MXPA99008146A - Composiciones en combinación contra la enfermedad de lyme y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las composiciones que contienen un antígeno de Borrelia burgdorferi, y los métodos para la fabricación y uso de las mismas. El antígeno puede ser OspA. Las composiciones pueden contener al menos un antígeno adicional proveniente de un patógeno diferente de Borrelia burgdorferi. Las composiciones sonútiles para promover una respuesta inmunológica en un mamífero huésped susceptible a la Enfermedad de Lyme y al patógeno de mamífero diferente de Borrelia burgdorferi. Los mamíferos huésped adecuados incluyen perros, cachorros, caballos y, el antígeno adicional puede ser de un patógeno canino, equino o felino, tales como de la rabia, el moquillo canino, adenovirus, coronavirus, parainfluenza y parvovirus. No se observa interferencia de eficacia significativa

Description

COMPOSICIONES EN COMBINACIÓN CONTRA LA ENFERMEDAD DE LYME Y SUS USOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a las composiciones contra la enfermedad de Lyme (An tí geno de Borreli a burgdorferi ) especialmente a las composiciones en combinación, y a los métodos de fabricación y uso de las mismas, especialmente para usos veterinarios. Las composiciones pueden incluir, además de un antigeno o antigenos de Borrel i a burgdorferi , un antigeno para un patógeno adicional, tal como un patógeno canino, felino o equino, por ejemplo un antigeno proveniente de al menos uno de: virus de la rabia, virus del moquillo canino, adenovirus, coronavirus, parainfluenza parvovirus, FeLV, herpesvirus felino, virus de la influenza equina, virus del herpes equino, y similares. Las composiciones inducen ventajosamente una respuesta inmunológica contra la enfermedad de Lyme ( Borrel i a burgdorferi ) asi como contra cualquier otro antigeno en la composición, cuando se administra a un huésped.

Las composiciones producen inmunidad a largo plazo (respuesta) contra Borreli a burgdorferi de la REF.: 31253 enfermedad de Lyme en animales, incluyendo caballos y perros, y proporcionan protección o promueven la respuesta inmunológica en los animales. En las composiciones en combinación, existe una ausencia de interferencia de eficacia. La invención se refiere además a los métodos para' la elaboración y usos de tales composiciones. La invención se refiere además a los anticuerpos producidos por las composiciones, aislados de un animal o cultivo celular, como pueda ser el caso, los cuales son útiles para la preparación de un equipo, prueba o ensayo de diagnóstico para la detección de un antigeno de Borreli a burgdorferi o de la enfermedad de Lyme u otro antigeno de otro patógeno u otro patógeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Lyme es una enfermedad de sistemas múltiples, trasmitida por ácaros del complejo de Ixodes ri cinus . La espiroqueta Borreli a burgdorferi sensu lato es el agente etiológico de la enfermedad de Lyme, la cual es ahora la enfermedad portada por artrópodo, más común en los Estados Unidos, y es endémica en Europa Central (Barbour y colaboradores, 1993) . Aunque es curable por terapia con. antibióticos en sus etapas tempranas, si la enfermedad de Lyme se deja progresar, pueden surgir anormalidades cardiacas, neurológicas y de las articulaciones. Las investigaciones en el desarrollo de una vacuna humana para la enfermedad de Lyme están en proceso. La lipoproteina OspA de la superficie exterior, de Borrel i a burgdorferi , es la molécula candidato mayor, actual, para el desarrollo de tal vacuna. La lipoproteina OspA recombinante (rOspA) se sabe que provoca una respuesta inmune protectora en ratones contra el reto por B . burgdorferi infecciosa (Fi rig y colaboradores, 1990); Erdile y colaboradores, 1993; USSN 08/373,455). OspA está sufriendo actualmente pruebas en el campo humano como una vacuna subcutáneamente administrada en los Estados Unidos (Keller y colaboradores 1994). Las solicitudes anteriormente citadas WO93/08299 y PCT/US92/ 08697 se refieren a vacunas de OspA recombinantes (rOspA) , especialmente rOspA lipidada, y los métodos para la expresión del ADN que codifica para OspA, y el aislamiento de la rOspA lipidada. Las patentes Norteamericanas anteriormente citadas Nos. 5,582,990 y 5,523,089 y la solicitud WO 90/04411 se refieren al ADN que codifica para OspA, a la secuencia de aminoácidos de OspA incluyendo rOspA y las formas lipidadas de la misma, OspA sintética incluyendo rOspA y formas lipidadas de la misma, las composiciones que contienen OspA u OspA sintética, y los métodos para utilizar tales composiciones. Y, las otras solicitudes anteriormente citadas se refieren al ADN que codifica para otros antigenos de Borreli a u otras Osps, o al ADN que codifica para fragmentos útiles de OspA o de otras Osps, las secuencias de aminoácidos de las mismas, las composiciones que contienen tales fragmentos u otras Osps, y los métodos para utilizar tales composiciones. El ADN de los documentos citados en la presente que pertenece a Borrel i a burgdorferi puede ser utilizado en los métodos de las patentes Norteamericanas Nos. 5,582,990, y 5,523,089 o PCT/US92/08697 para producir OspA, otros antígenos de Borrelia u Osps, o fragmentos de los mismos, para el uso en esta invención. Con respecto al ADN y a los antígenos útiles en esta invención, se puede hacer referencia a Molecular Microbiology (1989), _3(4), 479-486. Un problema particular en la técnica anterior involucra la infección de animales domésticos con Borreli a burgdorferi proveniente de mordeduras de ácaros. Por ejemplo, los perros y caballos son susceptibles a la enfermedad de Lyme debido a las mordeduras de ácaros, y sus amos no se enteran de la infección hasta que es demasiado tarde (el anillo circular de indicio alrededor de la mordedura del acaro no es detectado debido al pelaje, y el perro o caballo es incapaz de verbalizar los dolores o quejas tales como las coyunturas sensibles, etc., por la infección, o debido a que los amos no aprecian los síntomas sutiles de la enfermedad de los animales). Además, existe un interés respecto a la posible transmisión a humanos. Un problema adicional en la técnica involucra las estrategias de vacunación. Más específicamente, cuando se vacunan animales domésticos se prefiere administrar antígenos múltiples en un 'coctel" o en una composición multivalente; por ejemplo, para reducir el número de refuerzos y el número de visitas al veterinario. Un combinación o * coctel" para la enfermedad de Lyme o vacuna multivalente o composición inmunológica o inmunogénica (antígeno de Borrel i a burgdor eri en combinación con otros antígenos en una composición, particularmente para caninos) , no es actualmente disponible o conocida.

Un problema adicional de la técnica, especialmente para la composición multivalente, involucra la 'interferencia de eficacia", a saber una falla de uno o más antígenos, en una composición en combinación, para mantener o lograr la eficacia. Se cree que esto es debido a la interferencia sobre aquel antígeno que estimula una respuesta inmunológica, antigénica, de anticuerpo, o protectora en el huésped, por ejemplo, el perro, cuando se administra, debido a la presencia de los otros antígenos. Por ejemplo, los antígenos de la rabia en una combinación con otros antígenos sufren interferencia proveniente o interfieren con la estimulación de una respuesta inmunológica, antigénica, de anticuerpo o protectora por aquellos otros antígenos en tal composición, especialmente cuando esa composición es administrada a perros. Más particularmente, los antígenos, tales como antígenos de la rabia y antígenos de Lept ospi ra , cuando se administran con uno o más de otros antígenos pueden interferir con la respuesta provocada por esos antígenos. Por supuesto, los antígenos de Lep tospira pueden interferir con OspA. No obstante, para otros huéspedes, tales como gatos, son conocidas las vacunas en combinación. Quizás, sin desear comprometerse por ninguna teoría, la 'interferencia de eficacia" es debida a alguna peculiaridad del sistema biológico canino o, a la reacción con el sistema biológico canino por antígenos actualmente conocidos o, por la combinación de los mismos. A pesar de la teoría, no existe hasta la fecha al conocimiento del inventor, ninguna combinación contra la enfermedad de Lyme, con otra composición antigénica, especialmente para uso canino, y la cual no muestre interferencia de eficacia. Existe una necesidad para una combinación contra la enfermedad de Lyme, especialmente para uso canino. Podría por supuesto ser sorprendente, inesperado y no obvio el poder formular una composición en combinación contra la enfermedad de Lyme (con otros antígenos) la cual muestre una falta de interferencia de eficacia en caninos, especialmente como es mostrado por el presente conocimiento y la interferencia de eficacia, uno puede simplemente combinar las 'composiciones antigénicas" para preparar una combinación o composición de 'coctel" útil. Además, podría ser ventajoso si tal composición de coctel de antígeno de la enfermedad de Lyme proporcionara protección a largo plazo para caninos, así como protección para cachorros con inmunidad maternal a la enfermedad de Lyme. Como el experto en la técnica está enterado, la inmunidad maternal es inmunidad que adquiere un recién nacido de su madre después del nacimiento y/o por el amamantamiento, cuya inmunidad, después de un periodo de tiempo, decae en el recién nacido, con lo cual deja al recién nacido susceptible. Además, la presencia de anticuerpos maternos en el recién nacido previene que el recién nacido obtenga una respuesta protectora cuando se administra una composición antigénica, por ejemplo una vacuna, lo que significa que el recién nacido debe entrar a un periodo de ninguna o poca inmunidad, por ejemplo, susceptibilidad, y se puede considerar el peligro para el recién nacido antes de la administración de un antígeno o composición de vacuna. Con respecto a la inmunidad materna, se hace referencia a la Patente Norteamericana No. 5,338,683, expedida el 16 de Agosto de 1994 e incorporada por referencia en la presente . De este modo, las estrategias de vacunación alternativas son deseables. Podría ser aún más ventajoso, sorprendente e inesperado si el antígeno de Borrel i a burgdorferi que puede ser utilizado en una composición de 'coctel" en combinación que carezca de interferencia de eficacia en caninos, pueda ser utilizado en tal composición para otros huéspedes tales como felinos, equinos y similares y, la cual proporcione protección a largo plazo en perros así como protección en cachorros a pesar de la inmunidad materna, el cual fuera un antígeno recombinante. En particular, se cree que hasta la fecha la técnica no ha mostrado o sugerido la administración a un huésped mamífero -especialmente un animal doméstico tales como perros, gatos o caballos-susceptible a la enfermedad de Lyme, de una composición en combinación que incluye un antígeno de Borreli a burgdorferi , por ejemplo, OspA, especialmente como se describe en la presente.

OBJETIVOS Y BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La inmunización con una vacuna monovalente contra la enfermedad de Lyme ( Borrel i a burgdorferi ) (designada Ly) es mostrada como segura y eficaz en perros, como se evaluó por la tasa de seroconversión y protección contra la infección por Borreli a burgdorferi .

Los estudios han mostrado ahora que una vacuna contra Lyme, que contiene 10 µg/ml de OspA (preparado de acuerdo a WO93/08299 y Patentes Norteamericanas Nos. 5,582,990 y 5,523,089, incorporadas por referencia en la presente), le proporciona a los perros protección significativa contra el reto con ácaros, como es evaluado por la reducción en la proliferación de espiroquetas y la prevención de la enfermedad clínica. Además, esta inmunidad inducida por la vacuna es todavía significativa cuando el reto es de cinco a seis meses después de la vacunación. Se ha mostrado también que la vacuna monovalente es excepcionalmente segura; los perros que muestran signos clínicos de la enfermedad de Lyme no muestran exacerbación de la enfermedad cuando son vacunados con dosis altas, repetidas, de la vacuna de OspA. No obstante, podría ser un avance aún más significativo en la técnica el proporcionar una vacuna contra Lyme en combinación, segura y eficaz. Podría ser un avance más significativo el tener la falta de interferencia de la vacuna de OspA cuando se administra con otros antígenos caninos. Los resultados en la presente muestran que las vacunaciones subcutáneas, dadas a intervalos, dan como resultado seroconversión significativa. El nivel de anticuerpo inducido en estos vacunados es similar a aquel observado en perros que reciben la vacuna monovalente; se mostró que dichos niveles protegen a los vacunados incluyendo a largo plazo -contra un reto utilizando ácaros infectados con Borreli a . Debido a que existe evidencia de que los caballos son también susceptibles naturalmente a la infección por Borrel i a burgdorferi , podría ser un avance significativo el proporcionar vacunas equinas contra Lyme, las cuales den como resultado la producción de antigeno de JBo-r-re-ia burgdorferi significativo, por ejemplo, OspA, anticuerpo en caballos. Un objetivo de la presente invención es proporcionar una combinación de Borrel i a burgdorferi , por ejemplo, OspA, vacuna o composición inmunológica o antigénica, especialmente una composición que incluya la protección en perros, caballos, u otros animales domésticos. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar una vacuna o composición inmunológica o antigénica contra la enfermedad de Lyme, en combinación, en donde no exista interferencia de eficacia, significativa, por los antígenos en la combinación. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una vacuna o composición inmunológica o antigénica contra la enfermedad de Lyme para la producción de una respuesta serológica después de la administración a perros, caballos u otros animales domésticos. En consecuencia, la presente invención proporciona una composición inmunológica, antigénica o de vacuna que comprende un antígeno de Borreli a burgdorferi purificado, aislado, al menos un antígeno adicional de un patógeno para mamífero diferente de Borreli a burgdorferi , y opcionalmente un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable. En la composición, el antígeno aislado y purificado de Borrel i a burgdorferi puede comprender OspA purificado, aislado. Adicionalmente, en la composición, la OspA purificada, aislada, puede ser una OspA recombinante, lipidada, purificada, aislada, la cual está sustancialmente libre de lipopolisacárido y sustancialmente libre de otras proteínas bacterianas. La composición puede ser sin ningún adyuvante aumentador de la inmunogenicidad.

