JP4503700B1 - グルタミン酸高含有酵母の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、グルタミン酸を高濃度に含有する酵母の製造方法を提供する。本発明の酵母の培養方法においては、増殖の定常期にある酵母を、液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で液体培養する。増殖の定常期にある酵母の液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整後、さらに培養することにより、グルタミン酸高含有の酵母を製造することができる。本発明においては、前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ・ユティリスとすることができるので、本発明の方法により得られるグルタミン酸高含有酵母、及びこれから抽出されたエキスを用いることで、グルタミン酸高含有の調味料組成物、及び飲食品を提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、グルタミン酸高含有酵母の製造方法、グルタミン酸高含有酵母、グルタミン酸高含有酵母エキス、及びグルタミン酸高含有酵母エキス含有飲食品に関する。

現在、日本をはじめ欧米などの先進国を筆頭に、世界中で添加物を使用しない自然かつ健康志向の天然調味料が望まれている。そのような中、酵母エキス業界では核酸などの「旨味」を増強した高付加価値エキスの開発が行なわれているが、核酸と並び「旨味」の代表であるグルタミン酸などのアミノ酸についても開発が進んでいる。
グルタミン酸は、従来からグルタミン酸ナトリウムが化学調味料などとして普及しているが、近年は、グルタミン酸を天然に含有する酵母を培養して得られた培養物やエキスなどを飲食品に用いることが好まれている。

例えば、特許文献１には、酵母抽出物を有効成分とする甘味改善剤が記載され、該酵母抽出物が、５’−イノシン酸ナトリウム及び／または５’−アデニル酸ナトリウム、５’−グアニル酸ナトリウム、５’−ウリジル酸ナトリウム及び５’−シチジル酸ナトリウムを各々１〜１５％、及びグルタミン酸ナトリウムを１〜２０％含有している。
また、特許文献２には、乾燥菌体１ｇ当たり１５ｍｇ以上の遊離グルタミンを含有する酵母を消化する工程を含んでなる、細胞内遊離グルタミン由来のグルタミン酸をエキス固形分に対して少なくとも３％含む酵母エキスの製造方法が記載されている。
また、特許文献３には、酵母を消化、或いは分解した酵母エキスであり、１マイクロメーターの口径を有する濾過膜を透過させ、その透過部をゲル濾過に供し、分画された流出液中の２２０ｎｍにおける吸光光度法で検出されたペプタイド類において、分子量１００００以上となるものの比率が、全検出されたペプタイド類の総量に対し、１０％以上となる事を特徴とする酵母エキスが記載されている。
また、特許文献４には、Ｌ−グルタミン酸（Ｎａ塩として）を１３重量％以上含有することを特徴とするグルタミン酸高含有酵母エキスが記載されている。
また、特許文献５には、遊離アミノ酸の含有量が２５重量％以上であり、かつ核酸系呈味性成分の合計含有量が２重量％以上であることを特徴とする酵母エキスが記載されている。
また、特許文献６には、核酸系呈味物質、グルタミン酸類、カリウム及び乳酸、乳酸ナトリウム又は乳酸カリウムを含有し、モル比が核酸系呈味物質：グルタミン酸類＝１：２〜４０でありかつ（核酸系呈味物質＋グルタミン酸類）：カリウム：（乳酸、乳酸ナトリウム又は乳酸カリウム）＝１：５〜８０：１０〜８０であることを特徴とする調味料組成物が記載されている。
また、特許文献７には、グルタミン酸拮抗生育阻害剤に耐性を有し、菌体内にグルタミン酸を蓄積する酵母が記載されている。
また、特許文献８には、細胞膜の構造・機能を障害する薬剤ナイスタチンに耐性を有し、菌体内にL-グルタミン酸を５３０ｍｇ／ｌ以上蓄積する能力を有するヤロウィア・リポリティカ酵母を用いることを特徴とする酵母エキスの製造方法が記載されている。

特許第３０８８７０９号公報 特開２００２−１７１９６１号公報 特開２００５−１０２５４９号公報 特開２００６−１２９８３５号公報 特開２００７−４９９８９号公報 特開平５−２２７９１１号公報 特開平９−２９４５８１号公報 特許第３８９６６０６号公報

