CN115887633A - 一种猪δ冠状病毒基因工程亚单位疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猪δ冠状病毒基因工程亚单位疫苗及其应用，涉及兽用生物制品领域。所述猪δ冠状病毒基因工程亚单位疫苗包含重组PDCoV‑S蛋白或重组PDCoV‑RBD蛋白；所述重组PDCoV‑S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述重组PDCoV‑RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明利用杆状病毒表达系统表达的重组蛋白纯化工艺简便，便于大规模生产。本发明所述方法制备的猪δ冠状病毒基因工程亚单位疫苗填补了国内外尚无猪δ冠状病毒亚单位疫苗的空白，可用于预防猪δ冠状病毒的感染。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪δ冠状病毒基因工程亚单位疫苗及其应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(PDCoV)是一种新发的猪肠道致病性冠状病毒，可引起新生仔猪水样腹泻、呕吐和脱水，给养猪业造成巨大经济损失。疫苗接种是控制PDCoV疾病和保护仔猪免受PDCoV感染的有效措施。然而，目前尚无针对PDCoV的商品化疫苗。PDCoVS蛋白在病毒进入和感染中起重要作用，是疫苗研发的候选抗原。RBD中含有S蛋白的B细胞表位，是亚单位疫苗研发关注的焦点。因此，本发明制备的亚单位疫苗以S蛋白的全长、RBD区域作为抗原。
Bac-to-
杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system,BEVs)是近年来发展十分迅速的一种真核表达系统。该表达系统具有外源基因容量大，重组蛋白表达量高，可对目的蛋白进行表达后修饰，易于大规模生产和生物安全性高等优点。因此，BEVs已被认作一种在昆虫细胞中大量表达重组蛋白的强大表达载体，可以为亚单位疫苗的研发提供技术支持。
本发明利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中大量表达重组PDCoV-S和PDCoV-RBD蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗，对PDCoV的防控具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明目的在于提供一种猪δ冠状病毒基因工程亚单位疫苗及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：一种猪δ冠状病毒亚单位疫苗，包含重组PDCoV-S蛋白或重组PDCoV-RBD蛋白；所述重组PDCoV-S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述重组PDCoV-RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，所述重组PDCoV-S蛋白的编码基因如SEQ ID No.3所示。
进一步的，所述重组PDCoV-RBD蛋白的编码基因如SEQ ID No.4所示。
进一步的，所述重组PDCoV-S蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)将如SEQ ID No.3所示的基因克隆到表达载体上，构建得到重组质粒；
2)将所述重组质粒转染至真核细胞表达，再经蛋白纯化，得到所述猪δ冠状病毒重组蛋白。
进一步的，所述重组PDCoV-RBD蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)将如SEQ ID No.4所示的基因克隆到表达载体上，构建得到重组质粒；
2)将所述重组质粒转染至真核细胞表达，再经蛋白纯化，得到所述猪δ冠状病毒重组蛋白。
进一步的，所述猪δ冠状病毒亚单位疫苗还包括药学上可接受的佐剂。
进一步的，所述佐剂为GEL01或M103。
本发明还提供了一种表达载体，包含如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的基因。
本发明还提供了一种真核细胞，包含如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的基因。
本发明还提供了以下(1)-(4)任一项的物质在制备猪δ冠状病毒亚单位疫苗中的应用：
(1)氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的重组蛋白；
(2)核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的基因；
(3)权利要求8所述的表达载体；
(4)权利要求9所述的真核细胞。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过利用杆状病毒表达系统表达PDCoV-S和PDCoV-RBD蛋白，构建表达质粒通过昆虫细胞表达重组蛋白，利用杆状病毒表达系统表达的重组蛋白纯化工艺简便，便于大规模生产。同时，本发明进一步利用杆状病毒表达系统获得的重组蛋白制备了亚单位疫苗，该疫苗具有安全性高、免疫原性好、生产成本低，能够诱导小鼠和仔猪产生良好的免疫应答等优点，为PDCoV的防控奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是目的基因与载体构建示意图，其中A是pFast Bac Ⅰ-S质粒图谱；B是pFastBac Ⅰ-RBD质粒图谱；
