CN106267182A - 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及疫苗组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗组合物的制备方法，包括：(1)分别克隆、扩增gB蛋白片段基因、gD蛋白基因；(2)使用扩增的gB蛋白基因、gD蛋白基因构建串联表达gB蛋白和gD蛋白的质粒；以及(3)通过获得的串联表达gB蛋白和gD蛋白的质粒表达gB+gD重组蛋白、纯化，加入佐剂，乳化。所述制备方法简单，能大量制备猪伪狂犬病病毒gB和gD蛋白，耗时短，表达量高，大大降低生产成本，有利于大规模生产。包含有本发明制备方法制备的gB和gD蛋白的亚单位疫苗，免疫效果良好，免疫剂量小，能有效预防猪伪狂犬病病毒相关疾病和由猪伪狂犬病病毒造成的感染的相关疾病。

Description

一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及疫苗组合物和 应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法和其制备的疫苗组合物，以及用于该疫苗组合物的应用。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1)伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约猪场规模化生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、麻痹，仔猪死亡率高。

疫苗接种是预防、控制甚至消灭伪狂犬病的主要措施之一。亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭，然而，目前研究的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗生产成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗，应用受到限制。

因此研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的生产方法具有重要的现实意义。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及使用本发明所述方法制备的伪狂犬病病毒疫苗组合物。

本发明的第一方面在于提供了一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗组合物的制备方法，包括：(1)分别克隆、扩增猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因、gD蛋白基因，其中，所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因为gB蛋白片段基因；(2)使用所述步骤(1)中扩增的gB蛋白基因、gD蛋白基因构建串联表达gB蛋白和gD蛋白的质粒；以及(3)通过所述步骤(2)中获得的串联表达gB蛋白和gD蛋白的质粒表达gB+gD重组蛋白、纯化，加入佐剂，乳化。

术语“gB蛋白”又称“gB糖蛋白”，在疱疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白，其大小约2.8kb。

术语“gD蛋白”又称“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为“gp50蛋白”。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法中，氨基酸位点以SEQ ID NO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白的氨基酸序列为基准，所述gB蛋白片段氨基酸序列包含gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列以及第546位至700位氨基酸所示序列。

不同猪伪狂犬病病毒株gB蛋白的氨基酸序列可能因氨基酸位点的插入、缺失，造成本发明所述gB蛋白片段氨基酸序列位置在不同猪伪狂犬病病毒株gB蛋白的氨基酸序列中存在差异，比如在猪伪狂犬病病毒Bartha株对应氨基酸位置为gB蛋白第62位至150位以及第548位至702位，在猪伪狂犬病病毒Kaplan株对应氨基酸位置为gB蛋白第62位至154位以及第552位至706位，在猪伪狂犬病病毒Becker株对应氨基酸位置为gB蛋白第62位至147位以及第545位至699位，其可通过与SEQ ID NO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白的氨基酸序列进行比对，与猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列以及第546位至700位氨基酸所示序列对应的序列即为本发明所述gB蛋白片段氨基酸序列。

猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于Pathogenic PseudorabiesVirus,XiulingYu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.China,2012EmergingInfectiousDiseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014；PRV TJ strain(PRV TJ)株，公开于ChinaChun-Hua Wang Jin Yuan1,Hua-Yang Qin1，et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapidandcomplete protection from lethal challenge with the PRVvariantemerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in ChinaVaccine 32(2014)3379–3385中；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170公开于CN103627678A；猪伪狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)保藏号为CCTCC NO:V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2013年5月20日；猪伪狂犬病病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)保藏号为CCTCC NO:V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2013年8月26日；猪伪狂犬病病毒Fa株公开于伪狂犬病毒Fa株gB_gC_gD基因的克隆与序列分析[J].陈振海等，福建农业学报2007，22(2)：120-125；猪伪狂犬病病毒Bartha株及猪伪狂犬病病毒Becker株公开于A wide extent of inter-straindiversity in virulent and vaccine strains of alphaherpesviruses，Szpara,M.L.,et al.，PLoS Pathog.2011Oct；7(10):e1002282；猪伪狂犬病病毒Kaplan株公开于Analysis of viral and cellular factorsinfluencing herpesvirus-induced nuclear envelope breakdown，Grimm,K.S.,et al，J Virol.2012Jun；86(12):6512-6521。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法中，本发明的所述gB蛋白片段氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法中，本发明的所述gB蛋白片段由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列编码。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤(1)中猪伪狂犬病病毒gD基因来自包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株、猪伪狂犬病病毒Bartha株、猪伪狂犬病病毒Kaplan株、猪伪狂犬病病毒Becker株。

