JP2006280253A - 耐熱性酵素を高生産できる酵母変異株 - Google Patents
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Abstract
【課題】耐熱酵素を高生産する形質転換酵母株の提供。
【解決手段】耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換し、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊したサッカロミセスセレビシエ。この遺伝子は、ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407Wの1又は2以上であり、この破壊酵母は耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【選択図】図2
【解決手段】耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換し、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊したサッカロミセスセレビシエ。この遺伝子は、ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407Wの1又は2以上であり、この破壊酵母は耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【選択図】図2
Description
本発明は、耐熱性酵素を高生産できる、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、酵母変異株に関する。
耐熱性酵素とは、タンパク質の3次構造(立体構造)が高温でも壊れにくく、酵素活性を保持している酵素をいう。工業的に使用される酵素は、物理的に、化学的に、高い安定性が要求され、特に耐熱性酵素が好んで使用される。これは、酵素のかかわる多くの反応は、高温で行えるほうが好ましいからである。つまり、55℃〜95℃の如き高温下での処理が可能になり、基質の溶解度が増加し、溶媒粘度が減少し、触媒作用が加速され、さらに食品や医薬品の製造過程においては細菌混入のリスクが低下するからである。高温でのこれらのメリットを生かすため、種々の耐熱性酵素が求められている。
好熱菌の生体成分である酵素、核酸、膜、リボソームなどが熱安定性である。これらの菌から得られる耐熱性酵素は、医学・工学など広い分野で利用されている。たとえば、遺伝子DNAを試験管内で大量に増やす方法として近年、開発されたPCR法(Po1ymerase chain reaction)では、使用する酵素を大腸菌のDNAポリメラーゼからサーマス菌のDNAポリメラーゼ(Taq酵素)に切りかえたことにより、加熱を繰り返すたびに新たに酵素を加える必要がなくなり、自動化が可能になって、非常に広範な分野で用いられるようになった。
好熱性細菌(thermophilic bacteria,thermophile,Ca1doactive bacteria)とは、通常55℃以上で生育できる細菌の総称で、温泉や火山、あるいは海底の熱水の噴出口付近などから採取される。代表的なものにバチルス(Bacil1us)属、サーマス(Thermus)属がある。バチルス(Bacillus)属由来の酵素は高い耐熱性を示すことから、現在産業的にしようされる酵素の主流を占めている。
その一つ、バチルスリチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼは、バイオテクノロジーの反応で使用される天然の酵素の中でもっとも熱安定性が高いもののひとつであり、90℃以上の温度で工業的にでんぷん加水分解を行うことも可能とされている(非特許文献1)。
これらの耐熱性酵素を産業上利用するためには多量に生産する手段が必要であり、好熱性菌を培養することが考えられる。しかしながら、これらの好熱細菌からの耐熱性酵素の取得には高温での微生物培養操作を要するため、さらには一般に好熱性菌の酵素生産速度が大きくないことなどから、工業的な酵素製造方法としては問題を有している。そこで常温程度の温度で生育でき、しかも高い酵素生産速度を示す宿主を用いた組換え体での生産が望まれる。
組換えDNA技術による酵素生産の宿主としては、一般にサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が広く用いられており、1978年以来これに内在するプラスミドやDNA複製開始点(ars)や、誘導的あるいは恒常的高発現プロモーターなどを用いたベクターが開発されている。これにより酵母菌は、宿主にとって本質的に異種のタンパク質を遺伝子操作により、細胞培養培地中に分離する有用なタンパク質生産物として得ることができる(特許文献1)。
酵母の宿主−ベクター系は、酵母が真核生物であることにより、動物や植物の遺伝子の発現が大腸菌や枯草菌のような原核生物よりも効率がよい可能性がある。また、原核生物のように発熱性の毒素を持たないという利点もある。分泌に際してタンパク質をグリコシル化する能力もある。そして、古くから発酵工業に使われており、安全性の高いことが認められている。これまでにインターフェロン(αおよびγ)、B型肝炎ワクチン、キモシンなどのタンパク質の生産にも用いられている。また、遺伝子産物の生産量を上げるために、生産されたタンパク質を細胞外に分泌する分泌ベクターも開発され、ヒト・インスリン、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子やインターロイキン2などが分泌生産されるようになった。
しかしながら、酵母に限らず、組換え体による異種タンパク質生産では必ずしも異種タンパク質の高生産が実現されているわけではない。例えば、同種の宿主−ベクター系を用いても、生産されるタンパク質量は大きく異なり(非特許文献2)、組換えタンパク質は宿主内で発現抑制を受けていると考えられる。
バチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)由来耐熱性アミラーゼと麹菌由来α−アミラーゼはそれらのcDNAが共にクローニングされている。これらをそれぞれ同じベクターに導入し酵母S.cerevisiaeで発現させてアミラーゼ生産量を比較すると、酵母での耐熱性アミラーゼの生産量が非常に小さい(図1)。
その原因は異種たんぱく質の発現においては、異種細胞中での構造形成の困難な場合が多く、構造形成が不完全なこれらのタンパク質は宿主内で分解されることが知られており(非特許文献3)、高生産の妨げとなっていると考えられる。また、タンパク質の構造異常を管理している品質管理機構の働きにより、異種タンパク質の生産が抑制されている可能性があるが、この機構の詳細はほとんどわかっていない。従って、常温で効率よく耐熱性タンパク質を生産する技術が課題となっている。
特開平6−181779号公報
Philippe Joyet,et al,"Hyperthermostable Variant of a Highly Thermostable Alpha‐Amylase"BIO/TECHNOLOGY VOL10 DECEMBER 1992
Cereghino,J.L.and Cregg,J.M.,"Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris",FEMS Microbiolol.Rev.24,45‐66(2000)
Hammnd,C.and Helenius,A.,"Quality control in the secretory pathway"Curr.Open.Cell Biol.,7,523‐529(1995)
本発明は、耐熱性酵素を高生産できる、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、酵母変異株を提供することを目的とする。
本発明者は、酵母における耐熱性酵素の分泌について、品質管理機構を調査するために、4792株の遺伝子破壊株に耐熱酵素の遺伝子を形質転換し、分泌活性を測定した。意外なことに、ある特定の遺伝子破壊株が、天然の酵母に比較して分泌活性が高かったことを見出し、この発見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、下記のタンパク質遺伝子の1つ又は2以上が破壊された、酵母、特にサッカロミセスセレビシエ、に関する。このタンパク質遺伝子とは、ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407Wの群れからなる遺伝子の1又は2以上、である。この破壊株は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
なかでも、VTS1,ALG8,DIE2,ECM39,IXR1,YILO39W,ALG9,ALG5,HFM1,RHK1及びALG6よりなるタンパク質遺伝子群の中の少なくとも1種が破壊された酵母は、活性が高い特徴を有する。
また、本発明は、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した、酵母、に関する。この破壊酵母は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。この遺伝子を破壊した酵母に使用できる酵母としては、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母も使用できる。サッカロミセスセレビシエ以外の酵母としてはシゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、クルイベロミセスラクティス(Kluyveromyces lactis)がある。
サッカロミセスセレビシエなどの酵母には、約6000個の遺伝子がある。そのうち生存にとって必須な遺伝子約1200個を除いた4792個の遺伝子を1つ宛破壊した、4792種類の遺伝子破壊株(4792 yeast deletion strains)が販売されている。
バチルスリチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼの変異体H133I−A209Vは、熱安定性の高い耐熱性酵素として知られており、本明細書では耐熱性酵素の例としてこれを使用する場合を例として説明する。このα−アミラーゼの遺伝子AmyL‐H133I−A209VをベクターP316TDHpANに組換えた組換え体p316TDHAmyL‐H133I−A209Vを図2Aに示す。
この組換え体を使用して形質転換した、サッカロミセスセレビシエ(S.cervisiae)BY4743株を培養し、アミラーゼ活性を検出することにより、α−アミラーゼの変異体H133I−A209Vの発現を確認した。この確認工程を図2Bに示す。
4792個の各遺伝子を破壊した、4792株のサッカロミセスセレビシエに、酵素遺伝子発現ベクターp316TDHAmyL‐H133I−A209Vを、図3Aに示す方法で、形質転換した。
図3Bに示す方法で、アミラーゼ活性を測定することにより、アミラーゼ発現量を測定した。図4は、4792株全部の測定結果を図示するものであり、96穴ミクロタイターウェルが54枚示されている。その1穴が1株の試験に対応している。
このうち、アミラーゼ発現量が親株よりも高いものを図5に示す。図5には、形質転換破壊株を、破壊遺伝子名で示されている。アミラーゼ発現量は、親株の発現量を+としたときの相対的な発現量++、+++で示される。
図5に示されたように、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407Wの群れからなる遺伝子の1又は2以上のタンパク質遺伝子の1又は2以上を破壊した、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
