CN104892755A

CN104892755A - 百日咳prn蛋白单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN104892755A
Application number: CN201510161318.2A
Authority: CN
Inventors: 孙乐; 李茂华; 张翠娟; 张小刚; 李英姿; 陈兴; 张萍萍
Original assignee: AbMax Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Tiancheng Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd.
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: CN104892755B

Abstract

本发明提供了百日咳PRN蛋白单克隆抗体及其应用，属于生物制品领域，本发明的单克隆抗体其是以百日咳菌中PRN蛋白作为免疫原，免疫小鼠制备获得，获得的2个单抗的分别为，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明提供的单克隆抗体与百日咳细菌其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，用于检测百日咳PRN组分具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测样品中百日咳疫苗中PRN含量，在疫苗和临床检测中将会得到广泛应用。

Description

百日咳PRN蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是涉及百日咳菌中PRN蛋白的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系以及该抗体的应用。

背景技术

百日咳是一种严重威胁婴幼儿健康的急性呼吸道传染病，传染性强，且人群普遍易感。即使在疫苗接种覆盖率较高的国家，百日咳仍是一个较受关注的公共卫生问题。据WHO估计，2003年全世界约有1760万百日咳病例，其中90％发生在发展中国家，约27.9万人因此死亡。还估计，2003年全球预防百日咳的疫苗免疫接种避免了约3830万感染病例和60.7万死亡病例的发生。

百日咳的病原体为百日咳杆菌，归属于鲍特菌属。百日咳杆菌的主要毒力因子为百日咳毒素(pertussis toxin，PT)，具有多种生物学活性，导致多种多样的百日咳临床症状。20世纪30年代研制成功的全细胞百日咳疫苗(whole—cell pertussis vaccine，WPV)具有免疫保护作用，在控制儿童百日咳发病方面发挥了巨大作用。然而，WPV可导致严重不良反应，如抽搐和脑病。上世纪80年代，日本学者率先研制成功以脱毒PT和丝状血凝素(FHA)为主要成分的无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis Vaccine，APV)，再次成功地控制了百日咳流行。对照研究证实，与传统的WPV相比，APV可显著减少不良反应发生。1986-1987年在瑞典通过临床试验发现含有PT和FHA的APV与仅含PT的APV在接种后均能获得良好的免疫效果，预防百日咳的有效率均达80以上，从而提示PT是百日咳感染相关的保护性抗原，是APV的主要成分之一。百日咳杆菌的保护性抗原主要是PT、FHA、OMP以及少量Agg。进一步研究发现PT是引起百日咳发病的主要毒力因子，同时也是引起WPV不良反应的主要原因。经过化学脱毒的PT是APV的主要成分，也是疫苗中唯一没有争议的保护性抗原。

百日咳杆菌可以因环境条件改变而发生表型变化，毒力因子的表达水平也不同。这些因子包括百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳粘着素(PRN)、菌毛、腺苷酸环化酶-溶血素(AC-Hly)、气管细胞毒素(TCT)和百日咳杆菌内毒素。粘附因子如FHA、PRN和菌毛帮助细菌粘附在宿主细胞上，PT、TCT和AC-Hly可破坏上皮层，躲避宿主的免疫系统。但目前对百日咳发病机理的认识还不完全清楚。随时间推移，细菌的PRN和PT的基因序列也有一定改变。由于抗原漂移和对疫苗株敏感性较小的流行株的持续选择而可能导致目前百日咳疫苗效力逐渐丧失的问题，对此迄今尚未得到证实。

发明内容

本发明的目的是提供能与百日咳细菌中的PRN蛋白特异结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系。

本发明提供的单克隆抗体，其是以百日咳菌中的PRN蛋白为免疫原制备获得。

具体地说是使用百日咳菌中的PRN蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗PRN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。

本发明获得的特异识别PRN蛋白的单克隆抗体命名为4C8和2B9。

具体地，本发明提供一种百日咳PRN蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了稳定分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备百日咳检测试剂盒中的应用。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测百日咳PRN蛋白试剂盒中的应用。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测百日咳PRN蛋白抗体试剂盒中的应用。

本发明提供上述单克隆抗体在百日咳疫苗质检中的应用。

含有本发明所述单克隆抗体的药物属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备用于预防或治疗百日咳药物中的应用。

本发明的单克隆抗体为经生物标记或化学标记后获得的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

具体地，所述的生物标记为酶标记。更具体地，所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

本发明提供了含有上述单克隆抗体的检测试剂盒。

本发明提供的能够识别PRN蛋白的单克隆抗体4C8和2B9具有良好的特异性，实验表明，各克隆间识别没有交叉反应。间接ELISA表明这2个抗体具有较高的效价，因此可用于百日咳细菌及疫苗组分的检测。此外，由于4C8和2B9识别PRN蛋白的抗原决定簇。因此，可以采用双抗夹心法，分别利用特异识别的两个单克隆抗体对百日咳疫苗PRN蛋白进行检测。从而，本发明提供一种用于百日咳疫苗检测的试剂盒，可以准确检测样品中百白破联合疫苗中各有效成分的含量。