作为本发明的一种优选实施方式，所述gD基因氨基酸序列来自猪伪狂犬病病毒HN1201株。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法中，猪伪狂犬病病毒gD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法中，猪伪狂犬病病毒gD蛋白由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码。

作为本发明的一种优选实施方式，所述gB蛋白片段和gD蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。

术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪伪狂犬病病毒株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。

术语“片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。

如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪伪狂犬病病毒攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。

当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：4、6中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。

在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。

无论是氨基酸序列同源性，抑或是核苷酸序列同源性，其同源性高低以序列的改变不影响自身免疫原性为限定。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物的制备方法包括：

(1)将猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段基因、gD蛋白基因分别与经过双酶切的pFastBacI进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得阳性质粒pFastBac-HNgBΔ148～546和pFastBac-HNgD；(2)以所述步骤(1)中获得的pFastBac-HNgD为模板进行PCR扩增，扩增产物进行双酶切，与同样经过双酶切的pFastBac-Dual载体进行连接，获得的阳性克隆标记为pFastBac-gD；(3)以所述步骤(1)中获得的pFastBac-HNgBΔ148～546进行双酶切，与步骤(2)获得的pFastBac-gD经过同样的双酶切后进行连接，获得阳性质粒命名为pFastBac-gD-gBΔ148～546；(4)将所述步骤(3)获得的pFastBac-gD-gB质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过转座，获得重组BacmidBac-HNgD-gBΔ148～546；(5)将所述步骤(4)获得的重组Bacmid Bac-HNgD-gBΔ148～546转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBac-HNgD-gBΔ148～546；以及(6)培养所述步骤(5)得到的重组杆状病毒rBac-HN-gD-gBΔ148～546，收获上清，得到串联表达的gB+gD重组蛋白，纯化，加入佐剂，乳化。

优选地，所述步骤(1)中pFastBacI载体双酶切位点为EcoR I和Hind III。

优选地，所述步骤(2)中扩增产物及pFastBac-Dual载体双酶切位点为XhoI和NheI。

优选地，所述步骤(3)中扩增产物及pFastBac-gD阳性克隆双酶切位点为BamHI和HindIII。

优选地，所述步骤(5)中所述昆虫细胞为sf9细胞。

本发明的另一方面涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明的制备方法制备的gB+gD重组蛋白和佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中gB+gD重组蛋白抗原含量为25-100μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中gB+gD重组蛋白抗原含量为50μg/ml。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

作为本发明的一种优选实施方式，述疫苗组合物中gB+gD重组蛋白抗原中gB蛋白片段与gD蛋白的分子数比例为1:1。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”，是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。

本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。

本发明所用术语“铝盐佐剂”，又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”，包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。

本发明所用术语“细胞因子佐剂”，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等，又称“细胞因子”或“细胞素”，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞，在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在免疫系统中起着非常重要的调控作用。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中佐剂为206佐剂。

本发明的另一方面涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒感染的药物中的应用。

术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬病病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬病病毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”可以进一步用于指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。以及感染后会造成成年猪(体重在50kg以上猪)高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。