しかしながら、従来の方法では、酸加水分解（ＨＶＰ）処理など分解処理を行なう必要がある等、操作が煩雑になる場合が多かった。また、現在市販されている酵母エキスの遊離グルタミン酸含有量は１０％前後のものが多く、よりグルタミン酸を高濃度に含有する酵母エキスの製造方法が望まれている。
特許文献１については、グルタミン酸ナトリウムを１〜２０％含有した酵母抽出物と記載されているが、実際に使用しているものはグルタミン酸ナトリウム５．０％含有した市販品であって、それ以上のものについては何も言及されていない。
また、特許文献２については、遺伝子組み換えで行なっており、操作が煩雑であり、かつ食品としての安全性、嗜好性等に劣る。
また、特許文献３については、グルタミン酸ナトリウム（ソーダ）を固形分当たり１０％以上含有と記載してあるが、実施例については何らそれへの言及がない。
また、特許文献４については、酵素処理をするなど操作が煩雑である。
また、特許文献５については、酵素を使用するなど操作が煩雑であるのに加え、乾燥粉末当たりのグルタミン酸は１３％程度である。
また、特許文献６については、グルタミン酸を外添したものにすぎない。
また、特許文献７については、乾燥菌体重量当たりのグルタミン酸含有量は低い。
また、特許文献８については、親株に薬剤耐性付与を行なうなど、操作が煩雑である。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、グルタミン酸、特に遊離グルタミン酸を従来よりも高濃度に含有するグルタミン酸高含有酵母の製造方法、グルタミン酸高含有酵母、グルタミン酸高含有酵母エキス、およびグルタミン酸含有飲食品を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、増殖の定常期にある酵母の培養中に培養液を特定のｐＨに上昇（アルカリ性域にシフト）させることにより酵母中のグルタミン酸含有量、特に遊離グルタミン酸含有量が増加することを見出した。そして、この酵母を用いて酵母エキスを製造することにより、グルタミン酸含有量の高い酵母エキスを製造することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の構成を採用する。

（１） 増殖の定常期にある酵母を、液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で液体培養する工程を含み、
前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌であり、
前記の液体培養する工程において、培養酵母の一部を回収し、当該酵母内の遊離グルタミン酸含有量の測定を断続的に行う、酵母の培養方法。
（２） 増殖の定常期にある酵母を、液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で液体培養する工程を含み、
前記液体培養する工程が、
酵母の増殖が定常期に入った後に液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整する工程；及び、
当該酵母を当該ｐＨの範囲内において更に培養する工程；
を含み、
前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌である、酵母の培養方法。
（３） 前記の液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整する工程が、
前記液体培地にアルカリ物質を添加する工程である、前記（２）に記載の酵母の培養方法。
（４） 前記の液体培養する工程において、培養酵母の一部を回収し、当該酵母内の遊離グルタミン酸含有量の測定を断続的に行う、前記（２）に記載の酵母の培養方法。
（５） 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である前記（２）〜（４）の何れか一つに記載の酵母の培養方法。
（６） 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である前記（１）に記載の酵母の培養方法。
（７） 前記（１）〜（６）の何れか一つに記載の酵母の培養方法で培養した酵母を回収する工程を含む、酵母の製造方法。
（８） 前記（１）〜（６）の何れか一つに記載の酵母の培養方法で培養した酵母から、酵母エキスを抽出する工程を含む、酵母エキスの製造方法。

本発明のグルタミン酸高含有酵母の製造方法によれば、増殖の定常期にある酵母の液体培地のｐＨをアルカリにシフトするだけで簡便にグルタミン酸含有量、特に遊離グルタミン酸含有量が顕著に増加したグルタミン酸高含有酵母を製造することができる。

本発明のグルタミン酸高含有酵母から抽出作業を行なうことにより、グルタミン酸、特に遊離グルタミン酸を高濃度で含むグルタミン酸高含有酵母エキスが得られる。

図１は、実施例２において、培養時間に対する菌数の増加曲線を示す。 図２は、実施例２において、培養時間に対する乾燥酵母菌体重量の増加曲線を示す。 図３は、実施例２において、培養時間に対する液体培地のｐＨの変化を示す。

本発明の酵母の培養方法は、増殖の定常期にある酵母を、液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で、液体培養する工程を含むことを特徴とする。この培養方法を行うことで、グルタミン酸高含有酵母を得ることが可能になる。
以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。

酵母としては、単細胞性の真菌類であればよく、具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属菌、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属菌、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌などが挙げられる。
これらの中でも、可食性であることから、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが好ましく、より好ましくは汎用されているサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ・ユティリスである。

本発明を実施するには、上記の酵母を炭素源、窒素源及び無機塩等を含む液体培地で定常期まで培養した後、増殖の定常期にある酵母の液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で、液体培養すればよい。
これら菌株の培地組成としては、特に限定されるものではなく、定法において利用されるものを用いることができる。例えば、炭素源として通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選ばれる１種または２種以上が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機塩、およびコーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる１種または２種以上が使用される。更に、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしては、過リン酸石灰、リン安、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等の通常の工業用原料でよい。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。その他、ビタミン、核酸関連物質等を添加しても良い。

