CN101486758B - mda-7/IL-24突变体多肽及其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域。本发明公开了一种含RGD模体的mda-7/IL-24突变体多肽，及其制备方法和用途。本发明利用重叠延伸PCR技术，构建含RGD模体的人白介素24突变体(RGD-mda-7/IL-24)，克隆入表达载体并在大肠杆菌中高效表达。表达的RGD-mda-7/IL-24突变体多肽具有较野生型mda-7/IL-24更强的对多种肿瘤的治疗作用。

Description

mda-7/IL-24突变体多肽及其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体的说是一种mda-7/IL-24突变体多肽及其制备方法。涉及利用重叠延伸PCR技术，构建含RGD模体的人mda-7/IL-24突变体，克隆入含His-tag的表达载体，并在大肠杆菌中高效表达。利用表达的RGD-mda-7/IL-24治疗各种肿瘤疾病。

背景技术

(一)mda-7/IL-24的发现与结构

1995年Fisher等用β-干扰素和蛋白激酶C活化剂mezerin诱导人黑色素瘤细胞HO-1，通过减数杂交技术从HO-1中鉴定并克隆出黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7，mda-7)，同时发现mda-7对黑色素瘤细胞的生长产生不可逆抑制，并最终诱导其分化^[1]。随后多家研究证实mda-7能特异性诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖。2002年Caudell等基于基因结构、染色体定位、序列同源性、免疫活性等方面的考虑，将mda-7被归为IL-10家族，并正式命名为IL-24^[2]。

mda-7/IL-24基因是单拷贝基因，定位于1号染色体(1q32-41)，由7个外显子和6个内含子组成，其mRNA长约2kb，编码由206个氨基酸组成的、相对分子质量约为23800的蛋白质。序列分析表明，mda-7/IL-24蛋白的N端有一个49个氨基酸组成的信号肽，与蛋白的翻译后加工和分泌有关；此外，mda-7/IL-24蛋白序列上有3个N-糖基化位点、3个蛋白激酶C位点、6个磷酸化位点^[3，4]。mda-7/IL-24蛋白的受体属于II型细胞因子受体，由2个异源二聚体(IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2)组成，激活JAK/STAT信号传导通路^[5]。

2004年Chada等对mda-7/IL-24空间结构进行研究，根据mda-7/IL-24属于IL-10家族推测mda-7/IL-24蛋白分子结构由A-F 6条α-螺旋链组成，其空间结构可能是由Cys59和Cys107形成分子内二硫键的单体，也可能是由两条链的Cys59形成分子间二硫键的同源二聚体^[6]。Chada等分析认为IL-10家族中的IL-10、IL-22和IL-26的空间结构是二聚体，都有一个短的D-E linker，；而IL-19空间结构是单体，有一个长的D-E linker。mda-7/IL-24的D-E linker比IL-19的还要长，所以推测mda-7/IL-24是单体蛋白。

(二)mda-7/IL-24抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡

mda-7/IL-24蛋白主要在免疫系统相关的组织中表达，如胸腺、脾、外周血单核细胞等^[4]，其正常生理功能是调节免疫反应。然而研究发现，将mda-7/IL-24基因转入肿瘤细胞后，能特异性抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡，而对正常细胞没有影响。mda-7/IL-24蛋白不但具有直接抗肿瘤作用，还可以通过抑制肿瘤转移、抑制肿瘤血管形成、发挥旁观者效应，以及和其他药物或治疗方式联合应用产生协同抗肿瘤效应。