基于此，本发明的突出优点在于：

(1)本发明制备方法简单，能大量制备猪伪狂犬病病毒gB和gD蛋白，耗时短，表达量高，大大降低生产成本，有利于大规模生产；

(2)本发明制备方法制备的两种蛋白比例合适，免疫效果良好，免疫剂量小，进一步降低了生产成本；

(3)本发明的方法提供了一种完善预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染的途径，避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发生，对于净化猪伪狂犬病病毒有着积极的现实意义。

序列表中：

序列1为PRV HN1201株gB蛋白的核苷酸序列；

序列2为PRV HN1201株gB蛋白的氨基酸序列；

序列3为PRV HN1201株gB蛋白片段的核苷酸序列；

序列4为PRV HN1201株gB蛋白片段的氨基酸序列；

序列5为PRV HN1201株gD蛋白的核苷酸序列；

序列6为PRV HN1201株gD蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、gD蛋白的串联表达

1.猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段的扩增

在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒，取200μL收获的病毒液，参照用geneaid公司viral nucleic acid extraction kit II试剂盒说明书提取PRV基因组DNA。利用引物gBF1和gBR1扩展gB基因62-148aa，利用引物gBF2和gBR2扩展gB基因546-700aa，利用Overlapping PCR将二者扩增在一起，并利用引物的设计，在两者中间加入GGSG连接氨基酸。引物见表1，PCR体系见表2，PCR反应条件见表3。

表1 gB蛋白片段扩增引物

表2 PCR体系

2×PrimeSTAR GC buffer	25μL
		PRV基因组DNA	1μL
primers(10pM)	1μL/1μL
		dNTPs(2.5mM)	4μL
PrimeSTAR(2.5U/μL)	0.5μL
		ddH2O	17.5μL

表3 PCR反应条件

2.猪伪狂犬病病毒gD基因的扩增

以步骤1中抽提的猪伪狂犬病病毒HN1201株核酸为模板，参照步骤1中PCR体系及条件，利用引物gD18F和gD353R扩增gD基因。引物见表4。

表4 gD基因扩增引物

3.gB蛋白片段和gD蛋白串联表达供体质粒的构建

分别将步骤1和步骤2扩增的PCR产物利用EcoR I+Hind III进行双酶切，与同样双酶切的pFastBacI进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得的阳性质粒命名为pFastBac-HNgBΔ148～546和pFastBac-HNgD。

以pFastBac-HNgD为模板，利用引物GP67F(XhoI)和HNgD353R(NheI)进行PCR，PCR体系和条件参照步骤1，回收的PCR产物用XhoI和NheI进行双酶切，与经同样双酶切的pFastBac-Dual载体进行连接，连接获得的阳性克隆标记为pFastBac-gD。引物见表5。

表5 GP67F(XhoI)和HNgD353R(NheI)引物

将pFastBac-HNgBΔ148～546通过BamHI和HindIII双酶切回收，与经过同样双酶切的pFastBac-gD进行连接，鉴定的阳性质粒命名为pFastBac-HNgD-gBΔ148～546。

4.重组Bacmid的构建

将2μl pFastBac-HNgD-gBΔ148～546质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激60s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物经鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组Bacmid的提取，命名为Bac-HN gD-gBΔ148～546。

5.重组杆状病毒的获得及传代

将重组Bacmid Bac-HNgD-gBΔ148～546转染昆虫细胞sf9。参照II Regent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-HNgD-gBΔ148～546P1。

将对数生长期的sf9细胞按照0.9×10⁶cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20～1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100～1:200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。

6.蛋白的表达

将传至P4的重组杆状病毒按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞1L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HNgBΔ148～546+gD蛋白15mg，即串联表达的gB+gD重组蛋白。