图2是pFast Bac Ⅰ-S和pFast Bac Ⅰ-RBD双酶切验证结果，其中A是pFast Bac Ⅰ-S质粒EcoR I和BamH I双酶切鉴定结果，酶切片段大小为4752bp和3354bp，M：DNA分子量标准DL5000，泳道1-3为pFast Bac Ⅰ-S质粒；B是pFast Bac Ⅰ-RBD质粒EcoR I和BamH I双酶切鉴定结果，酶切片段大小为4752bp和540bp，M：DNA分子量标准DL5000，泳道1-3为pFastBac Ⅰ-RBD质粒；
图3是重组质粒Bacmid-S和Bacmid-RBD用M13通用引物鉴定结果核酸凝胶电泳图，其中A是Bacmid-S阳性质粒PCR鉴定结果，M：DNA分子量标准DL5,000，泳道1-9为重组载体Bacmid-S，10为空白对照；B是Bacmid-RBD阳性质粒PCR鉴定结果，M：DNA分子量标准DL5000，泳道1-6为重组载体Bacmid-RBD，7为空白对照；
图4是Westernblot鉴定重组质粒Bacmis-S和Bacmis-RBD在Sf9细胞中表达情况的结果图，M是蛋白质分子质量标准，泳道1是转染Bacmid-S的Sf9细胞，泳道2是转染Bacmid-RBD的Sf9细胞，泳道3是正常Sf9细胞；
图5是间接免疫荧光鉴定重组质粒Bacmis-S和Bacmis-RBD在Sf9细胞中表达情况的结果图；
图6是PDCoV-S蛋白纯化结果；
图7是PDCoV-RBD蛋白纯化结果；
图8是用本发明实施例的重组蛋白制备疫苗免疫后小鼠血清中IgG抗体检测结果图；
图9是免疫后小鼠血清中和抗体效价检测结果图；
图10是免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖结果图；
图11是免疫后小鼠脾细胞上清中细胞因子含量结果图，其中A是免疫小鼠脾细胞上清中IFN-γ含量，B是免疫小鼠脾细胞上清中IL-4含量；
图12和图13是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3+CD4+亚型比例结果的图，其中图13中的A是PBS组，B是S+GEL01免疫组，C是S+M103免疫组，D是RBD+GEL01免疫组，E是RBD+M103免疫组，F是PDCoV灭活病毒+GEL01免疫组，G是PDCoV灭活病毒+M103免疫组；
图14和图15是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3+CD8+亚型比例结果的图，其中图15中的A是PBS组，B是S+GEL01免疫组，C是S+M103免疫组，D是RBD+GEL01免疫组，E是RBD+M103免疫组，F是PDCoV灭活病毒+GEL01免疫组，G是PDCoV灭活病毒+M103免疫组；
图16是用本发明实施例的重组蛋白制备疫苗免疫后仔猪血清中IgG抗体检测结果图；
图17是免疫后仔猪血清中和抗体效价检测结果图；
图18是免疫后仔猪外周血单核细胞增殖结果图；
图19是免疫后仔猪外周血单核细胞中细胞因子相对mRNA表达水平。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。
实施例1 PDCoV-S和PDCoV-RBD蛋白的表达与纯化
本实施例以PDCoV病毒(GenBank：OK546242)的S基因序列和RBD基因序列为基础，通过南京金斯瑞生物科技有限公司进行优化合成。优化后基因序列的C端带有6个组氨酸(His)标签，N端带有蜂素分泌信号肽(Honeybee melittin signal peptide，Mels)，优化后的核酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。使用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ两个酶切位点将基因克隆到pFast Bac Ⅰ载体上，构建含有优化基因序列的pFast Bac Ⅰ-S和pFast Bac Ⅰ-RBD质粒，图1示出了pFast Bac Ⅰ-S和pFast Bac Ⅰ-RBD质粒示意图。
将合成的pFast Bac Ⅰ-S和pFast Bac Ⅰ-RBD质粒分别通过双酶切试验进行验证，图2分别示出了pFast Bac Ⅰ-S和pFast Bac Ⅰ-RBD质粒双酶切鉴定结果图。
将鉴定正确的pFast Bac Ⅰ-S和pFast Bac Ⅰ-RBD质粒分别转化大肠杆菌DH10BacE coli感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)，获得Bacmid-S和Bacmid-RBD重组质粒，图3示出了Bacmid-S和Bacmid-RBD重组质粒PCR鉴定结果图。
将鉴定正确的重组质粒Bacmid-S和Bacmid-RBD通过转染试剂X-tremeGENETMHPDNA(购自Roche公司)分别转染Sf9昆虫细胞(武汉普诺赛生物科技有限公司)，通过Western blot和间接免疫荧光方法鉴定重组S蛋白和RBD蛋白的表达。
