CN101314032B - 伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺 - Google Patents

伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺，该工艺主要包括制备免疫原，动物体内免疫，体外免疫动物淋巴细胞，制备伤寒、副伤寒特异性转移因子等步骤。本发明口服制剂具有转移细胞信息、介导细胞免疫反应、特异性地抑制和杀伤伤寒、副伤寒沙门菌的功能，并且能增强非特异性免疫功能；该口服制剂服用无过敏反应，使用安全，效果明显，患者服用不会产生抗药性；本产品采用口服给药途径，服用不受条件的限制，既方便，又不影响有效成分本身的生物学活性，是一种安全有效的制剂，具有很好的社会价值和市场应用前景。

Description

伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺。
背景技术
伤寒(typhiod fever)是由伤寒沙门菌引起的，人是其唯一的天然宿主及储存者，主要发病于学龄儿童、青壮年及旅游者，大多是通过该菌携带者的分泌物而污染食物和水来传播，发病季节高峰在7～9月。到目前为止，伤寒仍然是全球的公共卫生问题，全球均有伤寒的报道，以热带、亚热带地区多见。随着社会发展和公共卫生状况的改善伤寒发病率有所下降，但在发展中国家仍有地方性流行或局部暴发流行的趋势。在我国贵州、广西、云南、新疆、江苏等省市伤寒仍是高发区。在遵义，近20年的流行病学调查表明，伤寒的最高发病率为10.22/10万，且发病总体趋势呈上升态势，约隔5年就有一次流行高峰。
副伤寒(paratyphoid fever)是由副伤寒沙门菌所致的急性传染病，副伤寒的病原体有3型：甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌。甲型副伤寒是一种由甲型副伤寒沙门菌引起的急性肠道传染病，近年来在贵州省的发病明显增高。据贵州省疾控中心通报，仅2004年上半年遵义市开发区发生的副伤寒累计发病达1750例。其主要的致病因素是革兰氏阴性细胞壁的脂多糖(LPS)引起发热、白细胞反应及内毒素血症等。甲型副伤寒沙门菌侵入机体后，主要在细胞内生长繁殖，因而要彻底杀灭这类胞内寄生菌，特异性细胞免疫是主要的防御机制。
转移因子(transfer factor)是白细胞中有免疫活性的淋巴细胞所释放的一种低分子核苷酸和和多肽，其本质是少量核酸和小分子多肽的混合物。它可以将被某种抗原(病原)免疫的特异性免疫反应从某一个体转移到另一个体，非特异性的提高受者的免疫功能，促进免疫细胞因子释放。
转移因子包括非特异性转移因子和特异性转移因子。非特异性转移因子主要用于提高人体的免疫功能和抗病能力，而特异性转移因子除了具备非特异性转移因子的功能外，还可以激发针对某种抗原的免疫反应。转移因子具有可透析性，不含蛋白，粗制转移因子中含多肽、核酸，在-20℃条件下可长期保存，分子量小于5000，使用很小的剂量就可以使受体产生局部或全身反应，作用时间快，3-4小时就可激活宿主的淋巴细胞，使受体致敏。
伤寒、副伤寒特异性转移因子能传递伤寒抗原特异性物质，激活T淋巴细胞、巨噬细胞，介导免疫反应的发生，同时提高IL-2、IFN和集落刺激因子等多种细胞因子在体内的生成，作用于免疫系统的多个环节，调整多项免疫反应，以增强受体的免疫功能。
伤寒、副伤寒目前主要是采用化学药物治疗，化学药物治疗导致出现了越来越多的耐药菌株，并且缺乏效果理想的疫苗；目前还没有紧急预防和治疗伤寒、副伤寒的生物制品。
发明内容
本发明的目的在于公开一种伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺，为伤寒、副伤寒的紧急预防和生物治疗提供一种即安全又有效的生物制剂。
本发明采用如下的技术方案：
伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺，该工艺包括如下步骤：
