JPH0947295A - 蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質の製造方法Info
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- JPH0947295A JPH0947295A JP22469095A JP22469095A JPH0947295A JP H0947295 A JPH0947295 A JP H0947295A JP 22469095 A JP22469095 A JP 22469095A JP 22469095 A JP22469095 A JP 22469095A JP H0947295 A JPH0947295 A JP H0947295A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 異種蛋白質を発現し得るように形質転換
された酵母を、該異種蛋白質の発現と同時に、培地のｐ
Ｈを６．５〜８．５に保持し、培養物から該異種蛋白質
を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。異種蛋
白質を発現し得るように形質転換された酵母を、蛋白質
の酵素分解物を４W/V%以上含有する培地にて培養し、培
養物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする蛋白
質の製造方法。異種蛋白質を発現し得るように形質転換
された酵母を、アルギニンを０．２Ｍ以上含有する培地
にて培養し、培養物から該異種蛋白質を採取することを
特徴とする蛋白質の製造方法。 【効果】 酵母が産生する異種蛋白質が、該酵母由来の
酵素によって分解されることを抑制することができ、蛋
白質を高収率で得ることができる。
された酵母を、該異種蛋白質の発現と同時に、培地のｐ
Ｈを６．５〜８．５に保持し、培養物から該異種蛋白質
を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。異種蛋
白質を発現し得るように形質転換された酵母を、蛋白質
の酵素分解物を４W/V%以上含有する培地にて培養し、培
養物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする蛋白
質の製造方法。異種蛋白質を発現し得るように形質転換
された酵母を、アルギニンを０．２Ｍ以上含有する培地
にて培養し、培養物から該異種蛋白質を採取することを
特徴とする蛋白質の製造方法。 【効果】 酵母が産生する異種蛋白質が、該酵母由来の
酵素によって分解されることを抑制することができ、蛋
白質を高収率で得ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異種蛋白質を発現
し得るように形質転換された酵母が産生する異種蛋白質
が、該酵母由来の酵素によって分解されることを抑制
し、効率よく該異種蛋白質を得る蛋白質の製造方法に関
する。
し得るように形質転換された酵母が産生する異種蛋白質
が、該酵母由来の酵素によって分解されることを抑制
し、効率よく該異種蛋白質を得る蛋白質の製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】酵母、特
にピキア属酵母（Pichia pastoris 等）は、近年、異種
蛋白発現系の有効な宿主として注目を浴びている。ピキ
ア属酵母が有する、メタノール資化経路の第一番目に位
置するアルコールオキシダーゼはメタノール存在下で非
常に強力に誘導発現される酵素であり、そのプロモータ
ーを目的蛋白遺伝子の上流に接続した発現系は多くの成
果が認められている（Bio/Technology 11, 905-909, 19
93) 。しかし、遺伝子組換え法により異種蛋白を生産す
る場合、ピキア属酵母の発現系に限らず常に問題となる
ことは、誘導後産生される目的産物が宿主由来のプロテ
アーゼにより分解を受けることである。
にピキア属酵母（Pichia pastoris 等）は、近年、異種
蛋白発現系の有効な宿主として注目を浴びている。ピキ
ア属酵母が有する、メタノール資化経路の第一番目に位
置するアルコールオキシダーゼはメタノール存在下で非
常に強力に誘導発現される酵素であり、そのプロモータ
ーを目的蛋白遺伝子の上流に接続した発現系は多くの成
果が認められている（Bio/Technology 11, 905-909, 19
93) 。しかし、遺伝子組換え法により異種蛋白を生産す
る場合、ピキア属酵母の発現系に限らず常に問題となる
ことは、誘導後産生される目的産物が宿主由来のプロテ
アーゼにより分解を受けることである。
【０００３】かかる宿主由来のプロテアーゼによる生産
物の分解を抑制するため、プロテアーゼ欠損株の育成が
提案されている〔J.Bacteriol., 160, 442-444 (1987)
、Appl. Environ. Microbiol., 53, 379-384 (1987)
、特開昭64─37285 号公報等〕。しかし、このような
低プロテアーゼ生産性の宿主においても、菌体外に産生
された蛋白質等の分解を十分に抑制することが困難であ
る。
物の分解を抑制するため、プロテアーゼ欠損株の育成が
