CN110025778A

CN110025778A - 鸡滑液囊支原体新型基因工程亚单位疫苗

Info

Publication number: CN110025778A
Application number: CN201910297656.7A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 易小萍; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shino Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Shino Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-07-19

Abstract

本申请提供了一种免疫组合物及亚单位疫苗，包含：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体MSPA(Mycoplasma synoviae surface proteinA)蛋白；以及采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体MSPB(Mycoplasma synoviae surface protein B)蛋白。该疫苗使用Sf9细胞表达MSPB蛋白及MSPA蛋白，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对鸡没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。

Description

鸡滑液囊支原体新型基因工程亚单位疫苗

技术领域

本申请涉及动物免疫药物技术领域，具体而言，涉及一种鸡滑液囊支原体新型基因工程亚单位疫苗。

背景技术

鸡滑液囊支原体病又称鸡传染性滑膜炎，是由鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)引起幼龄鸡和火鸡的一种传染病，又称鸡传染性滑膜炎(avianonfectioussynovitis)，本病以侵害关节滑液，腱鞘膜为主，其特征为关节、腱鞘和足掌肿胀等。鸡群感染该病可导致明显的跛行、生长发育迟缓及胴体降级等。该病主要侵害商品肉鸡、蛋鸡和种鸡，一年四季均可发生。

鸡滑液囊支原体呈多形态的球形体，革兰氏染色阴性。只有一个血清型，不同菌株的致病力有差异.引起的症状也因病原的趋向性而不同。MS的防治主要采用药物治疗和疫苗接种两种方法，MS对某些抗生素敏感，但极易产生耐药性，同时抗生素疗法无法清除鸡群的MS感染，因此免疫接种是控制该病的更为有效的措施。

vlhA蛋白(phase-variable hemagglutinin)是滑液囊支原体膜表面主要的粘附素蛋白，和其血凝特性有关，是滑液囊支原体主要的保护性抗原蛋白。vlhA蛋白在翻译后被酶切成两个蛋白，包括N端的MSPB(Mycoplasma synoviae surface protein B)蛋白以及C端的MSPA(Mycoplasma synoviae surface protein A)蛋白。

目前用于预防、控制鸡滑液囊支原体感染的疫苗都是传统灭活疫苗，但支原体培养困难，需要血清，抗原含量低，并且灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱的问题。因此，现有技术亟需一种安全高效能预防鸡滑液囊支原体感染的新型基因工程疫苗，本发明因此而来。

发明内容

本申请旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体MSPA蛋白；

以及，

采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡滑液囊支原体MSPB蛋白。

本发明进一步的技术方案是：所述的鸡滑液囊支原体MSPA蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；

所述的鸡滑液囊支原体MSPB蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受鸡滑液囊支原体感染的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种核酸分子组合物，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的用于编码鸡滑液囊支原体NH蛋白的顺序核苷酸序列；以及，

包含SEQ ID NO:3的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的用于编码鸡滑液囊支原体MSPB蛋白的顺序核苷酸序列。

本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鸡滑液囊支原体感染的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对鸡滑液囊支原体的免疫反应的免疫组合物，包含：

所述的蛋白组合物和佐剂。

优选的技术方案是，所述佐剂选自白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合。

本发明公开了一种Sf9细胞表达的重组鸡滑液囊支原体重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鸡体内产生较强的体液免疫，免疫后的鸡能够抵御滑液囊支原体感染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的鸡滑液囊支原体重组亚单位疫苗的制备方法：先重组穿梭载体构建：分别克隆包含MSPB蛋白(vlhA蛋白的N端部分)及MSPA蛋白(vlhA蛋白的C端部分)编码基因到穿梭载体pFastBac 1载体上。将重组MSPA蛋白和MSPB蛋白充分混合，然后与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：

本发明目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗，为达到以上目的，本发明使用Sf9细胞表达重组鸡滑液囊支原体MSPB蛋白和MSPA蛋白的混合物，然后将这些蛋白混合使用作为疫苗，激发更强更全面的抗体保护。