(1)制备伤寒、副伤寒沙门菌免疫原：取伤寒沙门菌H901株、O901株和副伤寒沙门菌株三种菌株的脑心浸液固体培养基20小时培养物，H901株20小时培养物用0.4％甲醛生理盐水溶解后，菌液置4℃冰箱杀菌3-5天，O901株和副伤寒沙门菌株20小时培养物分别用0.5％石炭酸生理盐水溶解后，菌液置于37℃孵箱过夜杀菌；500r/m离心洗涤菌液2次，根据计算公式：细菌数＝OD500/1.25×2×109，杀灭后的H901菌株、O901菌株、副伤寒沙门菌株分别用无菌生理盐水配制成5亿个菌/ml后，按照1∶1∶1的比例混合三种菌液，无菌实验检测为阴性后分装10ml/瓶，得免疫原，置于4℃冰箱保存；
(2)动物体内免疫：免疫过程为第1、3、5、7天背部皮下多点注射0.5ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；第14和21天背部皮下多点注射1.0ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；第28天静脉注射1.0ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；免疫结束7天后检测伤寒、副伤寒抗体效价达到1/2000，表示免疫成功；
(3)体外免疫动物淋巴细胞：无菌分离出动物脾脏淋巴细胞，用10％小牛血清RPMI 1640液制成5×107个/ml的淋巴细胞悬液，淋巴细胞悬液、浓度为50μg/ml的PHA溶液和5×106个/ml伤寒、副伤寒免疫原按5∶1∶1的比例加入培养瓶内，置5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱内培养6天，待用；
(4)制备伤寒特异性转移因子：取体内免疫成功动物的脾脏、淋巴结等淋巴组织加入4倍量的三蒸水绞碎匀浆后，超声破碎细胞，采用冻结温度为-25～-50℃、融化温度为20～30℃的冻融条件冻融6次，最后将匀浆透析；
(5)体外免疫动物淋巴细胞后，收集淋巴细胞超声破碎细胞，采用冻结温度为-25～-50℃、融化温度为20～30℃的冻融条件冻融6次，然后置低温离心机以500r/min离心20min，取上清液透析；
(6)收集步骤(4)和(5)中所得透析液过滤除菌，以Lorry法测定特异性转移因子的多肽含量，以多肽含量为1mg/ml为标准进行相应的稀释或浓缩以多肽含量1mg/ml作为1U，按生物制品规程分装，每支2ml含有2单位。
其中：步骤(4)和(5)中所述透析条件为：温度为4℃、匀浆液和透析液比例为1∶4、10KD透析袋、中间震荡6次、换液一次、总透析时间不超过40小时。
采用如上技术方案制得的特异性转移因子口服制剂的主要成分是由低聚核苷酸和多肽组成的不含蛋白的一种可溶解、可透析、可超滤的小分子物质，分子量一般在3000～5000道尔顿。
本发明产品具有转移细胞信息，介导细胞免疫反应，特异性地抑制和杀伤伤寒、副伤寒沙门菌的功能，并且能增强非特异性免疫功能，且服用无过敏反应，是辅助紧急预防和生物治疗伤寒、副伤寒的一种安全有效的生物制剂。
本发明的制备工艺具有如下的特点：
1、免疫原采用弱毒性的伤寒沙门菌H901株和O901株、副伤寒沙门菌制备，免疫动物体内产生特异性免疫应答；
2、免疫的次数、部位及剂量既可保证伤寒、副伤寒有效应答又不引起免疫耐受；
3、特定透析的条件能提高伤寒、副伤寒特异性转移因子有效成分的含量；
4、体外免疫淋巴细胞，可节约成本，有利于控制和规范制备过程。
与现有技术相比，本发明的产品是取材于经过伤寒、副伤寒沙门菌免疫原免疫动物后的淋巴组织或者体外免疫淋巴细胞，采用匀浆透析法制得，具有以下优点：
(1)该口服制剂具有转移细胞信息、介导细胞免疫反应、特异性地抑制和杀伤伤寒、副伤寒沙门菌的功能，并且能增强非特异性免疫功能；
(2)因特异性转移因子本身没有免疫原性，所以服用无过敏反应，使用安全，效果明显，患者服用不会产生抗药性；
(3)本产品采用口服给药途径，服用不受条件的限制，既方便，又不影响有效成分本身的生物学活性，是一种安全有效的制剂，具有很好的社会价值和市场应用前景。
具体实施方式
本发明实施例：按照如下步骤制备伤寒、副伤寒特异性转移因子口服制剂：
