CN103436516B - 利用大肠杆菌原核表达系统生产的小麦蛋白质二硫键异构酶及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用大肠杆菌原核表达系统生产的小麦蛋白质二硫键异构酶及方法和应用。采用技术方案是：从小麦幼叶中提取小麦总RNA，经RT-PCR获取wPDI基因。将目的基因连接到载体PET-30b中，构建重组质粒。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，在LB培养基中诱导表达，培养重组大肠杆菌，离心收集菌体细胞；用超声法破碎菌体细胞后，离心后收集上清液；经一次Ni-sepharose亲和层析，获得wPDI。本发明通过大肠杆菌表达系统，实现了wPDI大量表达和简便的纯化工艺；获得的wPDI在面粉的加工品质实验中显示了良好的改善小麦加工品质的作用，可用于面粉加工中。

Description

利用大肠杆菌原核表达系统生产的小麦蛋白质二硫键异构酶及方法和应用

技术领域

本发明设计利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法及在面粉加工中的应用，属于微生物、分子生物学、基因工程及谷物化学领域。

背景技术

小麦是重要的粮食作物，为全球近40%人口提供主要粮食，我国小麦产量占世界总产量的六分之一。小麦面粉既具有良好的营养功能，又能加工成不同需求、适口性好、外形美观的面制品。麦谷蛋白在面团中所形成的网络结构赋予小麦面粉以加工品质，麦谷蛋白亚基间二硫键则是网络结构形成的基础，因此，面粉的加工品质与麦谷蛋白聚集体中二硫键的数量和质量密切相关。

与世界其它国家相比，我国小麦的加工品质较差，改良小麦加工品质是小麦育种领域和谷物化学领域一直致力于解决的关键问题之一，而且，随着人们对食品加工品质的要求不断提高，控制并提高加工品质已成为面制品加工产业的重要任务之一。二氧化氯、过氧化钙等“化学”氧化还原剂能影响面筋网络的形成和性质，改变面筋强度，是谷物加工领域较为普遍应用的面粉改良剂。由于“化学”面粉改良剂有可能带来潜在的食品安全问题，天然、安全的面粉改良剂越来越受到面制品加工领域的青睐。

小麦面粉中内源酶之一——小麦蛋白质二硫键异构酶（Wheat ProteinDisulfide Isomerase，wPDI）能催化蛋白质二硫键的形成和正确配对。蛋白质二硫键异构酶（PDI）是一种属于硫氧还蛋白家族、存在于各种真核生物细胞内质网中的氧化还原酶，具有催化二硫键形成的氧化活性、促使错误配对的二硫键重排的异构酶活性及指导蛋白质正确折叠的分子伴侣活性，对维持蛋白质分子的稳定性和功能具有不可替代的作用。

在国际上，小麦PDI（wPDI）应用于改善面粉加工特性有零星报道。Every等从小麦麸皮和胚芽等组织中分离wPDI，通过面包烘焙实验证明PDI在微量抗坏血酸存在的条件下能改善面包的烘焙品质，但没有添加抗坏血酸时则未见对面包品质有明显的改进，而日本的高野克己等发现仅使用E.coli（大肠杆菌）重组wPDI对面包的烘焙品质仍然具有改进作用，而且，在黄素蛋白和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）协同下，可以大大提高wPDI改善面团加工品质的能力。一般认为，wPDI改善面粉加工品质是通过PDI氧化活性催化麦谷蛋白之间形成二硫键的交联网状结构实现的，而添加氧化还原剂（FAD、抗坏血酸）则可以有效地向wPDI提供氧化当量，提高PDI氧化二硫键形成的效率。

PDI在小麦中的含量较少，通过提取分离纯化不仅得率低且工艺复杂，近年来，已有通过原核表达的方法获得小麦PDI的文献报道，但原核表达的量依然很低，且要进行几种组合的层析方式才能达到较高纯度，且酶活损失严重。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过大肠杆菌表达系统，实现了大量表达wPDI，并通过一次柱层析获得较高纯度的酶，克服了原核表达量低，纯化复杂的问题。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法，包括如下步骤：

（1）从小麦幼叶中提取小麦总RNA，通过RT-PCR获取小麦蛋白质二硫键异构酶基因，将此基因连接到PMD-19T载体上，从T载体上克隆的目的基因经酶切后，插入到载体质粒PET-30b中，酶切位点分别为BamH I和Xho I，构建出表达蛋白质二硫键异构酶基因的质粒PET30b-wPDI；

（2）将质粒PET30b-wPDI转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液OD值达到0.6-0.8时，在低温条件下用0.5mM IPTG诱导6-7小时后，4℃离心收集菌体细胞；