培養形式としては、回分培養、流加培養または連続培養のいずれでもよいが、工業的には流加培養または連続培養が採用される。

対数増殖期の培養条件又はｐＨ調整前の培養条件は、一般的な酵母の培養条件に従えばよく、例えば温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃がよく、ｐＨは３．５〜７．５、特に４．０〜６．０が望ましい。また、好気的条件であることが好ましい。
また、通気・攪拌を行いながら培養することが好ましい。通気の量と攪拌の条件は、培養の容量と時間、菌の初発濃度を考慮して、適宜決定することができる。例えば、通気は０．２〜２Ｖ．Ｖ．Ｍ．（Ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｓ)程度、攪拌は５０〜８００ｒｐｍ程度で行なうことができる。

増殖の定常期にある酵母を液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で、液体培養する方法は、特に限定されるものではない。ｐＨを調整する方法の例としては、培養した酵母が定常期に入ったときに、液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整する方法、液体培地にアルカリ物質を添加してｐＨを調整する方法、及び、培地中に予め尿素などを加えておいて、培養時間を経るに連れて自然にｐＨが７．５以上１１未満になるようにして、液体培地をアルカリシフトする方法を挙げることができる。
培地に添加するアルカリ物質の量は、ｐＨが上記範囲になる限り限定されるものではないが、培地を希釈しすぎず、その後の培養におけるグルタミン酸産生に悪影響を与えない観点から、培地に対して５％以下とすることが望ましい。例えば尿素の場合の量としては、特に限定されるものではなく、培養する酵母の菌体濃度にもよるが、培地に対して０．５〜５％程度が好ましい。

培養した酵母が定常期に入ったときに、液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整する方法は、特に限定されるものではなく、例えばアルカリ物質を適宜添加し、液体培地のｐＨを７．５以上１１未満、好ましくは７．５以上１０以下に調整すればよい。
ｐＨ調整は、定常期であればいつ行なってもよいが、定常期に入った直後に行なうことが好ましい。酵母内の遊離グルタミン酸濃度を十分に高めることが可能である上に、全工程終了時までに要する時間を短縮することができるためである。対数増殖期にある酵母の液体培地のｐＨを７．５以上１１未満にすると、酵母の増殖が抑制され、酵母の遊離グルタミン酸含有量が増加しないため好ましくない。
また、培養中の酵母が対数増殖期から定常期に移行する際、対数増殖の状態から徐々に定常状態に移行し、その後、完全に定常状態に入るが、対数増殖期から完全に定常状態に至る間の徐々に完全な定常状態に向かう時期も本発明の定常期に含まれる。

アルカリ物質としては、特に限定されるものではなく、例えば以下の成分が挙げられる。
ＮＨ_４ＯＨ（アンモニア水）、アンモニアガス、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の無機アルカリ、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ性塩基、尿素等の有機アルカリ等。
上記のうち、アンモニア水、アンモニアガス、尿素が好ましい。

定常期にある酵母を、ｐＨが７．５以上１１未満の液体培地において培養する場合における温度、その他の条件は、一般的な酵母の培養条件に従えばよく、例えば温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。培養時間は、ｐＨ調整後直後〜２４時間が好ましく、１〜１５時間がより好ましく、３〜１２時間がさらに好ましく、３〜６時間が特に好ましい。

なお、ｐＨが７．５以上１１未満にシフトした後の酵母内の遊離グルタミン酸含有量は、培養時間の経過とともに増大し、ピークに達した後、減少する傾向がある。また、これは培養する酵母の菌体濃度やｐＨ、温度等の条件に依存する。これは、アルカリ条件下で過度に長時間培養すると、酵母へのアルカリの影響が大きくなりすぎるためと推察される。よって、本発明においては、培養条件ごと、特にアルカリシフト後のｐＨごとに最適な培養時間を適宜選択することができるが、ｐＨシフト後に、培養酵母の一部を回収し、酵母内の遊離グルタミン酸含有量の測定を断続的に、好ましくは、一定時間毎に行う。

つまり、ピーク時に培養を終了し酵母を回収することにより、遊離グルタミン酸含有量が、乾燥酵母菌体重量当たり２．３重量％〜１０．０重量％という、遊離グルタミン酸含有量が非常に高い酵母を得ることができることが確認されている。より好ましい条件下で培養、製造した場合には、乾燥酵母菌体重量当たり、４．０重量％〜１０．０重量％の範囲で、遊離グルタミン酸を含有する酵母を得ることができる。また、ピーク時の酵母を用いて酵母エキスを調製することにより、遊離グルタミン酸含有量が乾燥重量当たり２０重量％〜３０重量％と、従来にはない程、非常に高いグルタミン酸高含有酵母エキスを得ることができることが確認されている。

