JP2011147360A - ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質を生産するための真核微生物及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ドッケリン−コヘシンの結合を利用するタンパク質を生産するための真核微生物を、以下の特徴;
(a)CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が破壊されている、を備えるものとする。
【選択図】なし
Description
(a)CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が破壊されている、を備える、真核微生物が提供される。また、糖鎖修飾関連遺伝子ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2,及びMNN11からなる群から選択される、前記真核微生物も提供される。前記タンパク質はドッケリンを有するタンパク質であって、前記ドッケリンを有するタンパク質はセルラーゼであってもよい。また、前記タンパク質はコヘシンを有するタンパク質であって、前記コヘシンを有するタンパク質は、スキャホールディンタンパク質であってもよい。また、前記真核微生物は、酵母であってもよい。
(b)1又は2以上のドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質を生産する、を備える前記真核微生物も提供される。前記ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質は、ドッケリンを有するタンパク質であってもよい。前記ドッケリンは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyicum)及びルミノコッカス・フラヴファシエンス(Ruminococcus flavefacience)からなる群から選択される1又は2以上の微生物に由来する、前記真核微生物も提供される。
(a)CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている、
(b)セルラーゼ活性を有しドッケリンを有する1又は2以上のタンパク質を生産する、及び
(c)コヘシンを有する1又は2以上のタンパク質を生産する、
を有する、真核微生物を用いてセルロース含有材料を糖化し、発酵する工程、を備える、有用物質の生産方法が提供される。
本明細書に開示される真核微生物は、特定遺伝子が不活性化されている。こうした真核微生物は、ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質を生産するための宿主細胞として用いることができる。この真核微生物を宿主細胞として用いて、ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質をコードするDNAを当該ドッケリンタンパク質を発現可能に導入し保持させることで、ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質を生産させることができる。
本明細書に開示されるドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質とは、ドッケリンとコヘシンとの結合能力を利用可能に、ドッケリン及びコヘシンの少なくとも一方を有するタンパク質を包含している。典型的には、少なくとも一つのドッケリンを有するドッケリンタンパク質及び少なくとも一つのコヘシンを有するコヘシンタンパク質が挙げられる。また、ドッケリン−コヘシンタンパク質には、少なくとも一つのドッケリンと少なくとも一つのコヘシンとを有するタンパク質も含まれる。
本明細書に開示されるドッケリンタンパク質は、セルロソームの構成タンパク質に由来する公知のドッケリンあるいはその改変体を含むことができる。ドッケリンとしては、セルロソーム構成タンパク質としてのセルラーゼの一部に備えられるドッケリンドメインが挙げられる。ドッケリンタンパク質は、真核微生物にとっては、本来的に内在していないため、外来タンパク質となる。
本明細書に開示されるコヘシンタンパク質は、ドッケリンを結合する1又は2以上のコヘシンを備えることができる。コヘシンは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプI骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている(粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10(1999)、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等)。コヘシンとしては、セルロソームのタイプI骨格タンパク質上のタイプIコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインを用いることができる。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びDNA配列は、NCBIのHP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
