CN1572323A - 一种抗sars病毒的基因疫苗及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗SARS病毒的基因疫苗，该疫苗由基因文库中登录号为AY278487的26386－227054片段编码的SARS病毒N蛋白、28120－29388片段编码的M蛋白和2486－2935片段编码的RNA聚合酶基因cDNA与哺乳动物表达载体pVAX1组成。该疫苗的构建包括：挑单菌落、摇菌、提含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆载体质粒；设计引物，用聚合酶链式扩增方法，克隆N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；将其纯化后重组到哺乳动物特殊表达载体pVAX1中，构建成抗SARS病毒的基因疫苗－pVAX1－SARS－MNRna疫苗。与当前常用的疫苗相比，本疫苗达到相同免疫效果时所需的量小，并且能同时、高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强，而且安全、长效、稳定、操作便捷，本疫苗可以用于制备预防和治疗SARS的药物。

Description

一种抗SARS病毒的基因疫苗及其构建和应用

技术领域

本发明涉及一种基因疫苗，更具体地说，本发明涉及一种含有N蛋白(Nucleocapsidphosphoprotein核蛋白壳磷蛋白)、M蛋白(Membrane glycoprotein膜糖蛋白)和RNA聚合酶基因片段cDNA的抗SARS基因疫苗。

技术背景

人类对疾病的预防是靠非特异和特异免疫系统来完成的。随着基因重组技术及基因载体传递系统的迅速发展，1992年美国有四个实验室(Robinson，Johoston，Li，David)同时开发研究出了DNA疫苗(即基因疫苗)的雏形，并在1992年9月召开的疫苗学新进展大会上同时进行了报告。从此DNA疫苗的新技术问世引起世界各国的高度重视，被人们视为疫苗研究领域的一场革命。1994年美国国家卫生研究院(NIH)以国家生物战略发展计划的专项经费资助开展DNA疫苗治疗HIV的研究工作。1994年美国FDA批准了在人体进行DNA疫苗治疗爱滋病的临床试验。1995年5月，报导了世界第一例DNA疫苗的临床试验，世界卫生组织(WHO)拨款把DNA疫苗纳入WHO全球免疫研制开发计划之中。1996年医生首次将新基因(编码HIV或流感蛋白质)注入健康人中，而不是注入患了某种疾病的人中。目前FDA已批准五种DNA疫苗进入临床，这五种疫苗是：爱滋病病毒疫苗、流感病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、单纯疱疹病毒疫苗和疟原虫病毒疫苗。

DNA疫苗是90年代新兴的一种以重组DNA形式进行免疫的一项新技术。技术的核心是将编码抗原的DNA序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中构建DNA疫苗，然后采用不同的方式将重组质粒导入到动物体内，重组的DNA疫苗可以利用宿主体内的酶系合成外源基因编码的蛋白，从而诱发宿主对该外源蛋白产生免疫应答，表达产物既可激活体液免疫，又能激活细胞免疫，从而可以达到预防和治疗疾病的效果，不仅如此，这一新技术还避开了蛋白疫苗在制备过程中复杂而昂贵的工艺，具有安全、长效、稳定、操作简便等特点。因此疫苗DNA具有其它免疫方法难以比拟的潜在优势。近年美国NIH以国家生物战略发展计划的专项经费资助开展DNA疫苗治疗重大疾病的研究。2002年欧盟第五框架、2003年欧盟第六框架生命科学部分均给予发展基因免疫技术治疗肿瘤、爱滋病的课题以优先资助。DNA疫苗引发的第三次疫苗革命为一些长期以来无法预防或预防效果不理想的传染病的预防和治疗带来希望。许多动物模型和人体实验都证明了DNA疫苗能激发有效的体液免疫应答和细胞免疫应答既可激活体液免疫，又能激活细胞免疫，表明DNA免疫技术，不仅能通过产生抗体预防病毒感染，更重要的是DNA疫苗可诱导极有效的专一性T杀伤细胞的能力，清除已经被感染的机体细胞，达到治疗的目的，而且没有副作用反应，这一点是该技术最诱人之处，也充分显示出DNA疫苗的巨大潜力和应用前景。

