JP5587635B2 - 酵母の培養方法 - Google Patents
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Description
グルタミン酸は、従来からグルタミン酸ナトリウムが化学調味料などとして普及しているが、近年は、グルタミン酸を天然に含有する酵母を培養して得られた培養物やエキスなどを飲食品に用いることが好まれている。
また、特許文献2には、乾燥菌体1g当たり15mg以上の遊離グルタミンを含有する酵母を消化する工程を含んでなる、細胞内遊離グルタミン由来のグルタミン酸をエキス固形分に対して少なくとも3%含む酵母エキスの製造方法が記載されている。
また、特許文献3には、酵母を消化、或いは分解した酵母エキスであり、1マイクロメーターの口径を有する濾過膜を透過させ、その透過部をゲル濾過に供し、分画された流出液中の220nmにおける吸光光度法で検出されたペプタイド類において、分子量10000以上となるものの比率が、全検出されたペプタイド類の総量に対し、10%以上となる事を特徴とする酵母エキスが記載されている。
また、特許文献4には、L−グルタミン酸(Na塩として)を13重量%以上含有することを特徴とするグルタミン酸高含有酵母エキスが記載されている。
また、特許文献5には、遊離アミノ酸の含有量が25重量%以上であり、かつ核酸系呈味性成分の合計含有量が2重量%以上であることを特徴とする酵母エキスが記載されている。
また、特許文献6には、核酸系呈味物質、グルタミン酸類、カリウム及び乳酸、乳酸ナトリウム又は乳酸カリウムを含有し、モル比が核酸系呈味物質:グルタミン酸類=1:2〜40でありかつ(核酸系呈味物質+グルタミン酸類):カリウム:(乳酸、乳酸ナトリウム又は乳酸カリウム)=1:5〜80:10〜80であることを特徴とする調味料組成物が記載されている。
また、特許文献7には、グルタミン酸拮抗生育阻害剤に耐性を有し、菌体内にグルタミン酸を蓄積する酵母が記載されている。
また、特許文献8には、細胞膜の構造・機能を障害する薬剤ナイスタチンに耐性を有し、菌体内にL−グルタミン酸を530mg/l以上蓄積する能力を有するヤロウィア・リポリティカ酵母を用いることを特徴とする酵母エキスの製造方法が記載されている。
特許文献1については、グルタミン酸ナトリウムを1〜20%含有した酵母抽出物と記載されているが、実際に使用しているものはグルタミン酸ナトリウム5.0%含有した市販品であって、それ以上のものについては何も言及されていない。
また、特許文献2については、遺伝子組み換えで行なっており、操作が煩雑であり、かつ食品としての安全性、嗜好性等に劣る。
また、特許文献3については、グルタミン酸ナトリウム(ソーダ)を固形分当たり10%以上含有と記載してあるが、実施例については何らそれへの言及がない。
また、特許文献4については、酵素処理をするなど操作が煩雑である。
また、特許文献5については、酵素を使用するなど操作が煩雑であるのに加え、乾燥粉末当たりのグルタミン酸は13%程度である。
また、特許文献6については、グルタミン酸を外添したものにすぎない。
また、特許文献7については、乾燥菌体重量当たりのグルタミン酸含有量は低い。
また、特許文献8については、親株に薬剤耐性付与を行なうなど、操作が煩雑である。
(2) 前記液体培地中の尿素含有量が0.5〜5%である、前記(1)に記載の酵母の培養方法。
(3) 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はキャンディダ・ユティリス(Candida utilis)である前記(1)又は(2)に記載の酵母の培養方法。
(4) 前記(1)〜(3)の何れか一つに記載の酵母の培養方法で培養した酵母を回収する工程を含む、酵母の製造方法。
(5) 前記(1)〜(3)の何れか一つに記載の酵母の培養方法で培養した酵母から、酵母エキスを抽出する工程を含む、酵母エキスの製造方法。
(6) サッカロマイセス(Saccharomyces)属菌又はキャンディダ(Candida)属菌である酵母を、尿素を含有するpH4.0〜6.0の液体培地に接種して液体培養し、当該液体培地のpHを経時的に高めて、増殖の定常期における液体培地のpHを7.5以上11未満に調整した後、当該酵母を当該pHの範囲内において更に培養する酵母の培養方法で培養した酵母から、酵母エキスを抽出する工程を含む、酵母エキスの製造方法。
以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
これらの中でも、可食性であることから、キャンディダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、キャンディダ・リポリティカ(Candida lypolitica)、キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)、キャンディダ・サケ(Candida sake)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などが好ましく、より好ましくは汎用されているサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ・ユティリスである。