1.mda-7/IL-24与黑色素瘤

1996年Jiang等^[7]首先研究证实，使用质粒携带mda-7/IL-24基因转染黑色素瘤细胞及其他肿瘤细胞，肿瘤细胞生长受到抑制，且对正常细胞没有损害。Lebedeva等^[8]用腺病毒介导mda-7/IL-24(Ad.mda-7)转染黑色素瘤细胞和正常黑色素细胞，发现能使黑色素瘤细胞生长停滞在细胞周期G2/M期，诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有影响。最新研究发现，对荷黑色素瘤裸鼠的瘤内注射肿瘤特异启动子PEG-3调控的荷载mda-7/IL-24的条件增殖腺病毒Ad.PEG-E1A-mda-7，不仅可以完全消灭治疗的原发肿瘤，而且可以根除远处的肿瘤^[9]。mda-7/IL-24给黑色素瘤的治疗带来新的希望。

2.mda-7/IL-24与肺癌

2000年Saeki等^[10]用Ad.mda-7作用于非小细胞肺癌(NSCLC)细胞包括p53野生型细胞株A549、H460和p53突变型细胞株H1299及正常人肺纤维细胞，结果发现mda-7/IL-24对正常细胞没有影响，但能特异性抑制各种肺癌细胞生长，诱导其凋亡，且这种抑制作用不依赖p53，依赖于激活caspase-3和caspase-9。由此可见mda-7/IL-24可以通过多种途径诱导肺癌细胞凋亡。最近Ad.mda-7联合其他抗肿瘤药物治疗肺癌取得很好效果。Pataer等^[11]联合应用Ad.mda-7和geldanamycin(格尔德霉素)治疗肺癌细胞发现可以产生协同抗肿瘤效果。Emdad等^[12]联合应用Gefitinib(吉非替尼)和Ad.mda-7治疗NSCLC，发现mda-7/IL-24可以逆转肺癌细胞对Gefitinib的耐药性，产生协同效果。Inoue等^[13]联合使用Bevacizumab(贝伐单抗)和Ad.mda-7治疗荷肺癌移植瘤裸鼠，发现联合应用可以完全消退小鼠体内肿瘤；分子水平研究发现联合应用Bevacizumab和Ad.mda-7可以减少VEGF和CD31的表达，增强肿瘤细胞凋亡。因此，Ad.mda-7与其他肺癌治疗药物联合应用可能是一种较好的肺癌基因治疗策略。

3.mda-7/IL-24与乳腺癌

Mhashilkar等^[14]用Ad.mda-7治疗乳腺癌细胞，发现mda-7基因可使原癌基因表达下降，包括β-连接素和PI3K信号传递途径。mda-7/IL-24引起细胞核及胞浆膜的β-连接素的重分布，导致E-cadherin-β-catenin黏附混合体上调；还可使PI3K途径上的成员(p85PI3K、FAK、ILK21、Akt和PLC-γ)的表达下调。McKerzie等^[15]通过体外及动物体内实验证明联合应用Trastuzumab(曲妥单抗)和Ad.mda-7治疗Her-2/neu过表达的乳腺癌细胞，可以有效的抑制肿瘤的生长。并且发现Trastuzumab和Ad.mda-7联合是通过β-catenin和Akt途径抑制乳腺癌细胞生长。近来又应用Ad.mda-7与放疗或其他治疗乳腺癌药物，如Tamoxifen、Taxotere、Adriamycin、Herceptin联合，均能产生协同治疗作用^[15，16]。

4.mda-7/IL-24与胰腺癌

2001年Su等^[17]应用Ad.mda-7治疗胰腺癌发现其不能抑制胰腺癌细胞的生长和凋亡。因考虑到90％胰腺癌发生K-ras基因突变率，遂使用K-ras基因反义寡核苷酸联合Ad.mda-7治疗胰腺癌，发现可以诱导胰腺癌细胞凋亡。后来证实胰腺癌K-ras基因的突变可以阻碍mda-7/IL-24的mRNA翻译成蛋白质，使用三氧化二砷等试剂提高活性氧簇水平，可以逆转这种蛋白翻译障碍，诱导K-ras基因突变的胰腺癌细胞凋亡，抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长^[18，19]。

mda-7/IL-24不仅可以特异性诱导黑色素瘤、肺癌、乳腺癌细胞凋亡及联合其他试剂抑制胰腺癌生长，而且几乎可以诱导所有的肿瘤细胞凋亡、抑制其生长，包括脑胶质瘤、肝癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤。