DNA疫苗与常用的疫苗相比，具有明显的优势，首先基因免疫所需的免疫量较小，20-100微克即可。其次基因免疫与病毒感染诱发的免疫反应十分相似，但基因免疫能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力强。第三基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。它既能通过B淋巴细胞免疫诱导产生保护性抗体，又能形成更为有效的T淋巴细胞免疫。

SARS病毒是一种新型的冠状病毒(即RNA病毒)，感染人体后，目前还没有治疗SARS的有效药物。现今，国内外科学家都在对SARS进行研究，以期早日找到预防SARS病毒的抗SARS疫苗方法。正在研究中有的灭活疫苗和减毒疫苗，其中的灭活疫苗没有解决免疫病理方面的问题，通常有些灭活病毒进入人体会在病毒入侵时加重病情；而减毒疫苗则要费很长时间使病毒繁殖许多代，然后逐渐减除病毒的大部分活性，也不能满足需要，这种疫苗对免疫预防SARS病毒也不合适。WHO专家认为：SARS的理想疫苗应是高效的、绝对安全的、适用于各类人群的、可大量生产且便于储运和方便使用。DNA疫苗恰好能满足这些条件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术还没有将基因疫苗应用于预防和治疗SARS病毒的空白，从而提供一种可以预防和治疗SARS病毒的基因疫苗，该疫苗由含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段与哺乳动物表达载体pVAX1组成，所述的真核质粒表达载体pVAX1为可用于人的真核表达载体，是经美国FDA认可的。

本发明的另一目的是提供该基因疫苗的构建。

本发明的再一目的是提供该基因疫苗的用途。

本发明的目的是由如下的技术方案实现的：

本发明提供一种抗SARS病毒的基因疫苗，该疫苗由基因文库中登录号为AY278487的26386-227054片段(图1中所示的序列1)编码的SARS病毒N蛋白、28120-29388片段(图2中所示的序列2)编码的M蛋白和2486-2935片段(图3中所示的序列3)编码的RNA聚合酶基因cDNA与哺乳动物表达载体pVAX1组成，所述登录号为AY278487的基因是SARS病毒S蛋白表面抗原决定簇分子，由北京华大基因研究中心提供。

本发明提供一种所述抗SARS病毒的基因疫苗的构建，包括如下步骤：

1)将含有SARS病毒N蛋白、M蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段和pGEM-tEasyvector载体的质粒引入DH5a菌株，按常规方法分别挑含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段克隆载体的单菌落、摇菌，提含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆载体；所述的SARS病毒N蛋白、M蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段分别由基因文库中登录号为AY278487的26386-227054、28120-29388和2486-2935基因所编码；

2)设计的用于扩增SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的引物序列分别为：

M蛋白

上游引物：5′-CGCGGATCCACC ATGGCAGACAACGGTACTATTACC-3′

下游引物：5′-CGCGGATCC TTACTGTACTAGCAAAGCAA-3′

N蛋白

上游引物：5′-CGCGGATCCACC ATGTCTGATAATGGACCCCAATCAA-3′

下游引物：5′-CGCGGATCC TTATGCCTGAGTTGAATCAG-3′

RNA聚合酶

上游引物：5′-CCGTATTCATGGGTGATTCACATGACA-3′

下游引物：5′-ATAACAAACTGGTTGTAAAGTCTTC-3′

3)用聚合酶链式扩增方法，从步骤1)得到的质粒克隆分别得到SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；

4)将步骤3)扩增的N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化；

5)将步骤4)纯化的SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重组到哺乳动物特殊表达载体pVAX1中，构建成抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-MNRna疫苗。

所述步骤3)的聚合酶链式扩增方法为：在95℃反应5分钟；在94℃持续1分钟，在56℃持续1分钟，在72℃持续1分钟，反复加温冷却共40个循环；最后在71℃延伸10分钟。