これら菌株の培地組成としては、特に限定されるものではなく、定法において利用されるものを用いることができる。例えば、炭素源として通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選ばれる1種または2種以上が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機塩、およびコーンスティプリカー(CSL)、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる1種または2種以上が使用される。更に、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしては、過リン酸石灰、リン安、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等の通常の工業用原料でよい。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。その他、ビタミン、核酸関連物質等を添加しても良い。
また、通気・攪拌を行いながら培養することが好ましい。通気の量と攪拌の条件は、培養の容量と時間、菌の初発濃度を考慮して、適宜決定することができる。例えば、通気は0.2〜2V.V.M.(Volume per volume per minuts)程度、攪拌は50〜800rpm程度で行なうことができる。
培地に添加するアルカリ物質の量は、pHが上記範囲になる限り限定されるものではないが、培地を希釈しすぎず、その後の培養におけるグルタミン酸産生に悪影響を与えない観点から、培地に対して5%以下とすることが望ましい。例えば尿素の場合の量としては、特に限定されるものではなく、培養する酵母の菌体濃度にもよるが、培地に対して0.5〜5%程度が好ましい。
pH調整は、定常期であればいつ行なってもよいが、定常期に入った直後に行なうことが好ましい。酵母内の遊離グルタミン酸濃度を十分に高めることが可能である上に、全工程終了時までに要する時間を短縮することができるためである。対数増殖期にある酵母の液体培地のpHを7.5以上11未満にすると、酵母の増殖が抑制され、酵母の遊離グルタミン酸含有量が増加しないため好ましくない。
また、培養中の酵母が対数増殖期から定常期に移行する際、対数増殖の状態から徐々に定常状態に移行し、その後、完全に定常状態に入るが、対数増殖期から完全に定常状態に至る間の徐々に完全な定常状態に向かう時期も本発明の定常期に含まれる。
NH4OH(アンモニア水)、アンモニアガス、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の無機アルカリ、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ性塩基、尿素等の有機アルカリ等。
上記のうち、アンモニア水、アンモニアガス、尿素が好ましい。
なお、遊離グルタミン酸含有量は、日本電子社製アミノ酸自動分析装置JLC―500/V型や、(米国)ウォーターズ社製Acquity UPLC装置などを用いて測定することも可能であるが、特に限定されるものではない。
このため、該酵母から酵母エキスを抽出し製造することにより、良好な呈味成分である遊離グルタミン酸を豊富に含む酵母エキスを簡便に得ることができる。
このため、本発明によって得られる酵母エキスは非常に呈味性が高く、飲食品等に用いることで、味に深みがあり、コクのある飲食品が製造できる。
グルタミン酸高含有酵母からグルタミン酸を含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよい。
従来、遊離グルタミン酸等の呈味性アミノ酸の含有量を高めるために、植物性又は動物性のタンパク質を用いて、酸やアルカリ等を用いた加水分解処理が行われることが一般的であった。しかしながら、タンパク質の加水分解処理物は、発ガン性の疑いのあるMCP(クロロプロパノール類)を含む、という問題がある。
これに対して、本発明の方法により製造された高グルタミン酸含有酵母は、そもそも遊離グルタミン酸含有量が高いため、該酵母を熱水抽出方法等により抽出した後、酸やアルカリ等による分解処理や酵素処理を行わずとも、遊離グルタミン酸含有量が十分に高い酵母エキスを調製することができる。すなわち、本発明の高グルタミン酸含有酵母を用いることにより、呈味性と安全性の両方に優れた酵母エキスを、簡便に製造することができる。
以下の<1>〜<8>に示す方法により、酵母(Saccharomyces cerevisiae AB9846株)を培養し、酵母培養液からエキス抽出およびグルタミン酸分析を行なった。
以下の組成からなる培地を、容量350mL(2Lバッフル付き三角フラスコ)で2本作製した。
(培地組成)
糖蜜 8%
尿素 0.6%
(NH4)2SO4 0.16%(硫酸アンモニウム)
(NH4)2HPO4 0.08%(リン酸水素2アンモニウム)
(1)糖蜜(糖度36%)167mlをミリQ水にて750mlにメスアップ後、2Lバッフル付き三角フラスコに350mlずつ分注した。
(2)オートクレーブ処理(121℃、15min)を行なった。
(3)使用時に糖蜜のみの培地に無菌的に窒素成分混液(×100)を1/50量添加(各7mL)した。
培養温度 30℃
振とう 160rpm(ロータリー)
培養時間 24h
(植菌量 300mL)
以下の組成からなる培地を、容量2000mL(流加終了時3Lの設定)作製した。
