容易に入手できる螢光成分を包含する。それらの色素は 、活性官能価を有し、又はそのような官能価は容易に導入され得る。 抗体は、Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅＳ ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　： 　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８３）　ｐｐ　２０８〜２４９により 記載される方法によりフルオロクロム又は発光団によりラヘルされ得る。フルオ ロクロムの濃度は、Ｇｏｄｉｎｇ、前記、　Ｐ２２９の表に従って選択される。 たとえば、ＤＭＳＯにおけるフルオレセインイソシアネ−４（＋、０濱ｇ／ｍｌ ）又はローダミンイソシアネート（１０，０ｍｇ／ｍｌ）が調製され、そして所 望する体積（合計のタンパク質溶液体積の１〜１０％）が、撹拌されながら、タ ンパク質溶液に滴下されるや反応は２時間進行し、光から遮断される。生成物は 、０．１％のＮａＮ０．を含む叩ＢＳ中、５ＥＰＨＡＤＥＸ　［；−２５ゲル上 でのゲル濾過により精製され、未反応又は加水分解されたフルオロクロムが分離 される。接合体の吸光度は２８０ｎ−及び可視領域におけるそのピーク（フルオ レセイン化された抗体のために４９５ｎ噂及びローダミン化された抗体のために ５５０　ｎｍ）で測定される。フルオロクロム；タンパク質の比は、Ｇｏｄｉｎ ｇ＋Ｍｏｎｏｃｌｏｒ＋ａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ 　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：接合体は、使用まで保護 するために４°Ｃで貯蔵される。抗体溶液濃度がｌａｇ／ｓ＋１以下である場合 、８ＳＡが、ｌ＋ｗｇ／ｓ＋Ｉの最終濃度まで溶液に添加される。 本発明のアッセイに使用される抗体及び試薬抗原は、アビジン又はビオチンに共 有結合され得る。適切な結合方法は、二官能価架橋剤を通しての架橋を包含する 。適切な二官能価化合物は、Ｐｅｔｅｒｓ。 Ｋ、など、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４６　：　５２３　（１ ９７７）により記載される。 アルキルイミデートは、タンパク質によりそれらに示される官能基の間で高い程 度の特異性を示す。その反応は一次アミノ基に対して特異的である。適切なカッ プリング試薬の例は、アミドエステル、たとえばジメチルマロンイミデート、ア ジド、たとえばアミド結合を生成するためにイムノ基と容易に反応するタルドリ ルジアジドのアシルアジドを包含する。アリールシバリド（たとえば１，５−ジ フルオロ−２，４−ジニトロヘンゼン、又は４，４′−ジフルオロ−３，３’− ジニトロフェニルスルホン、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメ チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、シマレイミド、混合された無水物 、ｍ−マレアミドベンゾイル　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び他 の既知の架橋剤が使用され得る。 前述の試薬は、実質的に不可逆的な結合を提供する。官能基を有する二官能剤１ 、たとえばジスルフィド又はグリコールが使用され得る。それらは、所望により 、架橋反応の後、分離され得る結合を提供する。そのような試薬は、ジメチル３ ．３′−ジチオビスプロピオンイミデート、スクシンイミジルプロピオンイミデ ート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−シニトロフエニル）〜シスタミン、タルド リルジアジド、タルトリルジ（グリシルアジド）及びタルドリル、；（ニブシロ ン−アミノカプロイルアジド）を包含する。 他の場合、結合は、試薬自体の間で直接的に形成され得る。たとえば、抗体は、 それぞれの材料上での官能基を通してビオチンに結合され得る。特定の例として 、ビオチンは過ヨウ素酸塩により処理され、そしてアビジン結合へのビオチンを 阻害しないで又は抗体の免疫学的活性をブロックしないで、シンフ塩基形成を付 与するために抗体と反応せしめられ得る。アビジン−接合された及びビオチニル 化された試薬は、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇ ａｍｅ＋　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手できる。 二官能価架橋剤を用いての既知の技法は、次のものを包含する：（ａ）１段階グ ルタルアルデヒド結合、＾ｖｒａｍｅａｓ、　Ｓ、Ｉｍｗｕｎｏｃｈｅ−。 ６　：４３　（１９６９）　；　（ｂ）　２段階グルタルアルデヒド結合、Ａｖ ｒａｍｅａｓ。 Ｓ、、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ−、８：　１１７５　（１９７１）　ｉ及び（ｃ）シ マレイミド結合、Ｋａｔｏ、　Ｋ、など、　Ｅｕｒｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｔｖ 、　６２　：　２８５　（１９６６）。 抗体は、Ｈｎａｔｏｗｉｅｈ＋　Ｄ、など、Ｊ、＾ｐｐ１．　Ｒａｄ、　３５　 ：　５５４〜５５７（１９８４）及びＢｕｃｋｌｅｙ、　Ｒ，など、　Ｆｅｄ、 　Ｅｕｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１６６　：　２０２〜２０４（Ｊａ ｎ、　１９８４）の方法に従って、金属放射性核種によりラヘルされ得る。この 方法においては、抗体はキレート剤、たとえば金属放射性核種とキレートを形成 できるジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）により接合される。　ＤＴ ＰＡの二環式無水物の０．１　＋ｍｇ／ｍｌの懸濁液は、無水溶媒、たとえばク ロロホルム、エーテル又は無水ＤＭｓｏにおいて調製される。アリコートが、１ ：１のモル比のＤＴＰＡ　：免疫グロブリンを提供するのに十分な、きれいで乾 燥した管に移され、そして窒素下で薄光される。塩溶液における０、０５Ｍの炭 酸水素塩緩衝液（ｐ）１７．０〜７．５）中、使用される抗体溶液（１０〜２０ ｍｇ／削ｌ）の１０〜２０１部分が、無水ＤＴＰＡに添加され、そしてその内容 物が０．５〜１．０分間、撹拌される。結合されたタンパク質調製物が同じ緩衝 溶液により０．２１に希釈され、そして塩溶液溶離液を用いて、５ＥＰＨＡＤＥ Ｘ　Ｇ−５０ゲルによる５ｃ■ゲル濾過カラム上で精製される。結合効率が、０ ．５Ｍの酢酸緩衝溶液（ｐＨ６，０）中、“キレート化−品種”のｌ　Ｉ　Ｉ　 １ｎの添加により、精製の前に決定される。