5.mda-7/IL-24间接抗肿瘤作用

mda-7/IL-24既能直接诱导肿瘤细胞凋亡抑制其生长，还能通过抑制肿瘤血管形成和发挥旁观者抗肿瘤效应间接抑制肿瘤生长。Saeki等^[20]研究发现Ad.mda-7在体外能抑制人血管内皮细胞分化，同时降低血管异生标志物CD31的表达。Nishikawa等^[21]研究发现，Ad.mda-7感染能抑制VEGF、bFGF和IL-8的表达，从而抑制肿瘤血管的形成。Su等^[22]将正常前列腺上皮细胞P69与Ad.mda-7以及含有IL-20和IL-22受体的前列腺癌细胞(DU-145)或胰腺癌细胞(BxPC-3)共同培养，发现mda-7能抑制肿瘤细胞生长，从而推测mda-7/IL-24通过抗肿瘤旁观者效应抑制肿瘤细胞生长；Sarkar等^[23]在应用Ad.mda-7治疗双侧肋部皮下荷乳腺癌移植瘤裸鼠模型时，单侧瘤内注射Ad.mda-7，发现双侧肿瘤生长都被抑制。

6.mda-7/IL-24抑制肿瘤转移作用

Ramesh等^[24]在体外和体内实验中证实，mda-7/IL-24蛋白能抑制肺癌细胞的浸润和迁移，这种抑制作用是通过抑制与肿瘤浸润和转移有关的分子如PI3K/PKB、FAK、MMP-2、MMP-9等的表达实现。Su等^[25]研究发现，正常细胞分泌的mda-7/IL-24蛋白也能抑制肿瘤细胞的浸润。

但mda-7/IL-24的治疗作用进一步提高受到限制，2008年Gopalan发现，mda-7/IL-24半衰期大约1.8小时，如果表达的IL-24蛋白不能快速有效的与细胞结合，很快就被泛素-蛋白体系统降解^[26]。因此提高IL-24与肿瘤细胞的结合能力将是改善IL-24治疗效果的关键。

(三)RGD肽发现及功能

自1984年Pierschbacher首次报道纤维蛋白原包含的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽序列为细胞识别位点以来，RGD肽一直是靶向抗肿瘤的研究热点。RGD肽是整合素和其配体结合的识别位点，因此RGD肽可以作为与细胞结合的载体。Zitzmann通过荧光标记检测发现，含有RGD序列的短肽能够靶向到达裸鼠乳腺癌移植瘤细胞，而在正常组织细胞中检测不到^[27]。Arap等将RGD肽与阿霉素偶连，发现它可以有效地将阿霉素运输到荷瘤小鼠肿瘤，更好地发挥疗效，同时降低毒副作用^[28]。将肿瘤坏死因子-α、抗CD3抗体、凋亡相关合成多肽与RGD偶联，体内外实验均获得了令人鼓舞的结果^[29]。以上研究使我们设想，如果在野生型mda-7/IL-24序列中的精氨酸(R)、天冬氨酸(D)之间插入一个甘氨酸(G)，使mda-7/IL-24含有RGD肽，就可以通过RGD肽与肿瘤细胞表面的整合素受体结合，从而使mda-7/IL-24快速有效的与肿瘤细胞结合，避免被泛素-蛋白体系统降解，借此改善IL-24治疗效果。

发明内容

本发明提供一种mda-7/IL-24突变体多肽。更加具体地说，本突变是在mda-7/IL-24结构的D-E linker区域中Arg-164和Asp-165残基之间插入一个氨基酸残基。所述肽中插入的残基是Gly残基。在实施例中，Gly被插入Arg和Asp之间，形成RGD(Arg-Gly-Asp)肽模体。

