CN1778926A - 一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域。具体涉及一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因及其应用。其特征在于，将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆盖表位间，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和附图1所示。该修饰基因包含在真核表达质粒pCI－52M中，含有该质粒的大肠杆菌Escherichia coliDH5α/pCI－52M，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M204080。本发明还公开了该基因在制备猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗中的应用。

Description

一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因及应用

                          技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学及基因工程学技术领域。具体地说涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的修饰，还涉及该基因修饰后的免疫原性评价及其在新型疫苗中的应用。

                          背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，简称PRRS，下文简称PRRS)是近年发现的一种新的病毒性传染病，以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。该病最早于1987年报道于美国南部，不久即传播到了中西部，并在全美迅速蔓延。随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病(Bilodeau R et al，Porcine reproductive andrespiratory syndrome in Quebec.Vet Rec，1991，129：102-103；Dea S，Bilodeau R，Athanassious R et al.Swine reproductive and respiratory syndrome virus in Quebec：isolation of an enveloped virus serologically-related to lelystad virus.Can Vet J.1992，33：801-808)；亚洲地区报道此病的时间相对较晚，中国台湾地区1991年出现此病(张志成等，台湾地区猪繁殖与呼吸道征候群I病毒鉴定，中华兽医杂志，1993，19(4)：268-276)；日本1994年暴发PRRS(Hiroyoshi Kuwaahara.An outbreak of PRRS in Japan.J Vet Med Sci，1994，56(50)：901-909)；中国大陆1996年报道此病开始流行，并分离到病毒(郭宝清等，从疑似PRRS流产胎儿分离猪生殖与呼吸综合征病毒的研究，中国畜禽传染病，1996，87(2)：1-5)。上述文献显示猪繁殖与呼吸综合征给全球养猪业造成了巨大的经济损失，仅1991年欧洲PRRS的暴发就造成了100万头猪的死亡。

同其它许多猪的病毒病的防制一样，PRRS的防制也主要是免疫预防。目前用于预防PRRS的主要是弱毒苗和灭活苗。尽管弱毒疫苗能提供较好的免疫保护，但存在毒力返强的危险，并且返强的机率相当高，这一点也在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实。与弱毒苗相比，灭活疫苗虽然安全，但往往需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。可以说，目前对该病的防制一直不尽人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV，下文简称PRRSV)ORF5基因编码的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免疫，而且目前确定的最主要的中和表位也位于其N端胞外区，因此是设计PRRS新型疫苗的首选目标基因(Dea S，Gagnon CA，Mardassi H.Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus：comparison of the North American and European isolates.Arch Virol，2000a，145：659-688)。1998年Pirzaden等(Pirzadeh B，Dea S.Immune response in pigsvaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus.J Gen Virol，1998a，79：989～999)用编码GP5的真核表达质粒免疫猪，可使接种猪产生抗GP5的特异性抗体，接种猪可免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。1999年Kwang等(KwangJ，Zuckermann F，Ross G，et al.Antibody and cellular immune responses of swine followingimmunization with plasmid DNA encoding the PRRS virus ORFs4，5，6 and 7.vet Sci，1999，67：199～201)用编码GP4、GP5、M、N 4种结构蛋白的基因构建了4种DNA疫苗，免疫猪中，表达GP5的质粒激发的抗体具有最强的中和病毒的能力。但上述研究均发现表达GP5蛋白的DNA疫苗诱导的中和抗体不高(＜1∶8)。最近，Ostrouski等(Ostrowski M，Galeota JA，Jar AM，et al.Identification of neutralizing and nonneutralizingepitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain.JVirol，2002，76：4241～4250)在采用噬菌体表面展示技术确定GP5中和表位时，发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位，此表位具有类似于HIV中覆盖表位的覆盖效应，也正是这一覆盖表位的覆盖效应，导致GP5中和表位无法充分暴露，从而难以激发很强的中和抗体。基于这一发现，申请人对ORF5基因进行了修饰，即将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸插入GP5的中和表位和覆盖表位间，并以DNA免疫的方式比较了修饰与未修饰的ORF5基因的免疫原性与免疫反应。