实施例2 猪伪狂犬病病毒gB蛋白的制备

1.猪伪狂犬病病毒gB基因的扩增

利用实施例1中抽提的PRV基因组DNA作为模板，利用引物gBF和gBR扩增HNgB基因62-752aa。引物见表6，PCR体系依据表2，反应条件依据表3。

表6 gB基因扩增引物

2.供体质粒的构建

参照实施例1中供体质粒的构建方法，将步骤1中扩增的PCR产物进行回收构建供体质粒，经鉴定正确的命名为pFastBac-HNgB。

3.重组Bacmid的构建

参照实施例1中重组Bacmid的构建方法，将步骤2获得的供体质粒进行构建重组Bacmid，经鉴定正确的重组Bacmid命名为Bac-HNgB。

4.重组杆状病毒的获得及传代

参考实施例1中重组杆状病毒获得及传代的方法，将步骤3鉴定正确的重组Bacmid Bac-HNgB转染细胞，制备重组杆状病毒。

5.蛋白的表达

将步骤4得到的重组杆状病毒传至P4代，按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞2L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HN gB蛋白5mg。

实施例3 猪伪狂犬病病毒gD蛋白的制备

1.猪伪狂犬病病毒gD基因的扩增

利用实施例1中抽提的PRV基因组DNA作为模板，利用实施例1中表4中的引物gD18F和gD353R扩增gD基因。PCR体系依据表2，反应条件依据表3。

2.供体质粒的构建

参照实施例1中供体质粒的构建方法，将步骤1中扩增的PCR产物进行回收构建供体质粒，经鉴定正确的命名为pFastBac-HNgD。

3.重组Bacmid的构建

参照实施例1中重组Bacmid的构建方法，将步骤2获得的供体质粒进行构建重组Bacmid，经鉴定正确的重组Bacmid命名为Bac-HNgD。

4.重组杆状病毒的获得及传代

参考实施例1中重组杆状病毒获得及传代的方法，将步骤3鉴定正确的重组Bacmid Bac-HNgD转染细胞，制备重组杆状病毒。

5.蛋白的表达

将步骤4得到的重组杆状病毒传至P4代，按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞2L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HN gD蛋白6mg。

实施例4 猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备

取实施例1HNgBΔ148～546+gD蛋白，缓缓加入到佐剂中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存；同样方法，取实施例2和实施例3表达的gB蛋白和gD蛋白，制备疫苗，即为猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗组合物。具体配比见表7。

表7 猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗成分配比

实施例5 猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫原性试验

将21日龄PRV抗体阴性仔猪28头随机分成7组，4头/组，即1-5组分别为本发明实施例4制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5，第6组和第7组注射等量的PBS，单次免疫。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×10^8.0TCID₅₀/头，攻击后7天内每天固定时间观察临床状况并测量体温。

结果在该攻毒剂量下第1-5免疫组4只仔猪均获得保护，出现短暂临床体征在5天后逐步恢复正常，最终存活；第6组在攻毒后2天死2头，3天全部死亡，有明显的临床体征；第7组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表8。

表8 猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒保护结果

体温情况见表9，疫苗免疫组出现短暂体温升高情况。通过比较免疫仔猪体温升高天数平均值，结果显示疫苗1、疫苗2和疫苗3免疫仔猪的体温升高天数平均值与疫苗4和疫苗5免疫仔猪的体温升高天数平均值相比由1-1.25天下降到0.5-0.75天，平均下降了25％-60％。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗1、疫苗2和疫苗3的免疫效果要高于疫苗4和疫苗5。证明了本发明串联表达的两种抗原制备的疫苗组合物免疫效果要优于单独表达的含有两种抗原的疫苗组合物，而且还发现，本发明串联表达的两种抗原制备的疫苗组合物具有更低的抗原含量，却能达到更好的免疫效果，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明串联表达的两种抗原制备的疫苗组合物疫苗1、疫苗2和疫苗3的临床疾病显著少于疫苗4和疫苗5。