薄層クロマトグラフィーが、結合効 率の計真のためにＤＴＰ＾結合抗体を分離するために使用される。 ＤＴＰＡ結合抗体は、金属放射性核種、たとえば”’Ｉｎ＋３．　””Ｂｉ＋３ 及び”Ｇａ＋３と結合するために必要なまで、４°Ｃで貯蔵され得る。 本発明は、次の特定の実施例によりさらに例示されるが、但しそれは非制限的な 例である。特にことわらない限り、温度は°Ｃであり、そして％は重量％である 。 実施例１ ポリクローナル抗−（胎児フィブロネクチン）抗体胎児フィブロネクチンを、Ｅ ｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ ２０：１〜５　（１９７７）により記載されているようにして羊水から精製する 。 抗−（胎児フィブロネクチン）抗体を、文献、たとえば５ｔｏｌｌａｒ。 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　７０　：　７０　（１９８０）に記載される免疫化 技法及びスケジュールを用いてウサギに誘発し、胎児フィブロネクチン抗原によ りウサギを免疫化する。抗血清、たとえば、［、ａｎｇｅなど、　Ｃｌ１ｎ、　 ＥＸｐ。 Ｉｗ＋＋ａｕｎｏ１．２５　：　１９１　（１９７６）及びＰｉｓｅｔｓｋｙな ど、　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎ、　Ｍｅｔｈ、　４１　：１８７（１９８１）により 記載されるような、モノクローナル抗体のために使用されるアッセイに類似する 固相アッセイにおいてスクリーンする。 抗血清のＩｇＧ画分を、胎児フィブロネクチンが結合されているＣＮＢｒ−９ｅ ｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒ＋５ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製する。結合の ために使用される方法は、ゲル製造業者、Ａｆｆｉｎｉｔｇ　Ｃｈｒｏ＋＊ａｔ ｏｇｒａｐｈｙ。 Ｐｈａｒ−ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｗｉｃａｌｓ＋　ρｐ１５〜１８により 推薦される方法でありラムを２〜３体積ノ緩衝液（０，ＯＩＭ（７）ＰＢＳＩｐ ）１７．２　）　ニよ＃）　平ｉ化し、そして抗−（胎児フィブロネクチン）抗 体含有溶液を次にカラムに通用する。溶出液の吸光度を、タンパク質がカラムか らもはや通過しなくなるまで、２８０　ｎ＊でモニターする。次に、カラムを０ 、１　Ｍツク’Ｊ　’ｙ　７ｔｌ衝液（ｐＨ２，５）により洗浄し、イムノアフ ィニティー結合された抗−（胎児フィブロネクチン）抗体を脱着する。 ピーク両分を集め、プールし、そして複数回の緩衝液の交換を伴って、０．０１ Ｍ　（７）ＰＢＳ（ｐＨ７，２）　ニ対して４°Ｃで２４〜３６時間、透析する 。 より高い純度が所望される場合、アフィニティー精製されたＩｇＧを、Ｌ配力法 により成人の血漿フィブロネクチン結合アフィニティーカラムに通し、成人の血 漿フィブロネクチンと交差するいづれがの抗体を除去する。 実施例２ モノクローナル抗−（胎児フィブロネクチン）抗体実施例１の方法により得られ た精製胎児フィブロネクチンを用いて、胎児フィブロネクチンに対するマウスモ ノクローナル抗体を、Ｇａ１ｆｒｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｍｅｔｈ、 　Ｅｎｚｙｍ、　７３　：　ｌ　（１９８１）及びＭａｔｓｕｕｒａ＋Ｈ，ａｎ ｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ＋　Ｓ、など、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８２　：　６５１７〜６５２１　（１９８５）の標準方法を用 い、そしてマウスの免疫化のための抗原として胎児フィブロネクチンを用いて得 る。モノクローナル抗体を、文献、たとえばＬａｎｇｅなど、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅ ｘｐ、　Ｉ−ｍｕｎｏｌ、　２５　；　１９１（１９７６）及びＰｉｓｅｔｓｋ ｙなと、　Ｊ、　ｌｍ５ｕｎ、　Ｍｅｔｈ、　４１　；　１Ｂ？　（１９８１） に記載される技法の変法を用いてスクリーンする。 マウスモノクローナル抗体を、Ｔｉｊｓｓｏｎ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　 Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆＥｎｚｙＩｌｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ＋　Ｅｌｓｅｖｉ ｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＰＰ　１０５　−１０７（１９ ８５）の方法に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ結合５ｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ　（ ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、腹水又はハイブ リドーマ培養上清液から精製する。 実施例３ ポリクローナル抗−（胎児フィブロネクチン）抗体−被覆のマイクロタイタープ レート 実施例１に記載されるように成人フィブロネクチン交差反応性を除去するために 調製され、そしてさらに精製されたウサギ抗−（胎児フィブロネクチン）を、０ ．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）により１０Ｍｇ／ｍｌに希釈する。その１ ００μｍを、Ｉｍｗｕｌｏｎ　Ｉｆマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ）の個々のウェル中に分散する。プレートを被覆し、そして室温で４時間又は ４　”Ｃで一晩インキュベートする。 プレートを洗浄緩衝液（０，０２ＭのトリスＨＣＩ、　０．０１５ＭのＮａＣ１ ，０，０５のＴｗｅｅｎ〜２０）により、ウェルを満たし、そして空にすること によって４度洗浄する。次に、プレートを、ブロッキング溶液（０，ＯＩＭのＰ ＢＳ、　１％のＢＳ＾、０．０２％のＮａＮ５．ｐＨ７，４）　２００　ｔｔ　 Ｉを個々のウェルに分散し、そして室温で１時間インキヱヘートすることによっ てブロックする０次に、ウェルを、上記のようにして洗浄緩衝液により４度洗浄 する。プレートは、その時点で、サンプルのイムノアッセイに使用できる。 実施例４ ポリクローナル抗−ヒトフィブロネクチン抗体ヒト血漿フィブロネクチンを、Ｅ ｎｇｒａｌｌ　ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｉｎｔ、　Ｊ。 