NO320349B1 - Modufiserte soppceller, fremgangsmate for fremstilling av rekombinante produkter, DNA-molekyl og anvendelse av slike. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører modifiserte soppceller og fremgangsmåter for fremstilling av rekombinante produkter samt DNA-molekyler og anvendelse av disse. Oppfinnelsen vedrører spesielt soppceller inneholdende spesifikke modifikasjoner innenfor deres DNA sekvenser som forårsaker at de utviser minst en redusert kapasitet for O-glykosylerende homologer og/eller heterologe proteiner, og anvendelse av disse cellene som vertsceller for å produsere høye utbytter av rekombinante produkter.

Utvikling innen rekombinant DNA teknologi har gjort det mulig å produsere fremmede produkter i vertsceller hvor eksogene DNA sekvenser kodende for produktene er blitt innført. Fordelen med denne teknologien er at produktene kan bli produsert i høye utbytter, i svært renset form, uten risiko for kontaminasjon så som viruskontaminasjon (AIDS, hepatitt B osv.). Disse rekombinante teknikkene har blitt meget anvendt for produksjon av rekombinante proteiner i prokaryote så vel som eukaryote vertsceller. Prokaryote vertsceller innbefatter £. coli [Nagata et al., Nature 284 (1980), 316; EP 001 929], Bacillus subtilis [Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 2917], Streptomyces og Corynebacterium (EP 433 117). Eukaryote vertsceller innbefatter planteceller, dyreceller og soppceller.

Produksjon i stor skala av rekombinante produkter ifølge disse teknikkene er fortsatt begrenset på grunn av problemene med ekspresjonseffektivitet til disse eksogene DNA sekvensene som også er forårsaket av manglende stabilitet på vektoren og intracellulær degradering av rekombinante produkter av vertscellen hvor de blir dannet i. Når det gjelder ekspresjonseffektiviteten har det blitt forsøkt å isolere sterke promotere som fører til økt ekspresjonsnivå av eksogene DNA sekvenser og derfor til økte produksjonsnivåer av rekombinante produkter. Forskjellige systemer er også blitt utviklet for å øke stabiliteten til vektorene innenfor vertscellene og de mest anvendte som består i å innføre på vektoren et antibiotikaresistensgen som muliggjør rekombinante vertsceller overlever og vokser i et selektivt medium. Med hensyn på intracellulær degradering er flere mutante celler som mangler eller har en redusert proteaseaktivitet blitt beskrevet og dette begrenser dermed kapasiteten til de nevnte cellene når det gjelder å degradere rekombinante produkter.

Ytterligere problemer begrenser fortsatt stor skala produksjon og farmasøytisk anvendelse av rekombinante produkter. Et av disse oppstår fra det faktumet at rekombinant produserte produkter ofte er forskjellige fra deres naturlige motparter. For eksempel har bakterielle vertsceller ikke alle post-translasjonelle mekanismer nødvendig for utvikling av pattedyr polypeptider. Nevnte pattedyrpolypeptider som blir produsert i bakterier er derfor ofte umodne og ikke riktig refoldet. Bakterielle vertsceller innfører videre vanligvis et N-terminalt methionin til produktene.

Rekombinante produkter produsert i heterologe eukaryote verter er også ofte forskjellig fra deres naturlig forekommende motparter i glykosyleringsinnholdet. Dette kan vedrøre tilstedeværelse og fravær av en hvilken som helst karbohydratstruktur, lokalisering av nevnte karbohydratstruktur på produktet, samt naturen til karbohydratet. Det er videre blitt vist at gjær-avledede rekombinante produkter ofte bærer ytterligere unaturlige O-glykaner sammenlignet med deres naturlige motparter. Det er blant annet blitt vist at det human seruminsulin-Hgnende vekstfaktor I (IGF-I) ikke er glykosylert, menes dets rekombinante form produsert i S. cerevisiae er O-glykosylert og, mer presist, O-mannosylert [Hard et al., FEBS Letters 248 (1989), 111]. På denne måten er det blitt vist at human blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) og human GM-CSF utviser unaturlig 0-mannosylstrukturer når produsert i S. cerevisiae [Biomedic, Envtron. Mass Spectrometry 19 (1990), 665; BIO TECHNOLOGY 5 (1987), 831]. Denne unormale 0-glykosyteringen er resultatet av viktige forskjeller mellom glykosyleringsmekanismene til pattedyr (humane) celler og de til andre eukaryote celler, så som gjær. I dette henseendet er det blitt observert at O-gtykosylering i soppceller (inkludert gjær og filamentøse sopp) forløper på en lignende måte og unaturlig måte som ikke før er blitt observert i noen annen organisme.

Forekomsten av denne uønskede O-glykosyleringen på sopp-avledede rekombinante produkter utgjør en viktig ulempe for denne teknologien når det gjelder produksjon av legemidler.

Den første grunnen er at sopp-spesifikke glykaner kan innføre nye immunologiske determinanter på et protein, og et glykoprotein med slike unaturlige karbohydrater kan derfor være antigent når administrert til mennesker. I dette henseendet er det for eksempel kjent at de fleste menneskene har antistoffer rettet mot N-kobledede gjær mannan kjeder [Feizi and Childs, Biochem. J. 245 (1987), 1].

En annen grunn er at proteiner uten hensiktsmessige karbohydratstrukturer også kan ha endrede farmakokinetiske egenskaper. Det er blitt vist at karbohydratstrukturene til glykoproteinene innvirker og deltar i å definere deres in vivo klaringsrate, som er vesentlig når det gjelder å bestemme effektiviteten til et legemiddel. En mannosereseptor er blitt identifisert på overflaten av leverendotelceller og stedbundne makrofager som tilsynelatende representerer et middel for eliminering av glykoproteiner som utviser mannose-type oligosaccharider [Stahl, Cell. Mol. Biol. 2 (1990), 317]. Tilstedeværelse av unaturlige, ytterligere mannosestrukturer på et protein kan derfor øke fjemingsraten derav og dermed redusere dets plasmahalveringstid.

En ytterligere grunn er at den biologiske aktiviteten til et glykoprotein også er blitt vist å variere med dets karbohydratiwihold, beliggenhet og natur. Det er for eksempel blitt vist at glykosyleringen påvirker de biologiske egenskapene til rekombinant human EPO [Takeuchi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 7819] og rekombinant human tPA [Pårekn et al., Biochemistry 28 (1989), 7644].

På grunnlag av det som er nevnt ovenfor er det klart at unaturlig O-glykosylering av sopp-avledede rekombinante produkter kan alvorlig påvirke deres immunologiske, biologiske og farmakokinetiske egenskaper, og kan dermed forhindre utvikling derav for human terapeutisk anvendelse.

Foreliggende oppfinnelse løser problemer med unormal O-glykosylering som er referert til ovenfor ved å tilveiebringe modifiserte soppceller som inneholder genetiske modifikasjoner innenfor deres DNA sekvenser som forårsaker at de har minst en redusert kapasitet for O-glykosylering av native eller fremmede proteiner.

Foreliggende oppfinnelse angår såtedes en soppcelle, kjennetegnet ved at den bærer genetiske modifikasjoner lokalisert i den kodende region eller i regioner ansvarlig for eller involvert i ekspresjons-og/eller transkripsjonsregulering av genet som koder for et protein som har Dol-P-ManrProtein (Ser/Thr) mannosyl transferase (PMTl)-aktivitet utvalgt fira gruppen bestående av

(a) DNA-molekyler omfattende nukleotidsekvensen vist i figur 4A eller

fragmenter av fragmenter av denne;

(b) DNA-molekyler som koder for et protein med aminosyresekvensen vist i

figur 4B eller fragmenter av denne; eller

(c) DNA-molekyler omfattende sekvensen til fragmentet på 126 bp av PMT1 -

genet til Kluyveromyces lactis vist i figur 7 eller fragmenter av dette; som medfører at nevnte celler har minst en redusert kapasitet for O-glykosylering sammenliknet med en soppcelle som bærer det tilsvarende umodifiserte DNA-molekyl definert i (a) til (c).

Det er oppdaget heri at det er mulig å oppnå genetiske modifiserte soppceller som har redusert kapasitet for O-glykosylering og som fortsatt er levedyktige og viser gode vekstkaraktertrekk innen industrielle rermenteringstilstander. Det er uventet at det heri også er vist at nevnte genetiske modifikasjoner ikke påvirker stabiliteten til disse soppcellene når transformert med eksogent DNA. Modifiserte soppceller ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli fordelaktig anvendt som vertsceller for produksjon av rekombinante produkter med høy kvalitet, med redusert eller ingen uønskede O-glykaner.

En hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er en soppcelle som inneholder genetiske modifikasjoner innen dets DNA sekvenser som forårsaker at en har minst en redusert kapasitet for O-glykosylering.

Soppcellene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli valgt fira filamentøse sopp og gjær. Eksempelvise slekter av filamentøse sopp betraktet ifølge foreliggende oppfinnelse er Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium og lignende. Eksempler på slekter fra gjær innbefatter Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizosaccharomyces og lignende. Mer foretrukne slekter er de som blir valgt fra gruppen bestående av Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula og Candida, og mer foretrukket er fra Kluyveromyces og Saccharomyces. Eksempelvise stammer av Kluyveromyces som utgjør foretrukne utførelsesformer ifølge denne oppfinnelsen innbefatter K. lactis, K. fragihs, K. waltii, K. drosophilarium og lignende. Foretrukken stamme av Saccharomyces er S. cerevisiae.

Ifølge foreliggende oppfinnelse betyr genetisk modifikasjon fortrinnsvis en hvilken som helst suppresjon, substitusjon, delesjon eller adhesjon av en eller flere baser eller av et fragment fra soppcelle DNA sekvenser. Slike genetiske modifikasjoner kan bli oppnådd in vitro (direkte på isolert DNA) eller in situ, for eksempel ved genetiske omkonstru-eringsteknikker eller ved eksponering av soppceller for mutagene midler. Mutagene midler innbefatter for eksempel fysiske midler så som energetiske stråler (røntgenstråler, X-tråler, UV osv.) eller kjemiske midler som kan reagere med forskjellige funksjonelle DNA grupper, så som alkyleringsmidler (EMS, NQO. osv.) bisalkylerende midler, interkalerende midler osv. Genetiske modifikasjoner kan også bli oppnådd ved genetisk ødeleggelse, for eksempel ifølge fremgangsmåten beskrevet av Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 194 (1991), 281-301].

Ifølge denne metoden blir en del eller hele genet erstattet, gjennom homolog rekombinasjon, med en in vitro modifisert versjon.

Genetiske modifikasjoner kan også bli oppnådd ved en hvilken som helst mutasjonsmessig innskudd på DNA sekvensene, så som transposons, fager, osv.

I tillegg er det kjent at visse modifikasjoner så som punkt mutasjoner kan bli reversert

eller attenuert av cellulære mekanismer. Slike modifikasjoner behøver ikke å utgjøre de mest nyttige fonnene av modifiserte soppceller ifølge denne oppfinnelsen på grunn av at deres fenotypiske egenskaper ikke behøver å være meget stabile. Modifiserte soppceller hvor modifikasjonene (og derfor fenotypiske egenskaper) er stabile i løpet av segregeringen og/eller ikke-reverterende og/eller ikke-lekkende frembringes. Slike modifiserte soppceller er spesielt fordelaktige som verter for produksjon av rekombinante produkter.

I en foretrukket utførelsesform ifølge denne oppfinnelsen er dermed en soppcelle som inneholder genetiske modifikasjoner som er stabile i løpet av segregasjonen og/eller ikke-reverterende og/eller ikke-lekkende. Disse modifikasjonene blir generelt oppnådd ved delesjoner eller avbrudd.

Genetiske modifikasjoner båret av soppcellene ifølge oppfinnelsen kan bli lokalisert enten i en kodende region av DNA sekvensene til cellen eller i en region ansvarlig for eller involvert i ekspresjon og/eller transkripsjonen regulering av et gen. Nevnte modifikasjoner vil generelt påvirke den kodende regionen eller regionen ansvarlig for eller som er involvert i ekspresjon og/eller transkripsjonen regulering av en eller flere gener hvor ekspresjonsproduktene er enzymer av O-glykosyleringsreaksjonsveien.

Den reduserte kapasiteten som soppcellene ifølge oppfinnelsen har til å O-glykosytere proteiner kan derfor være et resultat av produksjonen av inaktive enzymer på grunn av strukturelle og/eller konformasjonelle forandringer, produksjon av enzymer med endrede biologiske egenskaper, fravær av produksjon av nevnte enzymer eller produksjon av nevnte enzymer i lave nivåer.

Soppcelle O-glykosyleringsreaksjonsveien innbefatter kobling av et først mannosylresidie til hydroksylgruppen til seryl- og/eller threonylaminosyrene tit proteinene eller peptidene, og deretter kobling til O-koblet di- og oligosakkarider ved påfølgende addisjon av mannosylresidier. De første mannosylresidierblir overført fra dolichol monofosfat mannose (Dol-P-Man) til proteinet i endoplasmatisk retikulum, og de ytterligere mannosylresidiene blir overført fra GPD-Man i Golgi. I kontrast til dette blir høyere eukaryote (ikke-sopp) celler O-glykosylert ifølge en annen mekanisme ved at det innledende trinnet er kovalent kobling av N-acetyl-galaktosamiri til seryl- eller threonylaminosyrene, ingen lipid-koblet oligosakkarid donor er involvert i denne første reaksjonen, i det det første trinnet oppstår i Golgi, strukturene til karbohydratene er forskjellige osv.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen inneholder modifiserte soppceller genetiske modifikasjoner i minst et gen hvor ekspresjonsproduktet er involvert i kobling av et mannosylresidie til hydroksylgruppen til seryl eller threonyl aminosyrene.

I en mer foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen bærer de modifiserte soppcellene genetiske modifikasjoner i minst et gen hvor ekspresjonsproduktet er involvert i overføring av et mannosylresidie fra Dol-P-Man forløperen til hydroksylgruppen til seryl eller threonylaminosyrene.

En mer foretrukket er at et av disse genene er genet kodende for Dol-P-Man; protein (Ser/Thr) mannosyltransferase [DPM2 også betegnet PMT1] hvor sekvensen er representert i figur 4, eller et hvilket som helst homologt gen kodende for samme aktivitet som definert nedenfor.

I tillegg til modifikasjonene i et gen involvert i kobling av mannosylresidiene til hydroksylgruppen til seryl eller threonyl aminosyrene kan soppcellene ifølge oppfinnelsen også bære modifikasjoner i genene som er involvert i påfølgende addisjoner av mannosylresidier som fører til di-eller oligosakkarider, eller i syntese av mannosylresidiedonor (Dol-P-Man).

Spesifikke eksempler på slike soppceller er beskrevet i eksemplene.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen er en soppcelle som beskrevet ovenfor hvor en eksogen DNA sekvens er blitt innført.

Betegnelsen eksogen DNA sekvens innbefatter en hvilken som helst DNA sekvens som omfatter en eller flere gener kodende for et ønsket protein som skal bli uttrykt og/eller utskilt i nevnte celle. En slik DNA sekvens kan være en komplementær DNA sekvens (cDNA), en kunstig DNA sekvens, en genomisk DNA sekvens, en hybrid DNA sekvens eller en syntetiske eller semi-syntetisk DNA sekvens, inkludert i en ekspresjonskassett som muliggjør syntese i soppceller av nevnte proteiner. Ekspresjonskassetten omfatter fortrinnsvis en transkripsjons-og translasjonsinitieringsregion koblet til <5->enden av sekvensen kodende for nevnte proteiner for å lede, og eventuelt regulere, transkripsjonen og translasjonen av nevnte sekvens. Valg av disse regionene kan variere ifølge anvendt soppcelle. Disse sekvensene blir generelt valgt fra promotere og/eller terminatorer avledet fra soppcellegener, og, når ekspresjon i gjærverter er ønskelig, fra gjærgener. Av spesiell interesse er visse promoter- og/eller terminatorregioner avledet fra glykolytiske gener til soppceller så som, for gjær, gener kodende for fosfoglyceratkinase (PGK), glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GDP), enolaser (ENO) eller alkoholdehydrogenase (ADH) og for filamentøse sopp, gener kodende for trifosfatisomerase (tpi). Promoter- og/eller terminatorregioner kan også være avledet fra andre sterkt uttrykte gener så som, for gjær, laktasegenet (LAC4), sur fosfatasegen (PHOS), alkoholoksidasegen (AOX) eller metanoloksidasegen (MOX), og for filamentøse sopp, cellobiohydrolasegen (CBHI), alkoholdehydrogenasegen (alcA, alcC), glukoamylasegen (GAM) eller acetamidasegen (amds) og lignende. Disse transkripsjons- og translasjonsinitieringsregionene kan bli ytterligere modifisert for eksempel ved in vitro mutagenese, ved innføring av ytterligere kontrollelementer eller syntetiske sekvenser, eller ved delesjoner. For eksempel kan transkripsjons-regulerende elementer, så som såkalte UAS, med opprinnelse fra en annen promoter bli anvendt for å konstruere hybridpromotere som muliggjør at vekstfasen til soppcellekulturen blir separert fira ekspresjonsfasen til den ønskede proteinkodende sekvensen. En transkripsjons- og translasjonstermineringsregion som er funksjonell i den tilsiktede soppcellen kan også bli posisjonert i 3-enden av den kodende sekvensen. I tillegg kan det ved N-termimisen til proteinsekvensen bli innført et signalpeptid (pre-sekvens) for å lede det nakne proteinet til den sekretoriske reaksjonsveien i soppcellene som ble anvendt. Denne pre-sekvensen kan tilsvare den naturlige pre-sekvensen til proteinet dersom dette proteinet blir naturlig utskilt, eller kan ha en annen opprinnelse, for eksempel oppnådd fra et annet gen, eller til og med være kunstig.