本发明优点是生产过程不涉及支原体培养，通过Sf9细胞进行蛋白表达，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高。Sf9细胞使用无血清悬浮培养，易于大规模生产。而全菌疫苗生产过程中使用活菌，存在扩散的风险，灭活过程可能存在灭活不彻底的风险，并且滑液囊支原体非常难于培养，培养基需要高浓度的血清，价格昂贵且存在污染的风险。

本发明使用Sf9细胞表达MSPB蛋白及MSPA蛋白，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对鸡没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。免疫组合物可以大规模生产，质控容易；安全性高，免疫原性好；批次间稳定；生产成本低。

附图说明

图1为将MSPA基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果；其中1为MSPA基因；2为阴性对照；M为分子量标记；

图2为MSPA基因转化的菌落样品PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，其中1为阴性对照；2～7均为MSPA基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，M为分子量标记；

图3为将MSPB基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果；其中1为MSPA基因；2为阴性对照；M为分子量标记；

图4为MSPB基因转化的菌落样品PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，其中1为阴性对照；2～7均为MSPB基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，M为分子量标记；

图5为构建好的重组真核表达载体pF-MSPA图谱；

图6为构建好的重组真核表达载体pF-MSPB图谱；

图7为实施例4中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，其中1为阴性对照；2为单独表达MSPA蛋白的细胞培养物上清；M为分子量标记；

图8为实施例4中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，其中1为阴性对照；2为单独表达MSPB蛋白的细胞培养物上清；M为分子量标记；

图9为实施例5中单独表达MSPA蛋白重组SF上清样品Western Blot检测结果，其中1为阴性对照；2为单独表达MSPA蛋白重组SF上清样品；M为分子量标记；

图10为实施例5中单独表达MSPB蛋白重组SF上清样品Western Blot检测结果，其中1为阴性对照；2、3分别为单独表达MSPB蛋白重组SF上清样品；M为分子量标记；

图11为实施例4中重组杆状病毒转染MSPA蛋白的样品间接免疫荧光检测结果；

图12为实施例4中重组杆状病毒转染MSPB蛋白的样品间接免疫荧光检测结果；

图13为使用本发明疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组鸡解剖的对比结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明提供了一种免疫组合物，包含：

以及，

本发明也涉及一种诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的疫苗。

本发明也涉及一种保护受试动物免受鸡滑液囊支原体感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。

本发明还包括适用于诱导针对鸡滑液囊支原体的免疫反应的疫苗。本发明的疫苗可为包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本发明的疫苗可包含蛋白分子，一种选自由以下组成的组的蛋白组合物：包含SEQID NO:2或4的蛋白；在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白；SEQID NO:2或4的片段；与SEQ ID NO:2或4的片段95％相同的蛋白。

本发明的疫苗可包含一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2或4；(b)在如SEQ ID NO:2或4所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQID NO:2或4的包含SEQ ID NO:2的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ IDNO:2或4的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。

本发明的疫苗可包含核酸分子。还提供包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3；在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的片段；与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的片段95％相同的核苷酸序列。

本发明一些方面提供诱导针对鸡滑液囊支原体的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用鸡滑液囊支原体抗原和/或其组合物。

本发明另外的方面提供保护个体免受鸡滑液囊支原体感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反应。

本发明的一些方面提供一种诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的核酸分子。

本发明的一些方面提供一种保护受试动物免受鸡滑液囊支原体感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。

在另一方面，本发明提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2或4；(b)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:2或4的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。

本发明的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对鸡滑液囊支原体的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本发明的疫苗可还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸分子编码的蛋白。

蛋白或者核酸分子可以以任何量存在于组合物中。免疫组合物中不同蛋白分子以任意比例存在于组合物中；免疫组合物中不同核酸分子以任意比例存在于组合物中。当进行使用时，向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反应。术语“有效量”是有效地改善动物疾病的症状的量。

1.定义.