本发明进一步提供了所述抗SARS病毒的基因疫苗在制备用于预防SARS的药物中的应用。

本发明还提供了所述抗SARS病毒的基因疫苗在制备用于治疗SARS的药物中的应用。

本发明提供的抗SARS的基因疫苗优益之处在于：本发明是经克隆、筛选得到目标基因-N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，并以此首次制备了可以用于抗SARS的基因疫苗，该疫苗具有病毒易识别、有高度特异性、其他生物机体所没有的、且又能引起机体产生高效免疫应答的特性；

该疫苗不仅能通过B淋巴细胞免疫诱导机体产生保护性抗体，而且可以诱导极有效的专一性T杀伤细胞的能力，这种抗SARS新疫苗通过调动患者体内的免疫系统杀灭SARS病毒，达到治疗SARS的目的，从而达到预防和治疗SARS病毒的目的；与当前常用的疫苗相比，该基因疫苗达到相同免疫效果所需的量小，20-100微克即可；该基因疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比常用免疫手段免疫效果更强；使用本基因疫苗免疫安全、长效、稳定、操作便捷。本基因疫苗可在常温下运输。

附图说明

图1为序列1——基因文库中登录号为AY278487的26398-27063片段；

图2为序列2——基因文库中登录号为AY278487的28120-29388片段；

图3为序列3——基因文库中登录号为AY278487的2486-2935片段。

具体实施方式

实施例1.本发明的抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-MNRna疫苗的构建

本发明提供的pVAX1-SARS-MNRna基因疫苗的构建步骤如下：

1)将含有SARS病毒N蛋白、M蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段和pGEM-tEasyvector载体的质粒引入DH5a菌株，按常规方法分别挑含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段克隆载体的单菌落、摇菌，提含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆载体；所述的SARS病毒N蛋白、M蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段分别由基因文库中登录号为AY278487的26386-227054(图1所示的序列1)、28120-29388(图2所示的序列2)和2486-2935(图3所示的序列3)的基因编码，均由北京华大基因研究中心提供；

2)设计的用于扩增SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的引物序列分别为：

M蛋白

上游引物：5′-CGCGGATCCACC ATGGCAGACAACGGTACTATTACC-3′

下游引物：5′-CGCGGATCC TTACTGTACTAGCAAAGCAA-3′

N蛋白

上游引物：5′-CGCGGATCCACC ATGTCTGATAATGGACCCCAATCAA-3′

下游引物：5′-CGCGGATCC TTATGCCTGAGTTGAATCAG-3′

RNA聚合酶

上游引物：5′-CCGTATTCATGGGTGATTCACATGACA-3′

下游引物：5′-ATAACAAACTGGTTGTAAAGTCTTC-3′

3)用聚合酶链式扩增方法，从步骤1)得到的质粒克隆分别得到SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；

PCR程序：

95℃ 5min

  ↓

94℃ 1min 56℃ 1min 72℃ 1min共40个循环

  ↓

71℃ 10min

4)将步骤3)扩增的N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化；

5)将步骤4)纯化的SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重组到哺乳动物特殊表达载体pVAX1中，构建成抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-MNRna疫苗；

将rmCGβ全长氨基酸编码序列的cDNA片段重组到pVAX1真核表达质粒中：用连接反应液转化感受态细胞Top10F’，取80ul转化的菌液涂布LB(含氨苄青霉素)平板，于37℃培养过夜；挑取菌落摇菌过夜，用碱裂法提取质粒DNA，即本实施例的pVAX1-SARS-MNRna，进行酶切鉴定并对阳性重组质粒进行测序；将有正向插入了SARS-MNRna扩增产物外源DNA片断的重组克隆质粒经纯化后利用克隆质粒测序引物M13反向引物(reverse primer)和T7启动子引物(promoter primer)对pVAX1-SARS-MNRna扩增产物双向测序；