表9 猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后体温情况

组别	A(天)	B(天)	C(天)	D(天)	平均值(天)
						1	1	1	1	0	0.75

2	0	1	0	1	0.5
						3	0	1	1	0	0.5
4	1	1	1	2	1.25
						5	1	1	1	1	1
7	0	0	0	0	0

进一步对各试验组仔猪采食情况进行统计，结果见表10。临床猪只7天采食量统计，使用ANOVA分析来比较疫苗对仔猪采食量变化的作用。结果显示疫苗1、疫苗2和疫苗3免疫组之间采食量差异不显著(P＞0.05)，并且这三组与第7组之间差异不显著(P＞0.05)，疫苗4和疫苗5免疫组之间差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3、第7组同疫苗4、疫苗5之间差异显著(P＜0.05)。通过比较免疫仔猪采食量平均值，结果显示疫苗1、疫苗2和疫苗3免疫仔猪的采食量平均值与疫苗4和疫苗5免疫仔猪的采食量平均值相比由210.88g-211.56g上升到285.57g-290.54g，平均上升了34.98％-37.78％。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗1、疫苗2和疫苗3的免疫效果要显著高于疫苗4和疫苗5。进一步证明了本发明串联表达的两种抗原制备的疫苗组合物免疫效果要优于单独表达的含有两种抗原的疫苗组合物。

表10 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物免疫仔猪后采食情况

组别	A(g)	B(g)	C(g)	D(g)	平均值(g)
						1	280.44	275.22	298.36	288.26	285.57
2	295.22	289.16	287.40	290.38	290.54
						3	291.16	288.87	292.07	287.38	289.87
4	215.92	210.12	208.00	209.48	210.88
						5	214.49	210.26	210.05	211.44	211.56
7	288.47	290.53	287.95	296.37	290.83

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括：

(1)分别克隆、扩增猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因、gD蛋白基因，其中，所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因为gB蛋白片段基因；

(2)使用所述步骤(1)中扩增的gB蛋白基因、gD蛋白基因构建串联表达gB蛋白和gD蛋白的质粒；以及

(3)通过所述步骤(2)中获得的串联表达gB蛋白和gD蛋白的质粒表达gB+gD重组蛋白、纯化，加入佐剂，乳化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氨基酸位点以SEQID NO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白氨基酸序列为基准，所述gB蛋白片段氨基酸序列包含gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列以及第546位至700位氨基酸所示序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述gB蛋白片段氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中猪伪狂犬病病毒gD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段基因、gD蛋白基因分别与经过双酶切的pFastBacI进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得阳性质粒pFastBac-HNgBΔ148～546和pFastBac-HNgD；

(2)以所述步骤(1)中获得的pFastBac-HNgD为模板进行PCR扩增，扩增产物进行双酶切，与同样经过双酶切的pFastBac-Dual载体进行连接，获得的阳性克隆标记为pFastBac-gD；

(3)以所述步骤(1)中获得的pFastBac-HNgBΔ148～546进行双酶切，与步骤(2)获得的pFastBac-gD经过同样的双酶切后进行连接，获得阳性质粒命名为pFastBac-gD-gBΔ148～546；

(4)将所述步骤(3)获得的pFastBac-gD-gB质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过转座，获得重组Bacmid Bac-HNgD-gBΔ148～546；

(5)将所述步骤(4)获得的重组Bacmid Bac-HNgD-gBΔ148～546转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBac-HNgD-gBΔ148～546；以及

(6)培养所述步骤(5)得到的重组杆状病毒rBac-HNgD-gBΔ148～546，收获上清，得到串联表达的gB+gD重组蛋白，纯化，加入佐剂，乳化。

6.一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1～5所述方法制备的gB+gD重组蛋白和佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中gB+gD重组蛋白抗原含量为25-100μg/ml；优选地，所述疫苗组合物中gB+gD重组蛋白抗原含量为50μg/ml。

8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中gB+gD重组蛋白抗原中gB蛋白片段与gD蛋白的分子数比例为1:1。

9.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中佐剂为206佐剂。

10.根据权利要求6～9所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒感染的药物中的应用。