本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

对于本文所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本文所用的“佐剂”意指被添加到本文所述的疫苗中来增强由下文所述的编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定鸡滑液囊支原体抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定鸡滑液囊支原体抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株鸡滑液囊支原体抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株鸡滑液囊支原体抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。

如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。

在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本文所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫反应”意指响应于抗原如鸡滑液囊支原体共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的鸡滑液囊支原体蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部分裂解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。

如本文所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。

如本文所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。

“亚型”或“血清型”：如本文交换使用的并且关于鸡滑液囊支原体，意指鸡滑液囊支原体的基因变体，以使得一个亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。

本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

2.疫苗

本发明疫苗还包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可为编码鸡滑液囊支原体MSPA蛋白以及MSPB蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。本发明的疫苗可包含鸡滑液囊支原体MSPA蛋白以及MSPB蛋白。鸡滑液囊支原体MSPA蛋白以及MSPB蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。

所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗鸡滑液囊支原体免疫反应。鸡滑液囊支原体抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有96％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有97％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有98％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有99％同源性的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文所公开的蛋白的编码序列同源的本文所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序列。

在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1或3的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1或3。片段可与SEQ ID NO:1或3的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2或4同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:2或4中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQID NO:2或4中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2或4相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ IDNO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。

在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2或4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2或4。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2或495％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:2或4中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

3.疫苗构建体和质粒

鸡滑液囊支原体疫苗可包括编码鸡滑液囊支原体MSPA蛋白以及MSPB蛋白、鸡滑液囊支原体抗原以及鸡滑液囊支原体MSPA蛋白以及MSPB蛋白/抗原的组合的核酸构建体或质粒。本文提供可以包含编码本文所公开的鸡滑液囊支原体抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本文提供可包含编码本文公开的鸡滑液囊支原体表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。

所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。

编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。

所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在鸡滑液囊支原体核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。

载体也可包含在共有鸡滑液囊支原体核心蛋白编码序列或共有鸡滑液囊支原体表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。

载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或者pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。

所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNA I或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，其可用于在动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白。所述载体可以是通过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor(1989)。

本发明中MSPA蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列，MSPB蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列。疫苗的组成可以是MSPB蛋白及MSPA蛋白混合物、MSPB蛋白、MSPA蛋白或MSPB与MSPA蛋白的融合蛋白即vlhA蛋白全长，优选的是MSPB蛋白及MSPA蛋白混合物。重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达系统转移载体包括但不限于pFastBac1，Pvl1393等，例如可以优选采用pFastBac1。Sf9细胞系可以是为Sf9、High Five、S2或Sf21细胞，优选的用Sf9。

实施例1转移载体pF-MSPA构建与鉴定

1.MSPA基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的MSPA基因(SEQID NO:1)并克隆到pUC17载体上，得到pUC-MSPA质粒载体。以pUC-MSPA质粒作为模板，MSPA-F、MSPA-R作为上下游引物进行PCR扩增(MSPA-F、MSPA-R的基因序列如SEQ ID NO.5、6所示)，扩增体系见表1。

表1 MSPA基因扩增体系

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在1.3kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和MSPA基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及MSPA基因片段。

表2 MSPA基因酶切反应体系

表3 pFastbac 1质粒酶切反应体系

3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和MSPA基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表4。

表4 MSPA基因与pFastBac1质粒连接体系

4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，MSPA-F和MSPA-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图2所示，出现1.3kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-MSPA其示意图如图5。

实施例2转移载体pF-MSPB构建与鉴定

1.MSPB基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的MSPB基因(SEQID NO:3)并克隆到pUC17载体上，得到pUC-MSPB质粒载体。以pUC-MSPB质粒作为模板，MSPB-F、MSPB-R作为上下游引物进行PCR扩增(MSPB-F、MSPB-R的基因序列如SEQ ID NO.7、8所示)，扩增体系见表5。

表5 MSPB基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图3所示，在1.0kbp附近的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和MSPB基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表6、表7。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及MSPB基因片段。

表6 MSPB基因酶切反应体系

表7 pFastbac1质粒酶切反应体系

3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和MSPB基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表8。

表8 MSPB基因与pFastBac1质粒连接体系

5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，MSPB-F和MSPB-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图4所示，出现1.0kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-MSPB其示意图如图6。

实施例3重组杆状病毒基因组Bac-MSPA和Bac-MSPB构建

1.DH10Bac菌转化分别取实施例1中1μl pF-MSPA质粒和实施例2中1μl pF-MSPB质粒加入100μl的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100μl菌液稀释81倍后，取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。

2.挑选单克隆分别使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。分别获得重组质粒Bacmid-MSPA和Bacmid-MSPB。