En la composición, el antígeno adicional puede ser seleccionado del grupo que consiste de: un antígeno de un patógeno canino, un antígeno de un patógeno equino, y un antígeno de un patógeno felino. En ciertas modalidades preferidas, en la composición, el antígeno adicional es un antígeno de un patógeno canino o de un patógeno equino. El antígeno adicional puede ser seleccionado del grupo que consiste de: un antígeno del virus de la rabia, un antígeno del moquillo canino, un antígeno de adenovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza, un antígeno de parvovirus, y mezclas de los mismos. En ciertas modalidades preferidas de la composición, el antígeno adicional es un antígeno del virus de la rabia; o, el antígeno adicional comprende un antígeno del moquillo canino, un antígeno de adenovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza, y un antígeno de parvovirus. El antígeno adicional puede ser un virus vivo modificado o atenuado, por ejemplo, un CDV atenuado, CAV tal como CAV2 , un coronavirus, un virus de parainfluenza y/o un parvovirus. La invención comprende además un método para promover una respuesta inmunológica en un mamífero susceptible a la enfermedad de Lyme, y al patógeno mamífero diferente de Borreli a burgdorferi , que comprende el administrar al mamífero las composiciones anteriormente mencionadas. El mamífero puede también ser un caballo y el antígeno adicional es de un patógeno equino. El mamífero puede también ser un perro o cachorro y el antígeno adicional es de un patógeno canino. Todavía más, la presente invención proporciona un método para promover una respuesta inmune en un caballo contra Borreli a burgdorferi , que comprende el administrar al caballo una composición que comprende OspA de Borrel i a burgdo f ri , purificada, aislada. Adicionalmenté, la invención proporciona un método para promover una respuesta inmunológica en un perro o cachorro contra Borreli a burgdorferi , que comprende el administrar al perro o al cachorro una composición que comprende OspA de Borrel i a burgdorferi , purificada, aislada. En estos métodos la OspA puede ser una OspA recombinante, lipidada, purificada, aislada, la cual está sustancialmente libre de lipopolisacárido, y sustancialmente libre de otras proteínas bacterianas.

Y, en estos métodos, la composición puede ser sin ningún adyuvante aumentador de la inmunogenicidad. La invención también comprende un método para preparar las composiciones anteriormente mencionadas, que comprende el preparar el antígeno adicional en forma liofilizada, la preparación del antígeno de Borreli a burgdorferi en forma líquida, y la rehidratación del antígeno adicional con el antígeno de Borreli a burgdorferi . La OspA de Borreli a burgdorferi puede ser obtenida mediante la transformación de un organismo huésped por un plásmido que contiene un gen que codifica para la lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi , de tipo silvestre, de longitud completa, y produciendo lipoproteína OspA recombinante de Borreli a burgdorferi , y la purificación de dicha lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi , recombinante, sustancialmente libre de otra proteína bacteriana y de lipopolisacárido, bajo condiciones de no desnaturalización a partir de un lisado de dicho organismo huésped. Por ejemplo, útil en esta invención es una lipoproteína aislada la cual comprende la lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi , recombinante, purificada la cual ha conservado la lipidación, que está sustancialmente libre de otras proteínas bacterianas y está sustancialmente libre de lipopolisacárido, y la lipoproteína OspA de Borreli a burgdorferi , recombinante, purificada, que ha sido obtenida mediante un proceso que comprende: la transformación de un organismo huésped mediante un plásmido que contiene un gen que codifica para una lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi , de tipo silvestre, de longitud completa y que produce lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi , recombinante, la purificación de la lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi , recombinante, sustancialmente libre de otra proteína bacteriana, y de lipopolisacárido bajo condiciones no desnaturalizantes a partir de un lisado de dicho organismo huésped, para obtener una lipoproteína de Borrel i a burgdorferi recombinante, purificada, la cual permanece lipidada y es inmunogénica para un huésped mamífero cuando es administrada al huésped mamífero . La purificación de la OspA de Borrel i a burgdorferi recombinante puede ser mediante: la lisis de la célula del organismo huésped para obtener células Usadas; el tratamiento de las células usadas con un surfactante que solubiliza selectivamente la lipoproteína OspA de Borreli a burgdorferi de preferencia para proteínas bacterianas o de otro tipo, y la cual es capaz de afectar la separación de fases de una fase detergente bajo condiciones de temperatura leve de aproximadamente 35° a 40°C, para obtener células usadas, tratadas; la separación mediante separación de fases de las células usadas, tratadas, dentro de una fase detergente que contiene la lipoproteína OspA de Borreli a burgdorferi , solubilizada, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas y otras proteínas y una fase sólida que contiene el residuo celular; la separación de la fase detergente de las fases sólida y acuosa; el poner en contacto la fase detergente con una columna de cromatografía bajo condiciones que dan como resultado el enlace de las proteínas diferentes de la lipoproteína OspA de Borreli a burgdorferi a la columna de cromatografía; y la recuperación del flujo de lado a lado proveniente de la primera columna de cromatografía que contiene la lipoproteína OspA de Borrel i a burgdorferi liberada de las proteínas enlazadas.

La purificación de la OspA de Borreli a burgdorferi recombinante puede ser mediante la puesta en contacto de la fase detergente con la columna de cromatografía a un pH de aproximadamente 7.5. Alternativamente, la OspA puede ser obtenida mediante un proceso para la producción de una lipoproteína OspA recombinante, aislada y purificada, codificada por un gen de OspA de Borreli a de tipo silvestre, de longitud completa, que comprende: el efectuar la inducción de la lipoproteína OspA de Borrel i a a partir de un organismo huésped transformado con un plásmido que contiene el gen OspA, la lisis de las células del organismo huésped, el tratamiento de las células lisadas con un surfactante que solubiliza selectivamente la lipoproteína OspA de Borrel i a , de preferencia a proteínas bacterianas y otras proteínas, y el cual es capaz de efectuar la separación de fases de una fase detergente bajo condiciones leves, el efectuar la separación de fases en una fase detergente que contiene la lipoproteína OspA de Borreli a , solubilizada, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas y otras proteínas, y una fase sólida que contiene el residuo celular, la separación de la fase detergente de la fase sólida y la fase acuosa, y la purificación de la fase detergente libre de proteínas diferentes de la lipoproteína OspA de Borrel i a y de lipopolisacárido mediante: (a) poner en contacto la fase detergente con una primera columna de cromatografía bajo condiciones que dan como resultado el enlace de las proteínas diferentes de la lipoproteína OspA de Borrel i a a la primera columna de cromatografía, (b) la recuperación del flujo de lado a lado proveniente de la primera columna de cromatografía, que contiene la lipoproteína OspA de Borreli a , liberada de las proteínas enlazadas, (c) el poner en contacto el flujo de lado a lado de la primera columna de cromatografía con una segunda columna de cromatografía bajo condiciones que dan como resultado el enlace de la lipoproteína OspA de Borreli a a la segunda columna de cromatografía, de preferencia a cualesquiera proteínas contaminantes residuales y lipopolisacárido que fluyen de lado a lado de la segunda columna de cromatografía, (d) el poner en contacto la segunda columna de cromatografía con un eluyente bajo condiciones para eluir la lipoproteína OspA de Borreli a , enlazada, proveniente de la segunda columna de cromatografía, y (e) el recolectar el eluido que contiene la OspA de Borrel i a proveniente de la segunda cromatografía. Adicionalmente, en este proceso la puesta en contacto del flujo de lado a lado con la segunda columna de cromatografía, puede ser efectuada a un pH por debajo de aproximadamente 5.7 y efectivo para enlazar la lipoproteina OspA de Borrel i a a la segunda columna de cromatografía con un eluyente, que se efectúa a un pH de hasta y por arriba de aproximadamente 5.7, y efectiva para eluir la lipoproteína OspA de Borrel i a , enlazada a partir de la segunda columna de cromatografía. Y, adicionalmente todavía en este proceso la puesta en contacto de la fase detergente con la primera columna de cromatografía puede ser efectuada a un pH de aproximadamente 7.5, el contacto del flujo de lado a lado con la segunda columna de cromatografía se puede efectuar a un pH de aproximadamente 4.2, y la puesta en contacto de la segunda columna de cromatografía con un eluyente se puede efectuar a un pH de aproximadamente 5.7. La invención comprende además los anticuerpos producidos por las composiciones y métodos . Sorprendentemente, no se observa interferencia de eficacia significativa a partir de las composiciones y métodos inventivos. Otros antígenos de Borreli a , para el uso en las composiciones, métodos y procesos anteriormente mencionados además de o como alternativa a OspA, son entre otros, como se discuten en las solicitudes y documentos citados en la presente, descritos bajo 'Solicitudes Relacionadas", incluyendo los métodos para preparar aquellos otros antígenos. Otros objetivos y modalidades se describen en o son obvias a partir de la siguiente Descripción Detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En la Descripción Detallada subsecuente, se hace referencia a las siguientes Figuras anexas, incorporadas en la presente por referencia, en donde: La Figura 1 muestra los oligonucleótidos de PCR utilizados en la clonación del gen OspA de longitud completa B-31, ACA1 e Ip90 de B . burgdorferi dentro del vector de expresión pET9a; La Figura 2 ilustra la estrategia de clonación para la inserción del gen OspA de longitud completa dentro del vector de expresión pET9a para colocar el gen OspA bajo el control del promotor T7 0 10, para formar pOAl a partir del gen de B31, pOA9 a partir del gen ACA1 y pOAlO a partir del gen Ip90; La Figura 3 es un mapa de restricción predicho del plásmido pOAl; La Figura 4 muestra los resultados de diversas digestiones de restricción del plásmido pOAl, demostrando que todos los sitios predichos están presentes (M = marcadores (ADN de 0X 174 digerido con Hae III); B = Bam Hl; E = Eco Rl; H = Hind III; N = Nde I) ; La Figura 5 muestra los nucleótidos de PCR utilizados en la clonación del gen OspA de longitud completa de B-31, ACA1 e Ip90 de B . burgdorferi dentro del vector de expresión pCMBl; La Figura 6 ilustra la estrategia de clonación para la inserción del gen OspA de longitud completa dentro del vector de expresión pCMBl, para colocar el gen OspA bajo el control del promotor Tre, para formar pOA5 a partir del gen B31, pOA7 a partir del gen ACA1 y pOA8 a partir del gen Ip90; Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran un curso en el tiempo de la inducción con ITPG de OspA en dos cepas huésped que contienen pOAl (Figura 7A) , y una cepa huésped que contiene pOA5 (Figura 7B) y pOA6 (Figura 7C) ; Las Figuras 8A, 8B y 8C son diagramas de flujo que muestran, respectivamente, el desarrollo y la lisis celulares, la extracción con detergente y los pasos de purificación involucrados en la producción y purificación del OspA de longitud completa, recombinante, proveniente de E . col i , de acuerdo con una modalidad de la invención; y La Figura 9 ilustra la producción de los plásmidos pCMBl y pCMB2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se discute anteriormente, la invención proporciona composiciones que contienen antígeno de Borreli a burgdorferi , especialmente para el uso en animales domésticos tales como perros, cachorros, gatos, gatitos y caballos y similares. La composición son preferentemente composiciones en 'coctel" o multivalentes. Es decir, las composiciones contienen preferentemente antígenos adicionales u Otros" antígenos de otros patógenos. El antígeno de Borreli a burgdorferi puede ser un epítope de interés de un antígeno; y, el antígeno es preferentemente OspA. El OspA es más preferentemente el producto de expresión de un recombinante, tal como E . coli . El OspA es preferentemente lipidado y de este modo, más preferentemente, el OspA es un OspA recombinante el cual está lipidado. El antígeno de Borreli a burgdorferi , por ejemplo, OspA, puede ser obtenido mediante cualquier método adecuado, tal como mediante el aislamiento a partir de cultivos de Borreli a burgdorferi ; o, preferentemente el OspA lipidado recombinante puede ser obtenido mediante los métodos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,582,990 y 5,523,089 y WO93/08299 incorporadas por referencia en la presente. Respecto a los antígenos de Borreli a burgdorferi y a los métodos para la preparación de los mismos, útiles en la práctica de esta invención, se hace también referencia a los documentos citados bajo las 'Solicitudes Relacionadas" y los documentos citados en éstas . El procedimiento de administración para las composiciones de la invención tales como composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o composiciones terapéuticas, que incluyen composiciones multivalentes, 'coctel" o en combinación, puede ser vía una ruta parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea) . Tal administración hace posible una respuesta inmune sistémica. Más en general, las composiciones antigénicas inventivas, inmunológicas o de antígeno -de Borreli a burgdorferi de vacuna, se pueden preparar de acuerdo con las técnicas estándares bien conocidas por aquellos de experiencia en la técnica farmacéutica o veterinaria. Tales composiciones pueden ser administradas en dosis y mediante técnicas bien conocidas por aquellos de experiencia en las técnicas médicas o veterinarias, tomando en consideración factores tales como la edad, el sexo, el peso, la especie y la condición del paciente particular, y la ruta de administración.. El antígeno de Borreli a burgdorferi puede ser administrado solo, o puede ser coadministrado o secuencialmente administrado con 'otro(s)" antígeno (s) u Otras" composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna con lo cual se proporcionan composiciones de 'coctel" o en combinación o administraciones de la invención, y los métodos que emplean las mismas. El o los ' otros' antígenos u 'otras' composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna pueden ser un epítope o epítopes de interés de tal o tales antígenos, o las composiciones que contienen un epítope o epítopes de interés de tal o tales antígenos . Tales Otras" composiciones pueden incluir antígenos aislados y/o purificados provenientes de cualquier patógeno animal tal como un antígeno de un patógeno animal domesticado, por ejemplo, cualquier antígeno de un canino, felino, equino o patógeno similar, por ejemplo, uno de: un antígeno o antígenos de un patógeno canino tal como la rabia, por ejemplo, la glucoproteína G de la rabia, el antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, CDV HA y/o las glucoproteínas F, el antígeno tipo 2 del adenovirus canino, antígeno de coronavirus canino, antígeno de parainfluenza canina, antígeno de parvovirus canino, antígeno Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorragiae, cualquier combinación de estos antígenos; o un antígeno o antígenos de un patógeno felino tal como los antígenos del virus de la leucemia felina, antígenos del virus de la inmunodeficiencia felina, rabia, antígeno del herpesvirus felino, o cualquier combinación de estos antígenos; o un antígeno de un patógeno equino, por ejemplo, uno de influenza equina y/o un virus del herpes equino y/o antígeno de la rabia. Estos Otros" antígenos pueden ser provenientes de la expresión de tales antígenos mediante un recombinante, por ejemplo, poxvirus u otro sistema vector in vi tro ; o , tales Otras" composiciones pueden incluir un recombinante, por ejemplo, un poxvirus o varios poxvirus que expresan el o los antígenos i n vi vo . Los métodos para la elaboración de un vector o recombinante para la expresión de OspA o un epítope de interés del mismo, o de Otro", antígeno o un epítope de interés del mismo, para el uso en esta invención, pueden ser mediante o análogos a los métodos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, Paoletti, 'Aplicaciones de vectores de pox virus a vacunación: Una actualización" PNAS USA 93:11349-11353, Octubre 1996, Moss, 'poxvirus manipulados mediante ingeniería genética para la expresión génica recombinante, vacunación y seguridad" PNAS USA 93:11341-11348, Octubre 1996, Smith y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,745,051 (baculovirus recombinante), Richardson, C.D. 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Nuevamente, los ingredientes y la manera (secuencial o coadministración) de administración, asi como las dosis pueden ser determinadas tomando en consideración factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del paciente particular, y la ruta de administración. A este respecto, se puede hacer mención de las Patentes Norteamericanas Nos. 5,503,834, 5,529,780, 5,482,713, y 5,494,807 las cuales incluyen una descripción de los antígenos de patógenos caninos, felinos y equinos, recombinantes que expresan esos antígenos, y composiciones que contienen esos recombinantes, así como de la solicitud copendiente No. de serie 08/413,118 presentada el 29 de Marzo de 1995, dirigida a secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de antígenos del herpesvirus canino y recombinantes de los mismos, y usos de los mismos; las solicitudes Nos. de Serie 08/224,657, presentada el 6 de Abril de 1994 y 08/416,616 presentada el 5 de Abril de 1995, dirigidas a los recombinantes del virus del moquillo canino-poxvirus (CDV) y composiciones y métodos que emplean esos recombinantes; solicitud no. de Serie 08/675,556, presentada el 3 de Julio de 1996, dirigida a casetes de expresión, promotores y recombinantes, incluyendo los recombinantes de adenovirus caninos para aplicaciones veterinarias; solicitud No. de serie 08/746,668 presentada el 14 de Noviembre de 1996 la cual incluye los recombinantes que expresan los epítopes de interés del virus de la inmunodeficiencia felina; y solicitud No. de Serie 08/486,969, presentada el 7 de Junio de 1995 dirigida a las composiciones recombinantes de poxvirus -rabia, incluyendo las composiciones en combinación y usos de las mismas. Cada una de esas patentes y solicitudes es incorporada por referencia en la presente, especialmente en lo que respecta a los recombinantes, los productos de expresión de los mismos y el ácido nucleico codificante, descrito en estas solicitudes pueden ser empleados en composiciones de 'coctel", multivalentes o en combinación, o administraciones o recombinantes de las mismas de la presente invención. Por ejemplo, el adenovirus del moquillo canino tipo 2-coronavirus-parainfluenza-parvovirusXL, Virus Vivo Modificado (producto código 1491.21) es un producto. Podría ser altamente ventajoso el incluir un antígeno de Borreli a burgdorferi , por ejemplo, OspA, con este producto en un envase unitario simple, por ejemplo, como una composición en combinación; o administrar a un mamífero huésped adecuado, por ejemplo, un canino, dentro del curso de una visita única a un veterinario, el OACPiPXL y el antígeno de Borreli a burgdorferi . Los ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones líquidas para administración en orificios, tales como por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, etc., tales como suspensiones, jarabes o elíxires; y, preparaciones para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular, o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable) tales como suspensiones o emulsiones estériles. En tales composiciones el o los antígenos pueden estar en mezcla con un portador adecuado, diluyente o excipiente tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones pueden también ser liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores del pH, adyuvantes, aditivos aumentadores de la gelificación o de la viscosidad, conservadores, agentes saborizantes, colores y similares, dependiendo de la ruta de administración y de la preparación deseada. Los textos estándares, tales como 'REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edición, 1985, incorporada por referencia en la presente, pueden ser consultados para preparar las preparaciones adecuadas, sin experimentación indebida. Las dosis adecuadas pueden también estar basadas en los ejemplos siguientes. Las dosis caninas típicas del antígeno de Borrel i a burgdorferi pueden ser de 5 a 25 µg/ml, por ejemplo de 13 µg/ml de OspA, y las dosis equinas típicas del antígeno de Borreli a burgdorferi pueden ser de 15 a 150 µg/dosis, por ejemplo, 100 µg/dosis de OspA sola, 30 µg/dosis de OspA sola, o 30 µg/dosis de OspA en combinación con otro antígeno tal como de la rabia (Imrab es una vacuna contra la rabia comercialmente disponible, con la cual puede ser combinado el antígeno de Borreli a burgdorferi ) .