                             发明内容

本发明的一个目的是对猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因进行修饰，以暴露其中和表位，获得一种免疫原性更好的ORF5基因。

本发明的另一个目的是提供一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰的ORF5基因的DNA疫苗及其在防制猪繁殖与呼吸综合征中的应用。

本发明通过以下技术方案实施：

一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO：1所示。

一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因是将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆盖表位间而获得。

所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰的ORF5基因的DNA疫苗是将修饰的ORF5基因插入真核表达载体pCI-neo的XhoI与XbaI位点构建而成，含有该质粒的大肠杆菌Escherichia coli DH5α/pCI-52M，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M204080，保藏日期：2004年10月29日。

本发明还包括上述修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗上的应用。

更详细的技术方案如下列步骤所述：

一、PRRSV ORF5基因的修饰和表达修饰的ORF5基因的DNA疫苗的构建

1、引物的设计

采用PCR扩增和拼接方法，将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列引入ORF5基因的中和表位与覆盖表位之间。引物P51和P5m1，可扩增ORF5基因N端96bp，并同时引入长39bp的PADRE表位，两端依次设计XhoI和PstI酶切位点。P5m2和P52，可扩增ORF5基因后一部分的507bp，两端依次设计PstI和XbaI酶切位点。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下：

P51：5’-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’(序列表SEQ ID NO：2)

P5m1：5’-TTTCTGCAGAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACGAACTTGGCGTTGGC

      -GTTGACGAGC-3’(序列表SEQ ID NO：3)

P5m2：5’-TTTCTGCAGAGCAACAGCAGCCTCTC-3’(序列表SEQ ID NO：4)

P52：5’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’(序列表SEQ ID NO：5)

2、PCR扩增

以含PRRSV YA株(参见：方六荣等，猪繁殖与呼吸综合症病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析，华中农业大学学报，2002，21(6)：501-505)完整ORF5基因的质粒pMD-ORF5为模板进行扩增，ORF5基因两部分序列的扩增条件均为：95.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：95.0℃ 1min，55.0℃ 1min，72.0℃ 1min，35个循环后72.0℃延伸10min。反应结束后于1.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

3、修饰的ORF5基因的获得及其DNA疫苗质粒的构建

将上述两种PCR产物ORF5ml与ORF5m2分别用XhoI+PstI和PstI+XbaI酶切后，将两种纯化回收的酶切产物同时与用XhoI+XbaI酶切的pCI-neo真核表达载体质粒连接，获得修饰改造后的表达ORF5基因的真核表达质粒pCI-52M，经XhoI、XhoI+XbaI、PstI酶切与PCR鉴定证实构建正确。质粒的重组、制备、酶切分析均按常规方法进行(J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著。黄培堂，王嘉玺等译。分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002)。

二、用于对比试验的表达未修饰的ORF5基因的DNA疫苗表达质粒pCI-52的构建

设计一对可扩增ORF5完整编码区的引物P51S和P51R，上下游引物两端分别设计了XhoI和XbaI位点。引物序列如下：

P51S：5’-GAA CTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’

P51R：5’-TTT TCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’

以pMD-ORF5(参见：方六荣等，猪繁殖与呼吸综合症病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析，华中农业大学学报，2002，21(6)：501-505)为模板，进行PCR扩增，扩增大小为619bp。PCR反应条件为：94℃ 5min；进入PCR循环，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。纯化回收目的片段，纯化的扩增产物经XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表达载体pCI-neo(Promega)的相应位点，获得的重组质粒pCI-52经XhoI、XbaI和XhoI+XbaI酶切与PCR鉴定证实构建正确，测序证实无碱基误配。质粒的重组、制备、酶切分析均按常规方法进行(J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年)。

三、质粒pCI-52M、pCI-52的大量制备

(1)挑取含有质粒的菌落接种于75mL含终浓度为60μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃ 300r/min培养过夜，6000r/min 5min，收集细胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，高压灭菌后置4℃保存备用)悬浮(吹散或涡旋)。

(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS，现配现用)，冰浴7-10min。

(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸钾，冰醋酸调pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃ 10000r/min 10-15min。