实施例4重组杆状病毒转染

六孔板中每个孔接种0.8×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50～70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基T1稀释4μl的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；分别用100μl转染培养T1基稀释3μg实施例3中的重组Bacmid-MSPA和Bacmid-MSPB质粒，将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2ml SF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。获得重组杆状病毒rBac-MSPA和rBac-MSPB，对收获的P1代重组杆状病毒使用MTT相对效力法检测病毒滴度，rBac-MSPAP1种毒病毒滴度为3.4×10⁷pfu/mL，rBac-MSPB P1种毒病毒滴度为2.3×10⁷pfu/mL。扩增重组杆状病毒rBac-MSPA和rBac-MSPB作为种毒备用。

实施例5 SDS-PAGE检测

将实施例4中收获的细胞培养物分别进行SDS-PAGE检测，同时分别使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图7和图8所示，在分子量约47kDa附近和分子量约42kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例6 Western Blot鉴定

分别将实施例5中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，鸡源抗MS阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图9和图10所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例7间接免疫荧光检测

分别向96孔细胞培养板中加入转染过rBac-MSPA和rBac-MSPB的Sf9细胞悬液，100μl/孔(细胞浓度为2.5×10⁵～4.0×10⁵个/ml)，接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10μl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72～96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先与鸡源抗MS多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗鸡IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图11和图12所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。

实施例8抗原蛋白血凝检测

使用鸡红血球检测MSPA以及MSPB两个蛋白血凝效价。收获表达MSPA以及MSPB蛋白细胞悬液样品，将样品在-80℃反复冻融三次后离心取得上清用于检测。在微量板上，从第1孔至12孔，用移液器每孔加入PBS 0.025mL,用移液器吸取被检样品0.025mL,从第一孔起，依次作2倍系列稀释，至最后1个孔，弃去移液器内0.025mL液体(稀释倍数依次为2,4,8,16,32……)。每孔加入1％鸡红细胞悬液0.025mL，并设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振摇器上摇匀，置室温20～40℃分钟或置2～8℃40～60分钟，当对照孔中的红细胞呈显显著纽扣状时判定结果。使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定重点。检测显示MSPA以及MSPB两个蛋白的血凝效价分别为1:16和1:16。

实施例9昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及MSPA和MSPB蛋白的表达定量以及琼扩效价测定

在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95％时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到3-55×10⁶cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-55×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-85×10⁶cell/mL时，接种重组杆状病毒rBac-MSPA，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80％、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50％、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。同时以同样的方式制备表达MSPB蛋白的疫苗原液。

制备的上述疫苗抗原中MSPB和MSPA蛋白含量分别使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释鸡抗鸡滑液囊支原体多抗血清至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过粒子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体-MSPA蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-即HRP标记的羊抗鸡IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中MSPA蛋白的量。同样方法分别检测待检样品中MSPB蛋白的含量。

按照实施例9，大规模制备的MSPA和MSPB蛋白，Elisa检测结果如下表，从表中结果可以看出，疫苗原液中两个蛋白的平均含量分别约123mg/L、108mg/L。

制备的疫苗抗原中，分别使用琼扩效价法检测MSPB和MSPA蛋白：分别在5块琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入鸡滑液囊支原体抗血清，5块板周围分别加入稀释了2的3、4、5、6、7、8次方的5种疫苗原液。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价琼扩效价检测结果如下表。疫苗原液中MSPA和MSPB蛋白的琼扩效价均为1:32。

名称	MSPA	MSPB
			蛋白浓度	123mg/L	108mg/L
琼扩效价	1:32	1:32

实施例10疫苗的制备

取实施例9中表达的2种疫苗原液进行混合，并使用生理盐水进行稀释，使得这2个抗原蛋白每个抗原的浓度达到40mg/mL，然后将混合好的疫苗原液与油佐剂按照2:3的比例配置成油乳剂疫苗。具体的，每1L的混合疫苗原液加入白油1429g，司本70.2g，硬脂酸铝8.43g以及吐温53.3g。然后用乳化破碎机破碎乳化制备成油乳佐剂灭活苗。