Como se mencionó anteriormente, las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna pueden contener típicamente un adyuvante y una cantidad del o de los antígenos para promover la respuesta deseada. En ciertas aplicaciones, el alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) es un adyuvante típico. La saponina y su componente purificado Quil A, el adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes, son utilizados en aplicaciones veterinarias. No obstante, OspA recombinante lipidada puede promover una respuesta protectora sin ninguna necesidad de agregar un adyuvante. Las preparaciones químicamente definidas tales como dipéptido de muramilo, monofosforil-lípido A, conjugados fosfolipídicos tales como aquellos descritos por Goodman-Sni tkoff y colaboradores J. Immunol . 147:410-415 (1991) e incorporada por referencia en la presente, el encapsulamiento de la proteína dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller y colaboradores J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992) e incorporada por referencia en la presente, y el encapsulamiento de la proteína en vesículas lipídicas tales como las vesículas lipídicas NovasomeMR (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH) pueden también ser incluidas. La composición de la invención puede ser envasada en una forma de dosis única para la inmunización mediante administración parenteral (por ejemplo, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o administración en orificios, por ejemplo, perlingual (por ejemplo oral), intragástrica, mucosal incluyendo intraoral, intra-anal, intravaginal y administraciones similares. Y nuevamente, la dosis efectiva y la ruta de administración son determinadas por la naturaleza de la composición, y por factores conocidos, tales como la camada o la especie, la edad, el sexo, el peso, la condición y la naturaleza del huésped, así como la LD50 y otros procedimientos de selección que son conocidos, y que no requieren experimentación indebida. Las dosis pueden estar en el intervalo en general de unos pocos a algunos cientos de microgramos, por ejemplo de 5 a 500 µg de cada antígeno. Otros portadores o diluyentes adecuados pueden ser agua o una solución salina amortiguada, con o sin un conservador. El o los antígenos pueden ser liofilizados para la resuspensión al tiempo de la administración, o pueden estar en solución.

El portador puede también ser un sistema de liberación retardada, polimérico. Los polímeros sintéticos con particularmente útiles en la formulación de una composición que tiene liberación controlada. Un ejemplo temprano de esto fue la polimerización del metacrilato de metilo dentro de esferas que tienen diámetros menores de una miera, para formar las denominadas nanopartículas, reportadas por Kreuter, J., Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbro (Ed) . CRC Press, p. 125-148. El microencapsulamiento ha sido aplicado a la inyección de productos farmacéuticos microencapsulados, para dar una liberación controlada. Un número de factores contribuyen a la selección de un polímero particular para el microencapsulamiento. La reproducibilidad de la síntesis del polímero y del proceso de microencapsulamiento, el costo de los materiales de microencapsulamiento y el proceso, el perfil toxicológico, los requerimientos para la cinética de liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos, son todos factores que deben ser considerados. Los ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos, poliéteres, poliuretanos, poliortoésteres y poliamidas, particularmente aquellos que son biodegradables. Una elección frecuente de un portador para los productos farmacéuticos y más recientemente para antígenos es el poli- (d, 1-láctido-co-glicólido) (PLGA) . Este es un poliéster biodegradable que tiene una larga historia de uso médico en suturas erosionables, placas óseas y otras prótesis temporales donde éste no ha mostrado ninguna toxicidad. Una amplia variedad de productos farmacéuticos incluyendo péptidos y antígenos han sido formulados en microcápsulas de PLGA. Un cuerpo de datos se ha acumulado sobre la adaptación de PLGA para la liberación controlada del antígeno, por ejemplo, como es revisado por Eldridge, J.H. y colaboradores Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146:59-66. El atrapamiento de antígenos en microesferas de PLGA de 1 a 10 mieras de diámetro, ha mostrado tener un efecto adyuvante notable cuando se administran oralmente. El proceso de microencapsulamiento con PLGA utiliza una separación de fases de una emulsión agua en aceite. El compuesto de interés es preparado como una solución acuosa y el PLGA se disuelve en un solvente orgánico adecuado, tal como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas dos soluciones no miscibles son co-emulsificadas mediante agitación a alta velocidad. Se agrega luego un no solvente para el polímero, provocando la precipitación del polímero alrededor de las gotitas acuosas para formar microcápsulas embriónicas. Las microcápsulas son recolectadas y estabilizadas con uno de una suerte de agentes (alcohol polivinílico • (PVA) , gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP) , metilcelulosa) y el solvente es eliminado ya sea mediante secado a vacío o extracción de solvente. El microencapsulamiento, el sistema de liberación retardada, y las técnicas de encapsulamiento, por ejemplo, como se discuten anteriormente, pueden tener un uso cuando se desea la presentación retardada de uno o más antígenos en una composición en combinación al sistema inmune. De este modo, son consideradas también las composiciones líquidas, incluyendo mediante inyección u otra administración, así como sólidas, incluyendo líquido que contiene sólido, líquido, y gel (incluyendo 'cápsulas de gel") . Además, las composiciones pueden ser utilizadas directamente para estimular una respuesta inmune de animales. Esta respuesta inmune puede ser una respuesta de anticuerpo; y por lo tanto, a partir de esos anticuerpos, mediante técnicas bien conocidas en la materia, los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados y, esos anticuerpos monoclonales pueden ser empleados en ensayos de enlace de anticuerpo bien conocidos, equipos de diagnóstico o pruebas para determinar la presencia o ausencia de antígenos particulares. Esos anticuerpos monoclonales pueden también ser empleados en cromatografía de inmunoadsorción para recuperar o aislar antígenos. Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales y para usos de anticuerpos monoclonales son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Éstos pueden ser utilizados en métodos de diagnóstico, equipos, pruebas o ensayos, así como recuperar materiales mediante cromatografía de inmunoadsorción o mediante inmunoprecipitación . Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas producidas mediante células de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal reacciona con un determinante antigénico simple y proporciona mayor especificidad que un anticuerpo convencional, derivado del suero. Además, la selección de un gran número de anticuerpos monoclonales hace posible el seleccionar un anticuerpo individual con especificidad deseada, avidez e isotipo deseados. Las líneas de células hibridomas proporcionan una fuente constante y barata de anticuerpos químicamente idénticos y las preparaciones de tales anticuerpos pueden ser fácilmente estandarizadas. Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, Koprowski, H. y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,196,265, expedida el 1 de Abril de 1989, incorporada por referencia en la presente. Los usos de anticuerpos monoclonales son conocidos. Un uso tal es en los métodos de diagnóstico, por ejemplo, David, G. y Greene, H. Patente Norteamericana No. 4,376,110, expedida el 8 de Marzo de 1983, incorporada por referencia en la presente. Los anticuerpos monoclonales han sido utilizados también para recuperar materiales mediante cromatografía de inmunoadsorción, por ejemplo, Milstein, C. 1980, Scientific American 243:66, 70 incorporada por referencia en la presente. En consecuencia, las composiciones de la invención tienen varias utilidades establecidas en la presente. Otras utilidades también existen para modalidades de la invención. Un mejor entendimiento de la presente invención y de sus muchas ventajas será tomado a partir de' los siguientes ejemplos, dados a manera de ilustración.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - PREPARACIÓN DE OspA RECOMBINANTE Se produjo OspA recombinante como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,523,089, y 5,852,990, WO93/08299, PCT/US 92/08697 y Erdile y colaboradores 1993. En resumen: El gen OspA clonado de la cepa B31 de B . burgdorferi (como se describe en la Patente Internacional WO 90/0441 anteriormente mencionada) (región N-terminal: SEQ ID NO: 1, región C-terminal: SEQ ID NO: 2. El resto de la secuencia se muestra en la Patente Internacional WO 90/04411) se utilizó como una plantilla (pTRH44; Howe y colaboradores, 1986, Infection and Immunity, 54:207-212, '(Howe y colaboradores 1986") y los cebadores oligonucleotídicos especialmente diseñados (PET-IN [COI] (SEQ ID NO: 3) y PET-273C [C03] (SEQ ID NO: 4)) se utilizaron en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar la totalidad del gen OspA de tipo silvestre, como se muestra en la Figura 1. Similarmente, el gen OspA clonado de las cepas ACA1 e Ip90 de B . burgdorferi (como se describe en Johnson y colaboradores, 1992, Infect. Immun. 60:1845-1853 - región N-terminal de ACA1 e Ip90 es: SEQ ID NO: 1; región C-terminal de ACA1 : SEQ ID NO: 5; región C-terminal de Ip90: SEQ ID NO: 6) se utilizó en una reacción de PCR con pares de cebadores oligonucleotídicos (a) OspN2 (SEQ ID NO: 7) y BZ1 (SEQ ID NO: 8) y (b) OspN 2 (SEQ ID NO: 7) y pK4 (SEQ ID NO: 9), respectivamente en los extremos N- y C-terminales, para formar los fragmentos amplificados apropiados, como se muestra en la Figura 1. Los métodos básicos para la amplificación de una secuencia objetivo de ácido nucleico, deseada utilizando los cebadores oligonucleotídicos son en general conocidos en la técnica y se describen en las Patentes Norteamericanas No. 4,683,202 y 4,800,159. Se puede hacer referencia a tales patentes para la descripción de las técnica que van a ser empleadas. Los fragmentos resultantes fueron clonados dentro de los sitios Ndel y Bam Hl del vector plasmídico pET9, para colocar el gen OspA bajo el control de un promotor T7 y las señales de inicio de la traducción, eficientes provenientes del bacteriófago T7, como se observa en la figura 2. Los plásmidos pET9 y pLysS, los huéspedes bacterianos para la clonación, los medios de desarrollo y los métodos utilizados para dirigir la expresión de los genes clonados por la ARN-polimerasa T7, han sido previamente descritos en la Patente Norteamericana No. 4,952,496 y se puede hacer referencia a ésta para tal descripción. Mientras que un sistema promotor T7 es un sistema de expresión preferido en la presente invención, la expresión del gen OspA de longitud completa puede ser lograda utilizando otros sistemas de expresión compatibles con el organismo huésped. El vector de expresión pET9 fue utilizado ya que éste tiene un gen kan como su marcador selectivo en vez de un gen bla . En consecuencia, no se utiliza ampicilina durante el desarrollo celular y de aquí que no existe posibilidad de que un conjugado inmunogénico de a piciloil/proteína objetivo OspA, pueda ser formado. Tales conjugados se cree que son determinantes antigénicos mayores en alergia a la penicilina y pueden complicar los estudios inmunológicos.