(4)取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃ 30min或室温5min。室温，10000r/min 6-15min。

(5)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA)悬浮(洗壁20min左右)。

(6)加1.5ml即1倍体积冰预冷的5mol/L NH₄Ac，混匀。4℃ 10000r/min 10min。

(7)将上清转移至7mL的离心管，加1倍体积(3mL)的异丙醇混匀，-20℃作用30min。12000r/min 15min。

(8)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE悬浮(洗壁20min左右)，并转移至1.5mL的离心管。

(9)加入适量的RNase，37℃ 1h，去RNA。

(10)加1倍体积的13％的PEG8000(含1.6mol/L NaCl)，混匀，-20℃ 30min(可以过夜)。离心，弃上清，用400μLTE重溶。

(11)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，氯仿∶异戊醇抽提1次。

(12)加100μl 10mol/L NH₄Ac，充分混匀后，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃ 12000r/min离心5-10min。

(13)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50μL TE或H₂O重溶，置-20℃备用。

四、DNA疫苗的生产工艺

疫苗生产工艺的主要流程：质粒的转化、质粒的大量提取、质粒浓度的测定与稀释。

1、质粒的转化

将DNA疫苗表达质粒pCI-52M和pCI-52(氨苄抗性)分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。具体操作是：1)取100μl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5ml EP管中，加入10μl连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。2)将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒。3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。4)每管加400μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。5)取100μl转化的感受态细胞转移到含终浓度为60μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12～16h可出现菌落。

2、质粒的大量提取同本说明书的“二、质粒pCI-52M的大量制备”的方法(本段省略了该质粒的详细制备步骤)。

3、质粒浓度的测定、稀释

利用分光光度计测定大提质粒的浓度，用磷酸盐缓冲液(PBS pH7.4)将其稀释到1μg/μl，即可用于动物注射。

五、疫苗的免疫效力检验

1、疫苗对Balb/c小白鼠的免疫效力试验

将DNA疫苗pCI-52M和pCI-52分别经后腿肌肉注射6周龄的Balb/c小鼠，每组6只，每只小鼠100μl(含100μg质粒)，共免疫2次，间隔2周；同时用空白质粒载体pCI-neo作为核酸免疫的阴性对照。于首次免疫后2、4、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体，结果表达修饰的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显高于表达未修饰的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52(详见实施例2)。

2、疫苗对断奶仔猪的免疫效力试验

将DNA疫苗pCI-52M和pCI-52分别经颈部肌肉注射断奶仔猪，每组4头，每头猪500μl(含100μg质粒)，共免疫3次，间隔2周；同时用空白质粒载体pCI-neo作为核酸免疫的阴性对照。于首免后6周、8周、10周分别经前腔静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体水平，同时采集抗凝血，分离淋巴细胞检测细胞免疫应答水平。结果表达修饰的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52M诱导的体液免疫与细胞免疫反应均明显高于表达未修饰的ORF5基因的DNA疫苗pCI-52(详见实施例3)。

                  序列表及附图说明

序列表SEQ ID NO.1是本发明修饰后的ORF5基因的序列

序列表SEQ ID NO：2-5为本发明中用于PCR扩增的引物

图1显示了修饰后的ORF5基因的序列，图中黑体字表示的碱基是插入的人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列。

图2显示了PRRSV YA株修饰的ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和未修饰的ORF5基因DNA疫苗pCI-52的结构图

图3显示了未修饰的ORF5基因DNA疫苗pCI-52的酶切与PCR鉴定结果

图4显示了修饰的ORF5基因DNA疫苗pCI-52M的酶切与PCR鉴定结果

图5显示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫Balb/c小鼠后的ELISA抗体水平

图6显示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫Balb/c小鼠后诱导的细胞免疫水平(脾淋巴细胞刺激指数)

图7显示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫断奶仔猪后的ELISA抗体水平

图8显示了PRRSV YA株ORF5基因DNA疫苗pCI-52M和pCI-52免疫断奶仔猪后诱导的细胞免疫反应水平(外周血单核细胞刺激指数)

