WO2006107084A1 - 分泌型耐熱性酵素を高分泌生産できる酵母変異株 - Google Patents

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WO2006107084A1
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yeast
secretory
yeast mutant
thermostable enzyme
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Rinji Akada
Hisashi Hoshida
Tsuneyasu Fujita
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Yamaguchi University
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source

Definitions

  • the present invention relates to a yeast mutant that transforms a DNA encoding a secretory thermostable enzyme capable of producing a secretory thermostable enzyme in high secretion and has a specific gene disrupted or suppressed in expression.
  • thermostable enzyme is an enzyme whose protein tertiary structure (three-dimensional structure) is not easily broken even at high temperatures and retains enzyme activity. Enzymes used industrially require high physical and chemical stability, and thermostable enzymes are particularly preferred. This is because it is preferable to perform many reactions involving enzymes at high temperatures. In other words, processing at high temperatures such as 55 ° C to 95 ° C becomes possible, the solubility of the substrate increases, the solvent viscosity decreases, the catalytic action is accelerated, and in the manufacturing process of foods and pharmaceuticals This is because the risk of contamination with bacteria decreases. In order to take advantage of these advantages at high temperatures, various thermostable enzymes are required.
  • Enzymes, nucleic acids, membranes, ribosomes, etc. which are the biological components of thermophiles, are thermostable.
  • Thermostable enzymes obtained from these bacteria are used in a wide range of fields such as medicine and engineering.
  • PCR method Polymerase chain reaction
  • the enzyme used is changed from Escherichia coli DNA polymerase to Thermus DNA polymerase (Taq enzyme).
  • Taq enzyme Thermus DNA polymerase
  • thermophilic bacterium thermophilic bacterium ⁇ thermophile, caldoactive bacterium
  • thermophilic bacterium is a general term for bacteria that can usually grow at 55 ° C or higher, and is collected from hot springs, volcanoes, or near the hot water outlet of the seabed.
  • Typical examples are the genus Baci lus and Thermus.
  • Enzymes from the genus Bacillus are highly heat resistant As a result, it occupies the mainstream of industrially used enzymes.
  • One of them, ⁇ -amylase from Bacil lus l icheniformis is one of the most thermostable natural enzymes used in biotechnological reactions. It is also possible to perform starch hydrolysis industrially at a temperature of 90 ° C or higher (Non-patent Document 1).
  • thermostable enzymes In order to industrially use these thermostable enzymes, means for producing them in large quantities is necessary, and it is conceivable to culture thermophilic bacteria.
  • the acquisition of thermostable enzymes from these thermophilic bacteria requires a microbial culture operation at a high temperature, and moreover, generally, the enzyme production rate of thermophilic bacteria is not large. There is a problem as a method. Therefore, it is desired to produce a recombinant using a host that can grow at room temperature and has a high enzyme production rate.
  • yeast Saccharomyces cerevis iae has been widely used as a host for enzyme production by recombinant DNA technology. Since 1978, the endogenous plasmid DNA replication origin (ars) In addition, vectors using inducible or constitutive high expression promoters have been developed. As a result, yeast can be obtained as a useful protein product that isolates proteins essentially heterogeneous to the host into the cell culture medium by genetic manipulation (Patent Document 1). In yeast host-vector systems, the expression of animal and plant genes may be more efficient than prokaryotes such as Escherichia coli and Bacillus subtilis because yeast is eukaryotic. It also has the advantage of not having a pyrogenic toxin like prokaryotes.
  • Non-Patent Document 2 It is considered that the recombinant protein is subject to expression suppression in the host.
  • thermostable amylase derived from Bacillus ricinniformis and the hyalamylase derived from Aspergillus are both cloned.
  • the production of thermostable amylase in yeast was very small (Fig. 1, TAA: Aspergillus oryzae amylase gene, AmyL H133I-A209V: thermostable amylase gene derived from Bacillus ricinniformis.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 6-181779
  • Non-patent literature 1 Phi l ippe Joyet, et al., Hyperthermostable Variant of a Highly Thermostabl e Alpha- Amylase "BIO / TECHNOLOGY VOL 10 DECEMBER 1992
  • Non-patent literature 2 Cereghino, JL and Cregg, JM," Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastori s, EMS Mi crooiolol. Rev. 24, 45-66 (2000)
  • Non-Patent Document 3 Hamrand, C. and Helenius, A., "Quality control in the secretory pathway” Curr. Open. Ceil Biol., 7, 523-529 (1995) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a yeast mutant strain capable of producing a secretory thermostable enzyme in high secretion, transforming DNA encoding the secretory thermostable enzyme, and disrupting or suppressing expression of a specific gene. To do.
  • the present inventors have proposed a mechanism for suppressing secretion production of a secretory thermostable enzyme (a amylase mutant H133I-A209V derived from Bacillus ricinniformis) in yeast.
  • a secreted thermostable enzyme gene was transformed into 4792 gene-disrupted strains, and the secretion activity was measured.
  • a certain gene-disrupted strain was found in natural yeast. As a result, it was found that the secretion activity is high, and the present invention has been completed based on this finding.
  • the present invention includes the following. ⁇
  • a yeast mutant in which a DNA encoding a secretory thermostable enzyme is transformed, and one or more of the following genes or homologous genes thereof are disrupted or suppressed in expression.
  • the above-mentioned disrupted or expression-suppressed gene or its homologous gene force is selected from the group consisting of S, ALG3, ALG5, ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, ALG12, HFM1, RMD6, T0S1, VTS1, and YIL039W forces It is one or more genes or homologous genes thereof,
  • a yeast mutant in which a DNA encoding a secretory thermostable enzyme is transformed, and a gene involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum is disrupted or suppressed in expression.
  • the yeast mutant according to (5) which is a gene.
  • the gene involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum is one or more genes selected from the group consisting of ALG3, ALG5, ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, and ALG12 or homologous genes thereof.
  • the yeast mutant according to (7) is one or more genes selected from the group consisting of ALG3, ALG5, ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, and ALG12 or homologous genes thereof.
  • a method for producing a secretory thermostable enzyme is provided.
  • Fig. 1 shows the transformation of an expression vector containing Saccharomyces cerevisiae from the Aspergillus oryzae-derived amylase gene TAA and Bacillus' formus thermostable amylase-amylase gene AmyL-H133I-A209V inserted downstream of the TDH3 promoter.
  • the amylase expression of the recombinant yeast is shown.
  • the white part that does not cause the iodine starch reaction (the mouth) indicates the size of the amylase activity.
  • FIG. 2A shows a recombinant p316TDHAmyL-H133I-A209V obtained by recombining the gene AmyL-H133I-A209V of the a-amylase mutant H133I-A209V derived from Bacillus ricche-formis with the vector p316TDH3pAN.
  • FIG. 2B shows the expression of the -amylase mutant H133I-A209V in the Saccharomyces cerevisiae BY4743 strain transformed with p316TDHAmyL-H13 3 I-A209V.
  • FIG. 3A illustrates the transformation of recombinant p316TDHAmyL-H133I-A209V into 4792 gene disruption strains of Saccharomyces cerevisiae.
  • Figure 3B illustrates the amylase activity detection test.
  • Figure 4 shows the results of the activity test of 4792 types of Saccharomyces cerevisiae gene-disrupted strains of the Bacillus litchiformis ⁇ -amylase mutant H133I-A209V. It is fruit.
  • FIG. 5 shows the secretion amount of the ⁇ -amylase mutant H133I-A209V in each gene-disrupted strain as a relative secretion amount (+10, +++) when the secretion amount of the parent strain is 10.
  • Figure 6 shows the genes encoding enzymes involved in these reactions in the glycosylation process of ⁇ -linked glycosylation proteins in the endoplasmic reticulum (ER) and oligosaccharide extension and transfer and Saccharomyces cerevisiae. Show. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a strain in which a specific gene of yeast is disrupted is produced, a DNA encoding a secretory thermostable enzyme is transformed into this strain, and the secretory thermostable enzyme is secreted outside the cell.