Los plásmidos resultantes han sido designados pOAl, pOA9 y pOAlO, conteniendo los genes OspA provenientes de las cepas B31 ACA1 e Ip90 de B . burgdorferi , respectivamente. El plásmido pOAl es casi idéntico al plásmido pET9-pre0spA descrito por Dunn y colaboradores, 1990, Protein Expression and Purification, 1:159-168, excepto que los oligonucleótidos utilizados para la reacción de PCR fueron diferentes en los dos casos. Un mapa de restricción predicho para el plásmido pOAl se muestra en la Figura 3, mientras que la Figura 4 contiene los resultados de diversas digestiones de restricción del plásmido pOAl, demostrando que todos los sitios predichos están presentes. Para la producción de proteínas, los plásmidos pOAl, pOA9 y pOAlO fueron transformados dentro de la cepa de expresión de E . coli , preferentemente, la cepa de E . col i es la cepa de expresión T7 de E . col i , como se describe en la Patente Norteamericana anteriormente mencionada No. 4,952,496. Específicamente, la cepa puede ser la cepa de expresión BL21(DE3) (pLysS) de E . col i , como se describe anteriormente, o E . col i cepa HMS174(DE3) (pLysS). El huésped transformado fue desarrollado y la protéína fue inducida con isopropil-ß-D-tiogalactósido (IPTG) . Un curso de tiempo de inducción de OspA proveniente del plásmido pOAl , después de la adición de IPTG, se muestra en la Figura 7A. Se obtuvieron resultados idénticos a aquellos para pOAl utilizando pOA9 y pOAlO. La síntesis de la proteína OspA proveniente del plásmido pOAl cesó aproximadamente una hora después de la inducción, implicando alguna toxicidad de la proteína a JE. coli . No obstante, la producción de proteína fue a un nivel aceptable de aproximadamente 10 mg/l de cultivo celular. Además de la provisión de los plásmidos pOAl, pOA9 y pOAlO y la expresión de la lipoproteína OspA en E. col i utilizando el promotor T7, han sido construidos los plásmidos adicionales que contienen el gen OspA de B31, ACA1 e Ip90, de longitud completa, bajo un promotor diferente y la expresión de la lipoproteína ha sido lograda. A este respecto, los plásmidos pOA5 y pOA6 fueron preparados mediante la clonación del fragmento amplificado por PCR de OspA proveniente de la cepa B31 dentro de los sitios Ncol y Bam Hl de los vectores de expresión plasmídicos pCMBl y pCMB2, mientras que los plásmidos pOA7 y pOA8 fueron preparados mediante la clonación de un fragmento amplificado por PCR de OspA proveniente de la cepa ACAl (pOA7) y proveniente de la cepa Ip90 (pOA8) dentro de los sitios Ncol y Bam Hl del vector de expresión pCMBl (ver Figura 6 para pOA5, pOA7 y pOA8) . Como se observa en la figura 5, los genes OspA clonados de las cepas B31, ACAl e Ip90 de B . burgdorferi fueron amplificados mediante la reacción de PCR utilizando los pares de cebadores oligonucleotídicos (a) PK3 (SEQ ID NO: 10) y C03 (SEQ ID NO: 3), (b) PK3 y (SEQ ID NO: 10) y BZ1 (SEQ ID NO: 8), y (c) PK3 (SEQ ID NO: 10) y PK4 (SEQ ID NO: 9) , respectivamente en los extremos N- y C-terminales de los genes respectivos para formar los fragmentos amplificados, apropiados. Los plásmidos pCMBl y pCMB2 fueron construidos mediante digestión del plásmido pTrc99a (Pharmacia Catalogo No. 27-5007-01) y un gen de resistencia a la kanamicina (Pharmacia Catalogo No. 27-4897-01), aislando los fragmentos resultantes conjuntamente (Figura 9) . El plásmido pTrc99a, de 4197 pares de bases, contiene un promotor fuerte adyacente a un sitio de clonación múltiple, seguido •por una señal de terminación de la transcripción, fuerte (rrnB). La expresión del gen objetivo utiliza la ARN-poli erasa de la célula huésped, permitiendo su uso en una amplía variedad de cepas de E . coli . La expresión es fuertemente controlada por el gen supresor de la lactosa (laclq) incluido sobre el vector. La proteína represora de la lactosa previene la transcripción del gen objetivo en ausencia del inductor IPTG. El gen de resistencia a la kanamicina es un fragmento de ADN de doble hebra, lineal, de 1282 pares de bases que contiene el gen proveniente del transposón Tn903 flanqueado por los sitios de la enzima de restricción y que codifica para la enzima aminoglucósido-3' -fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a la kanamicina y a la neomicina. pCMBl, de 5.5 kb, contiene el gen de resistencia a la kanamicina orientado tal que su transcripción es en la misma dirección que aquella que se origina en el promotor Tre mientras que pCMB2 contiene el gen de resistencia a la kanamicina orientado en la dirección opuesta, tal que la transcripción del gen de resistencia y el gen de interés bajo el control del promotor Tre dan como resultado transcritos convergentes. Las digestiones con enzima de restricción de pCMBl y pCMB2 utilizando Smal, HindIII y BamHI+NcoI mostraron los fragmentos de tamaño exacto predichos.

Los plásmidos pOA5 y pOA6 fueron transformados dentro de la cepa de expresión de E . col i u otro organismo adecuado, preferentemente las células competentes DH5a. Los huéspedes transformados fueron desarrollados y la proteína fue inducida con IPTG. El curso de tiempo de la inducción con pOA5 (Figura 7B) fue similar a aquel para pOAl (Figura 7A) mientras que los niveles de OspA producidos por pOA6 (Figura 7C) fueron varias veces menores. Se obtuvieron resultados idénticos a aquellos para pOA5 utilizando pOA7 y pOA8. Los pasos involucrados en la producción y purificación de OspA de longitud completa recombinante, se muestran esquemáticamente en las Figuras 8A a la 8C. Las condiciones específicas del proceso son indicadas en la presente como se describe en los ejemplos más adelante. Después del paso de desarrollo celular e inducción de la proteína (Figura 8A) , las células se sujetan a lisis por congelamiento y a un descongelamiento. El lisado es tratado con un detergente el cual es selectivo para la solubilización de la proteína OspA, de preferencia para otras proteínas bacterianas presentes en el lisado. Se encontró que el Tritón X-114 solubiliza selectivamente una proteína de 31 kilodaltones , la cual se mostró que es OspA mediante inmunomanchado . La invención está limitada al empleo de Tritón X-114, pero claramente incluye también otros materiales que muestran una solubilidad selectiva similar para OspA, así como la propiedad de separación de fases bajo condiciones leves a las que se hace referencia más adelante. Después de la adición del detergente selectivo, la mezcla es calentada a una elevación de temperatura leve de aproximadamente 35° a 40°C, tiempo en el cual la solución se vuelve turbia conforme ocurre la separación de fases. La centrifugación de la mezcla turbia da como resultado la separación de la mezcla en tres fases, a saber una fase detergente que contiene 50% o más de la proteína OspA y una pequeña cantidad (aproximadamente 5% en peso) de las proteínas bacterianas, una fase acuosa que contiene el balance de las proteínas bacterianas y una pella sólida del residuo celular. La fase detergente es separada de la fase acuosa y de la pella sólida. Mediante los pasos de tratamiento con un detergente selectivo para OspA y la separación de fases subsecuente de la fase detergente, se logra la separación sustancialmente completa de OspA a partir de las proteínas bacterianas. Permanece la purificación final de OspA a partir de la proteína bacteriana residual presente en la fase detergente. La purificación final de la proteína efectuada sobre una columna de cromatografía selectiva para el enlace de las proteínas bacterianas pero no OspA, específicamente DEAE-Sephacel , DEA-Sep arose u otro material de cromatografía equivalente. La fase detergente es cargada sobre la columna y el flujo de lado a lado, el cual contiene toda la proteína OspA purificada, se recolecta. La fracción enlazada contiene todas las proteínas bacterianas en la fase detergente. Después de la purificación adicional utilizando S-Sepharose o una columna cromatográfica equivalente, además de estar libre de las proteínas contaminantes, la fracción que fluye de lado a lado está sustancialmente libre del liposacárido (LPS) como es indicado por la falta de pirogenicidad, como se determina por el lisado de amebocitos de límulo (LAL) . La solución altamente purificada de OspA puede ser liofilizada o de otro modo procesada. Más específicamente, el plásmido pOAl fue preparado como se describe anteriormente y se utiliza para transformar las cepas de E . col i BL21(DE3) (pLysS) (Poal) y HMS174 (DE3) (pLysS) (pOAl) . El E . col i transformado fue inoculado dentro de medio LB con 25 µg/ml de sulfato de kanamicina y 25 µg/ml de cloranfenicol a una tasa de 12 ml de cultivo por litro preparado. El cultivo fue desarrollado toda la noche en un agitador de matraces aproximadamente a 37°C. A la mañana siguiente, 10 ml del medio de cultivo de toda la noche se transfirieron a 1 litro de medio LB que contenía 25 µg/ml de sulfato de kanamicina y el cultivo se desarrolló en un matraz con agitación aproximadamente a 37°C a un nivel de densidad óptica = 0.6 (aunque puede ser efectuado el desarrollo hasta DO = 1.5), en aproximadamente 3 horas . Al medio de cultivo se agregó isopropil tio-galactósido (IPTG) a una concentración final de 0.5 mM y el medio de cultivo se desarrolló por dos horas adicionales aproximadamente a 37°C. Al final de este periodo, el medio de cultivo se enfrió a aproximadamente 4°C y se centrifugó a 10,000 xg por 10 minutos. El sobrenadante se desechó mientras que la pella celular se resuspendía en 1/10 del volumen de PBS. La suspensión celular se congeló en nitrógeno líquido y se puede almacenar indefinidamente a -70 °C, si así se desea. Después del congelamiento de la suspensión celular, las células se descongelaron hasta la temperatura ambiente (aproximadamente 20° a 25°C) lo cual provoca que las células se lisen. La ADNasa I fue agregada al material descongelado a una concentración de 1 µg/ml y la mezcla se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente, lo cual dio como resultado una disminución en la viscosidad del material . El material incubado se enfrió sobre hielo hasta una temperatura por debajo de 10°C y se agregó Tritón X-114 como una solución de reserva al 10% en peso, hasta una concentración final de 0.3 a 1% en peso. La mezcla se mantuvo sobre hielo por 20 minutos. La mezcla enfriada fue enseguida calentada aproximadamente a 37°C y se mantuvo a esa temperatura por 10 minutos. - La solución se volvió muy turbia conforme ocurrió la separación de las fases. La mezcla turbia fue luego centrifugada a aproximadamente 20°C por 10 minutos a 12,000 xg, lo cual provocó la separación de la mezcla en una fase detergente inferior, una fase acuosa clara superior y una pella o botón sólido. La fase detergente se separó de las otras dos fases y se enfrió a 4°C, sin perturbar la pella. El amortiguador A, a saber Tris 50 mM, pH 7.5, EDTA 2 mM y cloruro de sodio 10 mM, se agregó a la fase detergente enfriada para reconstituir nuevamente hasta un tercio del volumen original. La solución resultante puede ser congelada y almacenada para el procesamiento posterior como se describe más adelante o puede ser inmediatamente sujeta a tal procesamiento. Una columna CL-6B de DEAE-Sepharose se preparó en un volumen de 1 ml/10 ml de fase detergente y se lavó con dos volúmenes de Amortiguador C, a saber Tris 50 mM pH 7.5, EDTA 2 mM, NaCl 1 M, 0.3% en peso de Tritón X-100, y luego con 4 volúmenes de Amortiguador B, a saber Tris 50 mM pH 7.5, EDTA 2 mM 0.3% en peso de Tritón X-100. La fase detergente fue luego cargada sobre la columna y el flujo de lado a lado que contenía la proteína OspA, se recolectó. La columna se lavó con un volumen de Amortiguador B y el flujo de lado a lado fue nuevamente recolectado. El flujo de lado a lado combinado fue una solución acuosa de OspA purificada, la cual puede ser congelada para el almacenamiento.