6)构建的抗SARS的pVAX1-SARS-MNRna基因疫苗，免疫小鼠和转染HeLa细胞后检测体内外mRNA表达，

RT-PCR程序为：

45℃ 55min

  ↓

94℃ 5min

  ↓

94℃ 1min 55℃ 1min 68℃ 1min共40个循环

  ↓

64℃ 10min

所述步骤6)的逆转录-聚合酶链式扩增方法包括：逆转录反应在45℃反应55分钟，接着在94℃灭活5分钟，并启动逆转录-聚合酶链式扩增方法扩增反应：在第一个变性步骤时加入聚合酶，变性温度为94℃，持续1分钟，退火温度从55℃开始，持续1分钟，然后以每两个循环下降1℃的速度降至55℃，持续1分钟，延伸温度为68℃，持续40秒；最后在以退火温度60℃分钟继续扩增15个循环；最后在64℃延伸10分钟。

实施例2.pVAX1-SARS-MNRna疫苗的外源mRNA的体外表达和表达含量的鉴定

建立Hela细胞、CHO细胞体外瞬时表达系统，将实施例1中构建的pVAX1-SARS-MNRna表达质粒经脂质体转染，分别于24小时、48小时、72小时收集培养液，采用RT-PCR、激光共聚焦间接免疫荧光检测等方法鉴定重组真核表达载体pVAX1-SARS-MNRna疫苗体外瞬时表达及含量，可知pVAX1-SARS-MNRna真核表达质粒在Hela细胞、CHO细胞体外瞬时表达系统中在mRNA水平上能高效表达，mRNA水平的表达量比对照组(空质粒)高出151％。

实施例3.pVAX1-SARS-MNRna疫苗的体外蛋白水平表达的鉴定

建立Hela细胞、CHO细胞体外瞬时表达系统，将实施例1中构建的pVAX1-SARS-MNRna真核表达质粒经脂质体转染，分别于24小时、48小时、72小时加入，pVAX1-SARS-MNRna免疫后的BALB/C小鼠血清，采用激光共聚焦间接免疫荧光(immunofluorescence)检测、RT-PCR、ELISA(酶联免疫吸附试验)等方法鉴定重组真核表达载体pVAX1-SARS-MNRna疫苗体外瞬时表达及含量，可知pVAX1-SARS-MNRna真核表达质粒在Hela细胞、CHO细胞体外瞬时表达系统中在蛋白水平上能高效表达，蛋白水平的表达量比对照组(空质粒)高168％。

实施例4.pVAX1-SARS-MNRna在体内RNA的mRNA表达的检测

提取pVAX1-SARS-MNRna免疫小鼠肌肉细胞后第6周时收集的肌肉组织总RNA，利用扩增SARS病毒RNA聚合酶cDNA片段时采用的引物及RT-PCR方法，扩增cDNA条带，由检测结果可知，pVAX1-SARS-MNRna基因疫苗免疫后，肌肉细胞中RNA在mRNA水平上表达，mRNA水平的表达量比对照组(空质粒)高出243％。

实施例5.酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹法(Western-Blotting)与激光共聚焦间接免疫荧光检测小鼠免疫后的体液免疫应答

用1∶50倍稀释的正常血清作为对照，收集pVAX1-SARS-MNRna免疫小鼠的血清按1∶100和1∶1000的比例稀释，采用激光共聚焦间接免疫荧光检测等方法鉴定重组真核表达载体pVAX1-SARS-MNRna疫苗体内抗体表达及含量，由检测结果可知，pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗免疫接种BALB/C小鼠，20μg的剂量能诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答。从检测的第2周开始，免疫反应的滴度持续升高，在第6周时上升接近顶峰，抗体滴度最高可达1∶4200，显著高于对照组。

分别在原核表达系统DL21(PET21-N)和真核表达系统CHO获得了N蛋白，并获得了纯化的N蛋白。经Western-Blotting及ELISA技术鉴定证明融合pVAX1-SARS DNA疫苗免疫小鼠后诱导激活机体免疫系统产生抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体。结果显示pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗能有效激发小鼠产生抗原特异性的体液免疫应答。