质粒转染至细胞培养72h后，收获病毒上清，4℃避光保存，加入少量PBS覆盖细胞表面进行润洗，弃掉PBS。在24孔细胞板中每孔加入150μL含PMSF的RIPA蛋白裂解液(购自碧云天生物技术有限公司)，用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，细胞板置于冰上裂解10min，充分裂解后，将细胞裂解液转移至1.5mL离心管中，14000g离5min，取上清，加入37.5μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer(购自碧云天生物技术有限公司)，混匀后100℃水浴10min使蛋白变性，用于后续的Western blot。结果如图4所示，在180kDa和20kDa处分别出现了一条特异性的条带，对照细胞无条带，证明重组蛋白在昆虫细胞中成功表达。
将生长状态良好Sf9细胞提前一天接至24孔板中，细胞密度约1.5-2.5×106cells/mL，27℃恒温培养箱静置培养24h，使细胞贴壁；将汇合度约为70％的细胞，弃掉培养基，用PBS清洗2遍，更换新鲜培养基。按照1％的接毒量接种重组杆状病毒，细胞板放置在27℃恒温培养箱培养；接毒后72h，观察到细胞出现明显病变，收集上清4℃保存。细胞使用PBS洗涤三次，按500μL/孔的量加入无水乙醇于4℃下固定30min。固定结束后用PBS洗涤三次，加入500μL小鼠抗His标签单克隆抗体(购自Proteintech公司)，37℃恒温培养箱孵育60min。孵育结束后用PBS洗涤三次，加入500μL FITC标记山羊抗小鼠单克隆抗体(购自Beyotime生物公司)，37℃恒温培养箱孵育50min。孵育结束后，PBS洗涤二次后加入DAPI染液作用10min。染色后用PBS洗涤三次，使用倒置荧光显微镜观察荧光情况。结果如图5所示，接毒后的Sf9昆虫细胞内出现明显的绿色荧光，未接毒的Sf9昆虫细胞没有绿色荧光，证明重组蛋白在Sf9昆虫细胞中成功表达。
准备2瓶60mL的High Five细胞(本生(天津)健康科技有限公司)悬液，加3mL重组杆状病毒到细胞摇瓶中，混匀后置于27℃110rpm转速的恒温摇床中培养。培养96h后，收取蛋白。将细胞悬液装入50mL离心管中，9000rpm离心10min，收取细胞培养基进行蛋白纯化。
其中，所得到的PDCoV-S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQID No.3所示。
所得到的PDCoV-RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
接下来，采用Cytiva His TrapTM HP镍柱对上述得到的蛋白质进行进一步纯化，具体操作如下：
(1)分别用5倍柱体积的ddH2O和20mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)平衡镍柱；
(2)蛋白溶液通过NGC系统，A泵流经镍柱，此步重复一次；
(3)使用10倍柱体积的20mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)，经B泵流经镍柱进行漂洗，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；
(4)使用10倍柱体积的500mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、500mM咪唑)洗脱目的蛋白，以1mL/min流速洗脱柱子上的目的蛋白，收集洗脱液储存在1.5mL EP管内，每管1mL分别收集。经SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯化效果。
纯化结果如图6和图7所示，使用低浓度咪唑(20mmol/L)可以将大部分杂蛋白洗脱下来，接下来使用高浓度咪唑(500mmol/L)洗脱目的蛋白。
实施例2重组蛋白的小鼠免疫试验
分别使用市售的GEL01和M103佐剂与实施例1制备纯化的重组蛋白混合来制备亚单位疫苗。
将实施例1中纯化的重组蛋白与GEL01佐剂按体积比4:1混合制得亚单位疫苗，于4℃保存备用。将实施例1中纯化的重组蛋白与M103佐剂按体积比1:1混合制得亚单位疫苗，于4℃保存备用。将实验室分离的PDCoV株病毒液，经β-丙内酯进行灭活后，与上述佐剂以同样比例混合制成灭活病毒疫苗。
将56只BALB/c雌性实验小鼠随机分为7组，命名为G1-G7组，每组8只小鼠。每只小鼠肌肉注射100μL。共免疫三次，小鼠首免后14d二免，28d加强免疫一次，42d剖杀。每次免疫14d后通过内眦静脉丛进行采血，分离血清，检测小鼠血清抗体水平。第三次免疫14d后，进行小鼠眼球采血，分离血清，同时分离小鼠脾淋巴细胞，用于检测淋巴细胞增殖和脾淋巴细胞亚型比例。
表1小鼠免疫方案
1.免疫小鼠血清中IgG抗体水平测定
通过间接ELISA检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平，具体操作如下：
(1)S蛋白作为包被抗原蛋白，用pH9.6的碳酸盐缓冲液进行包被，按照4ng/μL的浓度进行稀释，加入到聚苯乙烯微量滴定板中，100μL/孔，4℃过夜。
(2)第二天弃去液体，使用每孔加200μL PBST，洗涤三次，每次5min。