  • a strain capable of producing a secretory thermostable enzyme with high secretion can be selected, whereby the yeast mutant according to the present invention can be obtained, and in order to obtain such a strain Identify genes that should be disrupted or suppressed.
  • FIG. 2A shows a recombinant p316TDHAmyL-H133I-A209V (an enzyme gene expression vector) obtained by recombining the ⁇ -amylase gene AmyL-H133I-A209V with the vector p316TDHpAN.
  • the expression of the -amylase mutant H133I-A209V was confirmed by culturing Saccharomyces cerevisiae BY4743 strain transformed with this recombinant and detecting amylase activity (Fig. 2 B).
  • the amount of amylase secreted is measured by measuring the amylase activity by the method using starch medium and iodine starch reaction shown in B. And of these, Amila As a target gene to be disrupted or to suppress expression in order to obtain a yeast mutant according to the present invention, a gene that has a higher secretion amount than the parent strain is identified. Can be identified.
  • the present invention relates to a yeast mutant in which a DNA encoding a secretory thermostable enzyme is transformed, and one or more of the genes shown in Table 1 or homologous genes thereof are disrupted or suppressed in expression.
  • the secretion amount of the secretory thermostable enzyme encoded from the transformed DNA to the extracellular level is negative (the DNA encoding the secretory thermostable enzyme is transformed).
  • it is higher than the yeasts whose genes shown in Table 1 or their homologous genes are not disrupted or suppressed in expression.
  • the genes that are subject to destruction or suppression of expression are shown in Table 1 according to the gene name of Saccharomyces cerevisiae (generic name / systematic name, but if there is no common name, only the systematic name is shown) ADE6 / YGR061C, ALG3 / YBL082C, ALG5 / YPL227C, ALG6 / YOR002W, ALG8 / Y0R067C, ALG9 / YNL219C, ALG10 / YGR227W, ALG12 / YNR030W, ASE1 / Y0R058C, B0P1 / YPL4lW007 YDR179C, CWH41 / YGL027C, FL01 / YAR050W, GDS1 / Y0R355W, GPA2 / YER020W, HAP2 / YGL237C, HFM1 /
  • ALG3 RHK1
  • ALG5 ALG6, ALG8, ALG9
  • ALG10 DIE2
  • ALG12 ECM39
  • HFM1 HFM1
  • Yeast in which one or more genes selected from the group consisting of RMD6, T0S1, VTS1 and YIL039W or homologous genes thereof are disrupted or expression-suppressed is encoded from the transformed DNA.
  • the amount of secretory thermostable enzyme secreted outside the cell is very high compared to the negative control.
  • genes targeted for destruction or suppression of expression include genes involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum.
  • a gene involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum encodes an enzyme or protein involved in oligosaccharide elongation and transfer in the daricosylation process of N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum. Means gene.
  • genes involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum include ALG3, ALG5, ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, ALG12, CWH41, and 0ST5 of the Saccharomyces cerevisiae genes described above.
  • One or more genes selected from the group or homologous genes thereof can be mentioned.
  • yeast mutants that disrupt or suppress the expression of one or more genes selected from the group consisting of ALG3, ALG5, .ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, and ALG12 or homologous genes thereof are encoded from the transformed DNA.
  • the amount of secretory thermostable enzyme secreted outside the cell is very high compared to the negative control.
  • a homologous gene is a protein having the same activity or function as the protein encoded by the aforementioned Saccharomyces cerevisiae gene in the yeast when the yeast to be transformed is a yeast other than Saccharomyces cerevisiae. It means a gene that encodes quality.
  • a secretory thermostable enzyme means an enzyme that is secreted extracellularly and retains the enzyme activity because the tertiary structure of the protein is not easily lost even at high temperatures (eg, 55 ° C to 95 ° C).
  • the DNA encoding the secretory thermostable enzyme to be transformed may be any DNA encoding any secretory thermostable enzyme, which is the same species as the yeast to be transformed, Any of different types may be used.
  • the secretory thermostable enzyme encoded from the DNA may be a fusion protein in which a known secretory signal peptide is functionally linked to a non-secretory thermostable enzyme.
  • Examples of the DNA encoding the secretory thermostable enzyme to be transformed include amylase derived from Bacillus licheniformis (for example, the above-mentioned amylase mutant H133I-A209V), and Bacillus stearothermo. Alaninde hydrogenase from Phyllus (Bacillus stearothermophi lus), DNA polymerase from Thermococcus kodakaraensis and Pyrococcus hololicosi The DNA that codes for senorella from (Pyrococcus horikoshi i) is raised.
  • a yeast serving as a host may be any type of yeast, e.g., Saccharomyces 'Serepishe, Shizosakka b Mrs' bomb (Schizosaccharomyces pombe) lambda Hikino lotus Bok Soo (Pi chia pastoris ) And Kluyverorayc.es lact is.
  • Saccharomyces 'Serepishe Shizosakka b Mrs' bomb (Schizosaccharomyces pombe) lambda Hikino lotus Bok Soo (Pi chia pastoris ) And Kluyverorayc.es lact is.
  • DNA encoding a secretory thermostable enzyme is transformed into the host yeast.
  • the DNA encoding the secretory thermostable enzyme is an expression vector in which a DNA fragment containing a gene encoding the secretory thermostable enzyme or a gene encoding the secretory thermostable enzyme is inserted into an appropriate vector. It's okay.
  • the vector for inserting the gene encoding the secretory thermostable enzyme is not particularly limited as long as it can replicate in the host yeast, and examples thereof include plasmids, shuttle vectors, and helper plasmids. .
  • the vector itself may be a DNA fragment that can be replicated by inserting it into the chromosome of the host yeast.
  • the purified DNA fragment containing the gene encoding the secretory thermostable enzyme is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and an appropriate vector DNA is restricted.
  • a method of inserting into an enzyme site or a multicloning site and ligating to a vector is employed.
  • the two are linked by an in vitro method or an in vivo method using PCR or the like. It may be a method. ⁇
  • the method for introducing DNA encoding the secretory thermostable enzyme into the host yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation electroporation method
  • spheroplast method spheroplast method
  • lithium acetate method for example, electroporation (electroporation method), spheroplast method and the lithium acetate method.
  • the target gene for the above-described disruption or expression suppression is disrupted or suppressed in the host yeast.
  • gene disruption means introducing a mutation into a gene endogenous to the host fermentation mother and destroying or deleting the gene, It means that the protein encoded by the gene is not produced or the produced protein has no function.
  • An existing yeast gene-disrupted strain or gene-deficient strain that has undergone such gene disruption can be used as a host as is, for example, the Saccharomyces cerevisiae gene-disrupted strain described above (manufactured by EUR0SCARF, Invitrogen, and Open Biosystems) Is mentioned.
  • gene disruption methods include mutation treatment methods such as UV and EMS, gene replacement methods using homologous recombination, and gene disruption using transposons.
  • suppression of expression means suppression at the transcriptional or translational level of a gene endogenous to host yeast, or suppression of the activity or function of a protein expressed from the gene. Such suppression of expression can suppress the activity or function of the protein encoded by the target gene in the host yeast.
  • Methods for suppressing the gene at the transcription level include, for example, replacement and mutation of the promoter that controls the target gene, RNA destabilization, and copy number reduction (one allele of the target gene in the diploid). Destruction).
  • Examples of the method for suppressing the gene at the translation level include a method using antisense RNA.
  • Examples of the method for suppressing the activity or function of the protein encoded by the target gene include a method using an antibody against these proteins. By culturing a yeast host in the presence of such an antibody, the activity or function of the protein can be suppressed by binding the antibody to the protein encoded by the target gene.
  • the yeast mutant according to the present invention can be obtained by transforming the DNA encoding the secretory thermostable enzyme and disrupting or suppressing the expression of the host yeast gene.