Ｃａｎｃｅｒ　２０　：　１〜５　（１９７７）により記載されるようにしてヒ ト血漿から精製した。 抗−ヒト血漿フィブロネクチン抗体を、文献、たとえば５ｔｏｌｌａｒ。 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　７０　：　７０　（１９８０）に記載される免疫化 技法及びスケジュールを用いてヤギに誘発し、ヒト血漿フィブロネクチン抗原に よウサギを免疫化した。抗血清を、たとえばＬａｎｇｅなど、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅ ｘｐ。 Ｉｓ＋５ｕｎｏｉ、　２５　：　１９１　（１９７６）及びＰｉｓｅｔｓｋｙな ど、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ、　４１　：１８７（１９８１）により記 載されるような、モノクローナル抗体のために使用されるアッセイに類似する固 相アッセイにおいてスクリーンする。 抗血清のＩｇＧ画分を、ヒト胎児フィブロネクチンが結合されているＣＮＢｒ− ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ＋＊１ ｃａｌｓ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製する。 結合のために使用される方法は、ゲル製造業者、＾ｆｆｉｎｉｔｇ　Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ。 Ｐｈａｒ−ａｃｊａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋　ｐｐ　１５〜１Ｂによ り推薦される方法である。 すぐに、カラムを２〜３体積の緩衝液（０，ＯＩＭのＰＢＳ、ｐＨ７，２）によ り平衡化し、そして抗−ヒト胎児フィブロネクチン抗体含有溶液を次にカラムに 適用する。溶出液の吸光度を、タンパク質がカラムからもはや通過しなくなるま で、２８０ｎ−でモニターする０次に、カラムを、２８０ｎ−での基線唆光度が 得られるまで、平衡化緩衝液により洗浄する。 イムノアフィニティー結合された抗−ヒト血漿フィブロネクチン抗体を、０．１ 　Ｍのグリシン緩衝液（ｐ）１２．５）により溶離した。ピークタンパク質画分 を集め、プールし、そして複数回の緩衝液の交換を伴って、０．ＯＩＭのＰＢＳ （ｐＨ７，２）に対して４°Ｃで２４〜３６時間、透析した。 上記方法をくり返し、ヒト血漿フィブロネクチンによりウサギを免疫化し、そし て得られたポリクローナル抗−ヒトフイプロネクチン抗体を精製した。 実施例５ ポリクローナル抗−フィプロネクチン抗体−被覆マイクロタイタープレート 実施例４に記載されるようにして調製されたヤギ抗−ヒト血清フィブロネクチン を、０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）により１０Ｍｇ／ｌに希釈する。　 １００　ｕ　ｌを、たとえばＣｏ５ｔａｒ＋　Ｎｕｎｃ、又はＤｙｒｉａｔｅｃ ｈにより供給されるポリスチレンマイクロタイタープレートの個々のウェル中に 分散する。プレートをカバーし、そして室温で２〜４時間又は４℃で一晩インキ ュベートする。プレートを、洗浄緩衝液（０，０２ＭのトリスＨＣＩ、　０．０ １５ＭのＮａＣｌ、　０．０５％のＴｈｅｅｎ−２０）により、個々の使用のた めに満たし、そして完全に空にすることによって３〜４度洗浄する０次に、プレ ートを、２００μｌのブロック／安定溶液（４％スクロース、１％マンニトール 、　０．０１ＭのＰＢＳ、　１％のＢＳＡ。 ０．０２％のＮａＮ５．　ｐＨ７，４）を個々のウェル中に分散することによっ てブロックし、そして室温で３０分〜２時間インキュベートする０次に、ウェル を排気乾燥し、プレートを乾燥パウチにより気密容器においてパッケージし、そ して必要とされるまで４°Ｃで貯蔵する。 実施例６ ハイブリドーマ８８９０１Ｂからのモノクローナル抗体＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｏ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして受託番号＾Ｔ ＣＣＨＢ９０１８であるハイブリドーマの調製法は、引用により本明細書に組込 まれる、１９９０年１月１６日に公開されたアメリカ特許第４．８９４，３２６ 号（Ｍａｔｓｕｕｒａなど）に詳細に記載されている。 前記ハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭ１１６４０ 組織培養培地において培養した。さらに、そのハイブリドーマを、Ｍｉｓｈｅｌ ｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉ　（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ １Ｉｕｌａｒ　Ｔｅ＋ｍｕｎｏｌｏ　。 Ｈ，Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ｐ３６ ８．１９８０）の方法に従って、ハイブリッド細胞の注入によりマウスにおいて 培養した。 ＦＤＣ−６と命名され、そして前記ハイブリドーマにより生成されたモノクロー ナル抗体を、次の方法によるイムノアッセイへの使用のために調製した。培養上 清液又は腹水のＩｇＧ画分を、硫酸アンモニウム分別により沈殿せしめた。抗体 を、製造業者の指針に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ　Ｆａｓｔ　Ｐｌｏｗ　（Ｐ ｈａｒ＋５ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）上でのアフィニティーク ロマトグラフィーによる精製のために適切な緩衝液中に再溶解し、そして透析し た。 実施例７ モノクローナル抗体−被覆のマイクロタイタープレートマイクロタイタープし・ −トを、下記方法に従って、ＦＤＣ−６モノクローナル抗体により被覆した。 実施例６に記載されるようにして調製されたモノクローナル抗体ＦＤＣ−６を、 リン酸緩衝液（ｐ）１７．２）に希釈し、１０Ｍｇ／ｍｌにし、そしてウェル当 たり１００μｍをポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に 分散した。プレートを室温で２時間又は４°Ｃで一晩インキユベートした。ウェ ルの含有物をアスピレートし、そして−′７乙ルを実施例５に記載されるように 洗浄緩衝液（０，０２ＭのトリスＨＣ１，０，Ｏ１らＭのＮａＣ１，０，０５％ のＴｗｅｅｎ−２０）により３〜４度洗浄した。 次に、２００　μｇ／ウェルのブロッキング／安定溶液（４％のスクロース、１ ％のマンニトール、０．５％のカゼイン、　０．０１ＭのＰＢＳ）をウェルに添 加し、そして室温で３０分〜４時間インキュベートした。