本明細書に開示される真核微生物は、CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている。糖鎖修飾に関連する遺伝子は各種存在するが、真核微生物において、これら15種の遺伝子から選択される1種又は2種以上が不活性化されていることで、この真核微生物で生産するドッケリンタンパク質のコヘシンへの結合性やコヘシンタンパク質のドッケリンへの結合性を向上させることができる。
本明細書に開示される真核微生物は、1又は2以上のドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質を生産するものであってもよい。すなわち、1又は2以上のこうしたタンパク質に対応するDNAをそれぞれのタンパク質を発現可能に保持するものであってもよい。
本明細書に開示されるドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質の生産方法は、前記ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質をコードするDNAを備え、CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている、真核微生物を培養して前記タンパク質を生産する工程、を備えることができる。
ドッケリン−コヘシンタンパク質をコードするDNAを備えて当該タンパク質を発現可能であって、上記特定の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている真核微生物を培養することで、ドッケリン−コヘシン結合能力が向上したタンパク質を得ることができる。真核微生物の培養条件は、微生物の種類に応じて当業者であれば適宜設定することができる。また、液体培地を用いる液体培養が好ましいが、特に培養方法は限定されない。ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質が細胞外分泌性を有している場合には、培養工程で得られる培養上清に、当該タンパク質を取得できる。
本明細書に開示されるタンパク質複合体の生産方法は、ドッケリン−コヘシンを利用する第1のタンパク質と、CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化され、第1のタンパク質とドッケリン−コヘシン結合で結合するドメインを有するドッケリン−コヘシン結合を利用する第2のタンパク質をコードするDNAを保持する真核微生物を用いて生産した第2のタンパク質と、を接触させることにより、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との複合体を取得する工程、を備えることができる。ここで、第1のタンパク質及び第2のタンパク質は、両者がドッケリン−コヘシン結合による結合可能に、それぞれドッケリン及び/又はコヘシンを有していればよい。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、以下の特徴;
(a)CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている、
(b)セルラーゼ活性を有するドッケリンタンパク質を生産する、及び
(c)コヘシンタンパク質を生産する、
を有する、真核微生物を用いてセルロース含有材料を糖化し発酵する工程、を備えることができる。この方法によれば、この真核微生物を用いてセルロース含有材料を直接分解糖化し、グルコース等として利用できることになる。前記発酵工程の実施により、用いた真核微生物が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。
PCR法により常法に従い増幅後クローニングしたaga1遺伝子の上流にAAP1相同領域とHOR7プロモーター、下流にTdh3ターミネーターとHis3マーカーおよびAAP1相同領域を持つ、pAI-HOR7p-AGA1ベクター(図1)を作製した。このベクターを用いて酵母S.cerevisiae BY4741に形質転換を行い、aga1を細胞表層に大量提示する酵母BY-AGA1を取得した。
3種類のセルロソーム生産微生物からコヘシンタンパク質の要素であるコヘシンとCBD-コヘシン等をクローニングした(図2参照)。C.thermocellum由来の骨格タンパク質cipAの配列からコヘシン(Ctcoh)(配列番号1)とCBD-4コヘシン(CtCBD4coh)(配列番号2)をそれぞれPCR法により常法に従い増幅後クローニングした(図2(a))。同様に、C.cellulolyticum由来の骨格タンパク質cipCの配列からコヘシン(Cccoh)(配列番号3)をPCR法により常法に従い増幅後クローニングした(図2(b))。またR. flavefaciens由来骨格蛋白質ScaBの配列から、コヘシン(Rfcoh)(配列番号4)を遺伝子合成により取得した(図2(c))。
C.thermocellum のゲノムからCel8Aセルラーゼ遺伝子(配列番号5)とCel48Sドッケリン遺伝子(配列番号6)をPCR法により常法に従い増幅後クローニングした。取得した遺伝子を接合し、上流にHis-tagが付加する形で2mmベクター(図4)に挿入し、2mm-Cel8A-Ctdocベクターを作製した。取得したベクターを酵母S.cerevisiae BY4741の表2に示す各糖鎖修飾酵素の破壊株(Open Biosystems社(米国))に導入して、各糖鎖修飾酵素破壊Cel8A-Ctdoc分泌生産酵母を取得した。