                     具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明的保护范围。

实施例1：含有本发明修饰的基因的质粒和含有对照基因的质粒的制备

1、表达未修饰的ORF5基因(对照)的真核质粒pCI-52的构建

以pMD-ORF5为模板，P52S和P52R为引物扩增ORF5基因，纯化的扩增产物经XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表达载体pCI-neo的相应位点，获得重组质粒pCI-52。其结构见图2，酶切与PCR鉴定结果见附图3(XhoI、XbaI酶切均只有一条约6000bp的带、XhoI+XbaI酶切产生一条约600bp和一条约5400bp的带、PCR扩增出一条约600bp的带)。

2、表达修饰的ORF5基因的真核质粒pCI-52M的构建

以pMD-ORF5为模板，利用引物p51和p5m1扩增ORF5基因的N端96bp，其中引入了长39bp的PADRE表位；再利用引物p5m2和p52扩增ORF5基因的后一部分约507bp。两端PCR产物纯化后分别以XhoI+PstI和PstI+XbaI酶切，回收纯化后，同时与用XhoI+XbaI酶切的真核表达载体pCI-neo连接，获得表达修饰后的ORF5基因的真核表达质粒pCI-52M，结构见图2，酶切与PCR鉴定结果见附图4(XhoI酶切产生一条约6.1bp的带、XhoI+XbaI产生一条约5.5bp和一条约0.6bp的带、PstI酶切产生3条带：0.4bp、2.0bp、3.7bp、PCR扩增出一条约0.6bp的带)。

实施例2：本发明的DNA疫苗和对照疫苗对小鼠免疫效力的生物学实验

1、Balb/c小鼠的免疫程序

将Balb/c小鼠分为3组，每组6只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠100μl(含100μg质粒)，共免疫2次，间隔2周，同时用空白质粒载体pCI-neo作为核酸免疫的阴性对照。在首免后2、4、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体。

2、ELISA抗体水平

采用大肠杆菌表达和纯化的GP5蛋白作抗原，检测血清中的ELISA抗体水平，结果显示经修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组诱导的ELISA抗体要明显高于未经修饰的DNA疫苗pCI-52免疫组(P＜0.05，t-test)，表明修饰后的GP5具有更好的免疫原性，结果如附图5。

3、中和抗体水平

采用Yoon等(Yoon IJ，Joo HS，Goyal SM.A modified serum neutralization test forthe detection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swinesera.J Vet Diagn Invest，1994，6：289-292)报道的改良的中和抗体检测方法，检测血清中的中和抗体水平，结果与ELISA抗体结果一致，未经修饰的DNA疫苗pCI-52免疫组的中和抗体水平不高，并且上升得较为缓慢，而修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组的中和抗体快速上升，于第6周达到了1∶16，与pCI-52免疫组相比差异极显著(P＜0.01，t-test)，试验结果如表1。

表1  Balb/c小鼠首免后第4周、6周的中和抗体水平

组别(6只/组)	免疫前	首免后4周			首免后6周
								≥1∶4	≥1∶8	≥1∶16	≥1∶4	≥1∶8	≥1∶16
		pCI-neopCI-52pCI-52M	NDNDND	0/66/66/6	0/61/64/6	0/60/61/6	0/66/66/6							0/63/66/6	0/60/63/6

注：ND表示未做

4、细胞免疫水平检测

采用MTT法测定小鼠脾淋巴细胞的刺激指数(SI)(沈关心，周汝麟主编，《现代免疫学实验技术》，湖北科学技术出版社，1998)。结果经修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组的刺激指数要明显高于未经修饰的DNA疫苗pCI-52免疫组(P＜0.05，t-test)。试验结果如附图6所示。

实施例3：本发明的DNA疫苗和对照疫苗对断奶仔猪免疫效力的生物学实验

1、猪的免疫程序

断奶仔猪随机分成5组，每组4头，采用颈部肌肉注射，每头猪500μL(含100μg质粒)，共免疫3次，间隔2周，同时用空白质粒载体pCI-neo作为核酸免疫的阴性对照。于首免后6周、8周、10周分别经前腔静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体水平，同时采集抗凝血，分离淋巴细胞检测细胞免疫应答水平。