次に、ウェルをアスピ レート乾燥し、そしてプレートを乾燥パウチにより気密容器にパンケージし、そ して必要とされるまで、４°Ｃで貯蔵した。 −Ｆ記方法を、Ｎｕｎｃ　ａｎｄ　Ｄｙｎａｔｅｃｈからのマイクロタイタープ レートを用いてくり返し、そして同等の結果を付与した。 実施例８ 酵素ラベルされた抗−（フィブロネクチン）抗体実施例４に従って調製された抗 −ヒト血漿フィブロネクチン抗体を、Ａｖｒａｓ＋ｅａｓ、　Ｉｓｎ＋ｕｎｏｃ ｈｅ＋ｍ、　６　：　４３　（１９６９）の１段階グルタルアルデヒド方法に従 ってアルカリホスファターゼにより接合した。 実施例９ 胎児フィブロネクチンアッセイキット及び方法好ましい態様において、胎児制限 抗原、すなわち胎児フィブロネクチンのためのアッセイキットは、次の試薬を含 んだ：１、ネズミモノクローナル抗−胎児フィブロネクチン抗体により被覆され たマイクロタイタープレート、 ２、アルカリホスファターゼ接合のアフィニティー精製されたポリクローナルヤ ギ抗−フィブロネクチン抗体、３、酵素基質、 ４、負の対照、 ５、正の対照、 ６、すすぎ用緩衝液濃縮物（５０Ｘ）。 ネズミモノクローナル抗−胎児フィブロネクチン抗体により被覆されたマイクロ タイタープレート及びアルカリホスファターゼ−接合のアフィニティー精製され たポリクローナルヤギ抗−フィブロネクチン抗体を、それぞれ実施例７及び８に 記載されるようにして調製した。マイクロタイタープレートを、乾燥剤を含む密 封されたプラスチックハングにそれぞれ８個のウェルの１２ストリツプとしてパ ッケージした。貯蔵抗体接合体を、接合希釈剤（０，０５Ｍのトリス緩衝液、　 ｐＨ７，２，２％のＤ−ソルビトール、２％のＢＳＡ、　０．１％のアジ化ナト リウム、　０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０，１＋ｅＭの塩化マグネシウム及び０ ．１％の塩化亜鉛）により適切に希釈し、そしてその１０１をポリエチレンドロ ンバーボトル容器に入れた。 酵素基質（ポリエチレンドロッパーボトル容器において１０ｍ１）は、０．１ｍ Ｍの塩化マグネシウム及び０．２％のアジ化ナトリウムを有する０゜４Ｍのアミ ノメチルプロパンジオール緩衝液（ｐＨ１０）に溶解されたフェノールフタレイ ンモノホスフヱート（１ｍｇ／ｍｌ）であった。 正の対照（ポリエチレンドロンパーボトル容器１２２．５　ｍｌ）は、サンプル 希釈溶液（０，０５Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ７，４，１％のウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）、　０．１５Ｍの塩化ナトリウム、　０．０２％のアジ化ナトリウム 、５纏Ｈのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、ＩＮＭのフェニルメチルス ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び５００力リクレイン単位／ｍｌのアプロチ ニン）に５０ｎｇ／ｍｌの胎児フィブロネクチンの濃度に希釈された胎児フィブ ロネクチンを含む羊水であった。このサンプル希釈溶液は、引用により本明細書 に組込まれる、１９９０年４月２４日に公開されたアメリカ特許第４．９１９． ８８９号（Ｊｏｎｅｓなど）に記載されている。 負の対照（ポリエチレンドロンパーボトル容器に２．５ｍ１）は、胎児フィブロ ネクチンを含まない正の対照のために使用されるサンプル希釈溶液であった。 すすぎ緩衝液（ポリエチレンドロッパーボトル容器に１０１）は、１、０　Ｍの トリス緩衝液、　ｐＨ７，４，４，０Ｍの塩化ナトリウム、２．５％のＴｗｅｅ ｎ−２０及び１％のアジ化ナトリウムを含む５０Ｘ　！種物であった。 すすぎ緩衝液は、アッセイに使用のために０．０２Ｍのトリス、　０．０８Ｍの 塩化３−トリウム、　０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び０．０２％のアジ化ナ トリウムの最終濃度に水により希釈された。 キットはさらに、２４個の５μ孔サイズのポリエチレンサンプルフィルター（Ｐ ｏｒｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｆａｉｒｂｕｒｎ、　Ｇｅｏｒｇｉａ ）、　マイクロタイターストリップホルダー、マイクロタイタープレートカバー 及び指針シートを含んだ。キットにおけるすべてのドロンパーボトルは、試薬約 ５０ｕＩ液滴を分散するように企画されたポリエチレンボトルであった。サンプ ル収集に続いて行なわれるすべてのアッセイ段階は、キットにおける試薬及び材 料を利用した。 アッセイは次のようにして行なわれた。すべてのサンプルを、グクロンスワブを 用いて、後方円蓋口又は子宮口近くで収集した。スワブサンプルを、収集バイア ルにおける１、０１のサンプル希釈液に含浸した。サンプル希釈溶液は上記の通 りである。スワブを溶液から除き、収集管にできるだけ液体を残した。サンプル を、濾過の前又は後で、アッセイの前、１５分間、アノセイキントからの対照と 共に３７゛Ｃでインキュベートした。サンプルフィルターを個々のサンプル管上 の特定の位置に置いた。８−ウェルストリンプを、ストリップホルダーの位置に 置いた。ホルダーは、１２段及び８列の標準マイクロタイタープレートの英数字 指示を有した。個々のサンプル及び正及び負の対照の二重の１００μｌアリコー トを、マイクロタイターストリップの別々のウェルに置き、そして室温で１時間 インキュベートシた。 インキュベージジンの後、サンプル及び対照をウェルからアスピレートした。ウ ェルを、希釈された洗浄緩衝液（１ｘ）により３度洗浄した。洗浄の後、１００ μｌの酵素−抗体接合体を個々のウェルに添加し、そして室温で３０分間インキ キュートした。ウェルをアスピレートし、そして上記のように洗浄した。洗浄の 後、１００　μＩの酵素基質を個々のウェルに添加し、そして室温で３０分間イ ンキキュートした。 インキュベージジンの後、プレートを手により又は軌道振盪機により軽く撹拌し 、ウェル内容物を混合した。ストリップのフレームを、ＥＬＩＳ＾プレートリー ダーに配置した。５５０　ｎｍでの個々のウェルの吸光度を測定した。個々のサ ンプル及び対照についての二重のウェルの平均吸光度を計算した。患者サンプル の吸光度が正の対照の吸光度よりも低い場合、サンプルは陰性であり、これはサ ンプルにおける検出できないレベルの胎児フィブロネクチンを示す。サンプル吸 光度が正の対照の吸光度よりも高いか、又は等しい場合、そのサンプルは陽性で あり、これは胎児フィブロネクチンがサンプルに存在したことを示す、いづれか のアッセイにおいて、正の対照の吸光度が負の対照の吸光度の１．５倍以上でな い場合、その結果は廃棄され、そしてアッセイ方法がくり返えされた。 