La columna puede ser liberada de las proteínas bacterianas para la reutilización mediante elución con dos volúmenes de Amortiguador C. La purificación adicional y final del flujo de lado a lado proveniente de la columna de DEAE-Sepharose por cromatografía sobre S-Sepharose de Flujo Rápido. El flujo de lado a lado proveniente de la columna de DEAE-Sepharose fue primeramente acidificado a pH 4.2 mediante adición de ácido cítrico 0.1 M. La columna de Flujo Rápido de S-Sepharose fue lavada extensamente con Amortiguador C, ajustada a pH 4.2 con ácido cítrico. La OspA altamente purificada fue eluida de la columna utilizando el amortiguador C, ajustado a pH 5.7 con ácido cítrico. El eluido fue inmediatamente ajustado a pH 7.5 mediante la adición de base de Tris 2 M. La solución acuosa de OspA altamente purificada, obtenida mediante los procedimientos de cromatografía, se analizó mediante geles teñidos con Coomasie y se confirmó que contenía OspA en forma altamente purificada. La pureza del producto producido por el procedimiento de cromatografía último fue mayor que aquella mediante el procedimiento de cromatografía previo, mostrando niveles muy bajos de endotoxina. Los plásmidos pOA5 y pOA6 fueron preparados como se describe anteriormente y utilizados para transformar E. col i cepa DH5a. El procedimiento de expresión de proteína empleado en el Ejemplo 1 fue repetido, y la expresión en el curso del tiempo de la lipoproteína OspA por pOA5 fue idéntica a aquella observada para pOAl mientras que la expresión de OspA por pOA6 se encontró que es varias veces menor que por pOA5 (Figuras 7B y 7C) . La purificación de la proteína OspA fue continuada en células que expresan pOA5, únicamente. La lipoproteína OspA de B31 producida por el sistema de expresión Tre de esta manera, fue purificada siguiendo el procedimiento idéntico a aquel descrito en el Ejemplo 1, con la excepción de que se agregó 0.1 mg/ml de lisozima al botón celular después de la cosecha, y las células se suspendieron por 30 minutos a temperatura ambiente antes del congelamiento . El flujo de lado a lado de la columna de DEAE-Sepharose contenía la lipoproteína OspA en una forma altamente purificada.

Los procedimientos para la producción del plásmido pOAl (promotor de pET) y pOA5 (promotor TRC) se repitieron, como se describe anteriormente, con el gen OspA clonado de la cepa asiática (Ip90) de B . burgdorferi , para formar los plásmidos pOA8 (promotor de Tre) y pOAlO (promotor de pET) que contenían el gen. Se realizó una digestión de restricción sobre estos plásmidos, la cual mostró que estaban presentes todos los sitios predichos. Los procedimientos fueron también repetidos con el gen OspA clonado de la cepa Europea (ACAl) de B . burgdorferi , para formar los plásmidos pOA7 (promotor de Tre) y pOA9 (promotor de pET) que contenían el gen. Se realizó una digestión de restricción sobre estos plásmidos, la cual mostró que estaban presentes todos los sitios predichos. El desarrollo y la inducción de las cepas de expresión pOA7 y pOA8 procedió idénticamente a la cepa pOA5, mientras que el desarrollo y la inducción de las cepas de expresión pOA9 y pOAlO procedieron idénticamente a la cepa pOAl . Las lipoproteínas OspA de ACAl e Ip90 obtenidas mediante estas operaciones, fueron purificadas idénticamente a la lipoproteína OspA de B31 (pOAl) como se describe anteriormente. El flujo de lado a lado de la columna de DEAE-Sepharose contenía la lipoproteína OspA en una forma altamente purificada. La OspA de B31, lipidada, recombinante, como se preparó anteriormente, se utilizó en las formulaciones de los siguientes ejemplos; no obstante, la OspA recombinante proveniente de otras cepas, como se describe en la presente, puede también ser utilizada, especialmente para animales domésticos en Europa y Asia.

EJEMPLO 2 - OspA RECOMBINANTE ES PROTECTORA EN PERROS Como se repite en Appel y colaboradores 1993, J. Infect. Dis. 167:651-64, los perros son susceptibles a la enfermedad de Lyme y existe un interés respecto a la posible transmisión de perros a humanos, con lo cual se hace deseable el vacunar a perros contra la enfermedad de Lyme ( Borrel i a burgdorferi ) .

Estudio de eficacia inicial: se utilizaron 14 perros en este estudio: 4 fueron vacunados con una bacterina a baja concentración (107), 4 fueron vacunados con una bacterina a alta concentración (109), 4 con una formulación de OspA adyuvada, y 2 fueron mantenidos como controles. Los ácaros infectados de manera natural fueron utilizados para retar a los perros. Todos los perros vacunados fueron completamente protegidos contra la infección y demostraron anticuerpos anti-B. burgdorferi , anti- OspA, mediante ELISA, así como anticuerpos que inhiben el desarrollo. Ambos controles fueron infectados .

Tabla 1 Estudio de la eficacia por reto en perros - Organización General Se recolectaron Ixodes dami nni mediante el arrastre de banderas blancas en áreas reforestadas del Condado de Westchester (Nueva York) , una semana antes del reto. Más del 60% de los ácaros recolectados de esta área son usualmente encontrados infectados . Los ácaros fueron almacenados por etapa y sexo y mantenidos a 98% de humedad relativa hasta el uso. Al tiempo de reto, 15 hembras adultas y 7 machos adultos fueron colocados en el flanco izquierdo sujeto de cada perro bajo una tapa de plástico la cual fue mantenida en su sitio por una semana con una cinta elástica. Se encontró que este tiempo era suficiente para obtener la engorda de los ácaros .

Recolección de muestra Se obtuvieron biopsias de piel (biopsias por punción de 4 mm) uno, dos y tres meses después del reto y en la necropsia, a partir del sitio de la adhesión del acaro, y se cultivaron para Borreli a burgdorferi .

Se recolectaron muestras sanguíneas semanalmente desde DO hasta el reto (D42), luego bisemanalmente hasta la necropsia. Los anticuerpos séricos fueron probados como se describe más adelante . La necropsia fue realizada aproximadamente a los 100 días (97 a 109 después del reto) . El material muscular y de la cápsula coyuntural se recolectaron de la babilla derecha e izquierda, del músculo frontal, del músculo posterior, del codo y del hombro y se cultivaron para Borrel i a burgdorferi .

Métodos de cultivo: Las muestras fueron trituradas en medio BSKII e inoculadas en tubos que contenían BSKII. Los tubos fueron incubados a 34°C por 6 semanas. Se seleccionaron muestras semanales de cada tubo para la evidencia de B . burgdorferi mediante microscopía de campo oscuro. Cualquier observación de B . burgdorferi fue calificada como positiva.

Métodos serológicos: ELISA RM: Este es un ELISA indirecto El antígeno es un sonicado lavado de B . burgdorferi cepa Bb212 aislada de ácaros en Francia. El conjugado es una IgG anti-canina, de cabra. El sustrato es tetrametilbencidina (TMB) . Los títulos son expresados como la densidad óptica diferencial a 450 nm y 620 nm a una dilución de 1/100 de la muestra de suero.

ELISA de Cornell: Esta prueba es realizada como se describe y como se hace referencia en Appel y colaboradores, supra . Esta es una ELISA indirecta. El antígeno es un lisado lavado de prensa francesa de B . burgdorferi de paso bajo aislada de I . dami ni recolectada del Condado de Westchester. El conjugado y el sustrato son los mismos que se describen anteriormente. Los títulos son expresados como unidades de ELISA cinéticas.

ELISA de OspA: Este ELISA indirecto es realizado utilizando una rOspA como el antígeno de placa. El conjugado es una IgG anti-canina, de cabra, conjugada a fosfatasa alcalina. El sustrato es el sustrato de fosfatasa signa 104 (NA 0200) . Los títulos son expresados como log10 de la dilución más alta dando una D.O. a 405 nm mayor de 0.1.

Ensayo de inhibición del desarrollo: Este ensayo es realizado como se describe por SADZIENE y colaboradores (J. Infect. Dis. 1993, 167 : 165-172) . Los sueros son diluidos en serie e incubados con organismos B . burgdorferi por 62 a 66 horas en presencia de dos unidades hemolíticas de complemento fresco de cobayo. Por este tiempo, el indicador de color rojo de fenol en el medio de crecimiento BSKII ha cambiado de rosa a amarillo en los pozos donde existen las espiroquetas. Tres pozos de cada lado de este punto son examinados por microscopía de campo oscuro para verificar la dilución donde las células viables han disminuido por 90%. Los títulos son expresados como logio de esta dilución.

RESULTADOS: Biopsias de piel: Los resultados son presentados en la Tabla 2. Se encontró que los perros control eran positivos en todas las muestras.

No se encontraron muestras positivas en ninguno de los 12 perros vacunados.

Tabla 2 * Cultivos examinados semanalmente por 6 semanas después de la inoculación ** Biopsia realizada en el reto Resultados de la necropsia - Cultivo: Estos resultados se detallan en la Tabla 3. Ambos perros control dieron cultivos positivos a partir de varios órganos sobre cualquier lado. La tasa de aislamiento no parece más frecuente sobre el lado izquierdo (lado del reto) que sobre el lado derecho.

Tabla 3 Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Resultados de cultivo proveniente de tejidos recolectados en la necropsia Tabla 3 (continuación) Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Resultados de cultivo proveniente de tejidos recolectados en la necropsia Serología: ELISA RM: Los resultados se presentan en la Tabla 4. La siguiente vacunación fue ya sea la vacuna de OspA o las bacterinas, la mayoría tuvieron un incremento notable en los títulos después de una inyección con un efecto de refuerzo significativo a partir de la segunda vacunación. Los siguientes títulos de reto de los perros vacunados permanecieron estables, pero en los perros control se incrementaron gradualmente en un periodo de dos meses .

Tabla 4 Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Serología por ELISA RM (títulos expresados como D.O. de suero a 1/100! e Tabla 4 (continuación) Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Serología por ELISA RM (títulos expresados como D.O. de suero a 1/100) cn co ELISA de Cornell: Los resultados se presentan en la Tabla 5. El incremento del anticuerpo patrón es casi idéntico a aquel obtenido con ELISA RM . Todos los vacunados muestran un incremento significativo en los títulos después de una inyección y un efecto de refuerzo de la segunda vacunación. Después del reto, los títulos permanecen estables. Los controles muestran un incremento gradual en los títulos en un periodo de 3 meses.

Tabla 5 Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Serología de ELISA RM (títulos expresados como unidades de ELISA K) o Tabla 5 (continuación) Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Serología de ELISA RM (títulos expresados como unidades de ELISA K) Tabla 5 (continuación) Vacuna contra la Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros Serología de ELISA RM (títulos expresados como unidades de ELISA K) NJ * DO, D21: Vacunación ** D42: Primer dia de reto ND: No realizado ELISA de OspA: Los resultados se presentan en la Tabla 6. Ambas bacterinas inducen niveles similares de anticuerpo anti-OspA. La vacuna de OspA induce una respuesta de anticuerpo homologa, significativa. El patrón es similar al ELISA del lisado total celular: incremento después de una inyección, refuerzo con segunda inyección. Inhibición del Desarrollo: los resultados se presentan en la Tabla 6. Ambas bacterinas y la vacuna de OspA indujeron altos niveles de anticuerpos que inhiben B . burgdorferi en todos los perros vacunados.

Tabla 6 Vacuna contra Enfermedad de Lyme Estudio de eficacia por reto en perros, de ELISA de OspA e inhibición del desarrollo (títulos expresados como logio de la dilución de punto final) Reto : El método de reto utilizado tiene una variedad de ventajas sobre otros métodos de reto publicados, basados en administración con aguja de B . burgdorferi . * El vector de reto y la ruta se parecen a la situación natural. * La infección puede ser trazada i n vi vo por biopsias de piel. Además, el reto (ácaros de origen Norteamericano) puede ser considerado heterólogo para las dos bacterinas (cepa Francesa) . La falta de signos clínicos es una limitación pero, como se describe en Appel y colaboradores, esto es totalmente esperado en perros de esta edad. Bajo estas condiciones, los resultados -por ejemplo: todos los controles infectados y ninguno de los 12 vacunados infectados- demuestran que ambas bacterinas a alta o baja concentración, y la vacuna de OspA protegieron completamente al perro contra el reto .

Serología: Las tres vacunas dieron resultados similares por todos los métodos utilizados: el incremento después de la inyección, el efecto de refuerzo de la segunda inyección. Es interesante hacer notar el alto grado de correlación entre los dos ELISAs del . lisado, utilizados (ELISA RM, ELISA Cornell) a pesar de una diferencia en la cepa utilizada para la producción de antígeno y la expresión de los resultados (Figura 3) (r2 = 0.86, F = 935, a = 0.001) . Es también importante hacer notar que los anticuerpos inducidos por vacunación: * Reaccionan fuertemente con OspA, la proteína mayor de membrana externa de B . burgdorferi , * Inhiben fuertemente el desarrollo de B . burgdorferi .

CONCLUSIÓN Las bacterinas que contenían una baja dosis (107) o alta dosis (109) de células muertas de _. burgdorferi protegieron completamente a los perros retados por una ruta natural (exposición al acaro) . Se obtuvieron los mismos resultados con la vacuna adyuvada de OspA.

Todas las vacunas indujeron un incremento significativo y similar en los títulos de anticuerpo que reconocieron la lipoproteína OspA e inhibieron el desarrollo de B . burgdorferi .