Den eksogene DNA sekvensen er en del av en vektor, som enten kan bli replikert autonomt i soppcellen som blir anvendt eller integrert inn i egne DNA sekvenser (kromosom). Autonomt replikerende vektorer kan inneholde autonomt replikerende sekvenser avledet fra det kromosomale DNA til soppcellen (ARS) eller fra naturlig-forekommende soppcelleplasmider så som pGKl-1 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1982), 737], pKDl (EP 241 435), 2 um plasmid (Borach, Cell 28 (1982), 203-204) og lignende. Integrerende vektorer inneholder vanligvis sekvenser som er homologe med regionene til soppcellekromosomet som etter åha blitt introdusert i nevnte celle muliggjør integrasjon gjennom in vivo rekombinasjon. I en spesifikk utførelsesform .

ifølge oppifnnelsen tilsvarer nevnte homologe sekvenser regionen til kromosomet som skal bli modifisert i soppcellen som muliggjør en ettrinns modifikasjons-integrasjonsmekanisme. Integrasjonen kan også oppstå gjennom uhomolog rekombinasjon.

Den eksogene DNA sekvensen kan bli innført i soppcellen ifølge en hvilken som helst teknikk kjent innenfor fagområdet og for eksempel ved rekombinante DNA teknikker, genetiske overkrysninger, protoplastfusjoner osv. Når det gjelder rekombinante DNA teknikker kan transformasjon, elektroporasjon eller en hvilken som helst annen teknikk beskrevet i litteraturen bli anvendt. Når soppcellen er en gjærcelle kan transformasjonen bli utført ifølge metodene til Ito et al., [J. Bacteriol. 153 (1983), 163], Dunens et al.

[Curr. Genet. 18 (1990), 7] eller ifølge metoden beskrevet i EP 361 991.

Elektroporasjon kan bli utført ifølge Karubc et al. [FEBS Letters 82 (1985), 90].

Soppcellene ifølge oppfinnelsen kan med fordel bli anvendt som vertsceller for produksjon av rekombinante produkter så som heterologe proteiner med farmasøytisk og/eller agro-matvare interesse. Soppcellene ifølge oppfinnelsen er spesielt fordelaktige på grunn av at de muliggjør produksjon og/eller utskillelse av produkter med høy kvalitet, og på grunn av at deres genetiske modifikasjoner ikke påvirker den mitotiske eller genetiske stabiliteten til nevnte produkts ekspresjonsvektorer. Cellene ifølge denne oppfinnelsen er spesielt egnede for produksjon av proteiner som har human terapeutisk anvendelse og som er mottagelige for O-glykosylering av vertscellen.

En ytterligere hensikt ifølge denne oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante produkter hvor en soppcelle som definert ovenfor blir dyrket i betingelser hvor den eksogene DNA sekvensen blir uttrykt og produktet blir isolert. I en foretrukket utførelsesform blir nevnte produkt utskilt i kulturmediet. I en annen foretrukket utførelsesform er nevnte produkt mottagelig for O-glykosylering av soppcellen.

Følgende proteiner er sitert som eksempler på heterologe proteiner som kan bli dannet i soppcellene ifølge foreliggende oppfinnelse: enzymer (så som superoksid dismutase, catalase, amylaser, lipaser, amidaser, chymosin, osv., eller et hvilket som helst fragment eller derivat derav), blodderivater (så som human serum-albumin, alfa- eller beta-globin, faktor VIII, faktor DC, van Willebrand faktor, fibronectin, alfa-1 antitrypsin,

osv., eller et hvilket som helst fragment eller derivat derav), insulin og varianter derav, lymfokiner (så som interleukiner, interferoner, kolontstimulerende faktorer (G-CSF,

GM-CSF, M-CSF...), TNF, TRT, osv. eller et hvilket som helst fragment eller derivat derav), vekstfaktorer (så som veksthormon, erythropoietin, FGF; EGF; PDGF, TGF, osv., eller et hvilket som helst fragment eller derivat derav), apolipoproteiner, antigene polypeptider for fremstilling av vaksiner (hepatit, cytomegalovirus, Epstein-Barr, herpes, osv.), eller et hvilket som helst fusjonspolypeptid så som for eksempel, fusjoner omfattende en aktiv del koblet til en stabiliserende del.

Foreliggende oppfinnelse angår således et DNA-motekyl, kjennetegnet ved at det omfatter et gen som koder for Dol-p-Man: protein (Ser/Thr) mannosyl transferase fra en Saccharomyces art, der genet har sekvensen gitt i figur 4A.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter et gen som koder for dol-p-Man: protein (Ser/Thr) mannosyl transferase fra en Kluyveromyces art, der genet inneholder sekvensen fra fragmentet på 126 basepar fra PMTl-genet til Kluyveromyces Lacds gitt i figur 7.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter et gen som koder for dol-p-Man: protein (Ser/Thr) mannosyl transferase:

(a) som hybridiserer med DNA-sekvensen; og/eller

(b) representerer fragmenter eller derivater av DNA-sekvensen.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et DNA-fragment, kjennetegnet ved at det er et fragment eller degenerert fragment beroende på den genetiske kode av genet ifølge krav 18 og har følgende sekvens:

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av et DNA fragment eller en hvilken som helst del derav som hybridiseringsprobe(er) eller for komplementering av mutante fenotyper for oppnåelse av homologe gener til soppcellene.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av DNA-fragmentet eller det degenererte fragment som en PCR-primer.

I foreliggende oppfinnelse betyr homolog! gen et hvilket som helst annet gen fra en hvilken som helst soppcelle som koder for et enzym som har nødvendig aktivitet. Nevnte andre gener kan for eksempel bli oppnådd ved komplementering av en mutant soppcelle som mangler nevnte aktivitet med DNA fremstilt fra en soppcelle med evne for nevnte aktivitet, seleksjon av transformanter som har oppnådd aktiviteten og isolering av den innskutte DNA sekvensen. Disse andre genene kan også bli isolert fra DNA bibliotek ved hybridisering med probe (inkludert PCR primere) omfattende hele eller deler av sekvensen presentert i figur 4.1 dette henseendet er det også en hensikt ifølge oppfinnelsen å anvende DNA fragmentene som er gitt, eller en hvilken som helst del derav, som hybridiseirngsprober eller for komplementering av mutantfenotyper, for oppnåelse av homologe gener til soppcellene.

Betegnelsen derivat angir et hvilket som helst annet DNA fragment dannet ifølge en hvilken som helst genetisk og/eller kjemisk modifikasjon av genene nevnt ovenfor. Nevnte genetiske og/eller kjemiske modifikasjoner kan være hvilke som helst av suppresjon, substitusjon, delesjon eller addisjon av en eller flere baser eller av en region av nevnte gener, som enten fører til en øket enzymaktivitet eller til det samme aktivitetsnivået, eller til en reduksjon eller 0 enzymaktivitet ved transformasjon i en soppvertcelle.

TEKST TIL FIGURENE

Figur 1: Restriksjonskart av plasmidene pDM3, pMT4 og pMTl.

Figur 2: Subkloning av plasmid pDM3

Fieur 3: Strategi for sekvensering av PMTl genet.

Figur 4a: Nukleotidsekvensen til PMTl genet (SEQ ID NO: 1)

Fieur 4b: Aminosyresekvensen til PMTl genet (SEQ ID NO: 2)*

Fieur 5: Konstruksjon av restriksjonskartet til pMTl.1/ URA3.

Fieur 6: O-glykosyleirngsaktivitet til S. cerevisiae WT (panel A) og MT

(panel B).

Figur 7: Delnukleotidsekvens til K.lactis PMTl gen (SEQ ID NO: 3).