このように、本発明の製造方法により、遊離グルタミン酸含有量の高い酵母を培養することができ、適宜、これを回収することで、遊離グルタミン酸含有量の非常に高い酵母を製造することができる。従って、得られた酵母から遊離グルタミン酸含有量の高い酵母エキスを調製することができる。なお、本発明の酵母及び酵母エキス等が、遊離グルタミン酸のみならず、総グルタミン酸含有量も高いことは言うまでもない。

例えば、特許文献１等には、グルタミン酸ナトリウム（分子量約１６９）換算で２０重量％の酵母エキスが記載されているが、これは、グルタミン酸（分子量約１４７）含有量としては、１７重量％程度に過ぎない。この点からも、本発明の製造方法により得られる酵母が、従来になくグルタミン酸含有量の高い酵母であることが明らかである。

本発明において、「乾燥酵母菌体当たりの遊離グルタミン酸含有量」とは、酵母菌体を乾燥させて得られる固形分中に含まれる遊離グルタミン酸の割合（重量％）を意味する。また、「酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量」とは、酵母エキスを乾燥させて得られる固形分中に含まれる遊離グルタミン酸の割合（重量％）を意味する。

酵母菌体中、又は酵母エキス中の遊離グルタミン酸含有量の測定方法は、例えば、王子計測機器社製ＢＦ―５のバイオセンサーを用いればよい。この装置は、グルタミン酸に特異的に反応する酵素電極を用いて溶液中のグルタミン酸を定量する装置であって、本酵素電極はタンパク質やペプチド中のグルタミン酸とは反応しない。よって、このような装置を用いることにより、遊離のグルタミン酸のみを選択的に定量することが可能である。
なお、遊離グルタミン酸含有量は、日本電子社製アミノ酸自動分析装置ＪＬＣ―５００／Ｖ型や、（米国）ウォーターズ社製Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ装置などを用いて測定することも可能であるが、特に限定されるものではない。

本発明の方法により、グルタミン酸、特に遊離グルタミン酸を菌体内に豊富に含有する酵母を製造することができる。このようにして得られた本発明のグルタミン酸高含有酵母は、遊離グルタミン酸を、乾燥酵母菌体中に２．３重量％以上、好ましくは２．３〜７．４重量％、より好ましくは４．０〜７．４重量％含むことができる。
このため、該酵母から酵母エキスを抽出し製造することにより、良好な呈味成分である遊離グルタミン酸を豊富に含む酵母エキスを簡便に得ることができる。

本発明の方法により製造されたグルタミン酸高含有酵母は、遊離アミノ酸含有量が高く、かつ、遊離グルタミン酸含有量が高い。例えば、本発明のグルタミン酸高含有酵母を用いて調製することにより、酵母菌体由来の遊離グルタミン酸を、酵母エキス中に乾燥重量当たり７重量％以上、好ましくは７〜３０重量％、より好ましくは１２〜３０重量％、更に好ましくは２０〜３０重量％含む酵母エキスを得ることができる。
このため、本発明によって得られる酵母エキスは非常に呈味性が高く、飲食品等に用いることで、味に深みがあり、コクのある飲食品が製造できる。

また、本発明は液体培地のアルカリシフトのみの簡単な工程でグルタミン酸高含有酵母を製造することが可能である。また、前述したように、培地は特に特殊なものを使用する必要はなく、アンモニア等、安価な原材料で製造することが可能である。

本発明の方法により、高濃度のグルタミン酸を酵母菌体内に含有するグルタミン酸高含有酵母が得られるが、グルタミン酸高含有酵母からグルタミン酸を含有する分画物を得てもよい。
グルタミン酸高含有酵母からグルタミン酸を含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよい。

また、上記方法により培養したグルタミン酸高含有酵母からグルタミン酸高含有酵母エキスを製造することができる。グルタミン酸高含有酵母エキスを製造する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよく、例えば、自己消化法、酵素分解法、酸分解法、アルカリ抽出法、熱水抽出法などが採用される。なお、一般的に、熱水抽出法のみによって得られる酵母エキス中のグルタミン酸は、自己消化法等の酵素反応法によって得られる酵母エキスとは異なり、ほぼ全量が遊離グルタミン酸であると考えられる。