DURACIÓN DEL ESTUDIO DE INMUNIDAD: Treinta y tres (33) Beagles (especie de perro sabueso, pachón) se dividieron en dos grupos. El primer grupo (20 perros) recibió dos dosis subcutáneas de una vacuna monovalente (10 µg/dosis de B31 recombinante de OspA como se preparó en el Ejemplo 1) a un intervalo de vacunación de 3 o de 4 semanas. El segundo grupo permaneció sin tratarse (13 perros) . Todos los perros fueron retados con el acaro 5 a 6 meses después de la segunda vacunación. Los niveles del anticuerpo fueron determinados a intervalos regulares por ELISA. La eficacia de la vacuna fue evaluada por reaislamiento de las espiroquetas a uno y dos meses después del reto. Los perros fueron también verificados periódicamente para los signos clínicos indicadores de la Enfermedad de Lyme canina (LD) .

Sumario Seguridad: No se encontraron reacciones adversas locales o generalizadas después de la inyección de la vacuna.

La vacuna de OspA Ly monovalente: * promueve la protección contra LD canino como es evaluado por el reaislamiento de las espiroquetas y los signos clínicos. * esta respuesta de protección es efectiva al menos cinco meses después de la vacunación. * protege contra la infección por espiroquetas (90%) y los signos clínicos después de un reto natural.

Animales : Treinta y tres (33) cachorros de perro Beagle (de cualquier sexo; de nueve a diez semanas de edad; negativos para la vacunación contra Lyme y Lept ospi ra ) fueron obtenidos de Las Granjas Ridglan (Mount Horeb, Wl). Los cachorros fueron divididos aleatoriamente en dos grupos y vacunados.

Preparación de la Vacuna: La vacuna monovalente de OspA (designada Ly) fue preparada mediante la dilución de una concentración de reserva de la proteína purificada OspA B31 producida como en el Ejemplo 1. La concentración de la reserva fue de 465 µg de OspA/ml . La vacuna de Lyme fue producida mediante la dilución de la concentración de reserva en diluyente estéril a una concentración de 10 µg/ml de OspA y tomando alícuotas de la vacuna en frascos para uso único y múltiple (de 1 ml a 10 ml respectivamente) . La vacuna fue probada satisfactoriamente para la esterilidad .

Protocolo de Vacunación: Los perros recibieron dos dosis de vacuna (1 ml/dosis) administradas subcutáneamente a un intervalo de tres (Grupo 1) o cuatro semanas (Grupo 2) . Los signos de anafilaxis, incluyendo la dificultad en la respiración, comezón y edema, fueron verificados periódicamente para los 15 minutos iniciales después de la inyección. Además, los perros fueron observados continuamente por la primera hora después de la vacunación, y luego a intervalos regulares durante 14 días después de cada inyección. Los signos verificados incluyeron la hinchazón, dolor, tensión y escozor en el sitio de inyección. Antes de la administración de la segunda inyección, el sitio de la vacunación primaria fue palpado para el hinchamiento y la tensión.

Serología: Fue tomada sangre para la determinación del título antes de cada vacunación y a intervalos mensuales después de esto. Los títulos de OspA fueron determinados mediante ELISA.

Reto : Todos los perros fueron retados con B . burgdorferi utilizando ácaros naturalmente infectados, de acuerdo al procedimiento de reto de Appel y colaboradores. El intervalo entre la vacunación final y el reto fue de 24 semanas para el Grupo 1 y de 21 semanas para el Grupo 2. Los ácaros fueron obtenidos en el Condado Westchester, Nueva York, un área endémica para la Enfermedad de Lyme, y el reto fue conducido de acuerdo al procedimiento de Appel y colaboradores. La tasa de infección por Borreli a burgdorferi de estos ácaros fue de 60%.

Biopsia de Piel y Reaislamiento de_ Espiroquetas : Se tomaron biopsias de todos los perros a uno y dos meses después del reto. La piel alrededor del sitio de adhesión del acaro o garrapata fue rasurado, preparado con solución quirúrgica Betadine, anestesiados con lidocaína al 2% intradérmicamente inyectada, y biopsia por punción utilizando un Punzón para Piel Baker. Las muestras de piel fueron colocadas en tubos que contenían medio de cultivo (medio BSK con suero de conejo inactivado por calor, y antibióticos) y transportadas al laboratorio. Los tubos fueron suplementados con medio adicional y colocados en una gradilla. La gradilla fue incubada por seis semanas. Los tubos fueron examinados semanalmente para la presencia de espiroquetas, utilizando un microscopio de campo oscuro. Al menos diez campos fueron examinados utilizando un objetivo de 40X antes de que la muestra fuera considerada como negativa .

Signos y Síntomas Clínicos: Los signos clínicos de la Enfermedad de Lyme canina (LD) no fueron esperados después de la infección, debido a la naturaleza variable de la enfermedad, por lo tanto la eficacia de las vacunas fue evaluada principalmente por el reaislamiento de las espiroquetas Borrel i a burgdorferi provenientes de muestras de biopsia de piel. No obstante, todos los perros fueron verificados periódicamente para la aparición de signos indicadores de LD. El dolor y la tensión, temperatura, debilidad, ataxia, depresión y anorexia están entre los signos para los cuales estos -perros fueron verificados periódicamente. Únicamente un estimado de 10 a 15% de los perros infectados naturalmente con Borrel i a burgdorferi mostraron los signos clínicos.

RESULTADOS Seguridad de la Vacuna: Todos los perros vacunados fueron verificados periódicamente para las reacciones adversas (incluyendo anafilaxis) por los primeros quince minutos después de la vacunación y dos semanas después de cada vacunación. No se encontraron reacciones adversas a ningún tiempo después de la inyección de la vacuna monovalente de Lyme. Además, no se encontró hinchazón, dolor, tensión o comezón en el sitio de la inyección durante el periodo de dos semanas después de la vacunación.

Títulos de anticuerpo (ver Tabla 7) : El anticuerpo para OspA fue determinado mediante ELISA. La Tabla 7 lista los valores de ELISA. Al tiempo del reto con el acaro, la mayoría de los perros vacunados con la vacuna monovalente (10 µg de OspA) mostraron todavía títulos significativos de anticuerpo contra OspA. Un perro, FAS< falló en montar una respuesta significativa de anticuerpo para OspA. Reaislamiento de espiroquetas (Ver Tabla 7) : Se realizaron biopsias de piel para todos los perros a uno y dos meses después del reto. Las biopsias fueron cultivadas por seis semanas y se examinaron para el reaislamiento de espiroquetas. Las espiroquetas fueron reaisladas a partir de siete de doce perros control en la primera biopsia (58%) . Una muestra no pudo ser leída debido a que se perdió después de cinco semanas en el cultivo, debido a la contaminación. Las 13 muestras (100%) de los perros control fueron positivas para las espiroquetas por la segunda fecha de biopsia. Los resultados muestran que únicamente dos perros vacunados con la vacuna de Lyme monovalente (HVT y DXT) fueron positivos para las espiroquetas; una tasa de reaislamiento de 10%.

Signos Clínicos de la Enfermedad Canina de Lyme (Ver Tablas 6 y 7 : Cinco meses después del reto, cinco de los 13 controles no vacunados (39%) han experimentado episodios atribuibles a LD; dos perros (HXT y JCT) han tenido episodios múltiples. Uno de los veinte vacunados (5.0%) también experimentaron un episodio único de debilidad.

DISCUSIÓN: La eficacia de la vacuna fue evaluada mediante la determinación de la habilidad de la vacuna para prevenir la diseminación de las espiroquetas y los signos clínicos en el corto plazo y la duración de las pruebas de inmunidad. LD en perros frecuentemente no da como resultado la aparición de la enfermedad clínica (Levy y Magnarelli, 1992, JAVMA, 200: 344-347), por lo tanto, además del reporte de los signos clínicos, la eficacia de la vacuna estuvo basada en la habilidad de las preparaciones experimentales para prevenir la proliferación de las espiroquetas, como fue evaluada por el reaislamiento de las espiroquetas a partir de biopsias de piel. El reaislamiento de espiroquetas es el parámetro más importante y más consistente para considerar cuando se evalúa la eficacia de una vacuna. Si la vacuna disminuye o elimina esta diseminación, el animal no desarrollará los signos clínicos. La vacuna de Ly mostró que protege a más del 90% de los pacientes o recipientes contra la proliferación de espiroquetas en la prueba de eficacia a corto plazo, como se discute anteriormente. En esta duración del estudio de inmunidad (DOl), con perros retados 5 a 6 meses después de la vacunación, 100% de los controles no tratados fueron positivos para las espiroquetas por la fecha de la segunda biopsia. En contraste, las espiroquetas fueron aisladas únicamente de dos de los vacunados (10%) . Los perros fueron también observados para los signos clínicos resultantes de la infección. Las observaciones fueron reportadas por los técnicos de animales en ciego para la condición de la vacunación en cada perro. En el estudio de eficacia a corto plazo discutido anteriormente, 25% de los controles no tratados demostraron signos típicos de Enfermedad de Lyme canina (LD), principalmente debilidad, mientras que ningún vacunado fue observado con signos. En este estudio de DOl, seis de los perros han mostrado tales signos; cinco son controles no vacunados (39%) y un perro fue un vacunado (5%) . El primer episodio de debilidad fue notado aproximadamente dos meses después del reto; ya que dos de los perros no tratados (JRT e IAT) mostraron episodios recurrentes. Un vacunado, HPS, fue reportado con hinchamiento y ligera debilidad en la pata frontal derecha aproximadamente 2 meses después del reto. El animal nunca fue positivo para el aislamiento de espiroquetas, aunque los cultivos de ese perro fueron examinados específicamente con el episodio de debilidad en mente. Es posible que este episodio no fuera el resultado de LD canina, sino que fue atribuible a otras causas (trauma, etc.) . No obstante, el perro fue listado como positivo para los signos clínicos con el fin de proporcionar una prueba tan exigente como fuera posible. Los resultados de los títulos de anticuerpo muestran que todos excepto uno de los perros (FAS) vacunados con la vacuna monovalente se habían seroconvertido después de la vacunación, como se determinó mediante una diferencia en los títulos de presangrado y pre-reto de al menos dos diluciones. Esto representa una tasa de seroconversión de 95%.

Por el tiempo del reto, todos excepto dos vacunados (FAS y HVT) mostraron todavía títulos significativos.

Ninguno de los perros control mostró un incremento sostenido en los niveles de anticuerpo de OspA, aunque tres controles (HXT, JBT y JIT) sí tuvieron niveles bajos de anticuerpo reportados a partir del sangrado de pre-reto. La seguridad de la vacuna monovalente de Ly es también demostrada por los resultados de este experimento. No se notaron efectos adversos al tiempo de la vacunación, o en el periodo de dos semanas después de cada inyección. 10 µg de OspA/dosis fueron bien tolerados por todos los cachorros. Debido a que esta vacuna no contiene adyuvante, incluso la respuesta granulomatosa leve y transitoria, característica de la vacunación con la mayoría de las preparaciones adyuvantes, estuvo ausente .

CONCLUSIÓN: La vacuna monovalente, que contiene 10 µg de OspA/dosis : * es segura en cachorros de 9 a 10 semanas de edad. * es muy antigénica e induce una seroconversión en 95% de los pacientes. * promueve una respuesta inmune que protege a los vacunados contra la infección por espiroquetas (90%) y los signos clínicos cinco a seis meses después de la vacunación, cuando 100% de los controles demuestran infección con espiroquetas, y 39% muestran signos clínicos después del reto con el acaro.

Este Ejemplo también demuestra que la vacuna de la invención es protectora para una estación completa de Enfermedad de Lyme.

Tabla 7. Resultados de los Títulos de Anticuerpo para OspA, Reaislamiento de Espiroquetas y Signos Clínicos en la Duración de la Prueba de Inmunidad (DOl) .

Se tomaron biopsias de todos los perros, a los 1, 2 y 3 meses después del reto (ver Materiales y Métodos) . Las muestras de piel fueron cultivadas en medio BSK (suplementado con antibióticos y 10% de suero de conejo) por 6 semanas; los tubos fueron examinados semanalmente utilizando un microscopio de campo oscuro, con al menos diez campos examinados antes de que lá muestra fuera considerada como negativa. ± Muestra perdida, que se debió a la contaminación.

Tabla 8. Signos Clínicos de la Enfermedad Canina de Lyme en un Reto de Cinco Meses Perro # Grupo Notas Debilidad (todas la extremidades) , ataxia, deprimido, anorexia . HXT Control Débil (Frente Izquierdo) Débil (Frente Izquierdo); Todos los episodios se resolvieron espontáneamente . JBT Control Débil (Frente Izquierdo) , episodio resuelto espontáneamente. Débil (Patas Posteriores) ; resuelto JCT Control espontáneamente Débil (Frente Derecho) ; resuelto espontáneamente JJT Control Débil (Frente Derecho); resuelto espontáneamente Los perros fueron vacunados con 1 ml de vacuna de Ly SQ a intervalos de tres o cuatro semanas. El reto fue a los 5 a 6 meses. Los perros fueron verificados periódicamente en ciego para los signos clínicos por técnicos de animales.

EJEMPLO FORMULACIÓN DE COMPOSICIONES EN COMBINACIÓN QUE NO MUESTRAN INTERFERENCIA DE EFICACIA Este ejemplo demuestra que no existe interferencia entre el Adenovirus del Moquillo Canino Tipo 2-Coronavirus-Parainfluenza-Parvovirus y antígeno OspA de Borreli a burgdorferi .

ABREVIATURAS Componente Abreviatura Virus del Moquillo Canino, Nacido Tambaleante (CDVR) o Onderstepoort (CDV0) D Adenovirus Canino Tipo 2 (CAV2) A Coronavirus Canino, MLV (CCVL) C Parainfluenza Canina Tipo 2 (CPi) Pi Parvovirus Canino, (CPVXL) PXL Estos componentes fueron preparados a partir del virus vivo modificado (disponible de Rhone Merieux, Inc., Athens, Georgia, E.U.A.) . Las vacunas tuvieron la siguiente formulación de componentes.