(3)用PBS配制5％的脱脂乳，200μL/孔，37℃封闭2h。弃去封闭液后，使用PBST洗三次，每次5min。
(4)用PBS稀释血清，取三次免疫后采集的血清，阴性血清为PBS免疫小鼠后采集的血清，按照1:50的比例，100μL/孔，37℃孵育1h，弃去一抗后PBST洗三次，每次5min。
(5)用PBS稀释羊抗鼠HRP-IgG，比例为1:5000，100μL/孔，37℃孵育1h，弃去二抗后使用PBST洗三次，每次5min。
(6)加入TMB 100μL/孔，室温避光作用10min。
(7)加入终止液(2M H2SO4)50μL/孔终止反应，用酶标仪读取OD450nm值。
结果如图8所示，经三次免疫后，小鼠血清中的IgG抗体水平逐渐上升。S蛋白免疫组产生IgG抗体水平明显高于灭活病毒免疫组及RBD蛋白免疫组。首免后42d，S+M103免疫组产生的IgG抗体水平与S+GEL01免疫组无显著差异(P>0.05)，但显著高于其他免疫组(P<0.05)。
2.免疫小鼠血清中和抗体水平
(1)将所有血清分装后放入水浴锅中56℃，灭活30min；
(2)在96孔细胞培养板上，将已灭活处理的血清做倍比稀释，分别为2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8，每孔终体积50μL，每个稀释度做2个重复孔；
(3)将PDCoV病毒液用DMEM培养基稀释成100TCID50/50μL；
(4)取50μL病毒液加入上述血清稀释板中，37℃5％CO2温箱中中和1h；
(5)待96孔板上长满单层LLC-PK1细胞，弃去细胞培养基，用DMEM清洗二遍，每孔加入100μL血清和病毒的混合液，37℃5％CO2温箱中培养吸附2.5h；
(6)用DMEM洗两遍，更换含有7.5μg/mL胰酶的纯DMEM维持液，放入温箱中培养，12h后开始逐日观察记录。
同时设置阴性血清和阳性血清对照。以完全抑制细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)的血清的最大稀释度为该血清的中和效价。
结果如图9所示，首免后42d的小鼠血清中和抗体检测结果表明，S蛋白免疫组产生中和抗体水平显著高于PBS组(P<0.01)，其中S+M103免疫组产生的中和抗体滴度(29)高于S+GEL01免疫组(28)，但组间无显著性差异(P>0.05)。灭活病毒免疫组产生的中和抗体滴度分别为28和27，显著高于PBS组(P<0.01)。RBD+M103免疫组与RBD+GEL01免疫组产生的中和抗体滴度分别为25和26，两免疫组间无显著差异(P>0.05)。其中，RBD+M103免疫组显著高于PBS组(P<0.01)。总之，中和抗体滴度：S蛋白免疫组>灭活病毒免疫组>RBD蛋白免疫组。
3.流式细胞术检测免疫小鼠脾淋巴细胞亚型比例
3.1脾淋巴细胞的制备
(1)颈椎脱位法处死小鼠，置于75％酒精浸泡5min，达到消毒的目的；
(2)小鼠侧放于无菌平皿，侧放有利于暴露脾脏位置，在超净工作台取出小鼠脾脏，置于24孔板中，孔中装有500μL不含牛血清的RPMI-1640培养液；
(3)50mL离心管上放置一个40μm细胞筛，将小鼠脾脏放置在细胞筛上，加1mLRPMI-1640培养基，用无菌注射器活塞顶部仔细研磨，加4mL RPMI-1640培养基冲洗活塞和细胞筛；
(4)将脾细胞研磨液1200r/min离心10min，弃掉上清，加入5mL红细胞裂解液，37℃静置5min；
(5)红细胞被充分裂解后，1200r/min离心10min，弃掉上清，加入5mL RPMI-1640培养基1200r/min离心10min，弃去上清，重复2次；
(6)用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞。
3.2 CCK-8法检测小鼠脾淋巴细胞增殖
按1×105/孔的细胞数，将脾淋巴细胞接种到96孔细胞板中，待细胞贴壁后，实验组每孔加终浓度为10μg/mL的刀豆素A(ConA)作为刺激源，阴性对照组加入等体积的RPMI-1640，每个样品设置3个重复孔；含细胞的RPMI-1640培养基作为空白对照，设置3个重复孔。37℃，5％CO2环境中培养72h。然后按照10μL/孔的剂量加入CCK-8试剂，继续孵育1-4h后，使用酶标仪检测OD450nm处的吸光值。
计算刺激指数(Stimulation Index，SI)，SI＝(OD实验组-OD空白组)/(OD阴性组-OD空白组)。
结果如图10所示，首免后42天，M103佐剂免疫组增殖水平显著高于PBS组(P<0.05)，GEL01佐剂组与PBS组相比无显著差异(P>0.05)。S+M103佐剂的增殖效果显著高于S+GEL01佐剂(P<0.01)，RBD+M103佐剂的增殖效果显著高于RBD+GEL01佐剂(P<0.05)，S+M103免疫组增殖效果最好。
3.3小鼠细胞因子的检测
使用3.2中收集的脾细胞上清液对IFN-γ和IL-4等细胞因子进行检测。
使用小鼠γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫分析试剂盒并参考试剂盒内说明书对脾脏淋巴细胞上清IFN-γ浓度进行检测。
使用小鼠白介素-4(IL-4)酶联免疫分析试剂盒并参考试剂盒内说明书对脾脏淋巴细胞上清IL-4浓度进行检测。
图11为IFN-γ和IL-4的检测结果，首免42d后，各免疫组与PBS组相比，IFN-γ和IL-4表达水平都有明显升高(P<0.001)。
3.4检测脾淋巴细胞亚型比例