（3）用超声破碎法冰浴裂解细胞，除去不溶性细胞碎片，收集上清液；将上清液过Ni-sepharose亲和层析柱，经梯度洗脱得到带有组氨酸标签的蛋白质二硫键异构酶。

为了获得高效并可溶的表达，目的基因的表达去掉信号肽部分，引物的设计在不改变氨基酸序列的情况下进行了三处碱基突变，并在目的片段C端和N端分别带入His标签；引物序列为5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。

所述RT-PCR中所用引物序列为：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’,5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’。

步骤（3）所述超声破碎法冰浴裂解细胞的条件为：振幅20%，0.4s一次，每5min停止一次，共进行两次，10000rpm，4℃离心15min。

上述方法生产的蛋白质二硫键异构酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。原始的氨基酸序列如下：EEAAAEEAAAAPEAVLTLHADNFDDAIAKHPFILVEFYAPWCGHCKSLAPEYEKAAQLLSKHDPAIVLAKVDANDEKNKPLAGKYEVQGFPTLKIFRNGGKNIQEYKGPREAEGIVEYLKKQVGPASKEIKAPEDATYLEDGKIHIVGVFTEFSGTEFTNFLELAEKLRSDYDFGHTVHANHLPRGDAAVERPLVRLFKPFDELVVDSKDFDVSALEKFIDASSTPKVVTFDKNPDNHPYLLKYFQSNAPKAMLFLNFSTGPFESFKSAYYGAVEEFSGKDVKFLIGDIEASQGAFQYFGLKEDQAPLILIQDSDSKKFLKEQVEAGQIVAWLKDYFDGKLTPFRKSEPIPEANNEPVKVVVADNIHDVVFKSGKNVLIEFYAPWCGHCKKLAPILDEAAATLQSEEDVVIAKIDATANDVPGEFDVQGYPTLYFVTPSGKKVSYEGGRTADEIVDYIKKNKETAGQAAAAATEKAAEPAATEPLKDELLE

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明采用原核表达的方法，获得了可溶性的具有生物活性的小麦PDI，表达量占总表达蛋白的40-50%，表达量较高，且分离纯化只需一次亲和层析，简便高效，易于大量表达，适合工业化生产。

（2）本发明所得的wPDI，经Ni-sepharose亲和层析，可一步实现wPDI的纯化，SDS-PAGE结果证明wPDI的纯度超过95%。

（3）获得纯化的wPDI经透析除盐、浓缩后，按照一定添加量进行面团的揉混后，用质构仪测定wPDI对面粉加工品质的影响，结果显示wPDI对面团的弹性、内聚力等均有积极的影响。

（4）本发明在构建表达载体的过程中，所使用的引物将编码基因在不改变氨基酸序列的情况下做了3处碱基突变，并在C端和N端分别加入His标签，提高了目的蛋白的表达量和纯化过程中的结合能力。

附图说明

图1用于构建重组wPDI的PET-30b质粒。

图2提取小麦总RNA的凝胶电泳图，泳道1的条带为样本总RNA的三条带，分别为28sRNA,18sRNA和5sRNA。

图3经RT-PCR获得的小麦wPDI基因的凝胶电泳图。

图4构建的PET30b-wPDI重组质粒酶切鉴定凝胶电泳图。

图5重组wPDI经亲和层析后的SDS-PAGE图谱，1.标准蛋白分子量；2.发酵上清液；3.通过Ni-sepharose纯化后的样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明的实施例中使用的品种为“中优9507”的小麦种子购于粮食市场；限制性内切酶Bam I和Xho I、PMD-19T载体均购自大连宝生物工程技术有限公司；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）、PET-30b购自Novagen公司；引物合成及序列测序工作由华大基因完成。

实施例1

利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法，具体步骤如下：

一、小麦蛋白质二硫键异构酶(wPDI)表达载体的构建

1.wPDI基因的获得

取生长8-10天的小麦幼叶，液氮中研磨成粉末，用RNA提取试剂盒提取小麦总RNA（如图1所示），通过RT-PCR获得小麦PDI的基因。根据NCBI上对植物PDI的序列分析表明PDI具有高度的保守性，因此根据其保守区设计引物，RT-PCR中所用引物序列为：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’,5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’，获得的小麦PDI基因切胶回收后，加A尾，连到PMD-19T中，送华大基因测序。

测序结果显示，克隆得到的此PDI基因大小为1548bp（如图2所示）上述来源于小麦“中优9507”的wPDI序列与NCBI上编号为AF262979.1来源于小麦Wyuna品种的具有99%的相似性，wPDI的基因序列如SEQ ID NO2。