La vacuna fue preparada como dos componentes separados : El primer componente fue el Adenovirus dei Moquillo Canino Tipo 2-Coronaviurs-Parainfluenza- ParvovirusxL, Virus Vivo Modificado, designado DACPÍPXL/ el cual fue liofilizado en un frasco y no contenía ningún adyuvante. El segundo componente fue Borreli a burgdorferi . La Proteína A (OspA) de Membrana Superficial Exterior de B31 fue producida a través de la tecnología recombinante como se describe en el Ejemplo 1 (designada Ly) u OspA. El segundo componente fue el componente líquido utilizado para rehidratar los componentes liofilizados de la vacuna antes de la inoculación. La fracción de OspA no contenía ningún adyuvante. La vacuna liofilizada DACPÍPXL fue probada como satisfactoria para la identidad del virus y el título, esterilidad, Micoplasma, y seguridad. La torta liofilizada fue rehidratada con Ly, que contenía 13 µg/ml de OspA. La vacuna de OspA fue probada para la esterilidad. La falta de interferencia del diluyente OspA después de los componentes liofilizados de la vacuna, fue determinada mediante prueba viricida in vi tro conducida de acuerdo a los lineamientos del Código de Regulaciones Federales 9 C.F.R. 113.35. La falta de interferencia de la fracción viral liofilizada después del diluyente OspA fue -determinada mediante comparación de los títulos serológicos de los perros vacunados con la vacuna en combinación (DACPiPXL+ OspA) a los títulos provenientes de perros vacunados con OspA sola (ver Ej emplo 2 ) . Ya que DACPÍPXL + OspA fue el resultado de la combinación de dos vacunas separadas que han sufrido ya prueba de eficacia extensa, únicamente un pequeño número de perros fueron retados para mostrar que el componente viral liofilizado de la vacuna no interfería con la protección promovida contra la Enfermedad de Lyme por la fracción de OspA, y viceversa. Veinte perros fueron repartidos aleatoriamente de acuerdo a la edad, camada y sexo, y fueron alojados conjuntamente. Diez perros fueron vacunados con la vacuna en combinación DACPiPXL + OspA, cinco perros fueron vacunados con OspA sola (como para el Ejemplo 2), y cinco perros sirvieron como controles no tratados. Los perros recibieron dos dosis de vacuna (1 ml/perro) , administradas subcutáneamente (SC) a un intervalo de tres semanas, de acuerdo al siguiente esquema : Los perros fueron sangrados antes de cada vacunación (días 0 y 21) , antes del reto (día 35) y antes de cada biopsia. El anticuerpo específico para OspA fue detectado mediante una prueba de ELISA. El anti-OspA fue detectado en perros que recibieron OspA o DACPiP?L + OspA. Todos los perros fueron observados inmediatamente después de la vacunación para verificar las reacciones adversas, incluyendo la anafilaxis . Además, los perros fueron verificados periódicamente diariamente por técnicos de animales para las reacciones adversas locales y sistémicas de la vacuna, incluyendo fiebre, anorexia, vómito o letargía. Antes de la segunda inyección, el sitio de la vacunación previa fue palpado para cualquier reacción anormal, incluyendo formación de granuloma. No se observaron reacciones adversas. Todos los perros fueron retados dos semanas después de la segunda vacunación con ácaros infectados naturalmente con Borrel i a burgdorferi (ver E emplo 2 ) . Las biopsias por punción de piel fueron obtenidas de perros a uno, dos, y tres meses después del reto. El material de la biopsia fue cultivado para el reaislamiento de espiroquetas de acuerdo al protocolo descrito en el Ejemplo 2. Una falta de interferencia de la fracción viral liofilizada de la vacuna en combinación, después de la dilución con OspA, fue evaluada mediante la comparación de la tasa de reaislamiento de espiroquetas, en perros vacunados en comparación a aquél en los controles no tratados. Para mostrar que la fracción de Ospa no afecta de manera adversa los componentes virales liofilizados en la vacuna en combinación contra Lyme, se realizó la prueba viricida. Todos los componentes virales fueron titulados después de la hidratación con Ly, y esa titulación fue comparada a una en la cual los componentes virales son rehidratados con agua estéril .

Interpretación de los resultados i n vi vo e i n vi tro : La eficacia de la vacuna en combinación fue determinada i n vi vo mediante los títulos serológicos y por los resultados del aislamiento de espiroquetas e in vi tro mediante la prueba viricida. Los niveles de anticuerpo contra OspA y los resultados del reaislamiento de espiroquetas, en perros vacunados con la vacuna en combinación (DACPiPXL + Ly) , se compararon a aquellos observados en perros vacunados con Ly sola, y a niveles en controles no tratados. La vacuna en combinación es considerada eficaz debido a que: 1) Los niveles de anticuerpo en los vacunados con la combinación fueron similares a los niveles en perros que recibieron la vacuna de Ly monovalente. Los niveles de anticuerpo en los vacunados fueron también significativamente más altos que los niveles en los controles no tratados . 2) 100% de los perros vacunados fueron negativos para el reaislamiento de espiroquetas, mientras que 80% (4/5) de los controles no tratados fueron positivos para las espiroquetas; y 3) No existió pérdida en el título de virus cuando la torta viral liofilizada es rehidratada con el diluyente Ly, en comparación al agua estéril. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

* Todos los perros recibieron dos vacunaciones subcutáneas, a intervalos de tres semanas. Ly= OspA de Lyme; DACPiPXL = vacuna viva modificada del moquillo canino, adenovirus, corona, parainfluenza, y parvovirus. Valores >50 = niveles significativos de anticuerpo contra OspA.

EJEMPLO 4 - EFICACIA DE LAS VACUNAS DE OspA EN CABALLOS Se utilizaron diez caballos para este estudio. Sus números son 74, 75, 76, 77, 93, 95, 96, 97, 98 y 99. Las vacunas monovalentes (designadas Ly; 100 µg/dosis de OspA; y 30 µg/dosis, fueron elaboradas a partir de la tecnología recombinante como se describe en el Ejemplo 1 (B31) . La vacuna en combinación (designada rabia/Ly) consiste de Imrab (disponible de Rhone Merieux, Inc., Athens, Georgia) más 30 µg/ml de OspA de B31 como se preparó en el Ejemplo 1 (B31) . Todos los caballos fueron vacunados intramuscularmente (IM) con dos dosis de vacuna, administrada a un intervalo de dos semanas, de acuerdo al siguiente protocolo: Grupo No . Vacuna 1 4 Rabia/Ly en combinación (30 µg/ml 2 4 100 µg/ml Ly 3 2 30 µg/ml Ly Los caballos fueron sangrados antes de cada vacunación y a las una, dos y tres semanas después de la segunda vacunación. Los resultados serológicos fueron determinados mediante ELISA (modificado mediante el uso de antisuero de caballo) . Los títulos de anticuerpo de la rabia fueron determinados, en los caballos vacunados con la combinación, ya que los resultados de la serología de OspA fueron alentadores . Todos los cab llos fueron observados por 30 minutos a una hora después de cada vacunación para los signos característicos de la anafilaxis. Después del periodo de observación inicial, los sitios de la vacunación fueron verificados antes de la administración de la segunda vacunación para la aparición de las reacciones de inyección local (abultamientos , etc.). Además, cada caballo fue observado diariamente para la aparición de las reacciones adversas de la vacuna (fiebre, depresión, anorexia, etc.) . Todas las observaciones diarias continuaron hasta una semana después de la vacunación final. No se observaron reacciones adversas. La eficacia de las vacunas fue evaluada mediante la evaluación de los niveles de anticuerpos anti-OspA en caballos vacunados, y comparando esos niveles a los niveles antes del sangrado. Los resultados se muestran en la Tabla 10. Los resultados indican que los caballos pueden ser protegidos contra la Enfermedad de Lyme ya sea por la vacuna de OspA monovalente o multivalente; y, que para la vacuna multivalente, no se observa interferencia de eficacia.

Tabla 10 Todos los caballos recibieron dos inyecciones intramusculares, a un intervalo de tres semanas. Imrab= vacuna contra la rabia inactivada, adyuvada, comercial. n.b. = no sangrado; valores >50 indican niveles significativos de anticuerpo contra OspA.

EJEMPLO 5 - LYME CANINA: SEGURIDAD, EFICACIA Y FALTA DE INTERFERENCIA DE UNA VACUNA EN COMBINACIÓN CONTRA LYME Este Ejemplo evalúa además la seguridad, la eficacia y la falta de interferencia de una vacuna en combinación contra Lyme (recDACPiPXL + OspA) . Treinta y cuatro (34) perros pachones fueron aleatoriamente divididos en dos grupos (22 vacunados y 12 controles) . Los vacunados recibieron dos dosis de una vacuna en combinación (recDACPiPXL + OspA) subcutáneamente, mientras que los controles fueron vacunados con los componentes virales solos (recDACPiPXL) . Todos los perros fueron retados 7 semanas después de la segunda vacunación con los ácaros naturalmente infectados. Los perros fueron probados para los anticuerpos contra OspA a intervalos regulares mediante la serología por ELISA. Para confirmar la eficacia de la vacuna contra el reto por Borrel i a burgdorferi , se tomaron biopsias de los perros y las muestras de piel se cultivaron para el reaislamiento de espiroquetas. Además, la falta de la prueba de interferencia y los ensayos viricidas fueron realizados para confirmar que el diluyente de OspA no tiene efecto dañino sobre los componentes de la vacuna viral. * Seguridad: No se encontraron reacciones adversas locales o generalizadas a ningún tiempo después de la inyección. * Resumen de Eficacia: Tabla 11 RecDACPiPx 12 0/11* = 0% 0/12 = 0% 4/12 = 33.4% 9/12 = 75% solo Un perro no fue sangrado.

* Falta de interferencia: Los ensayos viricidas y la prueba de falta de interferencia mostraron que el diluyente de OspA no tiene ningún efecto dañino sobre los componentes virales en la vacuna en combinación. De este modo, la vacuna en combinación contra Lyme (recDACPiPXL+OspA) : + es segura en cachorros de 8 a 10 semanas de edad; * es muy antigénica e induce la seroconversión de OspA en 100% de los perros vacunados; * protege a los vacunados contra la infección por espiroquetas y la diseminación de las mismas después de un reto con ácaros naturales; y * no interfiere con los componentes liofilizados de la vacuna viral, como es demostrado por una falta i n vi vo de prueba de interferencia o ensayos viricidas i n vi tro . Abreviaturas Utilizadas Componente de Vacuna Abreviatura La proteína A de la superficie exterior proveniente de Borreli a burgdorferi (OspA) OspA (ver Ejemplos previos) Virus del Moquillo Canino; Vector de la Viruela del Canario (recCDV) D Adenovirus Canino Tipo 2 (CAV2) A Virus de la Parainfluenza Canina (CPi) Pi Parvovirus Canino, (PXL) PXL Coronavirus Canino (CCV) C Una vacuna en combinación, la cual pudo inmunizar perros contra la Enfermedad de Lyme y proporcionar simultáneamente protección contra otros patógenos caninos, podría ofrecer a los veterinarios una alternativa importante para la profilaxis de la enfermedad infecciosa. El presente estudio fue conducido para •determinar la seguridad, la eficacia, y la falta de interferencia de la vacuna en combinación de la invención. La vacuna en combinación estuvo compuesta de un diluyente de OspA (designado OspA) y una torta viral liofilizada que contenía el Virus del Moquillo Canino recombinante-Adenovirus Tipo 2-Coronavirus- Parainfluenza-Parvovirus (designada recDACPiPXL) ) .

Materiales y Métodos: Animales : Treinta y cuatro cachorros de perro pachón (de ambos sexos; de ocho semanas de edad; negativos para Lyme ( Borrel i a burgdorferi ) y anticuerpos de Lep t ospi ra ) fueron obtenidos de las Granjas Ridglan (Mount Horeb, Wl). Los cachorros fueron divididos aleatoriamente en dos grupos y vacunados como sigue: Preparación de Vacuna: La vacuna de OspA fue obtenida como en el Ejemplo 1. El componente viral liofilizado fue obtenido como una serie de prelicencia. Las titulaciones de la torta liofilizada son como sigue: Protocolo de Vacuna: Los perros recibieron dos dosis de cada vacuna (1 ml/perro) subcutáneamente a un intervalo de tres semanas. Los signos de anafilaxis, incluyendo dificultad en la respiración, comezón y edema, fueron verificados periódicamente por los 15 minutos iniciales después de la inyección. Además, los cuidadores de los animales observaron a los perros continuamente por la primera hora después de la vacunación, y luego a intervalos diarios por catorce días después de cada inyección. Los signos verificados incluyeron hinchazón, dolor, sensibilidad y comezón en el sitio de la inyección. Antes de la administración de la segunda inyección, el sitio de la vacunación primaria fue palpado para la hinchazón y la sensibilidad.

Serologia : Se tomó sangre para la serología antes de cada vacunación y a intervalos mensuales después de eso. Los títulos de OspA fueron determinados mediante ELISA.

Prueba de Falta de Interferencia: Para demostrar una falta de interferencia del diluyente de OspA sobre los componentes virales en la vacuna en combinación, se determinaron los títulos de neutralización sérica y el GMT para el Grupo I (vacunado con recDACPiP?L+OspA) comparado a los títulos en el Grupo II (vacunado con recDACPiP?L solo ) .

Prueba Viricida Jn vi tro : Para demostrar que el diluyente de OspA no interfiere con los títulos de los componentes virales en la vacuna en combinación, la prueba dirigida i n vi tro fue conducida de acuerdo a 9 lineamientos de la CFR (113.35) .

Reto con el Acaro: Para verificar que los componentes virales no interfirieran con la protección promovida con la fracción de OspA de la vacuna en combinación, todos los perros fueron retados con B . burgdorferi siete semanas después de la vacunación. Este reto utilizó los ácaros naturalmente infectados obtenidos en un área endémica para la Enfermedad de Lyme. La tasa de infección por Borrelí a burgdorferi de estos ácaros fue determinada como de 60% .