  • a secretory thermostable enzyme encoded from transformed DNA is produced in high secretion.
  • the yeast mutant according to the present invention is cultured, and after the culture, the yeast mutant culture or By isolating the secretory thermostable enzyme from the culture supernatant, the secretory thermostable enzyme can be obtained in high yield.
  • the culture medium and culture conditions for culturing the yeast mutant are not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of host yeast used.
  • the secretory thermostable enzyme can be collected from the culture or the culture supernatant by extraction with an organic solvent, etc., and can be further isolated and purified using various chromatographies if necessary.
  • yeast mutant culture or culture supernatant may be used as is.
  • a secretory thermostable enzyme can be secreted and produced at a high yield at a temperature of about room temperature.
  • p316TDHAmyL-H133I-A209V expression vector
  • Saccharomyces cerevisiae to express the batinoles-Richejeholmis-derived hyalamylase (AmyL) mutant H133I-A209V.
  • AmyL-H133I-A209V cDNA fragment was prepared by PCR so that both ends had Ascl sites and Notl sites, respectively.
  • AmyL-H133I-A209V cDNA fragment was then digested with Ascl and Notl and cloned into the similarly digested vector p316TDH3pAN.
  • Saccharomyces cerevisiae BY4743 strain was transformed and cultured.
  • expression of the amylase mutant H133I-A209V secretion into the culture supernatant (See Fig. 2B).
  • the Bacillus licheniformis-derived ⁇ -amylase mutant H133I-A209V expression vector p316TDHAmyL-H133I-A209V prepared in (1) above was transformed into the 4792 types of gene-disrupted strains.
  • each gene-disrupted strain was statically cultured at 28 ° C. for 24 hours in a 96-well microtiter well dispensed with the above medium. After static culture, the culture solution was mixed with 25 gene transfer solutions containing the expression vector and treated at 42 ° C for 2 hours. Subsequently, this mixed solution was spread on a selective medium and cultured at 28 ° C. for 48 to 72 hours to obtain a transformant.
  • Figure 3B illustrates the amylase activity test.
  • the transformant obtained in (3) above was cultured at 28 ° C and pH 6.0 in a synthetic medium containing no uracil, and the resulting culture solution was added to a selective medium ( ⁇ 6.0 ⁇ 0 containing 1% starch. ), And after standing at 28 ° C for 24 hours, amylase activity was detected from the mouth of the iodine starch reaction.
  • Fig. 4 shows the measurement results of the activity test of the Bacillus and Litchiniformis-derived amylase mutant H133I-A209V in the 4792 Saccharomyces cerevisiae gene disruption strain of (4) above.
  • Figure 4 shows 54 96-well microtiter wells. Each hole corresponds to the amylase activity test results for each Saccharomyces cerevisiae gene disruption strain.
  • FIG. 5 shows the results of the amylase activity test for each gene-disrupted strain (denoted by the name of the disrupted gene) and the parent strain.
  • Fig. 5 shows the secretion amount of the amylase mutant H133I-A209V in each gene-disrupted strain in terms of relative production (++, +++) when the secretion amount of the parent strain is defined as +.
  • Table 1 shows the gene disrupted strains shown in Figure 5. The general name and systematic name of the disrupted gene (or the protein encoded by it), as well as the molecular function, biological action and localization of the protein encoded by the gene.
  • DNA encoding a secretory thermostable enzyme was transformed, and the following genes: ADE6, ALG3, ALG5, ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, ALG12, ASE1, B0P1, CAP1 , CLB4, CSN9, CWH41, FL01, GDS1, GPA2, HAP2, HFM1, HUB1, IVY1, IXR1, KEX1, MET12, 0ST5, PMP3, RMD6, RVS167, SET7, SNT309, SRF6, SYC1, T0S1, TRM1, UBR Saccharomyces cerevisiae, which destroyed one of VIK1, VTS1, YBL081W, YGL242C, YGR042W, YGR054W, YGR071C, YIL039W, YJL007 YLR232W and YLR407W, produces a secretory thermostable enzyme that is particularly powerful and highly secreted compared to its parent strain
  • Figure 6 shows the genes encoding enzymes involved in these reactions in oligosaccharide elongation and transfer and Saccharomyces cerevisiae in the glycosylation process of N-linked glycosylation proteins in the endoplasmic reticulum. Show.
  • the genes shown in white correspond to the disrupted genes of the above gene-disrupted strain that produced the secreted amylase mutant H133I-A209V in high secretion. Essential genes are underlined.
  • yeast mutants that have disrupted genes involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum are secreted thermostable enzymes encoded by the transformed DNA. Can be expected to produce high secretion.
  • GDS1 YOR355W Unknown Aerobic respiration Cytoplasm, mitochondrial, nucleus
  • DNA encoding a secretory thermostable enzyme is transformed, and the following genes: ADE6, ALG3, ALG5, A and G6, ALG8, ALG9, ALG10, ALG12, ASE1, B0P1, CAP1, CLB4 , CSN9, CWH41, FL01, GDS1, GPA2, HAP2, HFM1, HUB1, IVY1, IXR1, KEX1, MET12, 0ST5, PMP3, RMD6, RVS167, SET7, SNT309, SRF6, SYC1, T0S1, TRM1, UBR2, TS1 YBL081W, YGL242C, YGR042W, YGR054W, YGR071 YIL039W, YJL007C, YLR232W and YLR407W, a yeast mutant strain in which one or more genes or homologous genes thereof are disrupted or expression-suppressed are provided. If the yeast mutant according to the present invention is
  • yeast mutant according to the present invention in which the gene involved in protein N-linked glycosylation in the endoplasmic reticulum is disrupted or suppressed in expression, secretory heat resistance encoded from the transformed DNA is used. Enzymes can be produced with high secretion.
  • the yeast mutant according to the present invention can produce various secretory thermostable enzymes, and in particular, can secrete and produce secretory thermostable amylase efficiently.