具体地，本发明的检测试剂盒，其为ELISA检测试剂盒，其是以特异性地识别PRN蛋白的单克隆抗体为包被抗体，以酶标记的特异性地识别PRN蛋白的另一种单克隆抗体作为检测抗体，所述单克隆抗体为4C8或2B9；其中4C8的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；2B9轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供的单克隆抗体与百日咳细菌其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测样品中百白破联合疫苗中各有效成分的含量，在疫苗和临床检测中将会得到广泛应用。

附图说明

图1是抗体的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准(kDa)，本发明获得的2个单克隆抗体，其中泳道1为BSA，2为4C8，3为2B9。

图2所示的是检测识别PRN蛋白ELISA法灵敏度实验的拟合曲线。

具体实施方法

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、杂交瘤细胞系的建立

一、实验材料

1、免疫原：以百日咳疫苗中的PRN蛋白(购自自华兰生物工程股份有限公司)作为免疫原。

2、培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公司。

3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。

4、其他材料：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于JacksonImmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。

二、杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

1)基础免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。

2)加强免疫：加强免疫采用抗原与弗氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。

2、杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法分别筛选分泌抗PT、FHA和PRN的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μl的SP55和SP70包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后测定450nm OD值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。

3、杂交瘤细胞系的建立

重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株分别针对SP55、2株针对SP70的，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。筛选得到的2株杂交瘤细胞分泌的抗体分别命名为4C8和2B9。

4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测

表1 百日咳疫苗组分抗体效价检测

1)细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为：1：50000-1：100000。

2)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1：500000-1：1000000。

5、杂交瘤细胞系的传代培养

将上述稳定分泌4C8和2B9的杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。

以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗PRN蛋白的单克隆抗体。

实施例2抗PRN蛋白的单克隆抗体的制备

一抗体制备

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔分别接种实施例1的2株杂交瘤细胞的第16代细胞，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。

将腹水离心(13000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G～Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2.7,20mM的甘氨酸缓冲液，分别得到抗PRN蛋白的单克隆抗体，其中特异识别PRN蛋白的单克隆抗体命名为4C8和2B9。

二抗体的鉴定

1、抗体纯度鉴定：

对获得的2株单克隆抗体分别进行SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95％以上。

2、识别PRN蛋白4C8和2B9可变区序列测定

将2个克隆的细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。识别PRN蛋白的4C8和2B9的抗体的可变区氨基酸序列：4C8的氨基酸序列为：轻链如SEQ ID No.1所示，重链如SEQ ID No.2所示。2B9的氨基酸序列为：轻链如SEQ ID No.3所示，重链如SEQ ID No.4所示。将该序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为2个克隆各自特异的序列。

实施例3应用纯化抗体制备抗百日咳PRN蛋白检测试剂

一、抗PRN蛋白ELISA双抗体夹心法

应用4C8和2B9抗体做配对实验，确定以4C8为包被抗体，用HRP标记2B9作为检测抗体，确定了ELISA检测方法，试剂盒检测灵敏度可达7.8125ng/ml(图2)。采用改良过碘酸钠法标记抗体。

表2 ELISA法检测百日咳PRN蛋白的检测结果

检测方法：包被抗体4C8用pH 9.60.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液稀释成5μg/mL，在酶标板的每孔加100μL，4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200μL 1％的明胶，放入37℃恒温箱中封闭2小时后，用PBST洗涤3次，拍干后干燥保存。用辣根过氧化物酶标记2B9的抗体，得2B9-HRP并保存。向酶标板中分别加入百日咳疫苗组分PRN蛋白梯度稀释液100μL/孔，37℃孵育1小时，再加入2B9-HRP(1:4000稀释)100μL/，37℃孵育1小时，加入显色剂A、B各50μL/孔进行显色，37℃温育10min，加入终止液50μL/孔，进行读数。

其中显色剂A液配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，吐温-20100μL，pH5；B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。检测结果见表2，说明本申请的2个百日咳PRN蛋白单克隆抗体具有良好的活性和特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种百日咳PRN蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

3.权利要求1所述单克隆抗体在制备检测百日咳试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述单克隆抗体在制备检测百日咳PRN蛋白抗体试剂盒中的应用。

5.权利要求1所述单克隆抗体在百日咳疫苗质检中的应用。

6.含有权利要求1所述单克隆抗体的药物。

7.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于预防或治疗百日咳药物中的应用。

8.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，为经生物标记或化学标记后获得的单克隆抗体。

9.含有权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。

10.一种检测试剂盒，其为ELISA检测试剂盒，其是以特异性地识别PRN蛋白的单克隆抗体为包被抗体，以酶标记的特异性地识别PRN蛋白的另一种单克隆抗体作为检测抗体，所述单克隆抗体为4C8或2B9；其中4C8的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；2B9轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。