Fieur 8: Nukleoud (panel A) og antatt aminosyre (panel B)

sekvenssammenligning mellom S. cerevisiae PMTl genet (øvre sekvenser) og K. lactis homolog (nedre sekvenser) isolert ved PCR amplifikasjon av K. lactis genomisk DNA. Prikker representerer sekvensidentitet, spørsmåltegn angir sekvens uensartethet. Nukleottdsekvens komplementaritet med primer Sq3910 er

understreket.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Isolering av sterkt renset mannosvltarnsferase fra S. cerevisiae og dannelse av peptider

Mannosyltransferaseaktiviteten ble oppløst fra totale gjærmembraner og renset på hydroksylapatit ifølge Strahl-Bolsinger og Tanner (Eur. J. Biochem. 196 (1991), 185). Proteinet måtte deretter bli ytterligere anriket ved (NH^SC^ presipitering før ytterligere rensing ble utført via affinitetskromatografi. Det eluerte materialet ble deretter separert på SDS/P AGE. Det resulterende 92 kDa båndet ble spaltet fra gelen. Trypsinspaltning (i gelen) ga flere ikke-overlappende peptider som muliggjorde konstruksjon av prober.

E. l. l. ( NH^ SO^<p>resi<p>iterin<g>

100 ml fraksjoner av hydroksylapatitkolonne inneholdende mannosyltransferaseaktivitet ble blandet med (NH3)2S04 til en endelig konsentrasjon på 30% (v/v) og forsiktig omrørt i 1 time i et is/saltbad. Blandingen ble sentrifugert i 30' (800 x g). Den resulterende pelleten ble resuspendert i 8 ml AB-buffer (10 mM Tris/HCl, pH 7.5,15% glycerol (voI-%), 0.1% lubrol (vol-%), 150 mM NaCl) ogdialysert i 1 time mot samme buffer. Lagring: -20°C.

E. 1. 2 Affinitetskromato<g>rafi

E.l.2.1. Preparering av affinitetskromatografikolonnen

0.5 g frysetørret pulver av protein A-Sepharose Cl 4B ble svellet i 10 ml 100 mM NaPi, pH 7.0 i 15' og vasket på et sintret glassfilter (G3) med 200 ml av samme buffer. Protein A-Sepharose Cl 4B ble ekvilibrert i 100 mM NaPi, pH 7.00. Omtrent 3 til 6 ml anti-mannosyltransferasesemm ble dialysert i 2 timer mot 11 NaPi (100 mM), pH 7.0. Dialysert serum ble inkubert med kolonnematerialet i 16 timer ved 4°C. Serum ble fjernet ved anvendelse av et sintret glassfilter (G3). Kolonnematerialet ble vasket to ganger med 10 ml 10 mM NaPI, pH 8.5 og resuspendert i 50 ml av samme buffer.

For kovalent kobling ble 0.75 mg/ml dimetylsuberimidat tilsatt. pH ble justert til pH 8.5 ved tilsetning av 5-6 dråper 1 M NaOH. Materialet ble inkubert i 1 time ved RT. For annen gang ble dimetylsuberimidat tilsatt og pH justert til pH 8.5 med 1 M NaOH. Kolonnematerialet ble vasket i serie på et sintret glassfilter (G3) med:

a) 50 ml 100 mM NaPi, pH 8.0

b) 25 ml 100 mM NaPi, pH 8.0,3 M ammoniumrhodanid

c) 100 ml 100 mM NaPi, pH 8.0.

Materialet ble vasket og ekvilibrert i AB-buffer.

E. 1.2.2. Rensing av 92 kDa protein

8 ml (NH4)2SC<4 presipiterte og dialyserte protein (E. 1.1.) ble inkubert med affinitetskolonnematerialet (E. 1.2.1) i 16 timer ved 4°C med forsiktig risting. En kolonne (2 cm x 0.S cm) ble fylt og vasket med IS ml AB-buffer. Kolonnen ble eluert med 100 mM glycin/HCl pH 3.0,0.05% lubrol (vol-%), 15% glycerol (vol-%). Fraksjoner på 0.9 ml ble samlet og nøytralisert øyeblikkelig med 1 M Tris (15 ul/0.9 ml fraksjon).

For å detektere 92 kDa proteinet ble 40 ul av hver eluerte fraksjon analysert ved SDS-PAGE og Western-blot analyse som beskrevet (Strahl-Bolsinger og Tanner, 1991). 92 kDa proteininneholdende fraksjoner (fraksjon 2-6) ble slått sammen og konsentrert til 100 ul via mikrokonsentratorer (Centricon/Amicon) ved sentrifugering ved 5000 x g. 0.9 ml 98% EtOH ble tilsatt og proteinet presipitert i 16 timer ved -20°C. Det presipiterte proteinet ble pelletert ved sentrifugering i 30' ved 10.000 x g.

E. 1. 3. SDS- PAGE

Det presipiterte proteinet (E. 1.2.2) ble resuspendert i 150 pl SDS-prøvebuffer (0.07 M Na2C03,0.07% B-EtSH, 2% SDS, 12% Sakkarose, 0.07% bromfenolblue). SDS-gel elektroforese ifølge Lammli og Favre [J. Mol. Biol. 80 (1973), 575] ble utført ved 50-70 V ved anvendelse av BIORAD-Mini-Protean cell. Proteinstandarder: HMW-Standards/Gibco BRL.

Proteinet ble detektert ved farging med 0.05% Coomassie R250 (w/v), 25% isopropanol (vol-%), 10% eddiksyre (vol-%) og avfarvet i 7.5% eddiksyre (vol-%).

E. 1. 4 Trvpsinspaltning oe konstruksjon av oligonukleotider

Etter SDS-PAGE (E.1.3.) ble 92 kDa proteinbåndet spaltet ut (omtrent 10 fig protein). Gelfragmentet ble spaltet til små stykker og ristet tre ganger i 30' i 5 ml 50% metanol/10% eddiksyre og en gang i 30' i 5 ml 50% metanol. Gelen ble lyofilisert i 3 timer. Trvpsinspaltning ble utført i 0.3 ml 0.2 M ammoniumhydrogenkarbonat/2 ug trypsin i 16 timer ved 37°C. Supernatanten ble fjernet. Eluering av peptidene ble utført tre ganger i 1 time ved 37°C i 0.2 ml 0.2 M ammoniumhydrogenkarbonat og en gang i 1 time ved 37°C i 0.2 ml 0.2 M ammoniumhydrogenkarbonat/30% acetonitril. Det eluerte materialet ble slått sammen, lyofilisert og oppløst i 0.2 ml 1 M guanidiniumhydroklorid/50 mM Tris/HCi, pH 7.S. Peptidene ble separert ved anvendelse av en revers fase RP18 kolonne ekvilibrert i 0-13% TF A. Peptidene ble eluert med acetonitril (0-70%). Opp til 40 forskjellige peptidtopper kunne bli detektert. Fem av hovedtoppene ble sekvensert via automatisert sekvensanslyse ifølge Edman (G. Allen i: Sequencing of proteins and peptides, Laboratory Techniques in Biochem. and Mol. Biol. 9 ed.: Burdon, R.H. & Knippenberg, P.H.; Elsevier (1989)). Blant sekvensene oppnådd derved var tre egnede for konstruering av oligonukleotider som er presentert i tabell 1 nedenfor.

På grunnlag av disse sekvensene ble oligonukleotidene A-C kjemisk syntetisert ved anvendelse av kodonbruken til S. cerevisiae (Guthrie og Abelson i: The molecular biology og the yeast Saccharomyces; eds: J.N. Strathem, E.W. Jones, J.R. Broach

(1982)). Oligonukleotidene A-C har følgende karaktertrekk:

- Oligonukleotid A:

topp: 23 aminosyresekvens: G F D G D A

oligonukleotid: 5'-G<T>/cGTCACCGTCGAANCC-3'

8-ganger degenerert, kodende tråd, 17 nukleotider

- Oligonukleotid B:

topp: 34

aminosyresekvens: E P H V Y E

DNA sekvens: 5'-<C>/tTCGTAGAC<G>/aTG<a>/tGG<t>/cTC-3'

16-ganger degenerert, kodende tråd, 18 nukleotider

- Oligonukleotid C:

topp:IS

aminosyresekvens: ISYKPASFISK

DNA sekvens: S^ATTTC<T>/aTA<T>/cAA<A>/gCC<A>/tGCTTC<T>/a

TTT/aAAA-3'

128-ganger degenerert, kodende tråd, 33 nukleotider

Eksempel 2: Screenine av et <p>lasmidbibliotek til eiaergenomisk DNA

Kjemiske syntetiserte oligodeoksynukleotidene A-C (E. 1.4.) ble anvendt for å screene plasmidbiblioteket til gjærgenomisk DNA pCS19 (Sengstag og Hinnen, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 233). Dette biblioteket ble dannet ved delvis spaltning av gjærgenomisk DNA med Sau3A og kloning inn i Ball restriksjonssetet til vektor pCS19.