(1)制备伤寒、副伤寒沙门菌免疫原：取伤寒沙门菌H901株、O901株和副伤寒沙门菌株三种菌株的脑心浸液固体培养基20小时培养物，H901株20小时培养物用0.4％甲醛生理盐水溶解后，菌液置4℃冰箱杀菌3-5天，O901株和副伤寒沙门菌株20小时培养物分别用0.5％石炭酸生理盐水溶解后，菌液置于37℃孵箱过夜杀菌；500r/m离心洗涤菌液2次，根据计算公式：细菌数＝OD500/1.25×2×109，杀灭后的H901菌株、O901菌株、副伤寒沙门菌株分别用无菌生理盐水配制成5亿个菌/ml后，按照1∶1∶1的比例混合三种菌液，无菌实验检测为阴性后分装10ml/瓶，得免疫原，置于4℃冰箱保存；
(2)动物体内免疫：免疫过程为第1、3、5、7天背部皮下多点注射0.5ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；第14和21天背部皮下多点注射1.0ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；第28天静脉注射1.0ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；免疫结束7天后检测伤寒、副伤寒抗体效价均达到1/2000，表示免疫成功；
(3)体外免疫动物淋巴细胞：无菌分离出动物脾脏淋巴细胞，用10％小牛血清RPMI 1640液制成5×107个/ml的淋巴细胞悬液，淋巴细胞悬液、浓度为50μg/ml的PHA溶液和5×106个/ml伤寒沙门菌免疫原按5∶1∶1的比例加入培养瓶内，置5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱内培养6天，待用；
(4)制备伤寒特异性转移因子(typhoid fever specific transfer factor，简称T-STF)：取体内免疫成功动物的脾脏、淋巴结等淋巴组织加入4倍量的三蒸水绞碎匀浆后，超声破碎细胞，采用冻结温度为-25～-50℃、融化温度为20～30℃的冻融条件冻融6次，最后将匀浆在4℃温度下、匀浆液和透析液比例为1∶4、使用10KD透析袋透析，中间振荡6次、换液一次、总透析时间不超过40小时；
(5)体外免疫动物淋巴细胞后，收集淋巴细胞超声破碎细胞，采用冻结温度为-25～-50℃、融化温度为20～30℃的冻融条件冻融6次，然后置低温离心机以500r/min离心20min，取上清液在4℃温度下、匀浆液和透析液比例为1∶4、使用10KD透析袋透析，中间振荡6次、换液一次、总透析时间不超过40小时；
(6)收集步骤(4)和(5)中所得透析液过滤除菌，以Lorry法测定T-STF的多肽含量，以多肽含量为1mg/ml为标准进行相应的稀释或浓缩以多肽含量1mg/ml作为1U，按生物制品规程分装，每支2ml含有2单位。
本发明产品的检定
1、外观：无色或者淡黄色，略带腥味的透明澄清液体。
2、PH值：PH6.0～7.5，符合规定。
3、蛋白质：20％磺基水杨酸法，无沉淀。
4、核糖含量：3.5-二羟基甲苯比色法，＞0.3mg/ml。
5、多肽含量：Lorry法测定，1.0mg/ml。
6、紫外分光光度计：均在258.0～263.0nm处有一处高吸收峰，在230.0～243.0nm处有一低吸收峰，至300.0nm开始随波的增加接近于0。E260/280＝1.82。
7、无菌试验：按2005年版《中国药典》附录XIH检查，符合规定。
8、热原质：按2005年版《中国药典》附录XIE检查，符合规定。
9、安全试验：取体重250～300g的健康豚鼠2只，腹腔注射本品5ml，观察3天和7天，豚鼠健康存活，活动自如，体重未减轻，注射点无硬结和化脓。
10、活性测定
10.1、白细胞粘附抑制试验(LAIT)：
T-STF口服制剂1ml给6只昆明种小鼠灌胃，生理盐水作为对照组，连续7天后，无菌取脾，制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞终浓度为5×106个/ml。以青霉素瓶进行LAIT，每瓶加入淋巴细胞悬液0.1ml，伤寒沙门菌H901和O901免疫原(5×106CFU/ml)0.1ml和20％小牛血清RPMI 1640培养液0.1ml，每只动物做两个复瓶，孵育前各瓶取20μl计数每瓶细胞数，将瓶移入CO2培养箱内，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养2.5h。计数孵育后细胞数，以粘附抑制率表示结果。