另外，本发明提供了编码RGD-mda-7/IL-24突变体多肽的DNA。此外，本发明还提供了一种含有此突变体多肽DNA的表达载体，该载体能够表达带有His-tag的mda-7/IL-24突变体多肽。

本发明涉及mda-7/IL-24突变体或突变蛋白质，它增强野生型mda-7/IL-24(wtmda-7/IL-24)的抗肿瘤活性。具体地说，在野生型mda-7/IL-24序列中插入一个甘氨酸(G)，可以和序列中的精氨酸(R)、天冬氨酸(D)构成RGD肽。含有RGD肽的mda-7/IL-24可以通过RGD肽与肿瘤细胞表面的整合素受体结合，从而使mda-7/IL-24靶向性作用肿瘤细胞，快速有效的与细胞结合，保护其不被泛素一蛋白体系统降解，借此改善IL-24治疗的效果。

一种mda-7/IL-24突变体多肽，所述多肽是在mda-7/IL-24中构建含RGD模体的突变；所述突变是插入。

所述插入位于mda-7/IL-24的α-螺旋D-E linker区域中Arg-164和Asp-165氨基酸残基之间。

所述在Arg-164和Asp-165氨基酸残基之间插入的是Gly残基。

mda-7/IL-24突变体表达载体为一种带有His-tag的表达载体，蛋白的纯化由His-tag一步纯化。表达载体所表达蛋白不仅包括mda-7/IL-24突变体多肽，也包括利用其表达野生型mda-7/IL-24或其它白细胞介素。

mda-7/IL-24突变体多肽的用途，单独用于或与其它药物组合用于治疗各种肿瘤疾病。

mda-7/IL-24突变体多肽的制备方法是：(1)采用重叠延伸PCR法，以mda-7/IL-24为模板，分别用P1与P2、P3与P4二对引物进行两次PCR，得到mda-7/IL-24突变体的5′片段和3′片段；以这两个片段共同作为模板，加入引物P1、P4进行第三次PCR，得到含RGD模体的突变体全长cDNA；用HindIII、BamHI酶切得到的PCR产物，然后与同样酶切的载体pET28a(+)连接；将连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，DNA序列测定正确者，即为所需要的mda-7/IL-24突变体表达载体。(2)采用带有His-tag的表达载体表达mda-7/IL-24突变体多肽。

本发明的有益效果是：能快速有效的与肿瘤细胞结合，避免被泛素-蛋白体系统降解。能单独用于或与其它药物组合用于治疗各种肿瘤疾病。

附图说明

图1是野生型mda-7/IL-24(A)和突变型RGD-mda-7/IL-24(B)的DNA测序图；

图2是RGD-mda-7/IL-24的表达与纯化；其中：1、标准蛋白；2、未诱导表达的菌体蛋白；3、诱导表达的菌体蛋白；4、超声后上清；5、超声后沉淀；6、突变体蛋白纯化产物。

图3是RGD-mda-7/IL-24与野生型mda-7/IL-24的IL-6、TNF-α和INF-γ诱生活性测定分析；

图4是RGD-mda-7/IL-24、野生型mda-7/IL-24抑制多种肿瘤细胞增殖比较；

图5是RGD-mda-7/IL-24、野生型mda-7/IL-24诱导多种肿瘤细胞凋亡比较；

图6是RGD-mda-7/IL-24、野生型mda-7/IL-24与多种肿瘤细胞结合能力比较。

具体实施方式

下面结合优选具体实施例对本发明进行详细描述，但并不构成对本发明范围的限制。也就是说，凡针对此位点的插入，或对mda-7/IL-24改造含RGD肽的构建，均在本发明的范围。使用本发明治疗各种肿瘤疾病等也均在本发明的范围。

实施例1

(一)RGD-mda-7/IL-24突变体构建

2004年Chada证实D-E linker位于mda-7/IL-24分子结构表面，D-E linker上既没有N-糖基化、蛋白激酶C及磷酸化位点，也不是主要功能结构域^[24]。因此，在D-E环序列中插入甘氨酸残基不会影响mda-7/IL-24原有的空间结构和功能。