実施例１０ 妊娠試験 妊娠試験を行なうために、子宮頚管又は子宮口近くの膣腔から除去し、そして妊 娠であると思われる婦人からの胎児制限抗原、すなわち胎児フィブロネクチンの 存在を決定するためにアッセイした。 試験サンプルにおける有意な胎児フィブロネクチンを示す妊娠の２０週前に得ら れたサンプルは、正常な子宮妊娠を示す。 スワブサンプルを、実施例９に記載されているようにして、３９３人の婦人から 得た。試験された婦人のうち、５０人が非妊娠（ＮＰ）（血清又は尿ヒト絨毛性 性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ　）の分析による）としてｆｌｆされ；３３３人が子 宮内妊娠（ＩＵＰ）　（血清又は尿ｈＣＧの分析による）を有することが確認さ れ；そして１０人が子宮外妊娠（ＥＣＴ）（病歴、血清ｈＣＧ　、　Ｆ！床学的 試験及び手術による確認による）を有することが確認された。 アッセイを、実施例９に記載されるようにして行なった。但し次の例外が存在す る。抗体接合体は、０．０２Ｍのトリス、０．３＋ＭのＮａＣ１゜０．０５％の Ｔｗｅｅｎ　２０．５．０％のＢＳＡ、０．０２％のＮａＮにおいて１　：　１ ．０００に希釈されたヤギ抗−ヒトフイプロネクチン（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｓｗ ｕｎ。 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓカタログ番号１０９−０５６−０５９）であった、 酵素基質は、ＡＭＰ　１１衝液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｊｃａｌ　Ｃｏ、カタロ グ番号２２１）に希釈されたバラ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、カタログ番号１０４−４０Ｔ）であった、さらに、サ ンプルを濾過よりもむしろ遠心分離し、粒状物を除去した。この試験に関しては 、サンプルにいづれかの胎児フィブロネクチンを検出するアッセイが陽性試験と して評点された。試験の結果１０下記に示される。 試験結果の分析は下記に示される。第１の分析は子宮外妊娠を有する婦人からの 結果を包含しない、第２の分析は、子宮外妊娠を有する婦人からの結果を包含す る０分析において、次の略語が使用された。“Ｓｅ”は感受性を意味する（前記 条件を有する婦人の合計数により割り夏された正しい陽性試験結果の数；すなわ ち正しい陽性及び誤った陰性試験結果の合計により割り夏された正しい陽性試験 結果の数）。°“Ｓｐ”は特異性を意味する（前記条件を有さない婦人の合計数 により割り算された正しい陰性試験結果の数；すなわち正しい陰性及び誤った陽 性試験結果の数の合計により割り算された正しい陰性試験結果の数）。“ｐｐｖ ”とは、陽性の予測値を意味する（陽性として試験されたサンプルの合計数によ り割り算された正しい陽性試験結果の数）。“ＮＰＶ”とは陰性の予測値を意味 する（陰性として試験されたサンプルの合計数により割り算された正しい陰性試 験結果の数）。 Ｓｅ　＝　２６１／３３３　＝　７８％Ｓｐ　＝　４２／　５０　＝　８４％ ＰＰＶ　＝　２６１／２６９　＝　９７％ＮＰＶ　＝　４２／１１４　＝　３７ ％Ｓｅ　＝　２６８／３４３　＝　７８％Ｓｐ　＝　４２／　５０　＝　８４％ ＰＰＶ　＝　２６８／２７６　＝　９７％ＮＰＶ　＝　４２／１１７　＝　３６ ％前記研究の結果は、陽性アッセイ結果が婦人が妊娠していることを示すことを 指示した。 実施例１１ 子宮外妊娠試験 実施例１０の方法を、同しサンプルを用いてくり返した。しかしながら、この場 合、０．５μｇ／ｍｌの胎児フィブロネクチンのカットオフ（負の対照の値＋２ つの標準偏差）が、胎児フィブロネクチンの存在に一ついての陽性試験結果のた めに使用された。データは、実施例１０に記載されているようにして分析される 。感受性、特異性、陽性の予測値及び陰性の予測値は、この分析において子宮外 妊娠の検出に基づかれている。 Ｓｅ　＝　１０／　１０　＝　１００％Ｓｐ　＝　１３５／３３３　＝　４１％ ＰＰＶ　＝　１０／２０Ｂ　＝　５％ ＮＰＶ　＝　１３５／ｉ３５　＝　１００％上記結果は、陽性試験結果が、婦人 が子宮外妊娠を有さない高い程度の信頼性を提供することを示す、すなわち、そ れらのサンプルに関しては、婦人が子宮内妊娠を有することを示唆する試験結果 の１００％が正しかった。従って、その試験は“ＩＵＰにおける規則（Ｒｕｌｅ ｉｎ　ＩＬＩＰ）”試験として特徴づけられ；特に、０．５μｇ／ｓ＋１以上の 胎児フィブロネクチン濃度が子宮内妊娠を示す。 実施例１２ 治療用流産試験の生成物 治療用ｆＬ産から得られたサンプルを試験し、胎児性物質が子宮から除去された かを確かめた。アッセイは例９におけるようにして行なわれた。但し次の例外を 伴った。サンプルを、織られた綿を通しての水性濾過により妊娠の生成物から試 験管中に収集し、２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、そして上清液を追加 の希釈を伴わないで胎児フィブロネクチンについて直接的にアッセイした。検量 線は試験に包含された。検量体を、ｌＯｎｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌのアッセイ範 囲に既知の胎児フィブロネクチン濃度の羊水から希釈した。サンプル希釈溶液を 負のバンクグラウンド対照として使用した。サンプルを、胎Ｉ、υフィブロネク チン濃度を定量化するために検量線を用いて、実施例９に記載しているようにし てアッセイした。０．１１　／／　ｇ　／＋ｗｌのフィブロネクチンカットオフ （負の対照値＋２つの標準偏差）を用いて、陽性を決定した。 この研究においては、２９１人の婦人からのＤ＆Ｃ物質は子宮内妊娠であること が＆Ｉ　ｉ、ｐされ、そＵ７て８人の婦人は子宮妊娠（２人は子宮外り（娠であ り、そして６人の婦人は非妊娠であった）ではなかった。結果は、下記に示され る。 Ｓｅ　＝　２８８／２９１　＝　９９％Ｓｐ＝　８／　８　＝　１００％ ＰＰシー２８８／２８８　＝　１００％ＮＰν＝　８／１１　＝　７２．７％ 妊娠の生成物を含むづンブル？。：おい−Ｃは、有意な量の胎児フイブ１、Ｖネ クチンが見出され；これは正常な妊娠の存在及びその終結を確証した。データは また、負のアッセイ結果を有する妊娠の患者において、−宮外妊娠の可能性が示 唆されることも示す。 実施例１３ 早期分娩サンドイッチイムノアッセイ 実施例９の方法を、妊娠の２０〜３６週間で得られた試験サンプルによりくり返 した。研究は、アメリカ合衆国における３種の周産期紹介診療所で行なわれた。 婦人を、膜の疑わしい早期破壊又は損なわれていない膜を有する疑わしい早期分 娩のいづれかのために病院への入院について評価された。 膜の破壊の確認は、羊水の全体のプーリングについての膣の腺での試験、ニトラ ジン紙を用いてアルカリ性腺分泌の存在、シダ状結晶形成のために乾燥された膣 分泌の顕微鏡試験及び羊水過少症の超音波診断により行なわれた。