提案されている〔J.Bacteriol., 160, 442-444 (1987)
、Appl. Environ. Microbiol., 53, 379-384 (1987)
、特開昭64─37285 号公報等〕。しかし、このような
低プロテアーゼ生産性の宿主においても、菌体外に産生
された蛋白質等の分解を十分に抑制することが困難であ
る。
【０００４】また、アミノ酸またはその塩、無機塩等を
含有させ、さらにイオン強度が調節された培地で培養す
ることにより、宿主由来のプロテアーゼによる産生蛋白
質の分解を抑制する方法等（特開平4-36190 号公報）も
知られている。しかし、かかる方法に開示されるイオン
強度の培地を用いて菌体を培養した場合、培地の塩濃度
が高過ぎて菌体増殖が阻害されるおそれがあるため、必
ずしも有用な方法ではない。特に酵母を用いた場合に
は、増殖阻害がおこる可能性が高い。
含有させ、さらにイオン強度が調節された培地で培養す
ることにより、宿主由来のプロテアーゼによる産生蛋白
質の分解を抑制する方法等（特開平4-36190 号公報）も
知られている。しかし、かかる方法に開示されるイオン
強度の培地を用いて菌体を培養した場合、培地の塩濃度
が高過ぎて菌体増殖が阻害されるおそれがあるため、必
ずしも有用な方法ではない。特に酵母を用いた場合に
は、増殖阻害がおこる可能性が高い。
【０００５】従って、本発明は、遺伝子産物である蛋白
質等の分解を効果的に抑制し、該蛋白質を安定かつ高収
率で得ることができる異種蛋白質の製造方法を提供する
ことを目的とする。本発明における異種蛋白質とは、宿
主として用いられる酵母が本来は産生しない蛋白質であ
って、形質転換によって産生可能となった外来の蛋白質
を意味する。
質等の分解を効果的に抑制し、該蛋白質を安定かつ高収
率で得ることができる異種蛋白質の製造方法を提供する
ことを目的とする。本発明における異種蛋白質とは、宿
主として用いられる酵母が本来は産生しない蛋白質であ
って、形質転換によって産生可能となった外来の蛋白質
を意味する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】一般に、酵母、特にピキ
ア属酵母はｐＨ約４．８〜約５．２の範囲にある適切な
栄養培地で旺盛な増殖を示すことが知られており、通常
酵母の培養には当該ｐＨ範囲の培地が用いられている。
ア属酵母はｐＨ約４．８〜約５．２の範囲にある適切な
栄養培地で旺盛な増殖を示すことが知られており、通常
酵母の培養には当該ｐＨ範囲の培地が用いられている。
【０００７】本発明者らは、宿主由来のプロテアーゼに
よって、異種蛋白質を発現し得るように形質転換された
宿主によって産生された異種蛋白質が分解されることを
効果的に抑制できる簡便な方法について鋭意研究したと
ころ、酵母が異種蛋白質を発現する時と同時期に、培地
のｐＨを６．５〜８．５の範囲に保持するという前例の
ない方法を採用することにより、酵母が産生する異種蛋
白質の分解が顕著に抑制できることを見出して本発明の
第１の製造方法を完成した。これにより、酵母が産生す
る異種蛋白質の収率を少なくとも３００％増大させるこ
とができた。本発明の第１の製造方法は、かかる知見に
基づくものである。
よって、異種蛋白質を発現し得るように形質転換された
宿主によって産生された異種蛋白質が分解されることを
効果的に抑制できる簡便な方法について鋭意研究したと
ころ、酵母が異種蛋白質を発現する時と同時期に、培地
のｐＨを６．５〜８．５の範囲に保持するという前例の
ない方法を採用することにより、酵母が産生する異種蛋
白質の分解が顕著に抑制できることを見出して本発明の
第１の製造方法を完成した。これにより、酵母が産生す
る異種蛋白質の収率を少なくとも３００％増大させるこ
とができた。本発明の第１の製造方法は、かかる知見に
基づくものである。
【０００８】また本発明者らは、異種蛋白質を発現し得
るように形質転換された酵母を、通常は培地の２W/V%程
度しか含有されない蛋白質の酵素分解物を、過剰に、具
体的には４W/V%以上含有する培地を用いて培養するとい
う、前例のない方法を採用することにより、酵母が産生
する異種蛋白質の分解が効果的に抑制できることを見出
して本発明の第２の製造方法を完成した。これにより、
酵母が産生する異種蛋白質の収率を少なくとも２００％
増大させることができた。本発明の第２の製造方法は、
かかる知見に基づくものである。
るように形質転換された酵母を、通常は培地の２W/V%程
度しか含有されない蛋白質の酵素分解物を、過剰に、具
体的には４W/V%以上含有する培地を用いて培養するとい
う、前例のない方法を採用することにより、酵母が産生
する異種蛋白質の分解が効果的に抑制できることを見出
して本発明の第２の製造方法を完成した。これにより、
酵母が産生する異種蛋白質の収率を少なくとも２００％
増大させることができた。本発明の第２の製造方法は、
かかる知見に基づくものである。
【０００９】さらに本発明者らは、異種蛋白質を発現し
得るように形質転換された酵母を、通常は添加されたと
しても培地の０．１Ｍ程度しか含有されないアルギニン
を、過剰に、具体的には０．２Ｍ以上含有する培地を用
いて培養するという、前例のない方法を採用することに
より、酵母が産生する異種蛋白質の分解が効果的に抑制
できることを見出して本発明の第３の製造方法を完成し