本発明のグルタミン酸高含有酵母は遊離グルタミン酸が多く、このため、単に熱水処理によってのみから酵母エキスを抽出しても、呈味が良好な酵母エキスができる。
従来、遊離グルタミン酸等の呈味性アミノ酸の含有量を高めるために、植物性又は動物性のタンパク質を用いて、酸やアルカリ等を用いた加水分解処理が行われることが一般的であった。しかしながら、タンパク質の加水分解処理物は、発ガン性の疑いのあるＭＣＰ（クロロプロパノール類）を含む、という問題がある。
これに対して、本発明の方法により製造された高グルタミン酸含有酵母は、そもそも遊離グルタミン酸含有量が高いため、該酵母を熱水抽出方法等により抽出した後、酸やアルカリ等による分解処理や酵素処理を行わずとも、遊離グルタミン酸含有量が十分に高い酵母エキスを調製することができる。すなわち、本発明の高グルタミン酸含有酵母を用いることにより、呈味性と安全性の両方に優れた酵母エキスを、簡便に製造することができる。

更に、本発明のグルタミン酸高含有酵母エキスを粉末状にすることで、グルタミン酸高含有酵母エキス粉末が得られ、酵母菌を適宜選択することにより、遊離グルタミン酸を７〜３０重量％含む酵母エキス粉末が得られる。

また、上記方法により培養したグルタミン酸高含有酵母から乾燥酵母菌体を調製してもよい。乾燥酵母菌体を調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、工業的には、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法などが採用される。

また、本発明のグルタミン酸高含有酵母、該酵母の乾燥酵母菌体、該酵母から調製される酵母エキス、及び該酵母エキス粉末は、調味料組成物としてもよい。なお、該調味料組成物は、本発明の酵母エキス等のみからなるものであってもよく、本発明の酵母エキス等の他に、安定化剤、保存剤等の他の成分を含有していてもよい。該調味料組成物は、他の調味料組成物と同様に、様々な飲食品に適宜用いることができる。

さらに本発明は、上記の方法により得られたグルタミン酸高含有酵母、該グルタミン酸高含有酵母から抽出されたグルタミン酸高含有酵母エキスを含有する飲食品に関するものである。本発明のグルタミン酸高含有酵母等を含有させることにより、グルタミン酸を高濃度に含む飲食品を効率的に製造することができる。

これらの飲食品としては、通常乾燥酵母、酵母エキス、及びこれらを含む調味料組成物を添加しうる飲食品であれば何れでもよいが、例えばアルコール飲料、清涼飲料、発酵食品、調味料、スープ類、パン類、菓子類等を挙げることができる。

本発明の飲食品を製造するには、飲食品の製造工程において、上記グルタミン酸高含有酵母から得られる調製物、グルタミン酸高含有酵母の分画物を添加してもよい。その他、原料としてグルタミン酸高含有酵母をそのまま用いてもよい。

次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

以下の＜１＞〜＜８＞に示す方法により、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＢ９８４６株）を培養し、酵母培養液からエキス抽出およびグルタミン酸分析を行なった。

＜１＞ 前培養
以下の組成からなる培地を、容量３５０ｍＬ（２Ｌバッフル付き三角フラスコ）で２本作製した。
（培地組成）
糖蜜 ８％
尿素 ０．６％
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．１６％（硫酸アンモニウム）（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ０．０８％（リン酸水素２アンモニウム）

（作製方法）
（１）糖蜜（糖度３６％）１６７ｍｌをミリＱ水にて７５０ｍｌにメスアップ後、２Ｌバッフル付き三角フラスコに３５０ｍｌずつ分注した。
（２）オートクレーブ処理（１２１℃、１５ｍｉｎ）を行なった。
（３）使用時に糖蜜のみの培地に無菌的に窒素成分混液（×１００）を１/５０量添加（各７ｍＬ）した。

（培養条件）
培養温度 ３０℃
振とう １６０ｒｐｍ（ロータリー）
培養時間 ２４ｈ
（植菌量 ３００ｍＬ）

＜２＞ 本培養
以下の組成からなる培地を、容量２０００ｍＬ（流加終了時３Ｌの設定）作製した。
（培地組成）
塩化アンモニウム ０．１８％（流加終了時３Ｌ換算）５．３ｇ
（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ０．０４％（リン酸水素２アンモニウム、流加終了換算）１．２ｇ

続いて、以下の条件で培養を行なった。
（培養条件）
培養温度 ３０℃
通気 ３Ｌ／ｍｉｎ
撹拌 ６００ｒｐｍ
ｐＨ制御 下限制御ｐＨ５．０（１０％アンモニア水にて）、上限制御なし
消泡剤 アデカネート原液
流加培地 糖蜜（糖度３６％）、容量８００ｍＬ（１Ｌメジウム瓶にて、最終８％）

＜３＞ ｐＨシフト
次に、培養した酵母が定常期に入った直後に、ＮＨ_４ＯＨ水（１０％）にて培養液のｐＨをアルカリ性域にシフト（以下、ｐＨシフトという。）させて（設定ｐＨ７〜１１）、更に酵母を培養した。本培養開始後４８時間で終了した。