なかでも、ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,RMD6,TOS1,VTS1,及びYILO39Wの群から選ばれる少なくとも1種のタンパク質遺伝子を破壊されたものは、著しく高い活性を有することが理解される。
図6は、小胞体でのN結合型糖鎖付加タンパク質のグリコシル化プロセスにおけるオリゴ糖の伸長・転移、および、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)のこれらの反応にかかわる酵素をコードしている遺伝子を示している。
図5の高生産の株の破壊遺伝子のうち、ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,YIL039W,CWH41,OST5の10個は、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子であり、この10個のうち8個のALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,YIL039Wは、著しく高生産(+++)である。このような結果は、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母でも、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した株は、耐熱性酵素を高生産する。
すなわち、本発明においては、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母としては、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、クルイベロミセスラクティス(Kluyveromyces lactis)等が使用できる。
図5に示されたように、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407Wの群れからなる遺伝子の1又は2以上のタンパク質遺伝子の1又は2以上を破壊した、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
また、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子破壊酵母に、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した酵母は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
本発明による酵母変異株は、種々の耐熱性酵素を生産することが可能であるが、とりわけ、耐熱性アミラーゼを効率よく生産し得るものである。
組換え体p316TDHAmyL‐H133I−A209Vの構築
図2Aに示すように、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)において、バチルスリチェニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼAmyL H133I−A209Vを発現させるための、組換え体p316TDHAmyL‐H133I−A209Vを構築した。
図2Aに示すように、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)において、バチルスリチェニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼAmyL H133I−A209Vを発現させるための、組換え体p316TDHAmyL‐H133I−A209Vを構築した。
AmyL‐H133I−A209V cDNA断片は、両端にAscIサイトとNotIサイトを有し、PCRにより製造される。
AmyL‐H133I−A209V cDNA断片は、AscI及びNotIにより消化され、同様に消化されたベクターp316TDH3pANにクローン化される。
AmyLH133I−A209Vの発現
この組換え体を使用して形質転換した、サッカロミセスセレビシエ(S.cervisiae)BY4743株を培養し、アミラーゼ活性を検出することにより、α−アミラーゼの変異体H133I−A209Vの発現を確認した(図2B参照)。
形質転換
サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)には、約6000個の遺伝子がある。そのうち生存にとって必須な遺伝子約1200個を除いた4792個の遺伝子を破壊した、4792株の遺伝子破壊株(4792 yeast deletion strains)が販売されている。
AmyLH133I−A209Vの発現
この組換え体を使用して形質転換した、サッカロミセスセレビシエ(S.cervisiae)BY4743株を培養し、アミラーゼ活性を検出することにより、α−アミラーゼの変異体H133I−A209Vの発現を確認した(図2B参照)。
形質転換
サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)には、約6000個の遺伝子がある。そのうち生存にとって必須な遺伝子約1200個を除いた4792個の遺伝子を破壊した、4792株の遺伝子破壊株(4792 yeast deletion strains)が販売されている。
図3Aに示すように、バチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ発現ベクターp316TDHAmyL‐H133I−A209Vを4792破壊株に形質転換した。
具体的には、遺伝子破壊株を25μLの培地を分注した96穴ミクロタイターウェルで28℃、24時間静置培養した。培養液に発現ベクターを含む25μLの遺伝子導入液と混合し、42℃で2時間処理をした。これを選択培地にまき48から72時間培養して形質転換体を得た。