每只小鼠取1×105cells/mL脾脏淋巴细胞加入1.5mL无菌离心管中，1500rpm，离心5min，弃上清，用1mL PBS洗一遍，1500rpm，离心5min，弃上清。将2μL APC Anti-MouseCD3e、1μL FITC Rat Anti-Mouse CD4和1μL PE Anti-Mouse CD8a三种流式抗体溶于300μLPBS中然后加入至离心管，使EP管管底细胞充分重悬，于4℃避光孵育30min，用1mL PBS洗两遍，1500rpm，离心5min，弃上清，最后加入500μL PBS重悬细胞，利用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪检测1×104cells/mL中CD3+CD4+ T细胞和CD3+CD8+ T细胞亚型所占比例。
图12和图13示出了CD3+CD4+T淋巴细胞的变化，首免后42d，相对于PBS组(比例为15.5％)，所有实验组均有一定程度的上升。S+M103免疫组上升效果较其他两组显著，M103佐剂组上升效果明显高于GEL01佐剂组。S+M103组与PBS相比有极显著差异(P<0.01)。
图14和图15示出了CD3+CD8+T淋巴细胞的变化，首免后42d，相对于PBS组(比例为10.5％)，所有实验组均有一定程度的上升。M103佐剂组上升效果明显高于GEL01佐剂，S+M103免疫组CD3+CD8+ T淋巴细胞比例显著升高，与PBS相比有极显著差异(P<0.01)。
实施例3重组蛋白的仔猪免疫试验
实施例2小鼠的免疫结果可知，得出PDCoVS蛋白具有较好的免疫原性，而M103佐剂效果优于GEL01佐剂。因此将S蛋白和PDCoV灭活病毒与M103佐剂，按体积比1:1比例进行乳化，制成疫苗，免疫3日龄仔猪。
将15头3日龄仔猪随机分为3组，命名为G1-G3组，每组5头仔猪。每头仔猪后海穴肌肉注射2mL。一免后14d加强免疫一次。每次免疫通过猪前腔静脉丛进行采血，分离血清，用于检测不同免疫时期仔猪血清抗体水平。
表2仔猪免疫方案
1.免疫仔猪血清中IgG抗体水平测定
方法步骤同实施例2中，免疫小鼠血清IgG抗体测定方法。
结果如图16所示，仔猪经免疫后，血清中的IgG抗体水平逐渐上升。S+M103佐剂免疫组产生IgG抗体水平与PDCoV灭活病毒+M103佐剂免疫组无显著差异(P>0.05)。
2.免疫仔猪血清中和抗体水平
方法步骤同实施例2中，免疫小鼠血清中和抗体测定方法
结果如图17所示，S+M103佐剂免疫组产生的中和抗体滴度达到26.75，而PDCoV灭活病毒+M103佐剂免疫组的中和抗体滴度为26.5，两免疫组间无显著性差异(P>0.05)。
3.CCK-8法检测免疫仔猪外周血单核细胞(PBMCs)增殖
3.1免疫仔猪外周血单核细胞(PBMCs)的分离
使用北京索莱宝科技有限公司的猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：P8770)并参考试剂盒内说明书进行分离PBMCs。
3.2 CCK-8法检测免疫仔猪PBMCs增殖
方法步骤同实施例2中，免疫小鼠脾淋巴细胞增殖的检测方法。
结果如图18所示，仔猪免疫后，淋巴细胞出现增殖的情况。与PBS组相比，免疫组细胞增殖水平显著升高(P<0.05)，S+M103佐剂免疫组增殖水平与PDCoV灭活病毒+M103佐剂免疫组无显著差异(P>0.05)。
3.3 qRT-PCR检测免疫仔猪PBMCs中细胞因子mRNA表达水平
3.3.1 PBMC总RNA的提取
将用完全培养基稀释为1.0×106cells/mL的细胞悬液加至24孔细胞培养板中，每孔1mL。实验组每孔中加终浓度为10μg/mL的刀豆素A(ConA)作为刺激源，阴性对照组加入等体积的RPMI-1640，每个样品设置3个重复孔。将24孔细胞培养板放置37℃5％CO2温箱中培养20h。收集细胞至1.5mL离心管，每管加入500μL RL，后续使用Va公司的RNA提取试剂盒，按照说明书操作对细胞的总RNA提取。Nano-300测定A260及A280值，确定样品RNA含量及纯度，-70℃保存备用。
3.3.2 cDNA的合成
逆转录过程使用Vazyme的逆转录试剂盒进行，反应体系为5×HiScript II qRTSuperMixII 4μL，模板RNA 16μL，总体积20μL。反应条件为55℃15min，85℃5s。
3.3.3 qRT-PCR检测免疫仔猪PBMCs中细胞因子mRNA表达水平
使用相对荧光定量PCR检测免疫后仔猪IFN-γ和IL-4的mRNA表达水平。
表3 qRT-PCR的引物序列
qRT-PCR反应体系和反应条件参照Vazyme公司ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix试剂说明书。
3.3.4相对mRNA表达水平的计算
在实时荧光定量PCR中，mRNA相对表达水平的定量采用比较Ct法来计算相对定量。以IFN-γ基因为例，每个样品中IFN-γ靶基因的相对mRNA表达水平可以用以下公式计算：相对mRNA表达＝2-△△Ct。其中ΔCt值＝靶基因Ct值-GAPDH Ct值，△△Ct＝抗原刺激的靶基因ΔCt值-1640培养基刺激的靶基因ΔCt值。
结果如图19所示，第二次加强免疫后14d，与PBS组相比，免疫组表达的IFN-γ和IL-4显著升高(P<0.01)，PDCoV灭活病毒+M103佐剂免疫组IFN-γ含量显著高于S+M103佐剂免疫组(P<0.05)，但PDCoV灭活病毒+M103佐剂免疫组IL-4含量与S+M103佐剂免疫组无显著差异(P>0.05)。