根据已知的mda-7/IL-24序列，设计了4条引物：

P1：TGTGCATATG GCCCAGGGCCAAG

P4：TGTGGGATCCTCAGAGCTTGTAG

划线处CATATG为NdeI酶切位点，GGATCC为BamHI酶切位点，加框处为引物中设计的突变位点，斜体为肠激酶酶切位点。

采用重叠延伸PCR法，先由引物P1与P2、P3与P4进行前两轮PCR，分别得到突变体的5′片段和3′片段，回收这两个片段，共同作为模板，加入引物P1、P4进行第三轮PCR，得到突变体RGD-mda-7/IL-24的全长cDNA。用NdeI、BamHI酶切得到的PCR产物，用低熔点琼脂糖凝胶回收，然后与同样酶切的载体pET28a(+)连接。将连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，酶切鉴定后，行DNA序列测定，见图1。

(二)重组RGD-mda-7/IL-24突变体质粒的提取

利用pET28a(+)中的抗卡那霉素基因，筛选出阳性菌落。挑取单克隆菌落，在LB培养基中小量(3～5ml)扩增。先离心收集细菌沉淀，加入250μl细胞悬浮液(50nmol/L Tris-HCl，PH 7.5，10mmol/LEDTA，100g/mL RNaseA)将沉淀悬浮，然后加入250μl细胞裂解液(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，颠倒混匀4～5次，放置1～5min使悬浮液变澄清后，加入10μl碱性蛋白酶，轻轻混合，静置5min，再加入350μl中和液(4.09mmol/L盐酸胍，0.759mol/L醋酸钾，2.12mol/L冰醋酸，PH 4.2)，混匀后14000g室温离心10min。将上清转移至一特定收集管中，加入750μl洗脱液(60％乙醇，60mmol/L醋酸钾，10mmol/L Tris-HCl，PH 7.5)，室温14000g，离心1min，弃上清，再加入250μl洗脱液，室温14000g，离心2min，然后将收集管套入一新的1.5ml EP管中，加入适量无核酸酶水，14000g，离心1min，-20℃保存质粒。

(三)RGD-mda-7/IL-24突变体的表达、纯化与复性

1.RGD-mda-7/IL-24突变体的表达：

将RGD-mda-7/IL-24突变体cDNA重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，于TB培养基中37℃振荡培养约6小时，至培养液光密度A600为0.5～0.6时，以1∶50稀释到同样培养基中，继续在37℃摇床培养过夜。离心收集菌体，采用SDS-PAGE分析表达产物(分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为4％)。结果可见RGD-mda-7/IL-24突变体，占菌体总蛋白的30％，见图2。本技术所采用诱导表达RGD-mda-7/IL-24突变体，优点是经济有效，易于纯化，并且为大规模工业生产打下了良好的基础。另一方面，表达载体的独特酶切位点的设计使表达产物更加接近于野生型的mda-7/IL-24。

2.包涵体的分离、洗涤及溶解：

以0.02mol/L pH 6.8的磷酸缓冲液悬浮菌体，于冰浴中超声破碎3次，每次1min，10000g离心15min收集沉淀。以2mol/L尿素洗涤2次，每次2h，10000g离心15min收集沉淀。用8mol/L尿素室温溶解沉淀，10000g离心20min，收集上清。

3.Ni-NTA His·Bind Resin过滤：

以8mol/L尿素溶解的上清经超滤浓缩后，加入50％Ni-NTA His·BindResin混悬液在室温下摇动混匀30分钟，将混悬液上柱，用含0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)、8mol/L尿素、0.01mol/L Tris-HCl的洗液洗洗柱2次，用含0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 5.9)、8mol/L尿素、0.01mol/L Tris-HCl的蛋白萃取液提取纯化蛋白。收集各组分，用SDS-PAGE分析纯化产物。结果显示蛋白纯度达到了90％以上，见图2。