た。これにより、酵母が産生する異種蛋白質の収率を少
なくとも１００％増大させることができた。本発明の第
３の製造方法は、かかる知見に基づくものである。
得るように形質転換された酵母を、通常は添加されたと
しても培地の０．１Ｍ程度しか含有されないアルギニン
を、過剰に、具体的には０．２Ｍ以上含有する培地を用
いて培養するという、前例のない方法を採用することに
より、酵母が産生する異種蛋白質の分解が効果的に抑制
できることを見出して本発明の第３の製造方法を完成し
た。これにより、酵母が産生する異種蛋白質の収率を少
なくとも１００％増大させることができた。本発明の第
３の製造方法は、かかる知見に基づくものである。
【００１０】本発明の製造方法は、異種蛋白質を産生す
る酵母、すなわち異種蛋白質を産生し得るように形質転
換された酵母の培養に好適に適用でき、本発明を用いる
ことによって、該酵母が産生する異種蛋白質が該酵母由
来のプロテアーゼによって分解されることを抑制するこ
とができ、異種蛋白質の収率を向上させることができ
る。
る酵母、すなわち異種蛋白質を産生し得るように形質転
換された酵母の培養に好適に適用でき、本発明を用いる
ことによって、該酵母が産生する異種蛋白質が該酵母由
来のプロテアーゼによって分解されることを抑制するこ
とができ、異種蛋白質の収率を向上させることができ
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の第１の製造方法は、異種
蛋白質を発現し得るように形質転換された酵母を、該異
種蛋白質の発現と同時期に、培地のｐＨを６．５〜８．
５に保持して培養し、得られた培養物から該異種蛋白質
を採取することを特徴とする。すなわち、本発明の第１
の製造方法においては、異種蛋白質を発現し得るように
形質転換された酵母を、まず該酵母の生存の維持及び増
殖に適した条件にて培養し、ついで該酵母による異種蛋
白質の発現に適した条件下で培養して発現を誘導し、該
発現と同時期に培地のｐＨを６．５〜８．５に保持して
培養する。
蛋白質を発現し得るように形質転換された酵母を、該異
種蛋白質の発現と同時期に、培地のｐＨを６．５〜８．
５に保持して培養し、得られた培養物から該異種蛋白質
を採取することを特徴とする。すなわち、本発明の第１
の製造方法においては、異種蛋白質を発現し得るように
形質転換された酵母を、まず該酵母の生存の維持及び増
殖に適した条件にて培養し、ついで該酵母による異種蛋
白質の発現に適した条件下で培養して発現を誘導し、該
発現と同時期に培地のｐＨを６．５〜８．５に保持して
培養する。
【００１２】本発明の第１の製造方法に使用される酵母
としては、異種蛋白質を産生し得る酵母であれば特に制
限されない。前記酵母は、天然型ピキア属酵母または修
飾ピキア属酵母を遺伝子組換え技術により、目的とする
遺伝子産物をコードする異種のＤＮＡ断片を慣用の方法
〔スフェロプラスト方法（ Cregg等，Mol.Cell.Biol.,
5,3376 (1985)、米国特許第4,879,231 号）、塩化リチ
ウム法（Ito 等, Agric.Biol.Chem.,48,341 (1984)、欧
州特許出願第312,934 号、米国特許第4,929,535号）な
ど〕により宿主に移入し形質転換することにより調製す
ることができる。
としては、異種蛋白質を産生し得る酵母であれば特に制
限されない。前記酵母は、天然型ピキア属酵母または修
飾ピキア属酵母を遺伝子組換え技術により、目的とする
遺伝子産物をコードする異種のＤＮＡ断片を慣用の方法
〔スフェロプラスト方法（ Cregg等，Mol.Cell.Biol.,
5,3376 (1985)、米国特許第4,879,231 号）、塩化リチ
ウム法（Ito 等, Agric.Biol.Chem.,48,341 (1984)、欧
州特許出願第312,934 号、米国特許第4,929,535号）な
ど〕により宿主に移入し形質転換することにより調製す
ることができる。
【００１３】好ましくはピキア属酵母であり、例えば P
ichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalop
hila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pi
chiaopuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salict
aria, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。さらに好ましくは、唯一の炭素源およびエネルギー
源としてメタノールを利用できるメタノール資化性（me
thylotrophic）酵母である。適切なメタノール資化性酵
母としては、具体的には栄養要求性Pichia pastoris
ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）， Pichi
a pastoris ＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１