本发明通过构建真核表达质粒，能够昆虫细胞系中高效表达重组蛋白，利用该重组蛋白制备的亚单位疫苗免疫小鼠和仔猪后能够产生较高水平的IgG抗体和中和抗体。脾脏淋巴细胞亚型比例及细胞因子的检测结果表明，本发明的亚单位疫苗可以提高外周血T淋巴细胞免疫功能和细胞因子表达水平能力。淋巴细胞增殖试验结果表明，本发明的亚单位疫苗可以刺激T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次遇到同样的抗原时，可以发生更加迅速且有效的免疫应答反应。
SEQ ID No.1：
MKFLVNVALVFMVVYISYIYAADDLLDLLTFPGAHRFLHKLTSNSSSLYSRANNFDVGVLPGYATKNVNLFSPLTNSTLPINGLHRSYQPLMLNCFTKITNHTLSMYLLPSDVQTYSCGGAMVKYQTHDAVRIILDLTATDHISVEVVGQHGENYVFVCSEQFTYTTALHKSTFFSLNSELYCFTNNTYLGILPPDLTDFTVYRTGQFYANGYLLGTLPITVNYVRLYRGQLAANSAHFALANLTDTLITLTNTTISQITYCDKSVVDSIACQRSSHEVEDGFYSDPKSAVRARQRTIVTLPKLPELEVVQLNISAHMDFGEARLDSVTINGNTSYCVTKPYFRLETNFMCTGCTMNLRTDTCSFDLSAVNNGMSFSQFCLSTESGACEMKIIVTYVWNYLLRQRLYVTAVEGQTHTGTTSVHATDTSSVITDVCTDYTIYGVSGTGIIKPSDLLLHNGIAFTSPTGELYAFKNITTGKTLQVLPCETPSQLIVINNTVVGAITSSNSTENNRFTTTIVTPTFFYSTNATTFNCTKPVLSYGPISVCSDGAIVGTSTLQNTRPSIVSLYDGEIEIPSAFSLSVQTEYLQVQAEQVIVDCSQYVCNGNSRCLQLLAQYTSACSNIEAALHSSAQLDSREIINMFQTSTQSLQLANITNFKGDYNFSSIITPRIGGRSAIEDLLFNKVVTSGLGTVDQDYKACSRDMAIADLVCSQYYNGIMVLPGVVDAEKMAMYTGSLTGAMVFGGLTAAAAIPFATAVQARLNYVALQTNVLQENQKILAESFNQAVGNISLALSSVNDAIQQTSEALSTVAIAIKKIQTVVNQQGEALSHLTAQLSNNFQAISTSIQDIYNRLEEVEANQQVDRLITGRLAALNAYVTQLLNQMSQIRQSRLLAQQKINECVKSQSSRYGFCGNGTHIFSLTQTAPNGIFFMHAVLVPNKFTRVNASAGICVDNTKGYSLQPQLILYQFNNSWRVTPRNMYEPRLPRQADFIQLTDCSVNFYNTTAANLPNIIPDVIDVNQTVSDIIDNLPTATPPQWDVGIYNNTILNLTVEINDLQERSKNLSQIADRLQNYIDNHHHHHHRMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK。
SEQ ID No.2：
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSPELEVVQLNISAHMDFGEARLDSVTINGNTSYCVTKPYFRLETNFMCTGCTMNLRTDTCSFDLSAVNNGMSFSQFCLSTESGACEMKIIVTYVWNYLLRQRLYVTAVEGQTHTGTTSVHATGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLHHHHHHHH。
SEQ ID No.3：
ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGGCTGATGATCTACTCGATTTGCTCACCTTCCCGGGTGCACATCGCTTCTTACATAAACTCACGAGTAATTCCAGCAGTCTCTACTCGCGGGCTAATAACTTTGATGTTGGCGTTCTTCCTGGCTACGCCACTAAGAACGTTAACCTCTTCTCACCACTTACTAACTCTACTTTGCCAATTAATGGCCTTCATCGGAGTTATCAACCACTCATGCTGAATTGTTTTACTAAAATAACTAACCACACTCTCAGCATGTATCTCCTACCTAGTGATGTACAAACTTATAGCTGCGGCGGTGCCATGGTTAAATACCAGACACATGATGCAGTTCGTATCATTTTAGACCTCACTGCCACTGACCACATCTCTGTTGAAGTCGTTGGCCAGCATGGTGAAAATTATGTGTTTGTTTGTAGTGAGCAGTTTACCTACACCACTGCACTACACAAATCTACTTTCTTCTCACTTAATTCTGAGCTTTATTGCTTTACTAATAACACCTACTTAGGTATTCTTCCACCTGATTTAACTGACTTTACGGTCTACCGTACTGGTCAGTTCTATGCTAATGGTTACCTTTTAGGTACTTTACCTATTACGGTTAACTATGTTAGGTTGTATCGGGGTCAATTGGCTGCCAATAGTGCCCACTTTGCCCTAGCAAACCTAACCGATACACTTATAACACTTACCAATACCACTATATCGCAAATCACCTATTGTGATAAGTCAGTAGTTGATTCAATAGCATGCCAGCGCTCTTCTCACGAAGTGGAGGATGGGTTTTACTCTGACCCTAAATCTGCCGTTAGAGCTAGGCAACGTACTATTGTTACACTACCTAAGCTCCCTGAGCTTGAAGTAGTGCAGTTAAATATTTCTGCACACATGGATTTTGGCGAAGCCAGACTTGACAGTGTTACCATTAATGGTAACACATCCTATTGTGTCACTAAGCCTTACTTCAGGCTTGAAACTAACTTTATGTGTACAGGTTGCACTATGAATCTGCGCACTGATACCTGTAGTTTTGACCTGTCAGCAGTAAACAATGGCATGTCATTCTCTCAATTCTGTCTAAGCACTGAATCTGGTGCTTGTGAGATGAAAATTATTGTTACCTATGTATGGAATTACTTGCTAAGGCAGCGTTTGTATGTTACTGCTGTAGAAGGCCAGACTCACACTGGAACCACTTCAGTACATGCAACAGACACTTCTAGTGTAATCACTGATGTCTGCACTGACTACACTATCTATGGAGTCTCTGGTACTGGCATTATTAAGCCATCAGATCTCTTATTGCACAATGGCATAGCATTCACCTCTCCAACAGGTGAGCTCTATGCATTTAAAAATATAACCACTGGCAAAACCCTCCAGGTCTTACCGTGTGAAACCCCTTCTCAACTGATTGTGATAAACAACACCGTTGTCGGTGCTATCACATCCAGTAACTCAACTGAAAATAATAGGTTTACTACTACTATTGTCACACCTACTTTCTTTTATTCCACAAATGCCACCACCTTTAACTGCACCAAGCCTGTTTTGTCCTATGGACCCATCAGCGTGTGTAGTGATGGTGCAATTGTGGGAACATCTACATTACAGAATACTCGACCATCCATAGTTTCACTATACGATGGCGAAATTGAAATACCATCTGCATTTTCCCTTTCTGTTCAGACAGAGTATTTGCAAGTTCAAGCAGAGCAAGTTATAGTTGATTGTTCTCAGTATGTATGCAATGGCAACAGCCGTTGTCTACAATTACTGGCACAATACACCTCAGCTTGCTCTAACATTGAAGCAGCTCTGCATTCCTCTGCACAGTTGGATAGCAGAGAGATTATAAATATGTTTCAAACATCAACACAGTCCTTGCAGTTGGCTAATATTACCAACTTCAAGGGTGACTACAATTTTAGCAGCATAATAACCCCCAGAATTGGTGGCAGATCTGCTATTGAAGACCTTCTTTTTAATAAAGTTGTTACTAGTGGCCTTGGCACTGTTGATCAGGACTACAAAGCCTGCTCTAGAGACATGGCCATCGCTGACTTAGTTTGTTCCCAGTATTACAATGGCATCATGGTTCTACCTGGTGTTGTTGATGCTGAGAAAATGGCAATGTATACTGGCTCTCTTACTGGAGCTATGGTATTTGGGGGACTGACTGCTGCAGCGGCAATACCATTCGCCACGGCAGTACAAGCCCGTCTCAATTATGTCGCACTGCAAACAAATGTACTACAAGAAAACCAGAAAATTCTTGCAGAATCATTTAACCAAGCAGTTGGCAATATATCACTTGCACTATCTTCTGTTAATGATGCCATCCAGCAAACTTCTGAGGCTCTTAGCACCGTAGCTATTGCTATTAAAAAGATTCAAACAGTTGTTAATCAGCAGGGTGAGGCATTATCACACCTGACTGCACAGCTGTCAAACAATTTCCAAGCAATTTCGACTTCTATTCAAGACATTTATAACCGTCTTGAGGAAGTAGAGGCTAACCAGCAAGTTGACCGTCTCATCACAGGACGGTTGGCTGCACTTAATGCATATGTTACTCAGTTACTCAATCAGATGTCTCAGATTAGACAATCTCGATTGTTAGCTCAGCAAAAGATTAATGAGTGTGTCAAATCTCAGTCGTCCAGATACGGTTTCTGTGGAAATGGCACACATATCTTCTCACTTACACAGACTGCACCAAATGGCATATTTTTCATGCATGCAGTACTTGTACCCAACAAATTCACACGTGTCAACGCTTCTGCGGGTATTTGTGTGGATAATACGAAAGGCTACTCATTGCAGCCTCAACTTATACTCTACCAGTTTAATAACTCCTGGAGAGTTACACCTAGAAATATGTATGAACCCAGATTGCCCCGGCAAGCTGATTTCATACAATTAACTGATTGCAGCGTTAATTTTTACAATACCACCGCTGCTAATCTTCCCAATATTATCCCTGACGTTATAGATGTCAATCAAACAGTCAGTGATATTATTGACAATTTACCTACAGCAACACCTCCTCAGTGGGATGTTGGTATCTATAACAACACTATTCTCAACCTCACCGTTGAGATTAATGATCTACAAGAGCGGTCTAAAAATCTCTCACAGATTGCAGATCGTTTACAAAATTATATTGACAATCATCATCATCATCATCACAGAATGAAGCAAATTGAAGATAAGATTGAAGAAATTGAATCCAAGCAAAAGAAGATTGAAAATGAAATTGCTAGAATTAAGAAGTAG。
SEQ ID No.4：
ATGGGCTGGAGCTGGATCTTCCTGTTCCTGCTGAGCGGCACAGCTGGCGTGCTGAGCCCTGAGCTTGAAGTAGTGCAGTTAAATATTTCTGCACACATGGATTTTGGCGAAGCCAGACTTGACAGTGTTACCATTAATGGTAACACATCCTATTGTGTCACTAAGCCTTACTTCAGGCTTGAAACTAACTTTATGTGTACAGGTTGCACTATGAATCTGCGCACTGATACCTGTAGTTTTGACCTGTCAGCAGTAAACAATGGCATGTCATTCTCTCAATTCTGTCTAAGCACTGAATCTGGTGCTTGTGAGATGAAAATTATTGTTACCTATGTATGGAATTACTTGCTAAGGCAGCGTTTGTATGTTACTGCTGTAGAAGGCCAGACTCACACTGGAACCACTTCAGTACATGCAACAGGATACATCCCAGAGGCCCCGCGGGACGGCCAGGCCTATGTGCGGAAGGACGGCGAATGGGTCCTGTTATCAACCTTTCTGCACCACCACCACCACCATCATCACTGA。
申请人结合说明书附图对本发明的实施例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，包含重组PDCoV-S蛋白或重组PDCoV-RBD蛋白；所述重组PDCoV-S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述重组PDCoV-RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述重组PDCoV-S蛋白的编码基因如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述重组PDCoV-RBD蛋白的编码基因如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述重组PDCoV-S蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)将如SEQ ID No.3所示的基因克隆到表达载体上，构建得到重组质粒；
2)将所述重组质粒转染至真核细胞表达，再经蛋白纯化，得到所述猪δ冠状病毒重组蛋白。
5.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述重组PDCoV-RBD蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)将如SEQ ID No.4所示的基因克隆到表达载体上，构建得到重组质粒；
2)将所述重组质粒转染至真核细胞表达，再经蛋白纯化，得到所述猪δ冠状病毒重组蛋白。
6.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于：所述猪δ冠状病毒亚单位疫苗还包括药学上可接受的佐剂。
7.根据权利要求6所述的猪δ冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于：所述佐剂为GEL01或M103。
8.一种表达载体，其特征在于，包含如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的基因。
9.一种真核细胞，其特征在于，包含如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的基因。
10.以下(1)-(4)任一项的物质在制备猪δ冠状病毒亚单位疫苗中的应用：
(1)氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的重组蛋白；
(2)核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的基因；
(3)权利要求8所述的表达载体；
(4)权利要求9所述的真核细胞。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张爽等: "猪δ 冠状病毒RBD蛋白在昆虫细胞中的表达", 畜牧与兽医, vol. 53, no. 9, pages 103 - 108 * |
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