2.构建wPDI重组质粒

为了将连接到T载体上的去信号肽部分的wPDI基因插入到表达质粒中，并获得高效的表达，在其前端添加保护碱基、酶切位点的同时，不改变氨基酸序列的情况下做了三处碱基突变，且除掉终止密码子，使编码基因在C端和N端分别带一个His标签，引物序列如：

5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，

5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’由华大基因合成。通过亚克隆得到去信号肽且碱基突变的wPDI后，经限制性内切酶Bam I和Xho I处理wPDI基因片段和PET-30b载体，T4连接酶16℃反应30min，得到连接反应液。

3.转化大肠杆菌BL21

将连接反应液转化到表达宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中，化学方法转化后将菌液涂布在含有Kan的LB平板上，37℃培养16h，筛选阳性克隆。

挑取阳性单克隆，进行菌落PCR和提质粒酶切鉴定，确定wPDI被插入到表达质粒中，再由华大基因测序确认。

实验结果：经酶切及测序分析，成功构建了表达重组wPDI的原核表达载体，获得了带有重组质粒PET30b-wPDI的重组大肠杆菌（酶切鉴定结果如图4所示）。

二、重组wPDI诱导表达及纯化

1.重组wPDI的诱导表达

将重组大肠杆菌接种于含有Kan（50μg/ml）的5ml LB培养基中，摇菌过夜，次日按1%的接种量将培养好的菌液接种到含有Kan（50μg/ml）的100mlLB培养基中培养，当菌液吸光度在0.6-0.8时，0.5mM IPTG，16-22℃进行诱导，诱导时间6-7h。带两个His标签的目的蛋白分子量大小约为60kDa,在SDS-PAGE上显示的66kDa的位置基本相符（如图5所示）。

2.重组wPDI的纯化

诱导表达后的菌液经10000rpm，4℃离心15min，收集菌体细胞。将菌体细胞用0.02M PBS重悬（每100ml菌液菌体加5ml缓冲液）。

超声法破碎菌体细胞，振幅：20%，周期0.4s，每5min间隔停一次观察破碎情况。处理后，10000rpm离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。

将上清液低速上样于Ni-sepharose亲和层析柱中，平衡缓冲液(0.02M PBS,0.5M NaCl,pH8.0)平衡至基线，洗脱缓冲液（0.02M PBS,0.5M NaCl,0.5M咪唑，pH8.0）梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，SDS-PAGE分析纯度（如图5所示）。

实验结果：经SDS-PAGE、Western-blot验证，成功表达并纯化出重组wPDI。

实施例3

重组wPDI对面粉加工品质功能的影响

每8g面粉加8.9ml水/BSA溶液/蛋白质溶液（蛋白质加入量为:1mg蛋白/g面粉，加入BSA的实验组均为对照）进行揉混，揉混时间5min，制备成边长约1cm，高度约1.3cm的长方体，放置于质构仪上进行测定，每组实验做5个样品，测量的5个数据取平均值。质构仪探头为P/36R，测前速度1.0mm/s，测试速度2.0mm/s，测后速度2.0mm/s,压缩比50%，2次间隔时间10s。

实验结果：比较在和面过程中分别为空白/BSA/wPDI的质构数据（参见表1），和面过程中加入wDPI的实验组，在面团的硬度、弹性、内聚力、胶黏性、咀嚼性及回弹性上具有不同程度的增加，从总体趋势看来，wPDI对小麦面粉的加工品质有积极的影响作用。

表1

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从小麦幼叶中提取小麦总RNA，通过RT-PCR获取小麦蛋白质二硫键异构酶基因，将此基因连接到PMD-19T载体上，从T载体上克隆的目的基因经酶切后，插入到载体质粒PET-30b中，酶切位点分别为BamH I和Xho I，构建出表达蛋白质二硫键异构酶基因的质粒PET30b-wPDI；

(2)将质粒PET30b-wPDI转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液OD值达到0.6-0.8时，在16-22℃的低温条件下用0.5mM IPTG诱导6-7小时后，4℃离心收集菌体细胞；

(3)用超声破碎法冰浴裂解细胞，除去不溶性细胞碎片，收集上清液；将上清液过Ni-sepharose亲和层析柱，经梯度洗脱得到带有组氨酸标签的蛋白质二硫键异构酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)将目的基因插入到PET-30b所用的引物序列为5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述RT-PCR中所用引物序列为：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’,5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述超声破碎法冰浴裂解细胞的条件为：振幅20％，0.4s一次，每5min停止一次，共进行两次，10000rpm，4℃离心15min。