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Abstract

本発明は、分泌型耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換し、且つ以下の遺伝子：ADE6、ALG3、ALG5、ALG6、ALG8、ALG9、ALG10、ALG12、ASE1、BOP1、CAP1、CLB4、CSN9、CWH41、FLO1、GDS1、GPA2、HAP2、HFM1、HUB1、IVY1、IXR1、KEX1、MET12、OST5、PMP3、RMD6、RVS167、SET7、SNT309、SRF6、SYC1、TOS1、TRM1、UBR2、VIK1、VTS1、YBL081W、YGL242C、YGR042W、YGR054W、YGR071C、YIL039W、YJL007C、YLR232W及びYLR407Wから成る群より選択される遺伝子又はその相同遺伝子の1以上が破壊又は発現抑制された酵母変異株に関する。

Description

分泌型耐熱性酵素を高分泌生産できる酵母変異株 技術分野 ·
本発明は、 分泌型耐熱性酵素を高分泌生産できる、 分泌型耐熱性酵素をコード する DNAを形質転換し、 且つ特定の遺伝子が破壊又は発現抑制された酵母変異株 に関する。
明 背景技術
書
耐熱性酵素とは、 タンパク質の 3次構造 （立体構造） が高温でも壊れにく く、 酵素活性を保持している酵素をいう。 工業的に使用される酵素は、 物理的に、 化 学的に、 高い安定性が要求され、 特に耐熱性酵素が好んで使用される。 これは、 酵素の関わる多くの反応が、 高温で行えるほうが好ましいからである。 つまり、 55°C〜95°Cの如き高温下での処理が可能になり、 基質の溶解度が増加し、 溶媒粘 度が減少し、 触媒作用が加速され、 さらに食品や医薬品の製造過程においては細 菌混入のリスクが低下するからである。高温でのこれらのメリットを生かすため、 種々の耐熱性酵素が求められている。
好熱菌の生体成分である酵素、 核酸、 膜、 リボソームなどは熱安定性である。 これらの菌から得られる耐熱性酵素は、 医学 ·工学など広い分野で利用されてい る。 例えば、 遺伝子 DNAを試験管内で大量に増やす方法として近年、 開発された PCR法 （Polymerase chain reaction) では、 使用する酵素を大腸菌の DNAポリメ ラーゼからサーマス菌（Thermus)の DNAポリメラーゼ （Taq酵素） に切り替えたこ とにより、 加熱を繰り返すたびに新たに酵素を加える必要がなくなり、 自動化が 可能になって、 非常に広範な'分野で用いられるようになつた。
好熱性細菌 (thermophi l ic bacteria^ thermophi le、 Caldoactive bacteria) とは、 通常 55°C以上で生育できる細菌の総称で、 温泉や火山、 あるいは海底の熱 水の嘖出口付近などから採取される。 代表的なものにバチルス （Baci l lus) 属、 サーマス （Thermus) 属がある。 バチルス （Baci l lus) 属由来の酵素は高い耐熱性 を示すことから、 現在産業的に使用される酵素の主流を占めている。 その一つ、 ノ チノレス ' リチェニホノレミス （Bac i l lus l icheniformis) 由来の α - アミラーゼは、 バイオテクノロジ一の反応で使用される天然の酵素の中で最も熱 安定性が高いものの一つであり、 90°C以上の温度で工業的にデンプン加水分解を 行うことも可能とされている （非特許文献 1 )。
これらの耐熱性酵素を産業上利用するためには多量に生産する手段が必要であ り、 好熱性菌を培養することが考えられる。 しかしながら、 これらの好熱細菌か らの耐熱性酵素の取得には高温での微生物培養操作を要するため、 さらには一般 に好熱性菌の酵素生産速度が大きくないことなどから、 工業的な酵素製造方法と しては問題を有している。 そこで常温程度の温度で生育でき、 しかも高い酵素生 産速度を示す宿主を用いた組換え体での生産が望まれる。
組換え DNA 技術による酵素生産の宿主としては、 一般に酵母菌サッカロミセ ス 'セレビシェ （Saccharomyces cerevis iae) が広く用いられており、 1978年以 来これに内在するプラスミ ドゃ DNA複製開始点 （ars) や、誘導的あるいは恒常的 高発現プロモーターなどを用いたベクターが開発されている。 これにより酵母菌 は、 宿主にとって本質的に異種のタンパク質を遺伝子操作により、 細胞培養培地 中に分離する有用なタンパク質生産物として得ることができる （特許文献 1 )。 酵母の宿主-ベクター系は、酵母が真核生物であることにより、動物や植物の遺 伝子の発現が大腸菌や枯草菌のような原核生物よりも効率がよい可能性がある。 また、 原核生物のように発熱性の毒素を持たないという利点もある。 そして、 古 くから発酵工業に使われており、 安全性の高いことが認められている。 これまで にインターフェロン （ 及び y )、 B型肝炎ワクチン、 キモシンなどのタンパク質 の生産にも用いられている。 また、 遺伝子産物の生産量を上げるために、 生産さ れたタンパク質を細胞外に分泌する分泌ベクターも開発され、ヒ ト ·インスリン、 上皮成長因子 （EGF)、 インスリン様成長因子やインターロイキン 2などが分泌生 産されるようになった。
しかしながら、 酵母に限らず、 組換え体による異種タンパク質生産では必ずし も異種タンパク質の高生産が実現されているわけではなレ、。例えば、同種の宿主 - ベクター系を用いても、生産されるタンパク質量は大きく異なり（非特許文献 2 )、 組換えタンパク質は宿主内で発現抑制を受けていると考えられる。
バチルス'リチェ二ホルミス由来耐熱性ァミラーゼと麹菌由来ひ -ァミラーゼは それらの cDNAが共にクローニングされている。これらをそれぞれ同じベクターに 導入し、 サッカロミセス ·セレビシェで発現させてアミラーゼ生産量を比較する と、 酵母での耐熱性アミラーゼの生産量が非常に小さい （図 1 、 TAA :麹菌由来ひ -アミラーゼ遺伝子、 AmyL H133I-A209V :バチルス · リチェ二ホルミス由来耐熱性 ひ -アミラーゼ遺伝子）。
その原因は異種タンパク質の発現においては、 異種細胞中での構造形成が困難 な場合が多く、 構造形成が不完全なこれらのタンパク質は宿主内で分解されるこ とが知られており （非特許文献 3 )、 高生産の妨げとなっていると考えられる。 ま た、 タンパク質の構造異常を管理している品質管理機構の働きにより、 異種タン パク質の生産が抑制されている可能性があるが、 この機構の詳細はほとんどわか つていない。 従って、 常温で効率よく耐熱性タンパク質を生産する技術が課題と なっている。
特許文献 1 特開平 6- 181779号公報
非特許文献.1 Phi l ippe Joyet, et al . , Hyperthermostable Variant of a Highly Thermostabl e Alpha- Amylase" BIO/TECHNOLOGY VOL 10 DECEMBER 1992 非特許文献 2 Cereghino, J. L. and Cregg, J. M. , "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastori s , EMS Mi crooiolol . Rev. 24， 45-66 (2000)
非特許文献 3 Hamrand, C. and Helenius, A. , "Qual ity control in the secretory pathway" Curr. Open. Cei l Biol. , 7, 523 - 529 (1995) 発明の開示
本発明は、 分泌型耐熱性酵素を高分泌生産できる、 分泌型耐熱性酵素をコード する DNAを形質転換し、 且つ特定の遺伝子が破壊又は発現抑制された酵母変異株 を提供することを目的とする。
本発明者らは、酵母における分泌型耐熱性酵素（バチルス 'リチェ二ホルミス由 来のひ -アミラーゼ変異体 H133I - A209V)の分泌について、 分泌生産を抑制する機 構を調査するために、 4792株の遺伝子破壊株に分泌型耐熱性酵素の遺伝子を形質 転換し、分泌活性を測定したところ、意外なことに、ある特定の遺伝子破壊株が、 天然の酵母に比較して分泌活性が高いことを見出し、 この知見に基づいて本発明 を完成するに至った。
本発明は、 以下を包含する。 ·
( 1 ) 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ下記の遺伝子又 はその相同遺伝子の 1以上が破壊又は発現抑制された酵母変異株。