2、ELISA抗体检测

采用大肠杆菌表达和纯化的GP5蛋白作抗原，检测血清中的ELISA抗体水平，结果经修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组诱导的ELISA抗体要明显高于未经修饰的DNA疫苗pCI-52免疫组(P＜0.05，t-test)，表明修饰后的GP5具有更好的免疫原性，结果如图7。

3、中和抗体检测

采用Yoon等(Yoon IJ，Joo HS，Goyal SM.A modified serum neutralization test for thedetection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera.JVet Diagn Invest，1994，6：289-292)报道的改良的中和抗体检测方法，检测血清中的中和抗体水平，结果与ELISA抗体结果一致，未经修饰的DNA疫苗pCI-52免疫组的中和抗体水平不高，到首免后第10周所有免疫猪的中和抗体均在1∶4以下，而修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组的中和抗体上升较快，于首免后第6周就有2头猪的中和抗体达到了1∶4，到首免后第10周有3头猪的中和抗体都达到了1∶8，与pCI-52免疫组相比差异极显著(P＜0.01，t-test)，试验结果如表2。

表2  猪首免后第6周、8周、10周的中和抗体水平

组别(4头/组)	免疫前	首免后6周		首免后8周		首免后10周
								≥1∶4	≥1∶8	≥1∶4	≥1∶8	≥1∶4	≥1∶8
		pCI-neopCI-52pCI-52M	NDNDND	0/40/42/4	0/40/40/4	0/40/43/4	0/40/41/4							0/40/44/4	0/40/43/4

4、细胞免疫水平检测

采用MTT法测定免疫猪外周血单核细胞的刺激指数(SI)(沈关心，周汝麟主编。《现代免疫学实验技术》，湖北科学技术出版社，1998)，结果经修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组的刺激指数要明显高于未经修饰的DNA疫苗pCI-52免疫组(P＜0.05，t-test)。试验结果如附图8所示。

                           序列表

<120>一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因及应用

<130>

<141>2004-11-03

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>648

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(648)

<223>

<220>

<221>modified_base

<222>(97)..(141)

<223>

<400>1

atgttgggga aatgcttgac cacgggctgt tgctcgcgat tgctttcttt gtggtgtatc     60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgtcaac gccaacgcca agttcgtggc tgcctggacc    120

ctgaaggctg ccgctctgca gagcaacagc agctctcatt ttcagttgat ttataacttg    180

acgctatgtg agctgaatgg cacagattgg ctggctaaca aatttgactg ggcagtggag    240

acttttgtca tctttcccgt gttgactcac attgtttcct atggggcact caccaccagc    300

catttccttg acacagttgg tctggtcact gtgtccaccg ccgggtttta tcacgggcgg    360

tatgtcttga gtagcatcta cgcggtctgt gctctggctg cgttgatttg cttcgtcatt    420

aggcttgcga agaactgcat gtcctggcgc tactcttgta ccagatatac caacttcctt    480

ctggacacta agggcagact ctatcgttgg cggtcgcccg ttattgtaga gaaagggggt    540

aaggttgagg tcgagggtca cctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgtg    600

gcaacccctt taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtctctag                 648

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(33)

<223>

<400>2

gaactcgaga gtatgttggg gaaatgcttg acc                                  33

<210>3

<211>64

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(64)

<223>

<400>3

tttctgcaga gcggcagcct tcagggtcca ggcagccacg aacttggcgt tggcgttgac      60

gagc                                                                   64

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(26)

<223>

<400>4

tttctgcaga gcaacagcag cctctc                                           26

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>protein_bind

<222>(1)..(28)

<223>

<400>5

ttttctagag acgaccccat tgttccgc                                         28

Claims (2)

1、一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因，其特征在于，将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆盖表位间而获得，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该修饰基因包含在真核表达质粒pCI-52M中，含有该质粒的大肠杆菌Escherichia coli DH5α/pCI-52M，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M204080，保藏日期：2004年10月29日。

2、权利要求1所述的修饰的ORF5基因在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

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