４）， Pichia pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１８０１７）、野生型 Pichia pastoris株（ＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）等が例示
される。
ichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalop
hila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pi
chiaopuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salict
aria, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。さらに好ましくは、唯一の炭素源およびエネルギー
源としてメタノールを利用できるメタノール資化性（me
thylotrophic）酵母である。適切なメタノール資化性酵
母としては、具体的には栄養要求性Pichia pastoris
ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）， Pichi
a pastoris ＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１
４）， Pichia pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１８０１７）、野生型 Pichia pastoris株（ＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）等が例示
される。
【００１４】さらに、 Pichia pastorisの中でもプロテ
アーゼの生産性を遺伝子工学的手法あるいは突然変異等
の手法により低下させた菌株であれば、なお好ましい。
プロテアーゼ生産性の低い宿主を用い、前記培地にて培
養する場合には、産生される異種蛋白質の分解を著しく
抑制することができ、該異種蛋白質をさらに効率よく多
量に得ることができる。
アーゼの生産性を遺伝子工学的手法あるいは突然変異等
の手法により低下させた菌株であれば、なお好ましい。
プロテアーゼ生産性の低い宿主を用い、前記培地にて培
養する場合には、産生される異種蛋白質の分解を著しく
抑制することができ、該異種蛋白質をさらに効率よく多
量に得ることができる。
【００１５】前記酵母が産生する異種蛋白質は、宿主酵
母由来のプロテアーゼの作用により分解されうる蛋白質
であれば特に限定されない。天然由来の蛋白質に限定さ
れず、天然の蛋白質が遺伝的に変異されてなる変異体お
よび人工的に修飾してなる誘導体であってもよい。具体
的には、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ヒト血清ア
ルブミン、インターフェロン、インターロイキン、イン
シュリン、アネキシンＶ、成長ホルモン、アミラーゼ、
尿性トリプシンインヒビター等のタンパクなどが例示さ
れる。また、異なる蛋白質が連結されてなる融合蛋白
質、例えば血栓溶解作用を有するプロウロキナーゼ／ア
ネキシンＶ融合蛋白質（特表平５−５０８６６４号公
報）なども含まれる。
母由来のプロテアーゼの作用により分解されうる蛋白質
であれば特に限定されない。天然由来の蛋白質に限定さ
れず、天然の蛋白質が遺伝的に変異されてなる変異体お
よび人工的に修飾してなる誘導体であってもよい。具体
的には、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ヒト血清ア
ルブミン、インターフェロン、インターロイキン、イン
シュリン、アネキシンＶ、成長ホルモン、アミラーゼ、
尿性トリプシンインヒビター等のタンパクなどが例示さ
れる。また、異なる蛋白質が連結されてなる融合蛋白
質、例えば血栓溶解作用を有するプロウロキナーゼ／ア
ネキシンＶ融合蛋白質（特表平５−５０８６６４号公
報）なども含まれる。
【００１６】本発明の第１の異種蛋白質の製造方法に使
用される培地としては、慣用の炭素源，窒素源，無機塩
類，増殖因子成分などを含む培地が適用できる。前記炭
素源としては、メタノール、グリセリン、ソルビトー
ル、グルコース、フルクトースおよびそれらのうち１ま
たは２以上の組合せよりなる群から選択される炭素エネ
ルギー源が挙げられるが、これらに限定されることはな
い。酵母の中でも Pichia pastorisを増殖させるための
好ましい炭素エネルギー源は、メタノール、グリセリン
およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる炭素エネ
ルギー源である。また、酵母に適した栄養源としては、
窒素源、ホスフェート源、カリウム源、無機質源、例え
ば鉄、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、カルシウム
および他の微量元素、並びにビタミン（例えばビオチ
ン、パントテン酸、および必要に応じてチアミン）が例
示される。
用される培地としては、慣用の炭素源，窒素源，無機塩
類，増殖因子成分などを含む培地が適用できる。前記炭
素源としては、メタノール、グリセリン、ソルビトー
ル、グルコース、フルクトースおよびそれらのうち１ま