遺伝子： ADE6、 ALG3, ALG5, ALG6, ALG8, ALG9, ALG10, ALG12, ASE1、 B0P1、 CAP1、 CLB4、 CSN9、 CWH41、 FL01、 GDS1、 GPA2、 HAP2、 HFM1、 HUB1、 IVY1、 IXR1、 KEX1、 MET12、 0ST5、 PMP3、 RMD6、 RVS167、 SET7、 SNT309、 SRF6、 SYC1、 T0S 1、 TRM1、 UBR2、 VIK1、 VTS 1、 YBL081W、 YGL242C、 YGR042W、 YGR054W、 YGR071C、 YIL039W、 YJL007C, YLR232W、 YLR407W
( 2 ) 上記酵母がサッカロミセス · セレピシェであることを特徴とする、 （1 ) 記載の酵母変異株。
( 3 )上記破壊又は発現抑制された遺伝子又はその相同遺伝子力 S、 ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10, ALG12, HFM1、 RMD6、 T0S1、 VTS1及び YIL039W力 ら成 る群より選択される 1以上の遺伝子又はその相同遺伝子であることを特徴とする、
( 1 ) 記載の酵母変異株。
( 4 ) 上記分泌型耐熱性酵素がバチルス · リチェ二ホルミス由来のアミラーゼ であることを特徴とする、 （1 ) 記載の酵母変異株。
( 5 ) 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ小胞体における タンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が破壊又は発現抑制された酵母変異 株。
( 6 ) 上記酵母がサッカロミセス ·セレビシェであることを特徴とする、 （5 ) 記載の酵母変異株。
( 7 )上記小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 CWH41及び 0ST5力 ら成る群より選択さ れる 1以上の遺伝子又はその相同遺伝子であることを特徴とする、（5 )記載の酵 母変異株。 ( 8 )上記小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10及び ALG12カゝら成る群より選択される 1以上の 遺伝子又はその相同遺伝子であることを特徴とする、 （7 ) 記載の酵母変異株。
( 9 ) 上記分泌型耐熱性酵素がバチルス ' リチェ二ホル'ミス由来のアミラーゼ であることを特徴とする、 （5 ) 記載の酵母変異株。
( 1 0 ) ( 1 ) 〜 （9 ) のいずれか 1記載の酵母変異株を培養する工程と、 前記酵母変異株の培養物又は培養上清から上記分泌型耐熱性酵素を単離するェ 程と、
を含む、 分泌型耐熱性酵素の生産方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-103275号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 TDH3 プロモーター下流にそれぞれ揷入した麹菌由来ひ -アミラーゼ遺 伝子 TAA とバチルス ' リチヱ二ホルミス由来耐熱性ひ -アミラーゼ遺伝子 AmyL-H133I-A209Vを持つ発現ベクターをサッカロミセス 'セレピシェに形質転換 した組換え酵母のアミラーゼ発現を示している。 ョゥ素デンプン反応を起こして いない白い部分 （ハ口） がアミラーゼ活性の大きさを示している。
図 2 Aは、 バチルス · リチェ-ホルミス由来の a -アミラーゼ変異体 H133I-A209Vの遺伝子 AmyL - H133I-A209Vをベクター p316TDH3pANに組換えた組換 え体 p316TDHAmyL- H133I-A209Vを図示している。
図 2 Bは、 p316TDHAmyL- H133I-A209V によって形質転換された、 サッカロミセ ス 'セレビシェ BY4743株における、 -アミラーゼ変異体 H133I- A209Vの発現を 示している。
図 3 Aは、サッカロミセス 'セレピシェの 4792種類の遺伝子破壌株に組換え体 p316TDHAmyL-H133I-A209Vを形質転換することを図示している。
図 3 Bは、 アミラーゼ活性検出試験を図示している。
図 4は、 4792種類のサッカロミセス 'セレビシェ遺伝子破壊株におけるバチル. ス'リチヱ二ホルミス由来 α -アミラーゼ変異体 H133I-A209Vの活性試験の測定結 果である。
図 5は、各遺伝子破壊株における α -アミラーゼ変異体 H133I- A209Vの分泌量を、 親株の分泌量を十とした場合の相対的な分泌量（+十、 + + +)で示す。
図 6は、 小胞体 （ER) での Ν結合型糖鎖付加タンパク質のグリコシル化プロセ スにおけるオリゴ糖の伸長 ·転移並びにサッカロミセス 'セレピシェにおけるこ れらの反応に関わる酵素をコードしている遺伝子を示している。 発明を実施するための最良の形態
本発明によれば、 酵母のある特定の遺伝子を破壊した株を作製し、 この株に分 泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 当該分泌型耐熱性酵素の細胞外 への分泌量を測定することによって、 分泌型耐熱性酵素を高分泌生産する株を選 択し、 これによつて本発明に係る酵母変異株を得ることができ、 並びに、 そのよ うな株を得るために破壌又は発現抑制すベき遺伝子を.同定できる。
サッカロミセス ·セレピシェには、約 6000個の遺伝子がある。 そのうち生存に とって必須な遺伝子約 1200個を除いた 4792個の遺伝子をそれぞれ破壊したサッ カロミセス ·セレピシェの 4792種類の遺伝子破壌株（4792 yeast deletion strains collection) 力 S EUR0SCARF、 Invitrogen及ぴ Open Biosystems力 ら販売されてレヽ る。
一方、 バチルス · リチヱ二ホルミス由来のひ -アミラーゼ変異体 H133I-A209V は、 熱安定性の高い分泌型耐熱性酵素として知られている（非特許文献 1 )。 この α -アミラーゼの遺伝子 AmyL - H133I-A209Vをベクター p316TDHpANに組換えた組換 え体 p316TDHAmyL-H133I-A209V (酵素遺伝子発現べクタ一）を図 2 Aに示す。 なお、 この組換え体を使用して形質転換した、サッカロミセス 'セレピシェ BY4743株を 培養し、 アミラーゼ活性を検出するこ とによ り、 -アミ ラーゼ変異体 H133I-A209Vの発現が確認された（図 2 B )。
そこで、具体的に、上述の 4792種類の遺伝子破壊株に酵素遺伝子発現ベクター p316TDHAmyL-H133I-A209V を、 図 3 Aに示す方法で形質転換する。 次いで、 図 3
Bに示すデンプン培地とョゥ素デンプン反応を用いた方法で、 アミラーゼ活性を 測定することにより、 アミラーゼ分泌量を測定する。 そして、 このうち、 ァミラ ーゼ分泌量が親株よりも高いものを同定し、 当該遺伝子破壊株で破壌されている 遺伝子を、 本発明に係る酵母変異株を得るために破壌又は発現抑制すべき対象遺 伝子として同定できる。
このようにして破壌又は発現抑制の対象遺伝子として同定された遺伝子を下記 の表 1に示す。 ■
本発明は、 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ表 1に示す 遺伝子又はその相同遺伝子の 1以上が破壊又は発現抑制された酵母変異株に関す る。 本発明に係る酵母変異株では、 形質転換された DNAからコードされる分泌型 耐熱性酵素の細胞外への分泌量が、陰性対照（分泌型耐熱性酵素をコードする DNA が形質転換されているが、 表 1に示す遺伝子又はその相同遺伝子が破壊又は発現 抑制されていない酵母）と比べて高い。
破壊又は発現抑制の対象となる遺伝子としては、サッカロミセス'セレピシェの 遺伝子名称（一般名/系統的名称、 ただし一般名がないものについては、 系統的名 称のみ示す）に従えば、表 1に示す ADE6/YGR061C、 ALG3/YBL082C、 ALG5/YPL227C, ALG6/YOR002W、 ALG8/Y0R067C、 ALG9/YNL219C、 ALG10/YGR227W、 ALG12/YNR030W, ASE1/Y0R058C、 B0P1/YPL221W、 CAP1/YKL007Wヽ CLB4/YLR210W、 CSN9/YDR179C、 CWH41/YGL027C, FL01/YAR050W、 GDS1/Y0R355W, GPA2/YER020W , HAP2/YGL237C , HFM1/YGL251C, HUB1/YNR032C- A、 IVY1/YDR229W、 IXR1/YKL032C, KEX1/YGL203C、 MET12/YPL023C, 0ST5/YGL226C- A、 PMP3/YDR276C, RMD6/YEL072W、 RVS167/YDR388W、 SET7/YDR257C, SNT309/YPR101W、 SRF6/YNL179C、 SYC1/Y0R179C、 T0S1/YBR162C、 TRM1/YDR120C、 UBR2/YLR024C, VIK1/YPL253C、 VTS1/Y0R359W、 YBL081W、 YGL242C、 YGR042W、 YGR054W、 YGR071C、 YIL039W、 YJL007C、 YLR232W及び YLR407Wから成る 群より選択される 1以上の遺伝子が挙げられる。また、これら遺伝子の分子機能、 生物学的作用及び局在を表 1に示す。 なお、 これら遺伝子の遺伝子配列、 ァミノ 酸配列及びその他の情報については、 例えば、 Saccharomyces Genome