E. 2. 1. Merking av oligodeoksynukleonder

Oligonukleotidene A-C ble merket med kinasereaskjon, utført ifølge Maniatis et al (T. Maniatis, J. Sambrook, E.F. Fritsch (1989), Molecular doning: A Laboratury Manual, C.S.H. Press). 40 pmol oligodeoksynukleotid ble merket ved anvendelse av 50 uCi (_-<32p>]-ATP. Frie radioaktive nukleotider ble fjernet ved anvendelse av "NUC Trap Push columns" (Stratagene) ifølge instruksjonsmanualen til produsenten.

E. 2. 2. Screening av biblioteket

DNA-biblioteket (4992 forskjellige enkeltkolonier) ble overført fra mikrotiterskåler til nitrocellulose. Koloni hybridisering ble utført ifølge Grunstein og Hogness (PNAS 72

(1975), 3961) til følgende betingelser: - Prehybridisering: filtrene ble inkubert ved 44°C i 200 ml 5 x Denhardts, 6 x NET, 0.1% SDS (w/v), 0.1 mg/ml laksesperm DNA, i minst 4 timer (5 x Denhardts: 0.1% ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidon. 0.1% BSA; 6 x NET; 0.9 M NaCl, 90 mM Tris-HCl, pH 8.3,6 mM EDTA, pH 8.0). .- Hybridisering: filtrene ble inkubert ved 44°C i 100 ml 5 x Denhardts, 6 x NET, 0.1% SDS (w/v), 0.1 mg/ml laksesperm DNA, merkede oligodeoksynukleonder A og B (50 pmol hver). Hybridiseringen ble utført i 16 timer. ■ - Vaskebetingelser: filtrene ble vasket tre ganger i 50 ml 6 x SDC, 0.1% SDS (w/v) ved 0°C i 15'.

For å detektere positive kolonier ble filtrene eksponert for røntgenfilmer i 16 timer, - 70°C. Under disse betingelsene var det mulig & identifisere 12 positivt reagerende

kloner.

Eksempel 3: Southern analvse av 12 positive kloner

De 12 positive klonene ble analysert i Southern blot ved anvendelse av tre forskjellige oligodeoksynukleotider. Denne analysen førte til identifikasjon av en positiv klon som reagerte med alte tre oligonukleotidene. Denne klonene ble betegnet pDM3.

De 12 positive klonene ble dyrket i 5 ml LB medium supplementert med ampicillin og DNA ble isolert ifølge metoden til Bimbaum og Doly (Nucl. Acid. Res. 7, (1979), 1513).

1/10 av hvert isolerte plasmid DNA (plasmidene: pDMl-pDM12) ble spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI-Xhol (SU hver), 1 x "en av alle" buffer (Pharmacia) i et totalvolum på 20 ul i 1 time ved 37°C. DNA fragmentene ble separert på en 1% agarosegel og blottet til nitrocellulose ifølge Maniatis et al. (loe. eit). Southern analyse ble utført ved anvendelse av oligo A og B ved anvendelse av samme betingelser som beskrevet for bibliotek screeningen. Hybridiseringstemperaturen for oligo A var 48°C, for oligo B 42<*>C. Klonene 1,2,3,5,6,7 og 11 reagerte positivt med begge oligodeoksynukleotidene. Disse 7 klonene ble ytterligere analysert ved Southern blot analyser. Tre identiske blot ble derfor dannet, hvori DNA til klonene 1,2,3,5,6,7 og 11 ble spaltet med EcoRI-Xhol og blottet til nitrocellulose som beskrevet. Blot 1,2 og 3 ble prehybridisert i 20 ml 5 x Denhardts 6 x NET, 0.1% SDS (vekt/volum), 0,1 mg/ml laksesperm DNA ved 50°C i 4 timer. Hver blot ble deretter hybridisert i 10 ml 5 x Denhardts, 6 x NET, 0.1% SDS (vekt/volum), 0.1 mg/ml laksesperm DNA, 40 pmol merkede oligonukleotider i 16 timer. Hybridiseringstemperaturen er angitt i tabell 2 nedenfor. Vaskingen ble utført i 10' ved hver temperatur i 50 ml 2 x SSC, 0.1% SDS (vekt/volum).

Klon 3 var den eneste klonen som reagerte med oligo A, B og C. Klonen ble betegnet pDM3 og ble ytterligere analysert.

Eksempel 4: Analyse av pDM3

E. 4. 1. Metoder

E.4.1.1 Spaltning med restriksjonsendonukleaser

Anlytisk spaltning med endonukleaser ble utført i 1 x "one for all" buffer (Pharmacia), 0.2-0.5 ug DNA, 1-5 U restriksjonsenzym i et totalvolum på 20 ul i 1 time ved 37°C.

Preparativ spaltning ble utført i et totalvolum på 40-80 ul med 1-10 ug DNA, 5-20 ul restriksjonsenzym, 1 x "one for all" buffer i 2 timer ved 37°C. E.4.1.2 DNA-gelelektroforese

Separering av DNA fragmentene ble utført ifølge Maniatis et al. (loe. cit.)-

E.4.1.3. Isolering av DNA fragmenter

Etter separering ble DNA fragmentene isolert ved anvendelse av "Gene-clean kit"

(Stratagene) ifølge forhandlerens instruksjoner.

E.4.1.4. Behandling med alkalisk fosfatase

DNA fragmenter ble defosforylert med alaklisk fosfatase ifølge Maniatis et al. (loe.

eit).

E.4.1.5. Ligering

DNÅ fragmentene ble ligert i 1 x T4-ligcringsbuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.5,10 mM MgCl2,5 mM DTT, 1 mM ATP) med 1 U T4-DNA ligase (total volum 10-15 <p>l). Molart DNA forhold til vektor innskudd var 1:4 eller 1:8. Den absolutte mengden av DNA var 20-50 ng. Inkubasjonstid: 16 timer ved 14°C eller 5 timer ved 25°C.

E. 4.1.6. Transformasjon av E. coli

Kompetente E. coli DH5o>celler ble dannet ifølge Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557). Transformasjon ble utført som beskrevet av Maniatis et al. (loe. eit).

E.4.1.7. Preparering av DNA

Plasmid DNA ble dannet ifølge Bimbaum og Doly (loe. eit).

E.4.1.8. Southern blot analyse

Southern blot analyse ble utført ved anvendelse av de samme betingelsene som beskrevet i E.3.

E.4.1.9. DNA sekvensanalyse

DNA sekvensering ble utført ifølge metoden til Sanger et at. (PNAS 74 (1977), 5463). Bare plasmid DNA ble sekvensert. T7-DNA polymerasesekvenseringskit (Pharmacia) ble anvendt; det radioaktive nukleotidet var [ a -<35>S]-dATP (spek. akt. 600 Ci/mmol).

E. 4. 2. Identifikasjon av ORF

Dette eksempelet beskriver en restriksjonsanalyse av pDM3, identifikasjon av forsk jellige DNA fragmenter gjenkjent av oligonukleotidene A, B eller C og subkloning derav. Sekvensering av disse subklonene muliggjør identifikasjon av en ORF.

E.4.2.1.Subkloning av pDN3 DNA fragmenter hybridiserende med oligo A, B eller C.

pDM3 DNA ble spaltet med EcoRI, Xhol og EcoRI-Xhol. Southern blot analyse ble utført ved anvendelse av oligo A, B eller C som et mål.

Oligo A gjenkjenner et 3.0 kb EcoRI fragment, oligo B og C gjenkjenner et 1.1 kb EcoRI-Xhol fragment. 3.0 kb EcoRI fragmentet ble subklonet inn i pUC19 (linearisert med EcoRI og defosforylert). 1.1 kb EcoRI-Xhol fragmentet ble subklonet inn i pUC18 (linearisert med EcoRI-Sall, og defosforylert). De riktige subklonene ble identifisert ved restriksjonsanalyser og Southern blot analyser ved anvendelse av henholdsvis oligo A eller B/C.

3.0 kb EcoRI subklonen ble betegnet pMT4 og 1.1 kb EcoRI-Xhol subklonen ble betegnet pMTl, Ytterligere restriksjonsanalyser av pMT4 og pMTl ble utført ved anvendelse av et antall forskjellige restriksjonsendonukleaser (for eksempel: Pst I, Htndlll. BgllT). Southern blot analyser ved anvendelse a<y> oligo A eller B/C ble utført for å definere den nøyaktige regionen til en mulig ORF.