实施例6.细胞免疫检测

用pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗免疫接种BALB/C小鼠后8周T淋巴细胞检测CTL的抗原特异性杀伤活性。在经过特异性抗原蛋白M蛋白、N蛋白的致敏处理后的T淋巴细胞的CTL活性检测结果：T细胞毒淋巴细胞的抗原特异性杀伤活性在不同的E∶T比例中：50∶1达到35％，25∶1时达到24％，与对照组相比差异显著(p＜0.01)，结果说明pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗在BALB/c小鼠体内诱导产生了抗原特异性的细胞免疫应答。细胞增殖实验亦表明特异性抗原可以诱导淋巴细胞的增殖反应。

实施例7.细胞因子检测

经过分别用特异性抗原蛋白M蛋白、N蛋白的致敏处理或完全失活的SARS病毒致敏处理后，在pVAX1-SARS-SR小鼠中IL-2，IFN-γ，IILL-4，TNF-α，TGF-β均有表达。

实施例8.疫苗体外SARS病毒实验(由CDC合作完成)

我们送给中国疾病预防控制中心病毒病研究所(CDC)30份pVAX1-SARS-MNRnaDNA疫苗免疫小鼠的血清，其中对照血清样品6份。体外SARS活病毒中和实验证实：融合pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗免疫小鼠的血清能完全中和SARS病毒。Westem-Blotting及ELISA技术检测证实融合pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗免疫小鼠后能产生抗SARS病毒的特异性抗体。

实施例9.疫苗体内SARS病毒实验(由中国医学科学院动物研究所合作)

1.恒河猴SARS动物模型实验

7只恒河猴分为两组：一组注射生理盐水作为对照组(N＝3)，一组(N＝4)注射融合pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗50μg每隔一周注射一次共三次。注射融合pVAX1-SARS-MNRna DNA疫苗后40天，7只恒河猴分别注射同剂量的SARS活病毒，攻毒后第二天从7只猴取咽拭子分离SARS病毒，注射疫苗组与对照组均呈阳性，15天、20天后注射疫苗组均呈阴性(即分离后未见SARS病毒)，而对照组均呈阳性(即分离后有SARS病毒)；攻毒后第二天和第五天分别从7只猴取血浆分离SARS病毒，注射疫苗组与对照组均呈阳性，15天、20天后注射疫苗组均呈阴性(即分离后未见SARS病毒)，而对照组均呈阳性(即分离后有SARS病毒)；第二十一天从安乐处死的7只猴分别取肺、肾、脾、肝、淋巴结，注射疫苗组均呈阴性。血常规检测，注射疫苗组均呈正常。

2.布氏田鼠SARS动物模型实验

十六只布氏田鼠为两组：一组注射生理盐水(对照组，N＝5)，另一组(N＝11)注射融合pVAX1-SARS-MNRnaDNA疫苗20μg共三次。注射融合pVAX1-SARS DNA疫苗后30天，十六只布氏田鼠送到中国医学科学院动物研究所，分别注射同剂量的SARS活病毒，5天后对照组死亡4只，动物死亡前呈呼吸困难，口鼻出血等明显的SARS症状，而注射疫苗组未见死亡，且一直存活15天后安乐死亦未见其它异常症状。