4.纯化产物的复性：

纯化产物的复性采用透析法，在4℃进行4次过夜透析复性，透析液依次分别是透析液I(10mmol/L Tris-HCl、0.1mmol/L DTT pH 8.5)；透析液II(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0)，最后冷冻抽干后保存。

(四)RGD-mda-7/IL-24突变体免疫活性测定

新鲜正常人全血10ml，加入等体积生理盐水稀释后，分别加入2个内有4ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心30min，然后将淋巴细胞转至一新离心管中，生理盐水洗涤后，离心收集细胞。用RPMI-1640培养液悬浮后细胞计数，以5×10⁶细胞/ml接种到96孔板中，加入10％FCS、0.5％的双抗(青霉素+链霉素)。然后每孔分别加入100nmol/L的野生型mda-7/IL-24或RGD-mda-7/IL-24蛋白，于37℃，5％CO2培养箱中孵育48h，收集细胞上清，抗体夹心ELISA法检测IL-6、TNF-α和INF-γ生物学活性。

在包被有抗人IL-6、TNF-α和INF-γ单抗的酶标条中，每孔加入50μl细胞上清和等体积的生物素化检测抗体，室温(20℃)孵育120min，然后加入100μl辣根过氧化物酶标记的亲和素，室温孵育30min，使生物素与亲和素充分结合，再加入底物显色，10min后加入终止液，用酶标仪测OD490nm值。分别以IL-6、TNF-α和INF-γ标准品做平行实验，绘制标准曲线，计算样品中IL-6、TNF-α和INF-γ的含量。结果显示，RGD-mda-7/IL-24诱导人PBMC产生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力比野生型mda-7/IL-24显著提高(P＜0.05)，见图3。

(五)RGD-mda-7/IL-24突变体抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡

1.MTT检测肿瘤细胞体外增殖：

取对数生长期肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG-2和乳腺癌MCF-7细胞，以2×10³/孔的细胞浓度接种于96孔培养板，37℃，5％CO₂条件下培养。24h后分成3组，分别加入8μg/ml野生型mda-7/IL-24、突变型RGD-mda-7/IL-24和PBS。24、48、72和96小时后分别加入20μl 5mg/ml MTT，37℃孵育4h后吸尽培养液，加入二甲亚砜(DMSO)150μl，再次37℃孵育15min后在酶标仪上490nm波长读吸光值，取平均值分析。

结果显示，野生型mda-7/IL-24和突变型RGD-mda-7/IL-24治疗后的肿瘤细胞A549、HepG-2和MCF-7增殖明显被抑制，均与PBS对照组有显著性差异(P＜0.01)，突变型RGD-mda-7/IL-24抑制肿瘤增殖效果比野生型mda-7/IL-24显著增强(P＜0.05)，见图4。

2.凋亡检测：

在24孔板中接种A549、HepG-2和MCF-7肿瘤细胞至60％满后分成3组，分别加入野生型mda-7/IL-24(8μg/ml)、突变型RGD-mda-7/IL-24(8μg/ml)和PBS。72小时后，用4％多聚甲醛固定30min，反复磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入2ml配制好的DAPI溶液，避光染色15分钟后荧光显微镜下观察。以连续计数1000个细胞作为计数结果。

结果显示，野生型和突变型RGD-mda-7/IL-24能均诱导肿瘤细胞A549、HepG-2和MCF-7凋亡，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)见图5A。突变型RGD-mda-7/IL-24比野生型mda-7/IL-24诱导肿瘤细胞凋亡显著增强(P＜0.05)，见图5B。结果表明RGD-mda-7/IL-24具有比野生型mda-7/IL-24更强的治疗效果，RGD-mda-7/IL-24突变体有望成为一种比mda-7/IL-24更有效的肿瘤治疗药物。