(培地組成)
塩化アンモニウム 0.18%(流加終了時3L換算)5.3g
(NH4)2HPO4 0.04%(リン酸水素2アンモニウム、流加終了換算)1.2g
(培養条件)
培養温度 30℃
通気 3L/min
撹拌 600rpm
pH制御 下限制御pH5.0(10%アンモニア水にて)、上限制御なし
消泡剤 アデカネート原液
流加培地 糖蜜(糖度36%)、容量800mL(1Lメジウム瓶にて、最終8%)
次に、培養した酵母が定常期に入った直後に、NH4OH水(10%)にて培養液のpHをアルカリ性域にシフト(以下、pHシフトという。)させて(設定pH7〜11)、更に酵母を培養した。本培養開始後48時間で終了した。
(1)酵母を本培養した培養液を50mlプラスチック遠心チューブ(ファルコン2070)へ移し、遠心分離(3,000g、20℃、5min、HP―26)を行なった。
(2)上清を捨て、ペレットをミリQ水20mlに懸濁し、遠心分離(3,000g、20℃、5min、HP―26)を行なった。これを2回繰り返した。
(3)上清を捨て、ペレットをミリQ水20mlに懸濁した。
あらかじめ秤量しておいたアルミ皿(直径5cm)に、酵母懸濁液2mlとり、105℃にて4時間乾燥させた。
乾燥後の重量(酵母乾燥後重量)を測定し、以下の式(1)により固形分の重量(乾燥酵母菌体重量、単位g/L)を算出した。
酵母乾燥後重量 − アルミ皿重量 = 乾燥酵母菌体重量 ・・・(1)
(1)残りの酵母懸濁液(約18ml)を遠心分離(3,000g、20℃、5min、HP―26)した。
(2)残りの懸濁液1.5mlをエッペンドルフチューブに移して、チューブをブロックヒーターに移し、80℃にて30分加熱した(エキス化)。または、温浴中100℃にて10分間過熱してもよい(エキス化)。
(3)その後、遠心分離(6,000g、4℃、5min)にて上清液(エキス溶液)を分離した。
エキス溶液300μl中の遊離グルタミン酸を、バイオセンサーを用いて定量した。バイオセンサーを用いた測定方法により、エキス溶液中の遊離のグルタミン酸のみを選択的に定量することができる。具体的には、測定は、該エキス溶液の希釈液(5倍希釈が適当)に対して王子計測機器BF―5を用いて行ない、検量線には1mMおよび5mM標準溶液を用いた。
pH7.00、7.50、8.00、9.00、11.00にシフトさせた結果を表1に示す。また、pH8.00〜9.00において、pHを0.25ずつ変化させた結果を表2に、pH9.00〜10.00において、pHを0.25ずつ変化させた結果を表3に示す。表2に示した菌数データ及び乾燥酵母菌体重量データからも明らかであるように、増殖が定常期に入った後にpHシフトした。
特に、設定pH(pHシフト後のpH)が8.00〜9.00においては、表2に示したように、設定pHが高いほど、pHシフトによる乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量(重量%)の増加量が大きいことが確認された。
一方、表3に示したように、設定pH9.00〜10.00においては、pHシフトによる乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量(重量%)の増加は、設定pHが低いほど、顕著であることが確認された。特に、設定pH9.00では、pHシフトによりグルタミン酸含有量が2.3重量%から5.7重量%に増加した。また、表には示していないが、設定pH9.00において、pHシフト後3時間後では、乾燥酵母菌体中の遊離グルタミン酸含有量が4.6重量%であった。
以上の結果から、定常期後に7.5以上11未満にpH調整してさらに培養を行なうことによって、酵母中のグルタミン酸が増加することが示された。特に、pH調整後3〜6時間におけるグルタミン酸含有量が高かった。
実施例1の<1>と同様に前培養を行い、その後、以下の条件で本培養を行なった。
定常期後にpHシフトするのではなく、予め本培養の培地に尿素を加えておき、自然にpHがシフトする条件で、グルタミン酸高含有酵母を得た。
(培地組成)
塩化アンモニウム 0.18%(流加終了時3L換算)5.3g
(NH4)2HPO4 0.04%(リン酸水素2アンモニウム、流加終了換算)1.2g
尿素1%(流加終了時3L換算)30g
図1に示すように、菌数(×106cells/ml)の増加は、培養18時間後には定常状態に達し、増殖の定常期に入ったことが確認された。また、乾燥酵母菌体重量(g/L)も培養後24時間後にはほぼ定常状態になっており、増殖の定常期であることが確認された。培養液のpHを測定したところ、図3に示すように、増殖の定常期に入った後に、pHがアルカリ(7.5以上11未満)にシフトした。結果を表4に示す。
前培養、本培養の条件を下記の条件とした他は実施例1と同様にして酵母培養液からエキス抽出およびグルタミン酸分析を行った。
前培養液 150ml
実施例1の前培養と同様の方法で得られた前培養液から上澄みを取り除き、酵母濃度を15〜20%に濃縮したものを前培養液として用いた。
水 2000ml
H2SO4(97%) 1.33ml
糖蜜(糖度36%) 6.7ml
(NH4)2HPO4 0.06%
培養温度 32℃
pH 0〜15.5時間:無調整
攪拌 600rpm
続いて、以下の条件で培養を行った。
15.5時間以降:アンモニア水でpHシフト
攪拌 600rpm