Biopsia de Piel y Reaislamiento de Espiroquetas : Se tomaron biopsias de todos los perros a uno y dos meses después del reto. La piel alrededor del sitio de la adhesión del acaro fue rasurada, preparada con limpiador quirúrgico Betadine, se anestesiaron con lidocaína al 2% inyectada intradérmicamente, y se tomó una biopsia por punción utilizando un punzón para piel Baker. Las muestras de piel fueron colocadas en tubos que contenían el medio de cultivo (medio BSK con suero de conejo inactivado por calor y antibióticos) y transportados al laboratorio. Los tubos fueron suplementados con medio adicional y colocados en un recipiente con luz. El recipiente se incubó por seis semanas. Los tubos fueron examinados para la presencia de espiroquetas, utilizando un microscopio de campo oscuro. Se examinaron al menos diez campos con un objetivo de 40X antes de que la muestra fuera considerada como negativa.

Seguridad de la Vacuna: Todos los perros vacunados fueron verificados periódicamente para las reacciones adversas (incluyendo la anafilaxis) por los primeros quince minutos después de la vacunación mediante la Pl, y por los siguientes catorce días después de cada vacunación por parte de los cuidadores de los animales. No se observaron reacciones sistémicas adversas a ningún tiempo después de la vacunación con la vacuna en combinación de Lyme. Además, no se demostró hinchazón, dolor, sensibilidad o comezón en el sitio de la inyección durante el periodo de dos semanas después de la vacunación .

Títulos de Anticuerpo contra OspA (Ver Tabla 12 ) : El anticuerpo para OspA fue determinado mediante ELISA. Se extrajo sangre en el día 0 (presangrado; antes de la administración de la primera vacunación) ; en el día 14 (antes de recibir una segunda vacunación) ; en el día 42 (antes del reto) ; y a intervalos mensuales después de éstos. La Tabla 12 lista los valores de ELISA. Después de la primera vacunación, doce de los veintiún vacunados sangrados (57.1%) se habían seroconvertido , como se determinó mediante un incremento en los niveles de anticuerpo contra OspA de al menos cuatro veces. Dos semanas después de la segunda vacunación, los veintidós perros (100%) vacunados con recDACPiPXL solo, se habían seroconvertido a OspA. La mayoría de los vacunados mostraron todavía títulos significativos del anticuerpo contra OspA, antes del reto (19/22 = 86.4%) . Ninguno de los controles, vacunado con recDACPiPxL solo, mostró una respuesta serológica al antígeno OspA. En ambos grupos, los niveles de anticuerpo se elevaron muy poco después del reto con el acaro. El anticuerpo contra OspA no es expresado en humanos con la Enfermedad de Lyme, hasta muy tarde en el curso de la infección, y parece que lo mismo es cierto en caninos con infección natural.

Prueba de Falta de Interferencia (Ver Tabla 13 ) : Los sueros fueron obtenidos de perros en el día 0 (antes de la primera vacunación) y en el día 35 después de la vacunación. Los títulos de neutralización sérica de los antígenos virales en la vacuna en combinación, fueron determinados para cada perro en ambas fechas. Los títulos en media geométrica (GMT) y las desviaciones estándares (SD) se calcularon para el grupo vacunado con recDACPiPXL solo y se compararon al GMT para el grupo que recibió la vacuna en combinación de Lyme (recDACPiPXL + OspA) .

Los cachorros utilizados en este estudio fueron negativos para Lyme o la vacunación o la exposición a Lep tospira , pero no fueron elevados en condiciones Libres de Patógeno Específico. Por lo tanto, los resultados de presangrado en el día 0 mostraron títulos para los componentes virales en las fracciones liofilizadas de la vacuna. Después de la vacunación, los títulos de los componentes se elevaron como se esperaba. La comparación de los títulos individuales (analizados utilizando la prueba t de Student, con p<0.05 se consideraron como significativos) no mostraron diferencia en los títulos de neutralización en suero en perros vacunados con recDACPiPXL + OspA en comparación a los títulos de aquellos que recibieron recDACPiPxL solo. Por lo tanto, no existe interferencia significativa a partir del diluyente de OspA sobre cualquiera de los componentes virales de la vacuna.

Prueba Viricida In Vi tro ( Ver Tabla 14) : La prueba viricida i n vi tro comparó los títulos para cada componente de la vacuna viral rehidratada con el diluyente de OspA, a los títulos determinados cuando la vacuna fue rehidratada con agua estéril. La comparación de estos títulos determinó que la variación estaba dentro de límites aceptables para cada uno de los componentes virales en la vacuna en combinación de Lyme (menos de 0.5 log de diferencia en el título ) .

Reaislamiento de Espiroquetas (Ver Tabla 15 ) : Se realizaron biopsias de piel para todos los perros a uno y dos meses después del reto. Las biopsias fueron cultivadas por seis semanas y examinadas para el reaislamiento de espiroquetas. Los resultados muestran que únicamente un perro vacunado con la vacuna para Lyme en combinación (XBY) fue positivo para las espiroquetas (4.5%), y que el perro fue únicamente positivo en la fecha de la primera biopsia. Ninguno de los veintidós perros vacunados con recDACPiPXL + OspA fue positivo para las espiroquetas en la segunda biopsia (0%) . Las espiroquetas fueron reaisladas a partir de las muestras de biopsia tomadas de tres de los doce perros control a un mes después del reto (25%), mientras que nueve de los controles fueron positivos por la segunda biopsia (75%) . La Enfermedad de Lyme (LD) , provocada por la espiroqueta patógena Borrel i a burgdorferi , es actualmente la enfermedad más común llevada por garrapatas, en humanos. Además, la LD está siendo reportada más frecuentemente conforme se incrementa la alerta de infección en perros entre los veterinarios . Es sabido que una de las proteínas mayores de la superficie exterior de Borrel i a burgdorferi , designada OspA, es un potente inmunógeno y proporciona protección contra la infección por espiroquetas en una variedad de animales. La proteína OspA purificada, producida en amplias cantidades por tecnología recombinante, es también la base de dos vacunas humanas que sufren actualmente pruebas clínicas. Una vacuna en combinación, la cual podría inmunizar a perros contra la Enfermedad de Lyme y simultáneamente proporcionar protección contra otros patógenos caninos, podría ofrecer a los veterinarios una alternativa importante para la profilaxis de enfermedades infecciosas. El propósito de este Ejemplo fue determinar la eficacia, la seguridad y la falta de interferencia de tal vacuna en combinación. La vacuna contenía una torta viral liofilizada que contenía el virus del Moquillo Canino Recombinante-Adenovirus Tipo 2-Coronavirus -Parainfluenza-Parvovirus (designado (recDACPiPX ) ) y se rehidrató con un diluyente para OspA. Veintidós cachorros fueron vacunados con la vacuna en combinación (recDACPiPXL + OspA) , mientras que doce controles fueron vacunados con la torta viral liofilizada rehidratada con agua estéril (recDACPiPXL) . Todos los cachorros recibieron dos vacunaciones subcutáneas, con tres semanas de separación, y luego fueron retados con ácaros infectados con Borreli a burgdorferi . El modelo de reto con acaro, natural, fue utilizado en este Ejemplo. Después del reto se tomaron biopsias de todos los perros a uno y dos meses después del reto, y las muestras se cultivaron para el reaislamiento de las espiroquetas. Los resultados mostraron que únicamente uno de los cachorros vacunados con la vacuna en combinación para Lyme fue transitoriamente positivo para el reaislamiento de espiroquetas, debido a que este perro, y todos • los otros cachorros vacunados con la vacuna en combinación, fue negativo para la diseminación de las espiroquetas en la segunda biopsia. En contraste, las espiroquetas fueron reaisladas del 75% de los perros vacunados con recDACPiP?L solo, en la fecha de la segunda biopsia.

Los resultados del anticuerpo contra OspA han sido determinados para todos los perros. Todos los cachorros vacunados con la vacuna en combinación (recDACPiPxL + OspA) se seroconvirtieron después de recibir dos inyecciones, aunque ninguno de los controles mostró un incremento en niveles del anticuerpo contra OspA después de la vacunación con los componentes virales liofilizados, solos. Los títulos de OspA en los animales control, que mostraron estar infectados por la biopsia, no se elevaron significativamente, después del reto con el acaro. En humanos, se sabe que los anticuerpos contra OspA no están presentes en la Enfermedad de Lyme temprana; los resultados de este estudio indican que tal puede ser también el caso para la infección canina . La seguridad de la vacuna en combinación para OspA fue también demostrada por este estudio.

No se notaron reacciones adversas sistémicas o locales al tiempo de la vacunación, o en el periodo de dos semanas después de cada inyección.

La Vacuna en Combinación de Lyme de la Invención (recDACPiPXL + OspA) : * es segura en cachorros de 8 a 10 semanas de edad; * es muy antigénica e induce la seroconversión de OspA en 100% de los perros vacunados; * protege a los vacunados contra la infección por espiroquetas y la diseminación después de un reto natural con el acaro, como es demostrado por el reaislamiento de espiroquetas; y * no interfiere con los componentes de la vacuna viral liofilizada, como es demostrado por la prueba de falta de interferencia in vi vo y los ensayos viricidas i n vi vo .

Tabla 12: Resultados de los Títulos de Anticuerpo para OspA Tabla 13. Niveles de Anticuerpo en Suero: Falta de Interferencia del Diluyente para Lyme Sobre los Componentes Virales de una Vacuna en Combinación 4 NJ Fecha de primera vacunación GMT: Título de Media Geométrica Rehidratada con diluyente estéril SD: Desviación Estándar TABLA 14 Títulos de los Componentes Virales Liofilizados con y sin Diluyente de Lyme (Efecto Viricida) 10 Un perro no sangró Habiendo descrito de este modo con detalle las modalidades preferidas de la presente invención, se debe entender que la invención definida por las reivindicaciones anexas no está limitada por los detalles particulares descritos en la descripción anterior, ya que muchas variaciones aparentes de la misma son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente.

REFERENCIAS : 1. Barbour, A.G. y Fish, D. The biological and social phenomenon of Lyme Disease. Sci ence . 1993, 260, 1610-1616. 2. Fikrig, E., Barthold, S.W., Kantor, F.S. y Flavell, R.A. Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA. Sci ence . 1990, 250, 553-556.

Erdile, L.F., Brandt, M., Warakomski, D.J., Westrack, G.J., Sadziene, A., Barbour, A.G. y Mays, J.P. Role of attached lipid in immunogenicity of Borrel i a burgdorferi OspA. Infec t . Immun . 1993, 61, 81-90. Ver también USSN 08/373, 455.

Keller, D., Kister, F.T., Marks, D.H., Hosback, P., Erdile, L.F. y Mays, J.P. Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine. J. Am . Med . Ass oc . 1994, 271, 1764.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunológica, caracterizada porque comprende un antígeno de Borrel i a burgdorferi , purificado, aislado o un vector que expresa el antígeno, y un antígeno adicional de un patógeno de mamífero- diferente de Borrel i a burgdorferí , o un vector que expresa el antígeno adicional, y opcionalmente un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable.

2. La composición inmunológica de conformidad con la rei indicación 1, caracterizada porque el antígeno de Borreli a burgdorferi , purificado, aislado, ' comprende OspA purificada, aislada .

3. La composición inmunológica, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la OspA purificada, aislada es una OspA lipidada, purificada, aislada, la cual está sustancialmente libre de lipopolisacárido y sustancialmente libre de otras proteínas bacterianas.

4. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque está sin ningún adyuvante aumentador de la inmunogenicidad .

5. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el antígeno adicional se selecciona del grupo que consiste de: un antígeno de un patógeno canino, un antígeno de un patógeno equino, y un antígeno de un patógeno felino.

6. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el antígeno adicional es un antígeno de un patógeno canino.

7. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el antígeno adicional es un antígeno de un patógeno equino.

8. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el antígeno adicional se selecciona del grupo que consiste de: un antígeno del virus de la rabia, un antígeno del moquillo canino, un antígeno de adenovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza, un antígeno de parvovirus, y mezclas de los mismos.

9. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el antígeno adicional es un antígeno del virus de la rabia.

10. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el antígeno adicional comprende un antígeno del moquillo canino, un antígeno de adenovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza, y un antígeno de parvovirus.

11. La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el antígeno adicional es un virus vivo modificado .

12. Un método para promover una respuesta inmunológica en un mamífero susceptible a la Enfermedad de Lyme, y el patógeno de mamífero diferente de Borreli a burgdorferi , caracterizado el método porque comprende el administrar al mamífero una composición de conformidad con la reivindicación 1.

13. Un método para promover una respuesta inmunológica en un perro o cachorro, caracterizado porque comprende el administrar una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6, 8 ó 10, en donde el antígeno adicional es de un patógeno canino.

14. Un método para promover una respuesta inmunológica en un caballo, caracterizado porque comprende el administrar una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, 7 ó 9, en donde el antígeno adicional es de un patógeno equino.

• 15. Un método para promover una respuesta inmunológica en un caballo contra Borrel i a burgdorferi , caracterizado porque comprende el administrar al caballo una composición que comprende la OspA de Borreli a burgdorferí , purificada, aislada.

16. Un método para promover una respuesta inmunológica en un perro o cachorro contra Borrelia burgdorferi, caracterizado porque comprende el administrar al perro o al cachorro una composición que comprende OspA de Borreli a burgdorferi purificada, aislada .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque la OspA es una OspA recombinante, lipidada, purificada, aislada, la cual está sustancialmente libre de lipopolísacárido, y sustancialmente libre de otras proteínas bacterianas.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la composición está sin ningún adyuvante aumentador de la inmunogenicidad.

19. Un método para preparar una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el preparar el antígeno adicional en forma liofilizada, preparando el antígeno de Borreli a burgdorferí en forma líquida, y rehidratando el antígeno adicional con el antígeno de Borrelia burgdorferi .