アミラーゼ活性試験
図3Bは、アミラーゼ活性試験を図示している。
図3Bは、アミラーゼ活性試験を図示している。
得られた形質転換体を、28℃、pH6.0で、ウラシルを含まない合成培地で培養し、培養液を1%デンプンを含む選択培地(pH6.0)に植菌し、28℃、24時間静置培養後、ヨウ素デンプン反応により生じたハロによりアミラーゼ活性を検出した。
アミラーゼ活性試験結果
図4は、4792株の酵母破壊株のバチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼ活性試験を示している。図4には、96穴ミクロタイターウェルが54枚示されている。その1穴が1株のアミラーゼ活性試験に対応している。
図4は、4792株の酵母破壊株のバチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼ活性試験を示している。図4には、96穴ミクロタイターウェルが54枚示されている。その1穴が1株のアミラーゼ活性試験に対応している。
高分泌生産株
このアミラーゼ活性試験の結果、バチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼを高分泌生産する、45の破壊株をえた。破壊遺伝子名と、それぞれの破壊株と親株のアミラーゼ活性試験の結果を図5に示す。
このアミラーゼ活性試験の結果、バチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼを高分泌生産する、45の破壊株をえた。破壊遺伝子名と、それぞれの破壊株と親株のアミラーゼ活性試験の結果を図5に示す。
図5に示されたように、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407Wの群れからなる遺伝子の1又は2以上のタンパク質遺伝子の1又は2以上を破壊した、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
これらの遺伝子のうち、ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,YIL039W,CWH41,OST5の10個は、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子であり(図6、表1、参照)、この10個のうち8個のALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,YIL039Wは、著しく高生産(+++)である。このような結果から、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母でも、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した株は、耐熱性酵素を高生産することが期待できる。
表1は、AmyL高活性の破壊株の破壊遺伝子のタンパク質の一般名、系統的名称、その分子機能、生物学的作用、及び、その細胞内の局在を示す。
また、表1に示されるように、耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、小胞体N型糖鎖付加関連タンパク質の遺伝子を破壊した酵母は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
図3Bは、アミラーゼ活性検出試験を図示している。
図4は、4792株のサッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)破壊株のバチルスリチェニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼ活性試験。
図5はスクリーニングで得た耐熱性酵素AmyL‐H133I−A209Vを高分泌生産できる遺伝子破壊株のアミラーゼ活性試験の結果を示している。
図6は、小胞体(ER)でのN結合型糖鎖付加タンパク質のグリコシル化プロセスにおけるオリゴ糖の伸長・転移、および、サッカロミセスセレビシエ(S.cerevisiae)のこれらの反応にかかわる酵素をコードしている遺伝子を示している。
Claims (5)
- 耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、下記のタンパク質遺伝子の1つ又は2以上が破壊された酵母変異株。
タンパク質遺伝子:ADE6,ALG3,ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,ASE1,BOP1,CAP1,CLB4,CSN9,CWH41,FLO1,GDS1,GPA2,HAP2,HFM1,HUB1,IVY1,IXR1,KEX1,MET12,OST5,PMP3,RMD6,RVS167,SET7,SNT309,SRF6,SYC1,TOS1,TRM1,UBR2,VIK1,VTS1,YBL081W,YGL242C,YGR042W,YGR054W,YIL039W,YJL007C,YLR232W,YLR407W - サッカロミセスセルビシエである請求項1記載の酵母変異株。
- 耐熱性酵素をコードするDNAを形質転換した、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した、酵母変異株。
- 下記タンパク質遺伝子の1つ又は2以上が破壊された請求項1又は2記載の酵母変異株。
タンパク質遺伝子:ALG3、ALG5,ALG6,ALG8,ALG9,ALG10,ALG12,RMD6,TOS1,VTS1,YILO39W - バチルスリチエニホルミス由来のアミラーゼ生産DNAをコードした請求項1又は2記載の酵母変異株。
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