Database (http : //www. yeastgenorae. org/)力、り得ることがでさる。
特に、 ALG3 (RHK1)、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10 (DIE2)、 ALG12 (ECM39)、 HFM1、
RMD6、 T0S1、 VTS1及び YIL039Wから成る群より選択される 1以上の遺伝子又はそ の相同遺伝子が破壊又は発現抑制された酵母は、 形質転換された DNAからコード される分泌型耐熱性酵素の細胞外への分泌量が、 陰性対照と比べて非常に高い。 さらに、 破壊又は発現抑制の対象となる遺伝子としては、 小胞体におけるタン パク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が挙げられる。 ここで、 小胞体における タンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子とは、 小胞体での N結合型糖鎖付加 タンパク質のダリコシル化プロセスにおけるオリゴ糖の伸長及び転移に関与する 酵素やタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
このような小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子として は、 例えば、 上述のサッカロミセス ' セレピシェの遺伝子のうちの ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10, ALG12、 CWH41及び 0ST5から成る群より選択される 1 以上の遺伝子又はその相同遺伝子が挙げられる。特に、 ALG3、 ALG5、.ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10及び ALG12から成る群より選択される 1以上の遺伝子又はその相同 遺伝子を破壊又は発現抑制した酵母変異株では、 形質転換された DNAからコード される分泌型耐熱性酵素の細胞外への分泌量が陰性対照と比べて非常に高い。 ここで、 相同遺伝子とは、 形質転換すべき酵母がサッカロミセス ' セレビシェ 以外の酵母である場合に、 当該酵母における上述したサッカロミセス ' セレビシ ェの遺伝子からコードされるタンパク質と同様の活性又は機能を有するタンパク 質をコードする遺伝子を意味する。
一方、分泌型耐熱性酵素とは、細胞外へ分泌され、且つ高温（例えば、 55°C〜95°C) 下でもタンパク質の 3次構造が壌れにくく、酵素活性を保持する酵素を意味する。 本発明において、 形質転換の対象となる分泌型耐熱性酵素をコードする DNAとし ては、 いずれの分泌型耐熱性酵素をコードする DNAであってもよく、 形質転換す べき酵母に対して同種、 異種のいずれであってもよい。 また、 当該 DNAからコー ドされる分泌型耐熱性酵素は、 非分泌型耐熱性酵素に既知の分泌シグナルべプチ ドを機能的に連結した融合タンパク質であってもよい。 形質転換の対象となる分 泌型耐熱性酵素をコードする DNAとしては、 例えば、 バチルス · リチェニホルミ ス由来のアミラーゼ（例えば、上述のひ-アミラーゼ変異体 H133I-A209V等）、バチ ルス ·ステァロサーモフィラス (Bacillus stearothermophi lus)由来のァラニンデ ヒ ド ロゲナーゼ、 サーモ コ ッ カ ス · コ ダカ ラ ェ ン シス (Thermococcus kodakaraensis)由来の DNA ポリ メラーゼ及ぴパイ ロコッカス · ホリ コシ (Pyrococcus horikoshi i)由来のセノレラ——ゼをコードする DNA力挙け、ら 3 る。 本発明において、 宿主となる酵母は、 いずれの種類の酵母であってもよいが、 例えば、 サッカ ロ ミセス ' セレピシェ、 シゾサッカ ロ ミセス ' ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) Λ ヒキノ ·ハス卜ジス (Pi chia pastoris) 及びク ルイベロミセス · ラクテイス (Kluyverorayc.es lact i s) が挙げられる。
以下に、 本発明に係る酵母変異株の作製方法を説明する。
(1) 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAの形質転換
本発明に係る酵母変異株の作製では、 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを宿 主酵母に形質転換する。 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAは、 分泌型耐熱性酵 素をコードする遺伝子を含む DNA断片や適当なベクターに分泌型耐熱性酵素をコ 一ドする遺伝子が揷入された発現ベクターであってよい。 分泌型耐熱性酵素をコ 一ドする遺伝子を挿入するためのベクターは、 宿主酵母中で複製可能なものであ れば特に限定されず、 例えばプラスミ ド、 シャトルベクター、 ヘルパープラスミ ドなどが挙げられる。 また該ベクター自体に複製能がない場合には、 宿主酵母の 染色体に挿入することなどによって複製可能となる DNA断片であってもよい。 ベクターに分泌型耐熱性酵素をコードする遺伝子を挿入するには、 先ず、 精製 された分泌型耐熱性酵素をコードする遺伝子を含む DNA断片を適当な制限酵素で 切断し、 適当なベクター DNA の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに揷 入してベクターに連結する方法などが採用される。 またべクターと分泌型耐熱性 酵素をコードする遺伝子を含む DNA断片とのそれぞれ一部に相同な領域を持たせ ることにより、 PCRなどを用いた in vitro法又は in vivo法によって両者を連結 する方法であってもよい。 ·
宿主酵母への分泌型耐熱性酵素をコードする DNAの導入方法は、 酵母に DNAを 導入する方法であれば特に限定されず、 例えば電気穿孔法 （エレク ト口ポレーシ ヨン法）、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法等が挙げられる。
(2) 宿主酵母の遺伝子の破壊又は発現抑制
本発明に係る酵母変異株の作製では、 宿主酵母において、 上述した破壊又は発 現抑制の対象遺伝子を破壊又は発現抑制する。.ここで、 遺伝子破壊とは、 宿主酵 母に内在する遺伝子に変異を導入し、 当該遺伝子を破壊又は欠損させることで、 当該遺伝子からコードされるタンパク質が生産されないか又は生産されたタンパ ク質が機能を持たないことを意味する。 このような遺伝子破壊がなされた既存の 酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子欠損株をそのまま宿主として使用することができ、 例えば、 上述したサッカロ ミセス · セレビシェの遺伝子破壊株（EUR0SCARF、 Invitrogen及び Open Biosystems製）が挙げられる。 また、 遺伝子破壊方法とし ては、 例えば、 UVや EMS等の変異処理法、 相同組換えによる遺伝子置換法、 トラ ンスポゾンを利用した遺伝子破壊等が挙げられる。
一方、 発現抑制とは、 宿主酵母に内在する遺伝子の転写又は翻訳レベルでの抑 制、 あるいは当該遺伝子から発現されたタンパク質の活性又は機能の抑制を意味 する。 このような発現抑制により、 宿主酵母において、 対象遺伝子からコードさ れるタンパク質の活性又は機能を抑制することができる。
遺伝子の転写レベルでの抑制方法としては、 例えば、 対象遺伝子を制御するプ 口モーターの置換や変異、 RNAの不安定化、 コピー数の減少（二倍体における、 対 象遺伝子の一方の対立遺伝子の破壊）等が挙げられる。
遺伝子の翻訳レベルでの抑制方法としては、 例えば、 アンチセンス RNAを用い る方法が挙げられる。対象遺伝子の mRNAに対するアンチセンス RNAを転写する遺 伝子を、 宿主酵母ゲノムに組み込み、 当該アンチセンス RNAを過剰発現させるこ とで、 対象遺伝子の mRNAの翻訳が抑制される。