実施例2で取得した酵母CtcohをYP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、OD600=10の菌体を200ml集菌した。実施例3で取得した各株をYNB+2%カザミノ酸+2%グルコース培地で30℃、24時間培養しOD600=8の菌体を1.5ml集菌して培養上清を回収し、各糖鎖修飾酵素破壊Cel8A-Ctdoc分泌液を取得した。集菌したCtcohを大過剰量の各糖鎖修飾酵素破壊Cel8A-Ctdoc分泌液1mlで懸濁し、4℃、12時間静置することで細胞表層上でCel8A-CtdocとCtcohが再構成した酵母を取得した。この酵母をOD600=1、1ml相当量集菌し、50mM 酢酸緩衝液 pH6.0で洗浄後、1% CMC, 50mM 酢酸緩衝液pH6.0溶液に混合し、60℃でCMC分解反応を行った。反応後、TZアッセイにより、遊離還元糖を測定した。結果を図5に示す。
実施例4で取得したCMC分解活性の向上が認められる糖鎖修飾酵素破壊Cel8A-Ctdocが結合した酵母Ctcohを、OD600=0.5、62.5ml相当量集菌し、PBS溶液で洗浄を行い、PBS + 1mg/ml BSA + anti-His-FITC溶液と混合して4℃、30分間反応し、PBS溶液で2回洗浄後、Flow Cytometryで酵母細胞表層上のCelA提示量を評価した。結果を図6に示す。
実施例2で取得した酵母CtCBD4cohをYP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、OD600=10の菌体を200ml集菌した。実施例5で取得した12種類の糖鎖修飾酵素破壊Cel8A-Ctdoc分泌生産酵母のうち10種類に対して、実施例4と同様の手順にて細胞表層上でCel8A-CtdocとCtCBD4cohを再構成し、CMC分解活性を評価した。結果を図7に示す。
実施例3で取得した酵母のうちALG6破壊Cel8A-Ctdoc分泌生産酵母を、ジャーファーメンターを用い、YNB+2%カザミノ酸+2%グルコース培地で、通気0.5vvm、撹拌速度400rpm、pH5.0、30℃の条件で24時間培養した。遠心分離により培養上清を回収し、His-アフィニティーカラムでCel8A-Ctdocを精製し、SDS-PAGEにより分子量を評価した。結果を図8に示す。
C.cellulolyticumのゲノムからCel5Aドッケリン遺伝子(配列番号7)をPCR法により常法に従い増幅後クローニングした。また、R. flavefaciens由来ScaAの配列から、ScaAドッケリン遺伝子(配列番号8)を遺伝子合成により取得した。取得したそれぞれの遺伝子を実施例3で取得したC.thermocellum 由来Cel8Aセルラーゼ遺伝子と接合し、それぞれの上流にHXT3相同領域、HOR7プロモーターおよびHis-tag、下流にTdh3ターミネーター、URA3マーカーおよびHXT3相同領域を持つ、pXU-HOR7p-Cel8A-CcdocベクターとpXU-HOR7p-Cel8A-Rfdocベクター(図9)を作製した。これら各ベクターを実施例2で取得した2種類の酵母CccohとRfcohにそれぞれ導入して、C.cellulolyticum由来コヘシンとCel8Aを同時生産し細胞表層に提示する酵母Cccoh-Cel8A、およびR. flavefaciens由来コヘシンとCel8Aを同時生産し細胞表層に提示する酵母Rfcoh-Cel8Aを取得した。
酵母S.cerevisiae BY4741のALG6破壊株のゲノムから破壊領域遺伝子をPCR法により常法に従い増幅後クローニングした。取得した遺伝子を実施例8で取得した酵母Cccoh-Cel8AおよびRfcoh-Cel8Aに導入し、ALG6破壊酵母Cccoh-Cel8AとALG6破壊酵母Rfcoh-Cel8Aを取得した。
実施例8で取得した酵母Cccoh-Cel8Aと酵母Rfcoh-Cel8A、および実施例9で取得したALG6破壊酵母Cccoh-Cel8AとALG6破壊酵母Rfcoh-Cel8Aを、それぞれ、YP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、OD600=0.5、62.5ml相当量集菌し、PBS溶液で1回洗浄を行い、PBS + 1mg/ml BSA + anti-His-FITC溶液と混合して4℃、30分間反応し、PBS溶液で2回洗浄後、Flow Cytometryで酵母細胞表層上のCelA提示量を評価した。結果を図10に示す。
実施例8で取得した酵母Cccoh-Cel8Aと酵母Rfcoh-Cel8A、および実施例9で取得したALG6破壊酵母Cccoh-Cel8AとALG6破壊酵母Rfcoh-Cel8AをYP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、OD600=1、1ml相当量集菌し、50mM 酢酸緩衝液 pH6.0溶液で洗浄後、1% CMC, 20mM 酢酸緩衝液pH6.0溶液に混合し、60℃でCMC分解反応を行った。結果を図11に示す。
Claims (15)
- ドッケリン−コヘシンの結合を利用するタンパク質を生産するための真核微生物であって、以下の特徴;