たは２以上の組合せよりなる群から選択される炭素エネ
ルギー源が挙げられるが、これらに限定されることはな
い。酵母の中でも Pichia pastorisを増殖させるための
好ましい炭素エネルギー源は、メタノール、グリセリン
およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる炭素エネ
ルギー源である。また、酵母に適した栄養源としては、
窒素源、ホスフェート源、カリウム源、無機質源、例え
ば鉄、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、カルシウム
および他の微量元素、並びにビタミン（例えばビオチ
ン、パントテン酸、および必要に応じてチアミン）が例
示される。
【００１７】培地の種類は、特に制限されず、培養する
酵母宿主に応じて、天然培地、半合成培地及び合成培地
の中から適宜選択することができる。また、培地の形態
も特に制限されず、液体培地でも寒天やゼラチンを含む
固形培地であってもよいが、好ましくは液体培地であ
る。
酵母宿主に応じて、天然培地、半合成培地及び合成培地
の中から適宜選択することができる。また、培地の形態
も特に制限されず、液体培地でも寒天やゼラチンを含む
固形培地であってもよいが、好ましくは液体培地であ
る。
【００１８】なお、産生される蛋白質等をさらに安定化
させるため、プロテアーゼ阻害剤（例えば、キモスタチ
ン、ペプスタチン、フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド等）を添加してもよい。その添加量は、通常は１ｍ
Ｍ程度である。
させるため、プロテアーゼ阻害剤（例えば、キモスタチ
ン、ペプスタチン、フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド等）を添加してもよい。その添加量は、通常は１ｍ
Ｍ程度である。
【００１９】本発明の第１の製造方法においては、異種
蛋白質発現時の培地のｐＨを、６．５〜８．５に調整す
る。好ましくはｐＨ７．０〜８．５、さらに好ましくは
ｐＨ７．２〜８．３の範囲である。ピキア属酵母を用い
る場合には、ｐＨ７．０〜８．３が好ましい。ｐＨが
６．５未満では、酵母によって産生される異種蛋白質酵
母が該酵母に由来する酵素によって分解されることを抑
制することができない。また、ｐＨが８．５を越える
と、菌体増殖が著しく阻害される場合があるため、好ま
しくない。培地のｐＨは水酸化ナトリウム等の塩基性化
合物や、塩酸、有機酸等の酸性化合物を用いて調整する
ことができる。
蛋白質発現時の培地のｐＨを、６．５〜８．５に調整す
る。好ましくはｐＨ７．０〜８．５、さらに好ましくは
ｐＨ７．２〜８．３の範囲である。ピキア属酵母を用い
る場合には、ｐＨ７．０〜８．３が好ましい。ｐＨが
６．５未満では、酵母によって産生される異種蛋白質酵
母が該酵母に由来する酵素によって分解されることを抑
制することができない。また、ｐＨが８．５を越える
と、菌体増殖が著しく阻害される場合があるため、好ま
しくない。培地のｐＨは水酸化ナトリウム等の塩基性化
合物や、塩酸、有機酸等の酸性化合物を用いて調整する
ことができる。
【００２０】酵母を増殖させるために用いられる培養温
度は、一般に２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃で
ある。
度は、一般に２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃で
ある。
【００２１】形質転換された酵母の培養は、通常当業者
が行う方法、培地を用いるものであれば特に制限はな
く、連続培養、回分培養、半回分培養等で、前述の種々
の炭素エネルギー源および／または栄養源を用いて行う
ことができる。
が行う方法、培地を用いるものであれば特に制限はな
く、連続培養、回分培養、半回分培養等で、前述の種々
の炭素エネルギー源および／または栄養源を用いて行う
ことができる。
【００２２】例えば、メタノール誘導性調節領域を含む
ＤＮＡを含有する酵母を用いる半回分培養にて、本発明
の第１の製造方法を採用して異種蛋白質を製造する場合
には、該酵母をまずグリセロールを含む培地にて目的密
度になるまで増殖させる。好ましくは、培養温度を約３
０℃とする。グリセロールが消費されたのち、メタノー
ルを徐々に供給し、この供給により前記酵母が異種蛋白
質を産生し始め、この時期以降培地のｐＨを６．５〜
８．５に調整する。なお、メタノールの供給に際して無
細胞培地中に存在する異種蛋白質を定量分析することに
より、異種蛋白質の産生・分泌を監視することができ
る。産生された異種蛋白質の量を定量する試験法として
は、当業者に既知の、例えばＥＬＩＳＡ法、活性測定法
が挙げられる。
ＤＮＡを含有する酵母を用いる半回分培養にて、本発明
の第１の製造方法を採用して異種蛋白質を製造する場合
には、該酵母をまずグリセロールを含む培地にて目的密
度になるまで増殖させる。好ましくは、培養温度を約３
０℃とする。グリセロールが消費されたのち、メタノー
ルを徐々に供給し、この供給により前記酵母が異種蛋白
質を産生し始め、この時期以降培地のｐＨを６．５〜
８．５に調整する。なお、メタノールの供給に際して無