膜の破壊は、 それらの４種の診断基準のうちいづれかの２つの存在により定義された。２３週 〜３６週の妊娠、最後の知られている月経期間に基づいての６日日の妊娠、及び 初めの３力月の骨盤試験により及び２８週以下の妊娠を超音波処理的に確かめら れた出産の予定日の妊娠の損なわれていない羊膜を有する１１７人の婦人が続い て記載される。婦人は、病歴及び子宮収縮の記録を包含する臨床試験及び子宮の 試験に基づいて、早期分娩及び続く出産のために危険であることが主事医により 決定された。早期分娩の臨床学的定義は確立するのに時々困師であるので、胎児 フィブロネクチンの臨床学的利用性を確立するデータは、種々の結果として早期 分娩を用いて分析された。 母方の血漿フィブロネクチンによる子宮腔汚染についての可能性を評価するため に、母方の血液検体を、第２又は第３のトリメスターの間、明らかに健康的な妊 娠の５２人の婦人から得た。羊水検体を、初期の第２のトリメスターにおいて遺 伝子診断のために羊水穿刺を受ける９２人の患者及び第３のトリメスター、選択 的な帝王切開の前、胎児の肺の成熟の評価のために羊水穿刺を受ける８人の患者 から得アッセイ結果は、第２のトリメスターでの羊水における胎児フィブロネク チンの濃度が８７．１±４．８μｓ　／ｍｌ　（ｎ　＝９２）であり、そして第 ３のトリメスターにおいては、２７．１±１７．３μｇ　／ｍｌ　（ｎ　＝　８ 　）であることを示した。第２のトリメスターでの母方の血漿における胎児フィ ブロネクチンの濃度は１．４８＋０．１１μｇ　／ｓｏｌ　（ｎ　＝２０）　テ アリ、そして第３のトリメスターにおいては３．１９±０．３０μｇ／ｍ１（ｎ ＝３２）であった。 ＋感受性＝８３．１％、特異性＝８１．７％相対的危険比−２０，９（９５％ｃ ＋　：　８．８．４９．７）　；Ｘ”　、Ｐ＜０．０１ 疑わしい早期分娩及び損なわれていない羊膜を有する１１７人の患者について上 記表に示されるように、早熟出産する（ＰＴＤ）５９人の婦人のうち４９人（感 受性−８３，１％）は、出産予定で出産する（ＴＤ）　５８人の婦人のうち１１ 人（特異性−８１，０％）に比較して、それらの子宮膣分泌において胎児フィブ ロネクチンを有した（Ｐ＜０．０１）。同様に、それらの子宮膣分泌に胎児フィ ブロネクチンを有するそれらの患者は、子宮膣胎児フィブロネクチンを示さない それらの婦人（負の予測値＝８２．５％）よりもより一層、早熟出産する（正の 予測値−８１，７％）１頃向があった。 子宮膣胎児フィブロネクチンの存在は、疑わしい早期分娩を有するそれらの婦人 における早期出産についての危険性の敏感且つ特異的な予測物であった。それら の患者における胎児フィブロネクチンの存在は、３．７９の算定回帰推定比によ り早期出産の危険性に強く関係した（９５％ＣＩ　：　２．３３．６．１５　； 　Ｐ　＜０．０１）。 母方起源の胎児フィブロネクチンにより混合する可能性について評価するために 、データを、血液により汚染された３１種のサンプルの排除の後に分析した。下 記に示されるように、類似する割合の患者がそれらの子宮膣分泌に胎児フィブロ ネクチンを有し、そして早熟出産した。さらに、膣血液の存在又は不在の包含は 、１．７０　（９５％ｃＩ：０．９１　；３．１８；　Ｐ＝０．１　）の推定比 を付与する段階的な算定回帰モデルに示し、それは、血液が、胎児フィブロネク チンが前記モデル中に導入された後、早期出産の独立した予測体でないことを示 す。 しかしながら、血液により汚染された子宮膣における胎児フィブロネクチンの検 出が切迫分娩のインジケーターであることは単一変量分析から明白であった。 ＋感受性−７５．０％、特異性＝８６．０％相対的危険比＝１８．４　（９５％ Ｃ１ｎ　６．７．５０．４）　ｉｘｇ　、ｐ＜ｏ、ｏｉ ＰＴＤのための危険性の婦人を同定するためへの胎児フィブロネクチンの有益性 は、２ｃｍ＋を越える子宮拡張と共に損なわれていない膜を有する早期収縮での 婦人が分析から排除される場合でさえ、維持された。３．１８　（９５％Ｃ１： 　１．８．５．６．　Ｐ＜０．０１）の算定回帰推定比は、この臨床的に分離し た集団における胎児フィブロネクチンの′Ｙ−測値を確証した。 感受性＝７１．４％、特異性＝８３．７％相対的危険比−１２，８（９５％Ｃ１ ：　４．５．３６．３）　；Ｘ”　、Ｐ＜０．０１ 実施例１４ 破壊された膜サンドイッチイムノアッセイ実施例９の方法を、２０週の妊娠から 得られた試験サンプルにより（り返した。この複数部位臨床研究の目的は、満期 妊娠及び疑わしい膜の破壊を有する婦人（ＴＲＯＭ）　、早期妊娠及び疑わしい 膜の破壊を有する婦人（ＰＲＯＭ）及び損なわれていない羊膜を第３のトリメス ターにおいて有する妊娠の婦人（対照）の膣分泌における胎児フィブロネクチン を検出するためにイムノアンセイの効率を評価することであった。羊膜の破壊の 推定上の診断は、実施例１３に概略されている臨床的な基準に従って行なわれた 。そのアッセイ結果は、人口統計学的特徴、産科歴及びサンプル収集と出産との 間の期間を包含する現在の妊娠の特別な特徴により個々のグループについて分析 された。胎児フィブロネクチンが、ＦＲＯＭでの８５人の婦人、ＴＲ０Ｍでの３ ３９人の婦人及び対照の６７人の婦人から得られた子宮膣分泌において分析され た。超音波により又は最後の知られた月経期間により確かめられるような既知の 妊娠年齢の婦人についてのデータのみが続いて記載される。 次の表は、胎児フィブロネクチン結果により分離されるＦＲＯＭ。 ＴＲ０Ｍ及び対照における婦人のためにサンプリング（ＥＧＡＳ）及び出産（Ｅ ＧＡＤ）並びにサンプリングと出産との間の期間（ＳＡＭＤＥＬ）で妊娠年齢（ 週）についての観察の回数及び平均（±ＳＯ）を示す、データはまた、サンプリ ングの４８時間以内で生じる出産の％（％Ｄｅｌ＜４８Ｈｒｓ）及びＰｌ？ＯＭ における早期出産の％（％ＰＴＤ）も提供する。 ■卵　■賭　丼鼠 ｆＦＮ＋　ｆＦＮ−ｆＦＮ＋　ｆＦＮ−ｆＦＮ＋　ｆＦＮ−ｎ　８０　５　３１ ９　２０　１３　５４χＤｅｌ＜４８Ｈｒｓ−−９４，７４５，０２３，１５， ３χＰＴＤ　９７．５　６０．０ 疑わしい膜の早期破壊を存するＦＲＯＭの８５人の患者のうち、８０人は彼らの 子宮膣液に胎児フィブロネクチンを有し、そして早熟出産した９７．５％（ｎ＝ ７８）は、羊膜が破壊されたことを示す、疑わしい膜の破壊を有するＴＰＯＨの ３３９人の患者のうち、３１９人は彼らの子宮膣液に胎児フィブロネクチンを有 し、そしてサンプリングの４８時間以内で出産した９４．７％（ｎ＝３０２）は 、羊膜が破壊されたことを示す。 明らかに損なわれていない羊膜を有する対照の６７人の患者のうち、１３人は彼 らの子宮膣液に胎児フィブロネクチンを有し、そしてサンプリングの４８時間以 内で出産したのは２３．１％であり、負の胎児フィブロネクチン結果を有する対 照の婦人は５．３％であった。これらの結果は、膜の破壊の検出についての従来 使用されて来た診断試験がしばしば信頼できなくなることを示唆する。