Restriksjonskartene til pDM3, pMT4 og pMTl er vist i figur 1.

E.4.2.2. Sekvensanalyse

Fra begge endene ble DNA innskuddene til plasmidene pMT4 og pMTl sekvensert ved anvendelse av universal og revers primere som primer ved siden av polylinkeren til pUC19/pUC18. Også oligoene A, B og C ble anvendt som sekvenseringsprimere. Sekvenseringsdataene resulterte i en ORF på omtrent 400 bp på begge sider av innskuddet til pMTl. Også pMT4 viste en ORF på omtrent 200 bp når sekvensert med revers primer. Ved anvendelse av disse sekvenseringsdataene kunne en aminosyresekvens bli utledet. Denne AA-sekvensen viste peptidsekvenser kjent fra peptidanalyse av 92 kDa proteinet (peptidene tilsvarer toppene 15,23,34 ble funnet). Ifølge disse data kunne 5'/3'orienteringen av genet bli bestemt.

Flere andre subkloner ble konstruert og sekvensert ved anvendelse av universal og revers primere til pUC18/l 9 (figur 2).

Følgende oliogdeoksyoltgonukleotider ble også anvendt for sekvensering:

Disse oligodeoksymikleotidene representerer deler av de nylig sekvenserte DNA fragmentene.

For sekvensering ble 5' regionen til genet, exoMI/mung bønne delesjoner i vektoren pMT4 dannet. pMT4 ble linearisert ved anvendelse av SphI (3' overlapping). Plasmidet ble deretter spaltet ved anvendelse av BamHI (5' overlapping).

Eksonuklease III delesjon ble utført ifølge Roberts og Lauer (Meth. Enzymol. 68

(1979), 473), Heinikoff (meth. Enzymol. 155 (1987), 156).

Overlappende ender ble fjernet av mung bønnemiklease. De resulterende plasmidene ble analysert ved restriksjonsanalyse ved anvendelse av HindlH og EcoRI.

Sekvensanalyser av klonene ble utført ved anvendelse av revers primer pUC19. Sekvensstrategien er vist i figur 3. Sekvensdata er gitt i figur 4.

Eksempel 5: Northern blot analvse: Identifikasjon av mRNA kodende for mannosvltransferase.

E. 5. 1. Metoder

E.5.5.1. Isolering av RNA

Totalt RNA ble isolert fragjærstammen SEY2101 (Mat a, ade2-l, leu2-3,112, ura3-52 (Emr et al. PNAS 80 (1983), 7080) ifølge Domdey et al. (Cell 39 (1984), 611).

E.5.1.2. Northern blot

Totalt RNA ble separert ved anvendelse av en formatdehydagarosegel og blottet til nitrocellulose som beskrevet av Maniatis et al. (loe. eit.).

E.5.1.3.DNA-mål

1.1 kb til pMTl ble isolert ved EcoRI-PstI spaltning. Fragmentet ble renset ved anvendelse av "Gene-clean kit" (Stratagene).

200 ng av DNA fragmentet ble merket med (a -<32>P]-dCTP (50 uCi) ved anvendelse av "megaprime" merkingskit (Amersham) ifølge instruks] onsmanualen til produsenten.

E. S. 2. Resultater

Nitrocellulosefiltere ble prehybridisert i 2 timer ved 42°C i 20 ml 5 x Denhardts, 2 x SSC, 0.1% SDS (vekt/volum), 50% fbrmamid (v/v). 0.1 mg/mt laksesperm DNA. Hybridiseringen ble utført ved 42°C i 16 timer i 10 ml 1 x Denhardts, 2 x SSC, 0.1% SDS (w/v), 50% formamid (v/v), 0.1 mg/ml laksesperm DNA, 200 ug [ a -<32>P]-dCTP merket 1.1 kb EcoRI-PstI fragment av pMTl. Vaskingen ble utført to ganger ved RT og to ganger ved 50°C i 50 ml 0.1 x SSC, 0.1% SDS (w/v). Hybridiseringen av målet ble detektert ved eksponering for røntgenfilm (-70°C, 16 timer). Et enkelt mRNA med størrelse på 3 kb ble detektert. Denne prosedyren kan lett bli gjentatt av fagfolk innenfor dette området med andre prober avledet fra sekvensen i figur 4 og med RNA fira andre kilder (andre soppceller).

Eksempel 6: Preparering av en S. cerevisiae celle som mangler O-glvkosvleringsaktivitet

En S. cerevisiae celle som mangler O-glykosyleirngsaktivitet ble dannet ved genoppbrudd, ved innskudd av URA3 genet inn i Hindlll restriksjonssetet til identifisert ORF, ved bp 1595 av kodende sekvens.

E. 6. 1. Konstruksjon av plasmid anvendt for <g>eno<p>obrvtelsen

1.1 kb innskuddet til pMTl ble isolert som EcoRI-PstI fragmentet og subklonet inn i pUCl 8 vektoren (EcoRJ/Pstl linearisert, defosforylert, uten HindlTJ restriksjonssetet i polylinkeren). Den resulterende vektoren ble betegnet pMTl .1.

pMTl .1 ble linearisert med Hindlll og defosforylert. 1.1 kb Hindlll fragmentet til YEp24 (Julius et al., Cell 37 (1984), 1075) inneholdende URA3 genet til S. cerevisiae ble isolert og subklonet inn i Hindlll linearisert, defosforylert vektor pMTl.l. Kloner ble identifisert ved restriksjonsanalyser og betegnet pMTl.l/URA3 (figur 5).

pMTl .1/URA3 har 0.24 kb PMTl kodende sekvens flankerende i en side av URA3

genet og 0.86 kb PMTl kodende sekvens som flankerer den andre. CsCl-DNA av pMT. 1/URA3 ble dannet ifølge Maniatis et al. (loe. eit.).

E. 6. 2. Transformasjon av gjær

40 ug pMTl.l/URA3 CsCl-DNA ble spaltet med Sphl/EcoRI. For å undersøke at

spaltningen var fullført ble deler av spaltet DNA analysert pi en DNA agarose gel. Spaltningen ble deretter fenolisert og DNA presipitert med 98% EtOH (Maniatis et al., loe. eir.). DNA ble på ny oppløst i 10 ul TE, pH 8.0.

S. cerevisiae stammer SEY2101/2102 (Mat a/ a, ura3-52, leu2-3,112 (Emr et al., loe. eit.) og SEY2101 (Mat a, ura3-52, leu2-3.112, ade2-l) ble transformert med 5 pl EcoRi/Sphl spaltet vektor pMTl.l/URA3 ifølge fremgangsmåten til Ito et al. (J. BActeriol. 153 (1983), 163).

SEY2101/2102 transformanter ble selektert på minimalmedium + Leu; SEY2101 trans formant er ble selektert på minimal medium + Leu, + Ade.

Etter 3-4 dager ved 30°C kunne transformanter blir plukket og sådd ut på samme mediet for annen gang.

E.6.3. Genomisk Southern blot av transformantene

Genomisk DNA av tre haploide transformanter og villtype celler ble isolert som beskrevet av Hoffmann og Winston (Gene 57 (1987), 267). 1 ug av genomisk DNA ble spaltet med XhoVEcoRL separert på en agarosegel og blottet til nitrocellulose som beskrevet av Maniatis et al. (loe. eit).

Blottet ble prehybridisert i 20 ml 5 x Denhardts, 2 x SSC, 0.1% SDS (vekt/volum), 0.1 mg/ml laksesperm DNA, 50% formamid (w/v) i 4 timer ved 42°C.

Hybridisering ble muliggjort i 10 ml av samme oppløsning ved tilsetning av 200 ng [ o> <32>P]-dCTP merket 1.1 kb EcoRI/Pstl fragment av pMTl .1 (se: E.5.1.3) i 16 timer ved 42°C. Vaskingen ble utført to ganger ved RT i 50 ml 2 x SSC, 0.1% SDS (vekt/volum) og to ganger ved 68°C i 50 ml 1 x SSC, 0.1% SDS (vekt/volum). Signaldeteksjon ved røntgenfilmer. Villtype cellene viste et enkelt signal ved 1.1 kb som reflekterer EcoRJ/XhoI fragmentet uten TJRA3 innskudd. I de oppbrutte stammene manglet dette signalet. I stedet for dette ble et nytt 2.2 kb fragment oppdaget ved 1.1 kb målet som representerer 1.1 kb EcoRI/XhoI fragmentet som bærer 1.1 kb TJRA3 innskuddet.