实施例10.安全性检测

通过长期观察，注射疫苗的小鼠没有明显饮食、行为、毛等变化；病理切片表明心、肝、脾、肺、肾、脑等器官无明显病理变化。

异种核酸疫苗在理论上整合到染色体上的可能性比同种核酸疫苗小的多，这就一定程度上有效的解决了长期困扰核酸疫苗的整合安全问题。

F1代小鼠未检测到质粒DNA。

                           FPI04035 sequence list.txt

            SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院动物研究所

    北京华大基因研究中心

<120>一种抗SARS病毒的基因疫苗及其构建和应用

<130>FPI04035

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>666

<212>DNA

<213>coronavirus

<400>1

atggcagaca acggtactat taccgttgag gagcttaaac aactcctgga acaatggaac    60

ctagtaatag gtttcctatt cctagcctgg attatgttac tacaatttgc ctattctaat    120

cggaacaggt ttttgtacat aataaagctt gttttcctct ggctcttgtg gccagtaaca    180

cttgcttgtt ttgtgcttgc tgctgtctac agaattaatt gggtgactgg cgggattgcg    240

attgcaatgg cttgtattgt aggcttgatg tggcttagct acttcgttgc ttccttcagg    300

ctgtttgctc gtacccgctc aatgtggtca ttcaacccag aaacaaacat tcttctcaat    360

gtgcctctcc gggggacaat tgtgaccaga ccgctcatgg aaagtgaact tgtcattggt    420

gctgtgatca ttcgtggtca cttgcgaatg gccggacact ccctagggcg ctgtgacatt    480

aaggacctgc caaaagagat cactgtggct acatcacgaa cgctttctta ttacaaatta    540

ggagcgtcgc agcgtgtagg cactgattca ggttttgctg catacaaccg ctaccgtatt    600

ggaaactata aattaaatac agaccacgcc ggtagcaacg acaatattgc tttgctagta    660

cagtaa                                                               666

<210>2

<211>1288

<212>DNA

<213>coronavirus

<400>2

caaattaaaa tgtctgataa tggaccccaa tcaaaccaac gtagtgcccc ccgcattaca    60

tttggtggac ccacagattc aactgacaat aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg    120

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                                         FPI04035 sequence list.txt

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<210>3

<211>460

<212>DNA

<213>coronavirus

<400>3

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ctcaagaacg gtgaactcga agcactcgag acgcccgttg atagcttcac aaatggagct    120

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caatactgcg cattgtctcc tggtttactg gctacaaaca atgtctttcg cttaaaaggg    240

ggtgcaccaa ttaaaggtgt aacctttgga gaagatactg tttgggaagt tcaaggttac    300

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gaggctgttg tgaagacttt acaaccagtt tctgatctcc                          460

Claims (8)

1、一种抗SARS病毒的基因疫苗，该疫苗由图1中所示的序列1编码的SARS病毒N蛋白、图2中所示的序列2编码的M蛋白和图3中所示的序列3编码的RNA聚合酶基因cDNA与表达载体pVAX1组成。

2、如权利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗，其特征在于，所述的序列1为基因文库中登录号为AY278487的26398-27063片段。

3、权利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗，其特征在于，所述的序列2为基因文库中登录号为AY278487的28120-29388片段。

4、权利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗，其特征在于，所述的序列3为基因文库中登录号为AY278487的2486-2935片段。

5、一种权利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗的构建，包括如下步骤：

1)将含有SARS病毒N蛋白、M蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段和pGEM-tEasyvector载体的质粒引入DH5a菌株，按常规方法分别挑含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段克隆载体的单菌落、摇菌，提含有SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆载体；所述的SARS病毒N蛋白、M蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段分别由基因文库中登录号为AY278487的26386-227054、28120-29388和2486-2935基因所编码；

2)设计的用于扩增SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的引物序列分别为：

M蛋白

上游引物：5′-CGCGGATCCACC ATGGCAGACAACGGTACTATTACC-3′

下游引物：5′-CGCGGATCC TTACTGTACTAGCAAAGCAA-3′

N蛋白

上游引物：5′-CGCGGATCCACC ATGTCTGATAATGGACCCCAATCAA-3′

下游引物：5′-CGCGGATCC TTATGCCTGAGTTGAATCAG-3′

RNA聚合酶

上游引物：5′-CCGTATTCATGGGTGATTCACATGACA-3′

下游引物：5′-ATAACAAACTGGTTGTAAAGTCTTC-3′

3)用聚合酶链式扩增方法，从步骤1)得到的质粒克隆分别得到SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；

4)将步骤3)扩增的N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化；

5)将步骤4)纯化的SARS病毒N蛋白、M蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重组到哺乳动物特殊表达载体pVAX1中，构建成抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-MNRna疫苗。

6、如权利要求2所述的抗SARS病毒的基因疫苗的构建，其特征在于：所述步骤3)的聚合酶链式扩增方法为：在95℃反应5分钟；在94℃持续1分钟，在56℃持续1分钟，在72℃持续1分钟，反复加温冷却共40个循环；最后在71℃延伸10分钟。

7、一种权利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗在制备用于预防SARS的药物中的应用。

8、一种权利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗在制备用于治疗SARS的药物中的应用。