また、 対象遺伝子からコードされるタンパク質の活性又は機能の抑制方法とし ては、 例えば、 これらタンパク質に対する抗体を用いた方法が挙げられる。 酵母 宿主を、 このような抗体存在下で培養することで、 対象遺伝子からコードされる タンパク質に抗体が結合することで、 当該タンパク質の活性又は機能を抑制でき る。
このように、 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAの形質転換と宿主酵母の遺伝 子の破壌又は発現抑制とを行うことで、 本発明に係る酵母変異株を得ることがで きる。
本発明に係る酵母変異株では、 形質転換した DNAからコードされる分泌型耐熱 性酵素が高分泌生産される。
そこで、 本発明に係る酵母変異株を培養し、 培養後、 酵母変異株の培養物又は 培養上清から分泌型耐熱性酵素を単離することで、 分泌型耐熱性酵素を高収率で 得ることができる。
酵母変異株を培養する培地や培養条件は、 特に限定されず、 使用した宿主酵母 の種類に応じて適宜選択すればよい。
培養後、 酵母変異株の培養物をそのまま使用するか又は遠心分離等により酵母 変異株を除去し、 培養上清とする。 その後、 有機溶媒による抽出等により培養物 又は培養上清から分泌型耐熱性酵素を採取し、 必要に応じてさらに各種クロマト グラフィ一等を用いて単離精製することができる。
あるいは、 培養後、 酵母変異株の培養物又は培養上清をそのまま使用してもよ レ、。
このように、 本発明に係る酵母変異株を用いれば、 常温程度の温度下で分泌型 耐熱性酵素を高収率で分泌生産することができる。
実施例
(1) 組換え体 p316TDHAmyL- H133I- A209Vの構築
図 2 Aに示すように、 サッカロミセス ·セレビシェにおいて、 バチノレス · リチ ェェホルミス由来ひ -ァミラーゼ（AmyL)変異体 H133I - A209Vを発現させるための、 組換え体 p316TDHAmyL - H133I-A209V (発現ベクター）を構築した。
AmyL-H133I-A209V cDNA断片を、 両端にそれぞれ Asclサイ トと Notlサイトを 有するように、 PCRによって製造した。
次いで、 AmyL - H133I- A209V cDNA断片を、 Ascl及び Notlによって消ィ匕し、 同様 に消化されたベクター p316TDH3pANにクローン化した。
(2) ひ -アミラーゼ変異体 H133I - A209Vの発現
上記（1)の組換え体 p316TDHAmyL- H133I- A209Vを使用して、サッカロミセス ·セ レビシェ BY4743株を形質転換した後、 培養した。 次いで、 培養後、 図 3 Bに示す デンプン培地とョゥ素デンプン反応を用いた方法により、 アミラーゼ活性を検出 することにより、 ひ -アミラーゼ変異体 H133I - A209V の発現（培養上清への分泌） を確認した （図 2 B参照）。
(3) 組換え体 p316TDHAmyい H133I-A209Vの遺伝子破壊株への形質転換
サッカロミセス 'セレピシェには、約6000個の遺伝子がある。 そのうち生存に とって必須な遺伝子約 1200個を除いた 4792個の各遺伝子をそれぞれ破壊した、 4792株の遺伝子破壌株 (4792 yeast deletion strains collection)が EUR0SCARF、 Invitrogen及び Open Biosystems力 ら販売されて ヽる。
図 3 Aに示すように、 上記（1)で作製したバチルス ' リチェ二ホルミス由来 α - ァミラーゼ変異体 H133I- A209V発現ベクター p316TDHAmyL- H133I- A209Vを、 上記 4792種類の遺伝子破壊株に形質転換した。
具体的には、 各遺伝子破壊株を、 の培地を分注した 96穴ミクロタイター ゥェルで 28°C、 24時間静置培養した。 静置培養後、培養液を、 発現ベクターを含 む 25 の遺伝子導入液と混合し、 42°Cで 2時間処理した。 次いで、 この混合液 を選択培地にまき、 28°Cで 48から 72時間培養することで、 形質転換体を得た。
(4) アミラーゼ活性試験
図 3 Bは、 アミラーゼ活性試験を図示している。
上記（3)で得られた形質転換体を、 28°C、 pH6. 0で、 ゥラシルを含まない合成培 地で培養し、 得られた培養液を 1 %デンプンを含む選択培地 （ρΗ6· 0) に植菌し、 28°C、 24時間静置培養後、 ヨウ素デンプン反応により生じたハ口によりアミラー ゼ活性を検出した。
(5) アミラーゼ活性試験結果
図 4は、 上記（4)の 4792株のサッカロミセス 'セレビシェ遺伝子破壊株におけ るバチルス，リチェ二ホルミス由来 -アミラーゼ変異体 H133I- A209Vの活性試験 の測定結果を示している。 図 4には、 96穴ミクロタイターゥエルが 54枚示され ている。 各 1穴がサッカロミセス ·セレビシェ遺伝子破壊株 1株毎のアミラーゼ 活性試験結果に対応している。
(6) 高分泌生産株
上記（5)のアミラーゼ活性試験の結果、 バチルス · リチェ二ホルミス由来ひ -ァ ミラーゼ変異体 H133I-A209Vを高分泌生産する、 46種類の形質転換体である遺伝 子破壊株を得た。 それぞれの遺伝子破壊株（破壊遺伝子名で表記）と親株のアミラ ーゼ活性試験の結果を図 5に示す。図 5では、各遺伝子破壊株におけるひ-アミラ ーゼ変異体 H133I- A209Vの分泌量を、 親株の分泌量を +とした場合の相対的な分 泌量（ + +、 + + +)で示す。 また、 下記の表 1には、 図 5に示す遺伝子破壌株の 破壊遺伝子（又はそれにコードされるタンパク質）の一般名及び系統的名称、 並び にその遺伝子からコードされるタンパク質の分子機能、 生物学的作用及びその細 胞内の局在を示す。
図 5に示されたように、 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且 つ以下の遺伝子： ADE6、 ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 ASE1、 B0P1、 CAP1、 CLB4、 CSN9、 CWH41、 FL01、 GDS1、 GPA2、 HAP2、 HFM1、 HUB1、 IVY1、 IXR1、 KEX1、 MET12、 0ST5、 PMP3、 RMD6、 RVS167、 SET7、 SNT309、 SRF6、 SYC1、 T0S 1、 TRM1、 UBR2、 VIK1、 VTS1、 YBL081W, YGL242C, YGR042W, YGR054W, YGR071C、 YIL039W, YJL007 YLR232W及び YLR407Wのうち 1つを破壊したサッカロミセス 'セレビシ ェは、 親株と比べて、 分泌型耐熱性酵素を特に強力に高分泌生産した。 特に、 分 泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 RMD6、 TOS 1、 VTS1及び YIL039Wから成る群の遺伝子が破壊 された遺伝子破壊株は、 親株と比べて著しく高い活性（+ + +)、 すなわち著しく 高い分泌量を有することが理解される。
—方、 図 6は、 小胞体での N結合型糖鎖付加タンパク質のグリコシル化プロセ スにおけるオリゴ糖の伸長 ·転移並びにサッカロミセス ' セレピシェにおけるこ れらの反応に関わる酵素をコードしている遺伝子を示している。 図 6において、 白抜きで示した遺伝子は、ひ-アミラーゼ変異体 H133I-A209Vを高分泌生産した上 記遺伝子破壊株の破壊遺伝子に対応する。 また、 必須遺伝子には下線を付した。 図 5に示す遺伝子破壊株の破壌遺伝子のうち、 ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 CWH41及び 0ST5の 9個の遺伝子は、 小胞体におけるタンパク質 N 結合型糖鎖付加に関わる遺伝子であった（表 1及び図 6 )。 この 9個のうち 7個の ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10及ぴ ALG12を破壊した遺伝子破壊株は、 形質転換された DNA からコードされる分泌型耐熱性酵素を著しく高分泌生産（+ + +)した。このような結果から、サッカロミセス 'セレビシェを含めた酵母では、 小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した酵母変異 株は、 形質転換される DNAからコードされる分泌型耐熱性酵素を高分泌生産する ことが期待できる。 表 1
一般名 系統的名称 分子機能 生物学的作用 局在
ADE6 YGR061 C ホスホリボシルフオルミル プリン生合成 細胞質
グリシンアミジン合成活
性
ALG3 YBL082C - 1 ,3-マンノシル卜ラン ドリコール結合糖鎖合 小胞体
スフエラ一ゼ活性 成、タンパク質糖鎖修飾
ALG5 YPL227C ドリコールリン酸一糖転 N-結合型糖鎖 小胞体膜
移活性
ALG6 YOR002W へキソシル基転移酵素 ドリコール結合多糖生合 小胞体