Eksempel 7: Karakteriserin<g> av mutanten

E. 7. 1. Vekst

SEY2101 villtype celler ble dyrket enten på YPD (10 g/l gjærekstrakt; 10 g/1 pepton; 20 g/l dekstrose) eller på minimal medium + Ade, + Leu, + Ura. SEY2101 PMY1 ::URA3 mutante celler ble dyrket enten på YPD eller på minimal medium + Ade, + Leu. Cellene ble dyrket ved 30°C i vannbadrister. OD578 ble målt hver 30' etter sonikering av cellene. Villtype og mutante celler viser nesten identisk vekst på begge mediene til tross for at i noen tilfeller kan det hende at mutante celler kleber seg sammen. Til tross for dette kan slike celler lett bli separert ved sonikering (30", sonikerer vannbad). Vekstkaraktertrekkene til disse cellene er angitt nedenfor:

Generasjonstid:

- WT: 99'

-MT: 93*

- Celleantall:

-WT:lOD-1.9xl0<7>

-MT:lOD«1.9xl0<7>

- Doblingsrate:

-WT:0.61/t

-MT:0.65/t

I en logaritmisk voksende kultur viser 54.7% av villtype cellene og 56% av mutante celler knapper. Etter dyrking i 24 timer på YPD villtype celler ble det nådd en OD578 på 11.4 og mutante celler 12.3.

E. 7. 2. ln vitro mannosvltransferaseaktivitet og Western blot

E.7.2.1. Preparering av rå membraner

SEY2101 ble dyrket i 100 ml minimal medium + Ade + Leu + Ura til OD578 = 0.5. SEY2101 PMTl ::URA3 ble dyrket i 100 ml minimalmedium + Ade, +Leu til OD578 0.5.

To prepareringer av hver stamme ble utført. Arbeidet ble utført på is og alle buffrene var ved 4°C. 40 OD celler ble pelletert og vasket i 25 ml TMA (50 mM Tris/HCl. pH 7.5, 7.5 mM MgCl2). Cellene ble resuspendert i 100 fil TMA og overført til et violax rør. 0.3 g glasskuler ble tilsatt og cellene brutt opp på en vortex fire ganger i 30" (avkjøling på is mellom oppbruddsintervallene). Ekstraktet blir fjernet fra glasskulene ved anvendelse av en pasteur pipette. Glasskulene blir vasket tre ganger med 250 pl TMA. Alle vaskeoppløsningene blir slått sammen i en Eppendorf kopp. Oppløsningen blir sentrifugert i 15" (10.000 x g). Supematanten blir fjernet og peletten resuspendert i 40 ul TMA (1 OD =1 pl).

E.7.2.2. Mannosyltransferaseanalyse (in vitro)

1 og 5 pl rå membraner (E.7.2.1) ble testet for enzymaktivitet som beskrevet av Strahl-Bolsinger og Tanner (loe. eit). To parallelle prøver fra villtype og mutante celler ble målt Gjennomsnittlige verdier til disse to uavhengige målingene er vist.

I kontrast til villtype cellene viser mutante celler ingen in vitro mannosyltrans fer aseakti vitet.

E.7.2.3. Western blot analyse

Membraner (1 pl av E.7.2.1) ble inkubert i 20 pl SDS prøvebuffer i 1 time ved RT. Deretter ble SDS/Page og western blot utført som beskrevet av Strahl-Bolsinger og

Tanner (loe. eit). For antistoffdeteksjon ble peroksidase ECL kit (Amersham) anvendt ifølge instruksjonsmanualen til produsenten. Antistoffer mot 92 kDa proteinet reagerte spesifikt med et 92 kDa protein til villtype membraner. I mutante membraner mangler dette 92 kDa signalet

E. 7. 3. In vivo O- glykosvlering

For å undersøke in vivo glykosyleringen ble villtype og mutante celler dyrket i nærvær av [<3>H]-mannose. Deretter ble en rå cellevegg pluss membranfraksjonen isolert og O-glykosylert materiale frigitt ved B-eliminering.

E.7.3.1. Behandling med [<3>H]-mannose

Villtype og mutante celler ble dyrket overnatt i mimmalmedium inneholdende sukrose som eneste C-kilde. 7.5 OD av kulturen (OD578 = 1-2) ble pelletert og vasket med 5 ml H2O (forvarmet til 30°C). Cellene ble dyrket i 5 ml YP/0.5% sukrose/250 uCi [<3>H]-mannose i en vannbadrister i 2 timer ved 30°C.

E.7.3.2, Isolering av ri cellevegg og membranfraksjon

5 OD av [<3>H]-mannosebehandlede celler ble sentrifugert og vasket tre ganger med 1 ml TMA. Cellene ble resuspendert i 200 pm TMA og brutt opp med glasskuler som beskrevet i E.7.2.1 (10 pl prøve ble anvendt for telling av radioaktiviteten som tilsvarer totalinkorporering). Ekstraktet ble deretter sentrifugert i 15' (10.000 x g) og supematanten ble fjernet (100 pl prøve ble anvendt for opptelling av radioaktivitet som tilsvarer det oppløselige materialet).

E.7.3.3.6-eliminering

Pelleten ble resuspendert i 1 ml 0.1 N NaOH (en 10 pl prøve ble anvendt for telling av radioaktiviteten som tilsvarer materialet før Elimineringen). Inkubasjonen ble opprett-holdt i 24 timer ved 30°C.

E.7.3.4. Analyse av fi-eliminert materiale

Ø-eliminert materiale ble avsaltet via en Dowex 50WS8/H<+> kolonne (0.5cm x 6cm). Kolonnen ble mettet med 0.5M mannose og ekviltbrert i H2O. B-elimineirngsprøven ble applisert pi kolonnen og vasket gjennom med 1.5 pl H2O. Det som strømte gjennom ble samlet (en 100 pl prøve ble anvendt for opptelling av radioaktiviteten som tilsvarer det B-eliminerte materialet) og konsentrert til 10 pl i speed-vak. Tynnsjiktskormatografi på sitikagel 60 (merck) i aceton:butanol:H20 70:15:15 ble utført. Standarder: mannose, sukrose, stachyose, raffinose. Kromatografiske kjøringer ble gjentatt en gang. Sukkerene ble detektert med 0.5 g KMn04 i 100 ml 2N NaOH. Radioaktiviteten ble detektert ved en tynnsjiktsscanner (Berthold) (se figur 6).

Mutante celler viser redusert glykosylering sammenlignet med villtype celler. O-glykosylering i mutante celler er omtrent 40-50% lavere enn i villtype celler.

Eksempel 8: Kloning av PMTl homolo<g>en til Kluweromvces lactis

Gjær S. cerevisiae pleier å være det valgte systemet når produksjon av et heterologt protein i en sopp vertscelle var ønskelig. De senere årene har derimot vist at produktiviteten til bakegjær er ofte begrenset, spesielt når sekresjon av produktet til kulturmediet er nødvendig. Anvendelse av soppsystemer andre enn S. cerevisiae er derfor foretrukket i mange tilfeller (jfr. Romanos et al., Yeast 8 (1992) 423-488; Fleer, Curr. Opinion Biotechnol. 3 (1992) 486-496]. En av de alternative gjærvertene er representert ved genus Kluyveromyces hvor det er oppnådd meget gode sekresjonsutbytter med hensyn på flere proteiner av kommersiell interesse (for eksempel Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990) 135-139}. Det følgende eksempelet demonstrerer at foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til bakegjær, på grunn av at sekvensen til PMTl genet isolert fra S. cerevisiae kan med fordel bli anvendt for identifikasjon av gener som koder for den lignende enzymatiske aktiviteten i andre sopparter. Sekvensinformasjonen vist i foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt for identifikasjon av beslektede mannosyltransferase kodende gener i S. cerevisiae.

E. 8. 1. Konstruksjon av de<g>enererte PCR primere for amolifikasion av PMTl relaterte gener

Regionen av PMTl nukleotidsekvensen som tilsvarer den sentrale, hydrofile regionen til mannosyltransferaseproteinet ble valgt for å konstruere PCR primere [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki et al., Science 230(1985) 1350-1354; Mullis & Faloona, Meth. Enzymol. 155 (1987) 335-350] for amplifikasjon av homologe gener. Amplifikasjon krever hybridisering, også betegnet sammensmeltning, av disse syntetiske oligonukleotidene med mål DNA. Spesifisiteten hvorved individuelle regioner av genomisk DNA er amplifisert avhenger av betingelsene til PCR reaksjonen og homologigraden mellom primerne og nukleotidsekvensen som skal bli amplifisert. Etter sammensmeltningstrinnet blir primerne utvidet ved anvendelse av en termostabil DNA polymerase. Når den komplementære tråden er blitt polymerisert blir de to trådene separert ved varme denaturering og en ny sammensmeltningssyklus og polymerisering kan begynne. Fire eksempler på oligomikleotider egnede som primere for PCR amplifikasjon av PMTl homologer er presentert i tabell 2 nedenfor.