实施例11免疫实验

将实施例10中制备好的鸡滑液囊支原体灭活疫苗分别以0.3ml胸部肌肉注射21日龄SPF鸡各10只，另设不免疫对照10只。免疫后28日，各组试验鸡均用活菌量约10⁶CCU/ml的菌液爪垫注射攻毒，每只0.2ml。观察14日内试验鸡发病情况。试验结果表明，以0.3ml免疫21日龄SPF鸡，免后28日试验鸡的保护率为10/10；对照鸡10/10发病，出现精神不振，独处，喜卧，常呆在料槽和水槽边，食欲下降，生长停滞。跗关节和跖关节肿胀、跛行，甚至变形。结果表明，疫苗免疫效力合格。分别解剖试验组和对照组鸡发现，对照组鸡跗关节和翅关节有分泌物，出现继发细菌感染症状(图13)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 鸡滑液囊支原体新型基因工程亚单位疫苗

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ggatccatgt ccgagttcaa gctgcagaac ttcgtgatgg cccctactca ggccgctact 60

cctactacca cccagacttc cccttccgca gctacttccg ctactgtgcg cgtggctatg 120

tccgaaaagg ccgaaaccca accagccgct cctactccag ctgctgatct ggcttccacc 180

gcttcctacc tgaagtccct gaacgacacc ctgaaggccg ctacagacgc tctgaacgga 240

gacaacccca ccgagaagac cgcctactac aagcccgtgg acggtcgtac cctgtattgg 300

gacggcttca tgcccaagat cgtcgtgaac gacggctacg tgaagaacac cgaggagaac 360

aacaaggaga acaacaagaa caccaaccag cagaagctgg aggcttggtt caaggccaac 420

caggacaagt tcaccctggt ggccgaccaa ctgaccagaa agctgggctc cgacaagttc 480

aagaacgtga ccctgaccaa ccccaccatc tcttgggacg aggtccgctt ctccaagggc 540

aacgtgacca agctgtacct gacccccaag gtcaccttca acctggcagc taaggagggt 600

tacgctctgg ctcaggactc cgctacttcc gtgacactga ccatccgcgt gctgtacaag 660

gactccaacc ccgaggtcaa cgtgttccaa acccagggtt cctccccttc cgctacccct 720

aacggagcta actccgctaa ccacgcccag accatcaagg acgtgaacgt gtacctgaac 780

tacaccggct cctccatcga actggacgcc gacctgccta gagtgggaga gcaggagaac 840

acctccctga acggcacctc caacgtgacc ggcgacttca acaccaagtt caagaagctg 900

ctggtcaacg tggtgaagga gggtcacgcc gaatcctcac tgttccaagc tatcatcaac 960

tacgtgaaca agttcgaccc caagttccgc gccgctttcg ttaccaacgc taccaacggc 1020

gtggctctga ctaaggtgga gagcgacacc cagctgcgta tcggtactct ggacgacctg 1080

gtgaagaacc gcaacaacgt gttcctgcag cagatccagg gcgacaccga agccgtgtac 1140

ttcgccgtga cagccatcgc ctccaactct tggctgaaca ccttcctgat ccgcatcccc 1200

ctgaccaagt tcgtgaagcc cctgaccgag ttccgtccta ctacccctac ctccccttct 1260

tccgacactc agcagcaggg caccgctcaa acccagtcca accagggtgg tacctaatga 1320

aagctt 1326

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)