活性 成、タンパク質糖鎖修飾
ALG8 YOR067C 多糖転移活性 ドリコール結合多糖生合 小胞体膜
成、多糖一脂質中間体
形成
ALG9 YNL21 9C マンノシルトランスフェラ ドリコール結合糖鎖合 小胞体
—ゼ活性 成、タンパク質糖鎖修飾
ALG10 YGR227W ドリコールリン酸グルコ一 N結合型糖鎖合成 小胞体膜
スー糖脂質糖転移活性
ALG12 YNR030W - 1 ,6 -マンノシルトラン ドリコール結合糖鎖合 小胞体
スフ Iラーゼ活性 成、タンパク質糖鎖修飾
ASE1 YOR058C 微小管結合 紡錘糸形成 核微小管、紡錘体微 小管
BOP1 YPL221 W 不明 不明 芽のくびれ、液胞
CAP/ Y L007W タンパク質結合 ァクチンフィラメント制御 F-ァクチンキヤッピン グタンパク質複合体
CLB4 YLR210W サイクリン依存型タンパ 細胞周期 G2/M遷移、細 核
ク質リン酸化酵素調整因 胞周期 S期
子
CSN9 YDR1 79C 不明 フェロモン応答 シグナロソーム複合 体
GWH41 YGL027C マンノシル多糖ダルコシ 細胞壁合成，制御 小胞体膜
ダーゼ活性
FL01 YAR050W マンノース結合 凝集 細胞壁
GDS1 YOR355W 不明 好気呼吸 細胞質、ミトコンドリ ァ、核
GPA2 YER020W GTPase活性 細胞の成長■維持、擬菌 Ξ卜コンド、リア
糸、シグナル伝達、胞子
形成
HAP2 YGL237C 転写活性化活性 炭化水素代謝制御 CCAAT 結合因子複 合体 HFM1 YGL251 C DNAヘリカーゼ活性 DNA巻き戻し 核
HUB1 YNR032C-A タンパク質結合 接合時の形態形成 シュム一先端
IVY1 YDR229W リン脂質結合 分泌経路 液胞膜
IXR1 YKL032C DNA結合 DNA修復 核染色体
KEX1 YGL203C カルボキシぺプチダ一ゼ タンパク質プロセッシング ゴルジ体トランス面 D活性
MET12 YPL023C メチレンテトラヒドロフォレ メチォニン代謝 細胞
イト還元活性
OST5 YGL226C-A ドリコ一ルリン酸多糖ータ N結合型糖鎖 多糖転移酵素複合
ンパク質 糖転移活性 体
PMP3 YDR276C 不明 陽イオン輸送 細胞膜
RMD6 YEL072W 不明 不明 不明
RVS167 YDR388W 細胞骨格タンパク質結合 エンドサイト一シス、出 ァクチンパッチ
芽、浸透圧応答
SET7 YDR257G 不明 不明 核
SNT309 YPR101 W 不明 mRNAスプライシング スプライォソーム複 合体
SRF6 YNL179C 不明 不明 不明
SYC1 YOR179C 不明 転写終結 mRNA 切断'ポリ A
付加複合体
TOS1 YBR162C 不明 不明 細胞壁、液胞
TRM1 YDR120C tRNA (グァニン— N2-) -メ tRNAメチル化 ミ卜コンド、リア、核外
チル転移酵素 膜
UBR2 YLR024C ュビキチン一タンパク質 タンパク質ュビキチン化 細胞質
リガ一ゼ活性
VIK1 YPL253C 微小管モーター活性 微小管関連機能 キネシン複合体、中
心体
VTS1 YOR359W RNA 結合性細胞内輸送 タンパク質の液胞への輸 細胞質
活性 送
YBL081 W 不明 不明 不明
YGL242C 不明 不明 不明
YGR042W 不明 不明 細胞質、核
YGR054W 翻訳開始因子活性 翻訳開始 細胞質リボソーム
YGR071 C 不明 不明 核
YIL039W 不明 不明 小胞体
YJL007C 不明 不明 不明
YLR232W 不明 不明 不明
YLR407W 不明 不明 不明 産業上の利用可能性
本発明によれば、 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ以下 の遺伝子： ADE6、 ALG3、 ALG5、 Aし G6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 ASE1、 B0P1、 CAP1、 CLB4、 CSN9、 CWH41、 FL01、 GDS1、 GPA2、 HAP2、 HFM1、 HUB1、 IVY1、 IXR1、 KEX1、 MET12、 0ST5、 PMP3、 RMD6、 RVS167, SET7、 SNT309, SRF6、 SYC1、 T0S1、 TRM1、 UBR2、 VIK1、 VTS1、 YBL081W、 YGL242C, YGR042W、 YGR054W、 YGR071 YIL039W、 YJL007C、 YLR232W及ぴ YLR407Wから成る群より選択される遺伝子又はその相同遺 伝子の 1以上が破壊又は発現抑制された酵母変異株が提供される。 本発明に係る 酵母変異株を用いれば、 形質転換された DNAよりコードされる分泌型耐熱性酵素 を高分泌生産することができる。
また、 同様に、 小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が 破壊又は発現抑制された本発明に係る酵母変異株を用いることで、 形質転換され た DNAからコードされる分泌型耐熱性酵素を高分泌生産することができる。
本発明に係る酵母変異株は、 種々の分泌型耐熱性酵素を生産することが可能で あるが、 とりわけ、 分泌型耐熱性アミラーゼを効率よく分泌生産し得るものであ る。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ下記の遺伝子又 はその相同遺伝子の 1以上が破壊又は発現抑制された酵母変異株。
遺伝子： ADE6、 ALG3, ALG5、 ALG6 ALG8, ALG9, ALG10, ALG12, ASE1、 B0P1、 CAP1、 CLB4、 CSN9、 CWH41、 FL01、 GDS1、 GPA2、 HAP2、 HFM1、 HUB1、 IVY1、 IXR1、 KEX1、 MET12、 0ST5、 PMP3、漏 6、 RVS167、 SET7、 SNT309、 SRF6、 SYC1、 T0S1、 TRM1、羅 2、 VIK1、 VTS1、 YBL081Wヽ YGL242C, YGR042W, YGR054Wヽ YGR071C、 YIL039Wヽ YJL007C、 YLR232Wヽ YLR407W
2 . 上記酵母力 Sサッカロミセス · セレビシェ (Saccharomyces cerevi siae)で あることを特徴とする、 請求項 1記載の酵母変異株。
3 . 上記破壊又は発現抑制された遺伝子又はその相同遺伝子が、 ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 HFM1、 RMD6、 T0S1、 VTS1及び YIL039Wから成 る群より選択される 1以上の遺伝子又はその相同遺伝子であることを特徴とする、 請求項 1記載の酵母変異株。
4 . 上記分泌型耐熱性酵素がバチルス · リチェ二ホルミス （Bacillus l ichen ormis)由来のアミラーゼであることを特徴とする、 請求項 1記載の酵母 変異株。
5 . 分泌型耐熱性酵素をコードする DNAを形質転換し、 且つ小胞体における タンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が破壊又は発現抑制された酵母変異 株。
6 . 上記酵母力 Sサッカロミセス · セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)で あることを特徴とする、 請求項 5記載の酵母変異株。
7 · 上記小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が ALG3、 ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10、 ALG12、 CWH41及び 0ST5から成る群より選択さ れる 1以上の遺伝子又はその相同遺伝子であることを特徴とする、 請求項 5記載 の酵母変異株。
8 . 上記小胞体におけるタンパク質 N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子が ALG3、
ALG5、 ALG6、 ALG8、 ALG9、 ALG10及ぴ ALG12から成る群より選択される 1以上の 遺伝子又はその相同遺伝子であることを特徴とする、請求項 7記載の酵母変異株。
9 . 上記分泌型耐熱性酵素がバチルス ' リチェ二ホルミ ス （Bacillus licheni formi s)由来のアミラーゼであることを特徴とする、 請求項 5記載の酵母 変異株。
1 0. 請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の酵母変異株を培養する工程と、 前記酵母変異株の培養物又は培養上清から上記分泌型耐熱性酵素を単離するェ 程と、
を含む、 分泌型耐熱性酵素の生産方法。
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