(a)CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が破壊されている、を備える、真核微生物。 - 糖鎖関連修飾遺伝子ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2,及びMNN11からなる群から選択される、請求項1に記載の微生物。
- さらに、以下の特徴;
(b)1又は2以上のドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質を生産する、
を備える、請求項1又は2に記載の真核微生物。 - 前記ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質は、ドッケリンを有するタンパク質であって、前記ドッケリンは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyicum)及びリゾプス・フラヴファシエンス(Rhizopus flavefacience)からなる群から選択される1又は2以上の微生物に由来する、請求項1〜3のいずれかに記載の微生物。
- 前記ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質は、コヘシンを有するタンパク質であって、前記コヘシンは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyicum)及びリゾプス・フラヴファシエンス(Rhizopus flavefacience)からなる群から選択される1又は2以上の微生物に由来する、請求項1〜4のいずれかに記載の微生物。
- 前記ドッケリンを含むタンパク質はセルラーゼである、請求項1〜5のいずれかに記載の微生物。
- 前記微生物は酵母である、請求項1〜6のいずれかに記載の微生物。
- ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質の生産方法であって、
1又は2以上の前記ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質をコードするDNAを備え、CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている、真核微生物を培養して前記タンパク質を生産する工程、を備える、方法。 - タンパク質複合体の生産方法であって、
ドッケリン−コヘシンを利用する1又は2以上の第1のタンパク質と、CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化され、前記第1のタンパク質とドッケリン−コヘシン結合で結合するドメインを有しドッケリン−コヘシン結合を利用する1又は2以上の第2のタンパク質をコードするDNAを保持する真核微生物を用いて生産した前記第2のタンパク質と、を接触させることにより、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との複合体を取得する工程、を備える、方法。 - 前記第1のタンパク質は、CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化され、前記第1のタンパク質をコードするDNAを保持する真核微生物を用いて生産される、請求項9記載の方法。
- 前記第1のタンパク質及び前記第2のタンパク質のいずれか一方を、これらのタンパク質を生産する前記真核微生物に表層提示させる、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記第1のタンパク質及び前記第2のタンパク質の他方を、当該他方のタンパク質を生産する前記真核微生物の細胞外に分泌発現させる、請求項10に記載の方法。
- 前記一方のタンパク質は、コヘシンを有するタンパク質であり、前記他方のタンパク質は、記ドッケリンを有するタンパク質である、請求項12に記載の方法。
- 前記第1のタンパク質は、前記第2のタンパク質を生産する真核微生物において前記第2のタンパク質と同時発現される、請求項9〜13のいずれかに記載の方法。
- 以下の特徴;
(a)CAX4, ALG5, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, DIE2, OST3, OST5, PMT1, PMT2, ANP1, MNN2,及びMNN11からなる群から選択される1又は2以上の糖鎖修飾関連遺伝子が不活性化されている、
(b)セルラーゼ活性を有しドッケリンを有する1又は2以上のタンパク質を生産する、及び
(c)コヘシンを有する1又は2以上のタンパク質を生産する、
を有する、真核微生物を用いてセルロース含有材料を糖化し、発酵する工程、
を備える、有用物質の生産方法。
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CN112575022A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-30 | 齐鲁工业大学 | 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法 |
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JP5343873B2 (ja) | 2013-11-13 |
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