<400> 2

Met Ser Glu Phe Lys Leu Gln Asn Phe Val Met Ala Pro Thr Gln Ala

1 5 10 15

Ala Thr Pro Thr Thr Thr Gln Thr Ser Pro Ser Ala Ala Thr Ser Ala

20 25 30

Thr Val Arg Val Ala Met Ser Glu Lys Ala Glu Thr Gln Pro Ala Ala

35 40 45

Pro Thr Pro Ala Ala Asp Leu Ala Ser Thr Ala Ser Tyr Leu Lys Ser

50 55 60

Leu Asn Asp Thr Leu Lys Ala Ala Thr Asp Ala Leu Asn Gly Asp Asn

65 70 75 80

Pro Thr Glu Lys Thr Ala Tyr Tyr Lys Pro Val Asp Gly Arg Thr Leu

85 90 95

Tyr Trp Asp Gly Phe Met Pro Lys Ile Val Val Asn Asp Gly Tyr Val

100 105 110

Lys Asn Thr Glu Glu Asn Asn Lys Glu Asn Asn Lys Asn Thr Asn Gln

115 120 125

Gln Lys Leu Glu Ala Trp Phe Lys Ala Asn Gln Asp Lys Phe Thr Leu

130 135 140

Val Ala Asp Gln Leu Thr Arg Lys Leu Gly Ser Asp Lys Phe Lys Asn

145 150 155 160

Val Thr Leu Thr Asn Pro Thr Ile Ser Trp Asp Glu Val Arg Phe Ser

165 170 175

Lys Gly Asn Val Thr Lys Leu Tyr Leu Thr Pro Lys Val Thr Phe Asn

180 185 190

Leu Ala Ala Lys Glu Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Asp Ser Ala Thr Ser

195 200 205

Val Thr Leu Thr Ile Arg Val Leu Tyr Lys Asp Ser Asn Pro Glu Val

210 215 220

Asn Val Phe Gln Thr Gln Gly Ser Ser Pro Ser Ala Thr Pro Asn Gly

225 230 235 240

Ala Asn Ser Ala Asn His Ala Gln Thr Ile Lys Asp Val Asn Val Tyr

245 250 255

Leu Asn Tyr Thr Gly Ser Ser Ile Glu Leu Asp Ala Asp Leu Pro Arg

260 265 270

Val Gly Glu Gln Glu Asn Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Asn Val Thr

275 280 285

Gly Asp Phe Asn Thr Lys Phe Lys Lys Leu Leu Val Asn Val Val Lys

290 295 300

Glu Gly His Ala Glu Ser Ser Leu Phe Gln Ala Ile Ile Asn Tyr Val

305 310 315 320

Asn Lys Phe Asp Pro Lys Phe Arg Ala Ala Phe Val Thr Asn Ala Thr

325 330 335

Asn Gly Val Ala Leu Thr Lys Val Glu Ser Asp Thr Gln Leu Arg Ile

340 345 350

Gly Thr Leu Asp Asp Leu Val Lys Asn Arg Asn Asn Val Phe Leu Gln

355 360 365

Gln Ile Gln Gly Asp Thr Glu Ala Val Tyr Phe Ala Val Thr Ala Ile

370 375 380

Ala Ser Asn Ser Trp Leu Asn Thr Phe Leu Ile Arg Ile Pro Leu Thr

385 390 395 400

Lys Phe Val Lys Pro Leu Thr Glu Phe Arg Pro Thr Thr Pro Thr Ser

405 410 415

Pro Ser Ser Asp Thr Gln Gln Gln Gly Thr Ala Gln Thr Gln Ser Asn

420 425 430

Gln Gly

<210> 3

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

ggatccatgt gcggtgacca aactccagct ccagagccta ccccaggaaa ccctaacacc 60

gacaaccccc agaaccccaa cccaggaaac ccaggcaccc ctggaaaccc aggcaccgac 120

aaccctcaga accctaaccc aggcaaccca ggaggaggta cagtggaccc agtggaagcc 180

gctaagaccg aggctaagac cgctatcgac gcttcagccg agctgtcaga ctccgtgaag 240

gaggctctga agcgccaagt ggaggctact accaccgagg ctgaggctag agacctgaag 300

accaaggccg acgctctggt ttccgcagtg aaggctctgt ccggttccgt gacaaaggct 360

aaggaggcca agaaggacgc cgagtactcc aaggtcaccg acactaccca caagaccacc 420

ctggaggaga agtacaccgc cgctacagct ctgctggagg acggttccaa gctggctaac 480

ctggacgctt cctccaacct ggacaccacc aaggctaccc tggaatccgc taagaccgct 540

ctggacgcag ctgtggctgc tgtgaagcca gacctggact tccaaaagac caagacctcc 600

gccgcagcta aggtcaccga gctggagtcc ctggtcaaca cagctctgaa ggccgagctg 660

cagcgtcaag tgaacgagct gaccaaggag caggcagctc aggctaccac catgctggag 720

aacctgacct ccctgaagga ctccctgacc tctctgcagg acctggtgtc caagggtctg 780

gtgatgcagg tggactaccc tcgcaactac tacgacgccg acaacaagtc cgccttcgac 840

gacgctctgc tgaaggcttc ctccgtgttc ccagccttcc aatggacagc tcagtccatc 900

atggtgccca ccccagaagg agacgctctg cctaacccta gagcttggac caaggctcgc 960

gacaagtaat gaaagctt 978

<210> 4

<211> 320

<212> PRT

<213> 鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)