＜４＞ 集菌方法
（１）酵母を本培養した培養液を５０ｍｌプラスチック遠心チューブ（ファルコン２０７０）へ移し、遠心分離（３，０００ｇ、２０℃、５ｍｉｎ、ＨＰ―２６）を行なった。
（２）上清を捨て、ペレットをミリＱ水２０ｍｌに懸濁し、遠心分離（３，０００ｇ、２０℃、５ｍｉｎ、ＨＰ―２６）を行なった。これを２回繰り返した。
（３）上清を捨て、ペレットをミリＱ水２０ｍｌに懸濁した。

＜５＞ 酵母乾燥菌体重量の測定
あらかじめ秤量しておいたアルミ皿（直径５ｃｍ）に、酵母懸濁液２ｍｌとり、１０５℃にて４時間乾燥させた。
乾燥後の重量（酵母乾燥後重量）を測定し、以下の式（１）により固形分の重量（乾燥酵母菌体重量、単位ｇ／Ｌ）を算出した。
酵母乾燥後重量 − アルミ皿重量 ＝ 乾燥酵母菌体重量 ・・・（１）

＜６＞ 熱水抽出法によるエキス溶液の調製
（１）残りの酵母懸濁液（約１８ｍｌ）を遠心分離（３，０００ｇ、２０℃、５ｍｉｎ、ＨＰ―２６）した。
（２）残りの懸濁液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに移して、チューブをブロックヒーターに移し、８０℃にて３０分加熱した（エキス化）。または、温浴中１００℃にて１０分間過熱してもよい（エキス化）。
（３）その後、遠心分離（６，０００ｇ、４℃、５ｍｉｎ）にて上清液（エキス溶液）を分離した。

＜７＞ 遊離グルタミン酸含有量の測定方法
エキス溶液３００μｌ中の遊離グルタミン酸を、バイオセンサーを用いて定量した。バイオセンサーを用いた測定方法により、エキス溶液中の遊離のグルタミン酸のみを選択的に定量することができる。具体的には、測定は、該エキス溶液の希釈液（５倍希釈が適当）に対して王子計測機器ＢＦ―５を用いて行ない、検量線には１ｍＭおよび５ｍＭ標準溶液を用いた。
ｐＨ７．００、７．５０、８．００、９．００、１１．００にシフトさせた結果を表１に示す。また、ｐＨ８．００〜９．００において、ｐＨを０．２５ずつ変化させた結果を表２に、ｐＨ９．００〜１０．００において、ｐＨを０．２５ずつ変化させた結果を表３に示す。表２に示した菌数データ及び乾燥酵母菌体重量データからも明らかであるように、増殖が定常期に入った後にｐＨシフトした。

表１に示したように、乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量（重量％）は、ｐＨシフト前とｐＨシフト後６時間後では、設定がｐＨ７．５以上１１．０未満において増加することが確認された。特に、設定ｐＨ９．０では、ｐＨシフトにより２．２重量％から５．３重量％と２倍以上に増加し、顕著な遊離グルタミン酸含有量増加効果が確認された。
特に、設定ｐＨ（ｐＨシフト後のｐＨ）が８．００〜９．００においては、表２に示したように、設定ｐＨが高いほど、ｐＨシフトによる乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量（重量％）の増加量が大きいことが確認された。
一方、表３に示したように、設定ｐＨ９．００〜１０．００においては、ｐＨシフトによる乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量（重量％）の増加は、設定ｐＨが低いほど、顕著であることが確認された。特に、設定ｐＨ９．００では、ｐＨシフトによりグルタミン酸含有量が２．３重量％から５．７重量％に増加した。また、表には示していないが、設定ｐＨ９．００において、ｐＨシフト後３時間後では、乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量が４．６重量％であった。

また、これらの酵母のうち、設定ｐＨが７．５以上１１．０未満のｐＨシフト後の酵母を用いて調製された酵母エキスでは、ｐＨシフト前の酵母を用いて調製された酵母エキスと比較して、乾燥重量当たりのグルタミン酸含有量（重量％）が増大しており、本発明の製造方法により製造された酵母を用いて酵母エキスを調製することにより、グルタミン酸含有量が高い酵母エキスが得られることが確認された。例えば、表１に記載の設定ｐＨが９．００の酵母においては、ｐＨシフト前の酵母から調製された酵母エキスでは、乾燥重量当たりのグルタミン酸含有量が、ｐＨシフト後６時間培養した酵母から調製された酵母エキスでは２２．４重量％であった。また、同じく設定ｐＨが９．００の酵母（表３参照）においては、乾燥重量当たりのグルタミン酸含有量が、ｐＨシフト後３時間培養した酵母から調製された酵母エキスでは１９．４重量％、ｐＨシフト後６時間培養した酵母から調製された酵母エキスでは２５．５重量％であった。さらに、設定ｐＨが９．２５の酵母（表３参照）においても、乾燥重量当たりのグルタミン酸含有量が、ｐＨシフト後６時間培養した酵母から調製された酵母エキスでは２１．３重量％であった。
以上の結果から、定常期後に７．５以上１１未満にｐＨ調整してさらに培養を行なうことによって、酵母中のグルタミン酸が増加することが示された。特に、ｐＨ調整後３〜６時間におけるグルタミン酸含有量が高かった。