さらに、 陽性の胎児フィブロネクチン結果を有するすべての婦人は、陰性の胎児フイブロ ネクチン結果を有する婦人よりも有意に（Ｐ　＜０．０５）により短いサンプル からの出産の期間を存した。 ＴＲ０Ｍにおける婦人から収集された３３９種のサンプルのうち、膣血液痕跡の 存在に関する情報は、３１６人について利用できた。彼らのうち、９０人（２８ ，５％）が膣血液痕跡の存在下で収集された。　［！ＧＡＳ。 ＥＧＡＤ、　ＳＡＩ’１ＤＥＬ及び％Ｄｅｌ＜４８　ｈｒｓが、次の表にそれら の婦人のために示される。ＥＧＡＳ及びＥＧＡＤは膣血液痕跡を有する及び有さ ない婦人に関して類似するが、膣血液痕跡を有する婦人は膣に血液を有さない婦 人よりもよりすばやく出産する（　Ｐ　＜０．０５）。陽性結果の割合は、検体 収集の時点で、膣における血液の存在又は不在にもかかわらず類似する。 ｎ　９０　２２６ χＤｅｌ＜４８Ｈｒｓ　９１．２　９５．にの分析は、膣分泌における血液の存 在が婦人のこの集団についての試験結果に対して明らかな効果を有さないことを 示す。対照におけるたった１人の婦人が膣血液痕跡を有するものとして固定され た。彼女は負のアッセイ結果を有し、そして検体収集の後；約１３５時間で出産 した。 胎児フィブロネクチンは、羊膜の破壊を示す、羊水の検出のための最適なマーカ ーである。胎児フィブロネクチンは、羊水に高濃度で及び母方の血液に低濃度で 存在する。子宮膣液における胎児フィブロネクチンの免疫学的検出は、羊膜が傷 つけられたかどうかを決定するために膣における羊水の存在又は不在を同定する ための安全且つ効果的な方法である。 実施例１５ 胎児フィブロネクチンアッセイキット及び方法もう１つの好ましい１！様におい ては、胎児制限抗原、すなわち胎児フィブロネクチンのためのアッセイキットは 、次の成分を含む。 このキットは、急速な枕元アッセイを行うために使用されるように企画された。 １、プラスチック製ハウジングを含んで成り、そして（ａ）モノクローナル抗− 胎児フィブロネクチン抗体を結合される多孔性ナイロン膜； （ｂ）流れ調整膜システム；及び （ｃ）吸着剤層 を含むアッセイ装置、 ２、タンパク質マトリックスにおけるコロイド状金−ラベルされたヤギ抗−フィ ブロネクチン抗体接合体、３、接合体再構成緩衝液、 ４、洗浄溶液、 ５、殺菌されたダクロンサンプル収集スリブ。 膜装置は次の方法により調製された。実施例６に記載されるようにして調製され た２μｍのネズミモノクローナル抗体ＦＤＣ−６を、ｐＨ６の０．０１Ｍのリン 酸緩衝客演（ＰＢＳ）、０．５ｍｇ／請ｌのＢＳＡを含む０．１Ｍのクエン酸緩 衝液における膜表面（１，２μのナイロン、　Ｂｉｏｃｌｙｎｅ−Ａ、　Ｐａ１ ｌ）に適用する。同じ緩衝液中、実施例４に記載されるようにして精製されたヒ ト血漿フィブロネクチンから成る手続上の対照をまた、前記膜の別の領域に適用 する。膜を空気乾燥した後、ＰＢＳ−緩衝化された０、　５％非脂肪ドライミル クのブロッキング試薬を膜に適用する。過剰のブロンキング試薬を、少なくとも 約２０分後に除去する。 膜−維持装置（Ｔａｒｇｅｔ　Ｄｅｖｉｃｅ、　Ｖ−Ｔｅｃｈ、　Ｐｏ＋ｗｏｎ ａ＋　ＣＡ）を、アッセイ膜からのサンプル溶液の吸着剤層への流れをｔｌｉ節 するために抗体−担持膜（サンプル適用の方向における）の下に第２の多孔性層 （０，４５μの低タンパク質−結合ナイロン、　Ｌｏ　Ｐｒｏｄｙｎｅ、　Ｐａ １１）によりアセンブリーする。次に、２つの多孔性膜を、１．５ｍ１以上の容 量を有する吸着性多孔性ポリエチレン層（Ｃｈｒｏ＊ｅｘ、　Ｂｒｏｏｋｌｙｎ 、　ＮＹ）上に配置し、そして装置に包含する。その装置を、乾燥剤を含む密封 されたプラスチックバングに個々にバックする。 コロイド状金を、０．１６％のクエン酸ナトリウムによる０、０１％のテトラク ロ口金（Ｉ［［）酸の還元により調製し、この態様においては、約３０ｎｍの粒 子を製造する０手順に言及すれば、前記２種の溶液を９０°Ｃに別々に加熱する 。還元溶液を、激しく撹拌しながら、全溶液に添加する。その組合された溶液を 少なくとも１０分間、煮沸する（１００’Ｃ）。 アフィニティー精製されたヤギ抗−フィブロネクチン抗体（実施例４に記載され るようにして調製された）を、吸着によりコロイド状金に結合した。手順に言及 すれば、上記で調製されたコロイド状金溶液を、水中で抗体（５〜１０μｇ　／ ｍｌ）と共に組合した。接合に続いて、その接合体溶液を、５％のＢＳＡ及び５ ％のポリビニルピロリドン（最終濃度）の添加により安定化した。 ス）ｙり接合体を、中空繊維フィルターを用いての限外濾過により約ｔｏ−１２ 倍に濃縮した。その濃縮された接合体を、１５ｍＭのトリス。 ２％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ　２０．　０．２％のポリエチレングリコ ール。 ８％のポリビニルピロリドン及び０．０４％のチメロザールにより適切なレベル に希釈した。適切な濃度を、下記のようなサンプルア７セイ方法による広範囲の 希釈度を用い、そして最良の結果を生成する希釈度を決定することによって決定 した。 選択された接合体希釈溶液を、ポリエチレンサンプル収集管に置き、そして凍結 乾燥せしめる。その管を、凍結乾燥工程の間、２μの孔サイズのポリエチレンサ ンプルフィルター（Ｐｏｒｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。 Ｆａｉｒｂｕｒｎ、　Ｇｅｏｒｇｉａ）により固定する。凍結乾燥された接合体 を、乾燥剤を含む箔ボウチに個々にパッケージする。 接合体再構成緩衝液は１００　ｍＭの酢酸ナトリウムである。この緩衝液は、１ １の使い捨て管における単位用量としてパッケージされる。 洗浄溶液は、使い捨て管に単位用量としてパンケージされる水である。 キットはさらに、個々にパッケージされた殺菌ダクロンスワブ及び手順要約カー ドを含む。 アッセイは次の通りにして行なわれた。 １、サンプルを収集する前、箔ボウチから合接合体を含むプラスチック管を取り 出し、スポイト端を除去し、そして接合体再構成緩衝液を含む管の全内容物を添 加する。 ２、供給されるスワブによりサンプルを収集する。滅菌下での検鏡試験の間、膣 の後部膣円蓋中にスワブを挿入し、約１０秒間、くるくる回し、流体を吸収する 。すぐに、試験を行なうために進行する。サンプルは、後での試験のために貯蔵 され得ない、合接合体溶液にスワブを置き、そして１０〜１５秒間、上下運動に より象、速に混合する。 ３、管の内部上でスワブの先端を回すことによってそのスワブからできるだけ多 くの液体を除去する。たぶん感染性物質を取扱かうスワブを捨てる。 ４、プラスチフクの管上にスポイト先端を置き、そしてすぐに、膜装置の表面上 に希釈され、濾過されたサンプルの全体積を分散する。 ５、サンプル液体が膜表面中に吸収された後、数滴の洗浄溶液を添加し、そして その結果を観察する。 ６、陰性結果は、膜の手順対照領域のみにおいて赤色により示される。陽性結果 は、膜の試験領域及び対照領域においてピンク又は赤色の点により示される。 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０９２５９ λ　発明の名称 胎児制限抗原の決定のための試薬及びキット３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　アデザ　バイオメディカル コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話３５０ ４−０７２１　−。 氏名　弁理士（７７０９）宇　井　正　−１（外４名璽　゛ ５、補正命令の日付 ６、補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文７、補正の内容 明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 明細書、請求の範囲 及び要約書の翻訳文　各１通 国際調査報告