Konstruksjon av disse "degenererte" oliognukleotidene tar hensyn til at flere kodoner kan inneholde informasjonen for innkorporering av den samme aminosyren inn i en naken polypeptidkjede som som oftest varierer i den tredje ("boble") posisjonen til en triplett. Hver primer representerer derfor en blanding av oligonukleotider hvor Y angir C eller T, R angir A eller G og N angir A, C, G eller T.

B. 8. 2. PCR amplifikasjon av K. lactis genomisk DNA

Genomisk DAN til K. lactis stamme CBS2359 ble dannet som beskrevet av Sherman et al. ["Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986) s 127].

10 ng genomisk DNA ble anvendt i en standard PCR reaksjon [Sambrook et al., "Molecular Cloning - A laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] i nærvær av 1 ug av hver av primerene og 5% deionisert formamid. Amplifikasjonen ble utført ved anvendelse av en "DNA Thermal Cycler"

(Perkm Eimer Cetus) og "AmpliTag DNA Polymerase" (Perkin Eimer Cetus, 5 enheter pr reaksjonsrør). Betingelsene for denaturering, sammensmeltning og polymerisering (30 sykluser) var 90°C (1 min.), 42°C (2 min.) og 72°C (3 min.), med unntagelse av den første syklusen hvor denatureringen var i 5 min. Resultatene av PCR amplifikasjonene ved anvendelse av primerene beskrevet ovenfor er presentert i tabell 3 nedenfor.

Disse resultatene viser at det ikke bare er mulig å oppnå fragmenter som utviser samme størrelse som det som er ventet for K. lactis homologen til S. cerevisiae PMTl genet, men at i tillegg kan DNA fragmentet bli amplifisert med høy spesifisitet som sannsynligvis tilsvarer et annet gen kodende for en nær relatert enzymatisk aktivitet.

E. 8. 3. Delsekvenskarakteriserine av K. lactis PMY1 homolog

400 bp fragmentet amplifisert med primerkombinasjonen Sq3908+Sq3910 ble subklonet inn i vektor pCRII (TA Cloning<TM>, invitrogen Corp.) ifølge forhandlerens instruksjoner og delvis sekvensert ifølge metoden beskrevet i E.4.1.9. ved anvendelse av universalprimeren. Den oppnådde sekvensen er vist i figur 7. Sekvenssammenligning mellom S. cerevisiae PMTl genet og fragmentet isolert fra K. lactis genomisk DNA ved PCR amplifikasjon viser 75% og 80.5% identitet på nukleotid og aminosyrenivå (figur 8). Det amplifiserte 400 bp DNA fragmentet kan bli anvendt for å målsøke et selekterbart markørgen til K. lactis PMTl kromosomalt lokus analogt med eksperimentet beskrevet under E.6. som fører til et oppbrutt gen. Dette vil tilveiebringe en K. lactis stamme med redusert Ser/Thr spesifikk monosyltransferaseaktivitet. I tillegg kan det amplifiserte fragmentet bli anvendt som homolog hybridiseirngsprobe for kloning av hele K. lactis PMTl genet ved anvendelse av standardprosedyrer.

Claims (23)

1. Soppcelle, karakterisert ved at den bærer genetiske modifikasjoner lokalisert i den kodende region eller i regioner ansvarlig for eller involvert i ekspresjons-og/eller transkripsjonsregulering av genet som koder for et protein som har Dol-P-Man :Protein (Ser/Thr) mannosyl transferase (PMTl)-aktivitet utvalgt fira gruppen bestående av (a) DNA-molekyler omfattende nukleotidsekvensen vist i figur 4A eller fragmenter av fragmenter av denne; (b) DNA-molekyler som koder for et protein med aminosyresekvensen vist i figur 4B eller fragmenter av denne; eller (c) DNA-molekyler omfattende sekvensen til fragmentet på 126 bp av PMT1-genet til Kluyveromyces lactis vist i figur 7 eller fragmenter av dette; som medfører at nevnte celler har minst en redusert kapasitet for O-glykosylering sammenliknet med en soppcelle som bærer det tilsvarende umodifiserte DNA-molekyl definert i (a) til (c).

2. Soppcelle ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte modifikasjon(er) omfatter en hvilken som helst suppresjon, substitusjon, delesjon, addisjon, oppbrudd og/eller mutasjonelt innskudd.

3. Soppcelle ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte modifikasjon(er) er stabile i løpet av segregeringen og/eller ikke-reverterende og/eller ikke-lekkende.

4. Soppcelle ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3,karakterisert ved at den reduserte kapasiteten for O-glykosylering er et resultat av produksjon av inaktive enzymer, fra produksjon av enzymer som har endrede biologiske egenskaper, fra fråvær av produksjon av nevnte enzymer eller fra produksjonen av nevnte enzym i lave nivåer.

5. Soppcelle ifølge et hvilket som helst krav 1 til 4, karakterisert ved at den videre omfatter modifikasjon(er) i en eller flere gener involvert i påfølgende addisjoner av mannosylresidier, eller i syntese av mannosylresidiedonor (Dol-P-Man).

6. Soppcelle ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert v ed at en eksogen DNA sekvens er blitt innført.

7. Soppcelle ifølge krav 6, karakterisert ved at den eksogene DNA sekvensen omfatter en eller flere gener kodende for et ønsket protein som skal bli uttrykt og/eller utskilt i nevnte celle.

8. Soppcelle ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte DNA sekvens er innbefattet i en ekspresjonskassett omfattende en transkripsjons- og translasjonsinitierende region koblet til 5-enden av nevnte DNA sekvens kodende for ønsket protein(er).

9. Soppcelle ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte transkripsjon og translasjonsinitierende region blir valgt fra promotere avledet fra soppcellegener.

10. Soppcelle ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved at nevnte ekspresjonskassett videre omfatter en transkripsjons- og translasjonstermineringsregion ved 3'-enden av DNA sekvensen kodende for ønskede protein(er).

11. Soppcelle ifølge krav 8 til 10, karakterisert ved at nevnte ekspresjonskassett videre omfatter et signalpeptid (pre-sekvens) ved N-terminusen av den ønskede proteinsekvensen for å lede det nakne proteinet til den sekretoriske reaksjonsveien til nevnte soppcelle.

12. Soppcelle ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 11,karakterisert ved at den eksogene DNA sekvensen er en del av en vektor som enten kan bli replikert autonomt i nevnte soppcelle eller integrert inn i egne DNA sekvenser (kromosom).

13. Soppcelle ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert v e d at den blir valgt fra filamentøs sopp og gjær.

14. Soppcelle ifølge krav 13, karakterisert ved at gjæren blir valgt fra gruppen bestående av Kluyveromyces og Saccharomyces.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante produkter, karakterisert ved at en soppcelle ifølge kravene 6-14 blir dyrket ved betingelser hvor den eksogene DNA sekvensen blir uttrykt og produktet blir isolert.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte produkt blir utskilt i kulturmediet.

17. Fremgangsmåte ifølge kravene 15 eller 16, karakterisert ved at nevnte produkt er mottagelig for O-glykosylering av soppcellen.

18. DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter et gen som koder for Dol-p-Man: protein (Ser/Thr) mannosyl transferase fra en Saccharomyces art, der genet har sekvensen gitt i figur 4A.

19. DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter et gen som koder for dol-p-Man: protein (Ser/Thr) mannosyl transferase fra en Kluyveromyces art, der genet inneholder sekvensen fra fragmentet på 126 basepar fra PMTl-genet til Kluyveromyces Lactis gitt i figur 7.

20. DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter et gen som koder for dol-p-Man: protein (Ser/Thr) mannosyl transferase: (a) som hybridiserer med DNA-sekvensen ifølge krav 18 eller 19; og/eller (b) representerer fragmenter eller derivater av DNA-sekvensen ifølge krav 18 eller 19.

21. Anvendelse av et DNA fragment ifølge krav 19 eller 20 eller en hvilken som helst del derav som hybridiseringsprobe(er) eller for komplementering av mutante fenotyper for oppnåelse av homologe gener til soppcellene.

22. DNA-fragment, karakterisert ved at det er et fragment eller degenerert fragment beroende på den genetiske kode av genet ifølge krav 18 og har følgende sekvens:

23. Anvendelse av DNA-fragmentet eller det degenererte fragment ifølge krav 22 som en PCR-primer.