実施例１の＜１＞と同様に前培養を行い、その後、以下の条件で本培養を行なった。
定常期後にｐＨシフトするのではなく、予め本培養の培地に尿素を加えておき、自然にｐＨがシフトする条件で、グルタミン酸高含有酵母を得た。

まず、以下の組成からなる培地を、容量２０００ｍＬ（流加終了時３Ｌの設定）作製した。
（培地組成）
塩化アンモニウム ０．１８％（流加終了時３Ｌ換算）５．３ｇ
（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ０．０４％（リン酸水素２アンモニウム、流加終了換算）１．２ｇ
尿素１％（流加終了時３Ｌ換算）３０ｇ

その他の条件は実施例１と同様に行なった。図１は、培養時間に対する菌数の増加曲線を示す。図２は、培養時間に対する乾燥酵母菌体重量の増加曲線を示す。図３は、培養時間に対する培養液のｐＨの変化を示す。
図１に示すように、菌数（×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の増加は、培養１８時間後には定常状態に達し、増殖の定常期に入ったことが確認された。また、乾燥酵母菌体重量（ｇ／Ｌ）も培養後２４時間後にはほぼ定常状態になっており、増殖の定常期であることが確認された。培養液のｐＨを測定したところ、図３に示すように、増殖の定常期に入った後に、ｐＨがアルカリ（７．５以上１１未満）にシフトした。結果を表４に示す。

表４に示すように、乾燥酵母菌体重量当たりのグルタミン酸含有量は、ｐＨ上昇前は２．６重量％であったのに比べ、ｐＨ上昇時は７．４重量％になり、２．８倍に増加した。

前培養、本培養の条件を下記の条件とした他は実施例１と同様にして酵母培養液からエキス抽出およびグルタミン酸分析を行った。

（培地組成）
前培養液 １５０ｍｌ
実施例１の前培養と同様の方法で得られた前培養液から上澄みを取り除き、酵母濃度を１５〜２０％に濃縮したものを前培養液として用いた。
水 ２０００ｍｌ
Ｈ_２ＳＯ_４（９７％） １．３３ｍｌ
糖蜜（糖度３６％） ６．７ｍｌ
（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ０．０６％

（培養条件）
培養温度 ３２℃
ｐＨ ０〜１５．５時間：無調整
攪拌 ６００ｒｐｍ
続いて、以下の条件で培養を行った。
１５．５時間以降：アンモニア水でｐＨシフト
攪拌 ６００ｒｐｍ
流加培地 糖蜜（糖度３６％） ８７０ ｍｌ
NH_４OH(１０%） １００〜２００ｍｌ
リン酸（８５%） ５〜２０（ｇ）
酵母を培養して１５．５時間後にＮＨ_４ＯＨ水にてｐＨシフトを行い、更に培養を続けた。得られた結果を表５に示す。

表５に示したように、乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量（重量％）は、ｐＨシフト前とｐＨシフト後６時間後では、設定がｐＨ９．０の場合において増加することが確認された。グルタミン酸含有量９．０重量％は酵母エキス中のグルタミン酸含有量に換算すると約２５％となる。
実施例１と比較すると培地の組成が異なっており、いずれの培地組成であってもｐH依存的にグルタミン酸の含有量を増加させることが可能になることが確認された。

続いて、菌株に酵母（Ｃａｎｄｉｔａ ｕｔｉｌｉｓ ＪＣＭ１６２４株）を用い、実施例１と同様の方法で培養し、酵母培養液からエキス抽出およびグルタミン酸分析を行なった。結果を表６に示す。

以上の結果から、酵母（Ｃａｎｄｉｔａ ｕｔｉｌｉｓ ＪＣＭ１６２４株）においても、定常期後にｐＨシフトを行なうことによって、酵母中のグルタミン酸含有量が有意に増加することが示された。