<400> 4

Met Cys Gly Asp Gln Thr Pro Ala Pro Glu Pro Thr Pro Gly Asn Pro

1 5 10 15

Asn Thr Asp Asn Pro Gln Asn Pro Asn Pro Gly Asn Pro Gly Thr Pro

20 25 30

Gly Asn Pro Gly Thr Asp Asn Pro Gln Asn Pro Asn Pro Gly Asn Pro

35 40 45

Gly Gly Gly Thr Val Asp Pro Val Glu Ala Ala Lys Thr Glu Ala Lys

50 55 60

Thr Ala Ile Asp Ala Ser Ala Glu Leu Ser Asp Ser Val Lys Glu Ala

65 70 75 80

Leu Lys Arg Gln Val Glu Ala Thr Thr Thr Glu Ala Glu Ala Arg Asp

85 90 95

Leu Lys Thr Lys Ala Asp Ala Leu Val Ser Ala Val Lys Ala Leu Ser

100 105 110

Gly Ser Val Thr Lys Ala Lys Glu Ala Lys Lys Asp Ala Glu Tyr Ser

115 120 125

Lys Val Thr Asp Thr Thr His Lys Thr Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Thr

130 135 140

Ala Ala Thr Ala Leu Leu Glu Asp Gly Ser Lys Leu Ala Asn Leu Asp

145 150 155 160

Ala Ser Ser Asn Leu Asp Thr Thr Lys Ala Thr Leu Glu Ser Ala Lys

165 170 175

Thr Ala Leu Asp Ala Ala Val Ala Ala Val Lys Pro Asp Leu Asp Phe

180 185 190

Gln Lys Thr Lys Thr Ser Ala Ala Ala Lys Val Thr Glu Leu Glu Ser

195 200 205

Leu Val Asn Thr Ala Leu Lys Ala Glu Leu Gln Arg Gln Val Asn Glu

210 215 220

Leu Thr Lys Glu Gln Ala Ala Gln Ala Thr Thr Met Leu Glu Asn Leu

225 230 235 240

Thr Ser Leu Lys Asp Ser Leu Thr Ser Leu Gln Asp Leu Val Ser Lys

245 250 255

Gly Leu Val Met Gln Val Asp Tyr Pro Arg Asn Tyr Tyr Asp Ala Asp

260 265 270

Asn Lys Ser Ala Phe Asp Asp Ala Leu Leu Lys Ala Ser Ser Val Phe

275 280 285

Pro Ala Phe Gln Trp Thr Ala Gln Ser Ile Met Val Pro Thr Pro Glu

290 295 300

Gly Asp Ala Leu Pro Asn Pro Arg Ala Trp Thr Lys Ala Arg Asp Lys

305 310 315 320

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 5

ataggatcca tgtccgagtt caagctgcag aac 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 6

aagctttcat taggtaccac cctggttgga ctggg 35

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 7

ataggatcca tgtgcggtga ccaaactcca gctc 34

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 8

ataaagcttt cattacttgt cgcgagcctt ggtcc 35

Claims

1.一种免疫组合物，包含：

以及，

2.根据权利要求1所述的免疫组合物，所述的鸡滑液囊支原体MSPA蛋白包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；

所述的鸡滑液囊支原体MSPB蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。

4.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受鸡滑液囊支原体感染的药剂的用途。

5.一种核酸分子组合物，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的用于编码鸡滑液囊支原体MSPA蛋白的顺序核苷酸序列；以及，

6.权利要求5所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡滑液囊支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。

7.权利要求5所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鸡滑液囊支原体感染的药剂的用途。

8.一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：

9.一种适用于在受试动物体内产生针对鸡滑液囊支原体的免疫反应的免疫组合物，包含：

权利要求8所述的蛋白组合物，和

佐剂。

10.根据权利要求9所述的免疫组合物，其特征在于，所述佐剂选自白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合。