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．試験サンプルにおける胎児制限抗原の検出のためのキットであって： ａ．不溶性支持体に付着される抗−（胎児制限抗原）抗体；及びｂ．抗−（胎児 制限抗原クラス）抗体を含んで成るキット。
2. ２．前記抗−（胎児制限抗原）抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１ 項記載のキット。
3. ３．前記抗−（胎児制限抗原）抗体が抗−（胎児フィブロネクチン）抗体である 請求の範囲第１項記載のキット。
4. ４．前記抗−（胎児制限抗原クラス）抗体がポリクローナル抗体である請求の範 囲第１項記載のキット。
5. ５．前記抗−（胎児制限抗原クラス）抗体が抗−フィブロネクチン抗体である請 求の範囲第１項記載のキット。
6. ６．前記抗−（胎児制限抗原クラス）抗体がラベルされる請求の範囲第１項記載 のキット。
7. ７．前記ラベルが酵素である請求の範囲第６項記載のキット。
8. ８．前記キットが、酵素基質をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載のキット 。
9. ９．前記キットが、正の対照をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載のキット 。
10. １０．前記キットが、サンプル濾過装置をさらに含んで成る請求の範囲第１項記 載のキット。
11. １１．試験サンプルにおける胎児フィブロネクチンの検出のためのキットであっ て： ａ．不溶性支持体に付着される抗−（胎児フィブロネクチン）抗体；及び ｂ．抗−フィブロネクチン抗体を含んで成るキット。
12. １２．前記抗−（胎児フィブロネクチン）抗体がモノクローナル抗体である請求 の範囲第１１項記載のキット。
13. １３．前記抗−（胎児フィブロネクチン）抗体がＦＤＣ−６である請求の範囲第 １２項記載のキット。
14. １４．前記抗−フィブロネクチン抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第 １１項記載のキット。
15. １５．前記抗−フィブロネクチン抗体がラベルされる請求の範囲第１４項記載の キット。
16. １６．前記ラベルが酵素である請求の範囲第１５項記載のキット。
17. １７．前記酵素がアルカリホスファターゼである請求の範囲第１６項記載のキッ ト。
18. １８．前記キットが酵素基質をさらに含んで成る請求の範囲第１７項記載のキッ ト。
19. １９．前記酵素基質がフェノールフタレインモノホスフェートである請求の範囲 第１８項記載のキット。
20. ２０．前記ラベルがコロイド状金である請求の範囲第１５項記載のキット。
21. ２１．前記不溶性支持体がマイクロタイタープレート、又はマイクロタイタープ レートの壁のストリップを含んで成る請求の範囲第１１項記載のキット。
22. ２２．前記キットがマイクロタイタープレートカバーをさらに含んで成る請求の 範囲第２１項記載のキット。
23. ２３．前記キットが、マイクロタイタープレートの壁のストリップを含み、そし て前記ストリップのためのホルダーをさらに含んで成る請求の範囲第２１項記載 のキット。
24. ２４．前記キットが正の対照をさらに含んで成る請求の範囲第１１項記載のキッ ト。
25. ２５．前記正の対照が既知胎児フィブロネクチン濃度の羊水である請求の範囲第 ２４項記載のキット。
26. ２６．前記胎児フィブロネクチン濃度が約１０〜約１００ｎｇ／ｍｌである請求 の範囲第２５項記載のキット。
27. ２７．前記羊水が、０．０５Ｍのトリス緩衝液，ｐＨ７．４，１％ウシ血清アル ブミン，０．１５Ｍの塩化ナトリウム．０．０２％のアジ化ナトリウム，５ｍＭ のエチレンジアミン四酢酸，１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド及び ５００カリクレイン単位／ｍｌアプロチニンの溶液に希釈される請求の範囲第２ ６項記載のキット。
28. ２８．前記キットが負の対照をさらに含んで成る請求の範囲第１１項記載のキッ ト。
29. ２９．前記負の対照が、０．０５Ｍのトリス緩衝液，ｐＨ７．４，１％ウシ血清 アルブミン，０．１５Ｍの塩化ナトリウム，０．０２％のアジ化ナトリウム，５ ｍＭのエチレンジアミン四酢酸，１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド 及び５００カリクレイン単位／ｍｌアプロチニンの溶液である請求の範囲第２８ 項記載のキット。
30. ３０．前記キットが少なくとも１つのサンプル濾過装置をさらに含んで成る請求 の範囲第１１項記載のキット。
31. ３１．前記サンプル濾過装置が予定された体積の濾過されたサンプルを分散する 請求の範囲第３０項記載のキット。
32. ３２．前記キットがすすぎ用緩衝液をさらに含んで成る請求の範囲第１１項記載 のキット。
33. ３３．前記すすぎ用緩衝液が０．０２Ｍのトリス，０．０８Ｍの塩化ナトリウム 及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０である請求の範囲第３２項記載のキット。
34. ３４．前記すすぎ用緩衝液がアジ化ナトリウムをさらに含んで成る請求の範囲第 ３３項記載のキット。
35. ３５．前記すすぎ用緩衝液が濃縮形でパッケージされる請求の範囲第３３項記載 のキット。
36. ３６．前記固相が膜である請求の範囲第１１項記載のキット。
37. ３７．前記膜がナイロンである請求の範囲第３６項記載のキット。
38. ３８．前記膜が吸着層上に置かれる請求の範囲第３６項記載のキット。
39. ３９．流れ調節層が前記膜及び前記吸着層の中間に存在する請求の範囲第３６項 記載のキット。
40. ４０．前記キットが、ラベルされた抗−フィブロネクチン抗体を含むサンプル濾 過装置をさらに含んで成る請求の範囲第３６項記載のキット。