次に、ｐＨシフト後の培養時間を３時間とした以外は実施例１と同様にして調製した酵母（設定ｐＨ９．０）から調製された酵母エキスの、乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量および総遊離アミノ酸含有量を測定した。なお、遊離グルタミン酸等の遊離アミノ酸の測定は、ウォーターズ社製Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ分析装置を用いて、アキュタグウルトラ（ＡｃｃＱ−Ｔａｇ Ｕｌｔｒａ）ラベル化法により行った。測定結果を表７に示す。なお、表７中、「グルタミン酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量を意味し、「総アミノ酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離アミノ酸の総含有量を意味する。

表７に示すように、ｐＨシフトの前後で遊離グルタミン酸含有量は６．９重量％から２６重量％と約３．７倍に増大していた。一方、総遊離アミノ酸含有量は１１．４重量％から４３重量％に増大していた。

続いて、実施例１と同様にして調製した酵母（ｐＨ９．０）から製造した酵母エキスと、市販の酵母エキス（比較例１〜８）について、エキス乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量及び総遊離アミノ酸含有量を測定し、比較した。なお、遊離グルタミン酸等の遊離アミノ酸の測定は、実施例５と同様にして行った。測定の結果得られた、各酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量（重量％）及び総遊離アミノ酸含有量（重量％）を表８に示す。なお、表８中、「グルタミン酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量を意味し、「総アミノ酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離アミノ酸の総含有量を意味する。

以上の結果から、本発明の酵母エキスの遊離グルタミン酸含有量は２９．１重量％と非常に高いことが示された。このように、遊離グルタミン酸を約３０重量％と非常に高濃度で含有している酵母エキスは、従来にはないものである。この結果から、本発明の酵母エキスが調味料として好適であることが示唆された。

更に、実施例１と同様にして調整した酵母（ｐＨ９．０）から製造した酵母エキスを粉末状にした酵母エキス粉末（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＢ９８４６株由来、グルタミン酸含有量 ２３重量％）を用い、みそ汁とコンソメスープを作製した。みそ汁、コンソメスープに対する酵母エキスの配合量は０．２％である。
比較例として、ミーストパウダーＮ（アサヒフードアンドヘルス株式会社製）（グルタミン酸含有量 ４重量％）を用い、同様にみそ汁とコンソメスープを作製し、以下の方法で官能評価を行なった。

（評価方法）
専門パネラー１０名によるブラインド２点比較により、比較官能検査を実施した。２対比較テストとして、ｔ−検定を行なった。

（評価基準）
塩味（減塩効果）、旨味、コクの３項目について、基準のみそ汁または基準となるコンソメスープを０とし、以下のように５段階で評価した。
「強い」＝＋２、
「やや強い」＝＋１、
「どちらでもない」＝０、
「やや弱い」＝−１、
「弱い」＝−２。
みそ汁の結果を表９に示し、コンソメスープの結果を表１０に示す。

表９の結果から、みそ汁では、塩味と旨味の平均値で差があり、コクで有意差があった。表１０の結果から、コンソメスープでは、塩味とコクの平均値で差があり、旨味で有意差があった。これは、本発明の酵母エキスが、従来よりもグルタミン酸含有量が有意に高いためと考えられる。

本発明のグルタミン酸高含有酵母の製造方法により、菌体内にグルタミン酸を高濃度に保持させた酵母を得ることができるため、酵母エキスの製造等の食品分野において利用が可能である。

Claims (8)

1. 増殖の定常期にある酵母を、液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で液体培養する工程を含み、
   前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌であり、
   前記の液体培養する工程において、培養酵母の一部を回収し、当該酵母内の遊離グルタミン酸含有量の測定を断続的に行う、酵母の培養方法。
2. 増殖の定常期にある酵母を、液体培地のｐＨが７．５以上１１未満である条件下で液体培養する工程を含み、
   前記液体培養する工程が、
   酵母の増殖が定常期に入った後に液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整する工程；及び、
   当該酵母を当該ｐＨの範囲内において更に培養する工程；
   を含み、
   前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌である、酵母の培養方法。
3. 前記の液体培地のｐＨを７．５以上１１未満に調整する工程が、
   前記液体培地にアルカリ物質を添加する工程である、請求項２に記載の酵母の培養方法。
4. 前記の液体培養する工程において、培養酵母の一部を回収し、当該酵母内の遊離グルタミン酸含有量の測定を断続的に行う、請求項２に記載の酵母の培養方法。
5. 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である請求項２〜４の何れか一項に記載の酵母の培養方法。
6. 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である請求項１に記載の酵母の培養方法。
7. 請求項１〜６の何れか一項に記載の酵母の培養方法で培養した酵母を回収する工程を含む、酵母の製造方法。
8. 請求項１〜６の何れか一項に記載の酵母の培養方法で培養した酵母から、酵母エキスを抽出する工程を含む、酵母エキスの製造方法。

Images