结果：T-STF口服制剂组白细胞粘附抑制率为50.04±7.71％，显著高于生理盐水对照组的粘附抑制率15.08±3.40％，表明T-STF口服制剂含有介导对伤寒沙门菌抗原特异性LAI效应的免疫活性物质。
10.2、毒株攻击实验
T-STF口服制剂1ml给48只昆明种小鼠灌胃(T-STF组)，生理盐水作为对照组(NS组)，连续7天，第10天用伤寒沙门菌(ATCC编号58T779)毒株LD50(含于0.5ml中)腹腔接种，进行攻击实验，观察一般情况、3d和7d的存活率。
毒株攻击后各实验组小鼠的一般情况、3d和7d的存活率
Figure GDA0000029880730000061
结果：经卡方检验统计分析T-STF组相对NS组有较高的存活率，说明T-STF可以有效降低伤寒的感染率和死亡率，产生有效的保护力；转移给正常小鼠的细胞免疫能力是针对伤寒沙门菌的，且传递特异性活性物质，调节细胞免疫反应，具有抗伤寒的效应。

Claims (2)

1.伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺，该工艺包括如下步骤：
(1)制备伤寒、副伤寒沙门菌免疫原：取伤寒沙门菌H901株、O901株和副伤寒沙门菌株三种菌株的脑心浸液固体培养基20小时培养物，H901株20小时培养物用0.4％甲醛生理盐水溶解后，菌液置4℃冰箱杀菌3-5天，O901株和副伤寒沙门菌株20小时培养物分别用0.5％石炭酸生理盐水溶解后，菌液置于37℃孵箱过夜杀菌；500r/m离心洗涤菌液2次，根据计算公式：细菌数＝OD500/1.25×2×109，杀灭后的H901菌株、O901菌株、副伤寒沙门菌株分别用无菌生理盐水配制成5亿个菌/ml后，按照1∶1∶1的比例混合三种菌液，无菌实验检测为阴性后分装10ml/瓶，得免疫原，置于4℃冰箱保存；
(2)动物体内免疫：免疫过程为第1、3、5、7天背部皮下多点注射0.5ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；第14和21天背部皮下多点注射1.0ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；第28天静脉注射1.0ml伤寒、副伤寒沙门菌免疫原；免疫结束7天后检测伤寒、副伤寒抗体效价均达到1/2000，表示免疫成功；
(3)体外免疫动物淋巴细胞：无菌分离出动物脾脏淋巴细胞，用10％小牛血清RPMI 1640液制成5×107个/ml的淋巴细胞悬液，淋巴细胞悬液、浓度为50μg/ml的PHA溶液和5×106个/ml伤寒、副伤寒免疫原按5∶1∶1的比例加入培养瓶内，置5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱内培养6天，待用；
(4)制备伤寒特异性转移因子：取体内免疫成功动物的脾脏、淋巴结加入4倍量的三蒸水绞碎匀浆后，超声破碎细胞，采用冻结温度为-25～-50℃、融化温度为20～30℃的冻融条件冻融6次，最后将匀浆透析；
(5)体外免疫动物淋巴细胞后，收集淋巴细胞超声破碎细胞，采用冻结温度为-25～-50℃、融化温度为20～30℃的冻融条件冻融6次，然后置低温离心机以500r/min离心20min，取上清液透析；
(6)收集步骤(4)和(5)中所得透析液过滤除菌，以Lorry酚法测定特异性转移因子的多肽含量，以多肽含量为1mg/ml为标准进行相应的稀释或浓缩以多肽含量lmg/ml作为1单位，按生物制品规程分装，每支2ml含有2单位。
2.如权利要求1所述伤寒特异性转移因子口服制剂的制备工艺，其特征在于：步骤(4)和(5)中所述透析条件为：温度为4℃、匀浆液和透析液比例为1∶4、10KD透析袋、中间震荡6次、换液一次、总透析时间不超过40小时。
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