流加培地 糖蜜(糖度36%) 870 ml
NH4OH(10%) 100〜200ml
リン酸(85%) 5〜20(g)
酵母を培養して15.5時間後にNH4OH水にてpHシフトを行い、更に培養を続けた。得られた結果を表5に示す。
実施例1と比較すると培地の組成が異なっており、いずれの培地組成であってもpH依存的にグルタミン酸の含有量を増加させることが可能になることが確認された。
続いて、菌株に酵母(Candita utilis JCM1624株)を用い、実施例1と同様の方法で培養し、酵母培養液からエキス抽出およびグルタミン酸分析を行なった。結果を表6に示す。
次に、pHシフト後の培養時間を3時間とした以外は実施例1と同様にして調製した酵母(設定pH9.0)から調製された酵母エキスの、乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量および総遊離アミノ酸含有量を測定した。なお、遊離グルタミン酸等の遊離アミノ酸の測定は、ウォーターズ社製Acquity UPLC分析装置を用いて、アキュタグウルトラ(AccQ−Tag Ultra)ラベル化法により行った。測定結果を表7に示す。なお、表7中、「グルタミン酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量を意味し、「総アミノ酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離アミノ酸の総含有量を意味する。
続いて、実施例1と同様にして調製した酵母(pH9.0)から製造した酵母エキスと、市販の酵母エキス(比較例1〜8)について、エキス乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量及び総遊離アミノ酸含有量を測定し、比較した。なお、遊離グルタミン酸等の遊離アミノ酸の測定は、実施例5と同様にして行った。測定の結果得られた、各酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量(重量%)及び総遊離アミノ酸含有量(重量%)を表8に示す。なお、表8中、「グルタミン酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離グルタミン酸含有量を意味し、「総アミノ酸含有量」は、酵母エキスの乾燥重量当たりの遊離アミノ酸の総含有量を意味する。
更に、実施例1と同様にして調整した酵母(pH9.0)から製造した酵母エキスを粉末状にした酵母エキス粉末(Saccharomyces cerevisiae AB9846株由来、グルタミン酸含有量 23重量%)を用い、みそ汁とコンソメスープを作製した。みそ汁、コンソメスープに対する酵母エキスの配合量は0.2%である。
比較例として、ミーストパウダーN(アサヒフードアンドヘルス株式会社製)(グルタミン酸含有量 4重量%)を用い、同様にみそ汁とコンソメスープを作製し、以下の方法で官能評価を行なった。
専門パネラー10名によるブラインド2点比較により、比較官能検査を実施した。2対比較テストとして、t−検定を行なった。
塩味(減塩効果)、旨味、コクの3項目について、基準のみそ汁または基準となるコンソメスープを0とし、以下のように5段階で評価した。
「強い」=+2、
「やや強い」=+1、
「どちらでもない」=0、
「やや弱い」=−1、
「弱い」=−2。
みそ汁の結果を表9に示し、コンソメスープの結果を表10に示す。
Claims (6)
- サッカロマイセス(Saccharomyces)属菌又はキャンディダ(Candida)属菌である酵母を、尿素を含有するpH4.0〜6.0の液体培地に接種して液体培養し、当該液体培地のpHを経時的に高めて、増殖の定常期における液体培地のpHを7.5以上11未満に調整した後、当該酵母を当該pHの範囲内において更に培養し、
前記の液体培養において、培養酵母の一部を回収し、当該酵母内の遊離グルタミン酸含有量の測定を断続的に行うことを特徴とする酵母の培養方法。 - 前記液体培地中の尿素含有量が0.5〜5%である、請求項1に記載の酵母の培養方法。
- 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はキャンディダ・ユティリス(Candida utilis)である請求項1又は2に記載の酵母の培養方法。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載の酵母の培養方法で培養した酵母を回収する工程を含む、酵母の製造方法。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載の酵母の培養方法で培養した酵母から、酵母エキスを抽出する工程を含む、酵母エキスの製造方法。
- サッカロマイセス(Saccharomyces)属菌又はキャンディダ(Candida)属菌である酵母を、尿素を含有するpH4.0〜6.0の液体培地に接種して液体培養し、当該液体培地のpHを経時的に高めて、増殖の定常期における液体培地のpHを7.5以上11未満に調整した後、当該酵母を当該pHの範囲内において更に培養する酵母の培養方法で培養した酵母から、酵母エキスを抽出する工程を含む、酵母エキスの製造方法。
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