(六)RGD-mda-7/IL-24黏附肿瘤细胞能力增强

用包被液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Na₂HPO₄，pH 7.3)稀释纯化复性后的RGD-mda-7/IL-24和野生型mda-7/IL-24，以每孔100μl的体积加入到96孔板中，4℃包被过夜。0.9％的NaCl洗板3次后每孔加入封闭液200μl(含2％BSA的1640完全培养基)，37℃封闭2小时，再用0.9％的NaCl洗板3次。肿瘤细胞用0.9％的NaCl洗涤后，每孔加入100μl细胞混悬液(3×10⁴个细胞/孔)，37℃，5％CO₂条件下培养1小时后，洗板除去未黏附细胞，用4％的多聚甲醛固定后，用0.5％的结晶紫染色，倒置显微镜观察并照相。

如图6所示，被突变型RGD-mda-7/IL-24包被的孔中有细胞黏附，而被野生型mda-7/IL-24包被的孔中没有细胞黏附。结果证明突变型mda-7/IL-24通过RGD肽增强与肿瘤细胞结合作用。

序列表

人mda-7/IL-24基因序列表

SEQUENCE LISTING

<110>郑骏年 裴冬生 张宝福

<120>mda-7IL-24突变体多肽的制备及应用其治疗肿瘤

<130>

<160>2

<210>1

<211>624

<212>DNA

<213>人(human)

<400>

atgaattttc aacagaggct gcaaagcctg tggactttag ccagcagacc cttctgccct 60

cctttgctgg cgacagcctc tcaaatgcag atggttgtgc tcccttgcct gggttttacc 120

ctgcttctct ggagccaggt atcaggggcc cagggccaag aattccactt tgggccctgc 180

caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact 240

atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac 300

gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact 360

gttttcaaaa actaccacaa tagaacagtt gaagtcagga ctctgaagtc attctctact 420

ctggccaaca actttgttct catcgtgtca caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg 480

ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg tttctgctat tccggagagc attcaaacag 540

ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc cttggggaag tggacattct tctgacctgg 600

atgcagaaat tctacaagct ctga                                        624

<210>2

<211>

<212>DNA

<213>引物

<400>2

P1：TGTGCATATG GACGACGACG ACAAGGCCCA GGGCCAAG 38

P2：ACTGTCACCT CTGATGGAAA ACATC 25

P3：ATCAGAGGTG ACAGTGCACA CAGGC 25

P4：TGTGGGATCC TCAGAGCTTG TAG 23

Claims (3)

1.一种mda-7/IL-24突变体多肽，其特征在于，所述多肽是在mda-7/IL-24中构建RGD模体的突变；所述突变是插入；所述突变是在mda-7/IL-24的α-螺旋D-E linker区域中Arg-164和Asp-165氨基酸残基之间插入Gly残基。

2.一种权利要求1所述的mda-7/IL-24突变体多肽的制备方法，其特征在于：采用重叠延伸PCR法，以mda-7/IL-24为模板，分别用P1与P2、P3与P4二对引物进行两次PCR，得到mda-7/IL-24突变体的5′片段和3′片段；以这两个片段共同作为模板，加入引物P1、P4进行第三次PCR，得到含RGD模体的突变体全长cDNA；用HindIII、BamHI酶切得到PCR产物，然后与同样酶切的载体pET28a(+)连接；将连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，DNA序列测定正确者，即为所需要的mda-7/IL-24突变体表达载体；采用带有His-tag的表达载体表达mda-7/IL-24突变体多肽；

其中，P1为TGTGCATATGGACGACGACGACAAGGCCCAGGGCCAAG；

P2为ACTGTTCTGATGGAAAACATC；

P3为ATCAG

GACAGTGCACACAGGC；

P4为TGTGGGATCCTCAGAGCTTGTAG。

3.如权利要求1所述的mda-7/IL-24突变体多肽的用途，所述mda-7/IL-24突变体多肽单独用于或与其它药物组合用于制备治疗各种肿瘤疾病的药物。

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