細胞培地中に存在する異種蛋白質を定量分析することに
より、異種蛋白質の産生・分泌を監視することができ
る。産生された異種蛋白質の量を定量する試験法として
は、当業者に既知の、例えばＥＬＩＳＡ法、活性測定法
が挙げられる。
【００２３】酵母が産生した異種蛋白質は、培養物から
慣用の方法で採取される。例えば、分画法、イオン交
換，ゲル濾過またはアフィニティカラムクロマトグラフ
ィー等により所望の異種蛋白質を精製取得することでき
る。
慣用の方法で採取される。例えば、分画法、イオン交
換，ゲル濾過またはアフィニティカラムクロマトグラフ
ィー等により所望の異種蛋白質を精製取得することでき
る。
【００２４】本発明の第２の製造方法は、異種蛋白質を
発現し得るように形質転換された酵母を、蛋白質の酵素
分解物を４W/V%以上含有する培地にて培養し、得られた
培養物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする。
発現し得るように形質転換された酵母を、蛋白質の酵素
分解物を４W/V%以上含有する培地にて培養し、得られた
培養物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする。
【００２５】本発明の第２の製造方法に使用される酵母
としては、異種蛋白質を産生し得る酵母であれば特に制
限されない。前記酵母は、天然型ピキア属酵母または修
飾ピキア属酵母を遺伝子組換え技術により、目的とする
遺伝子産物をコードする異種のＤＮＡ断片を、例えば、
第１の製造方法において例示した慣用の方法により宿主
に移入し形質転換することにより調製することができ
る。
としては、異種蛋白質を産生し得る酵母であれば特に制
限されない。前記酵母は、天然型ピキア属酵母または修
飾ピキア属酵母を遺伝子組換え技術により、目的とする
遺伝子産物をコードする異種のＤＮＡ断片を、例えば、
第１の製造方法において例示した慣用の方法により宿主
に移入し形質転換することにより調製することができ
る。
【００２６】好ましくはピキア属酵母であり、例えば P
ichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalop
hila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pi
chiaopuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salict
aria, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。さらに好ましくは、唯一の炭素源およびエネルギー
源としてメタノールを利用できるメタノール資化性（me
thylotrophic）酵母である。適切なメタノール資化性酵
母としては、具体的には栄養要求性 Pichia pastoris
ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）， Pichi
a pastoris ＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１
４）， Pichia pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１８０１７）、野生型 Pichia pastoris株（ＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）等が例示
される。第２の製造方法においては、メタノール資化性
酵母のなかでも、 Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株が
好ましく用いられる。
ichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalop
hila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pi
chiaopuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salict
aria, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。さらに好ましくは、唯一の炭素源およびエネルギー
源としてメタノールを利用できるメタノール資化性（me
thylotrophic）酵母である。適切なメタノール資化性酵
母としては、具体的には栄養要求性 Pichia pastoris
ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）， Pichi
a pastoris ＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１
４）， Pichia pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１８０１７）、野生型 Pichia pastoris株（ＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）等が例示
される。第２の製造方法においては、メタノール資化性
酵母のなかでも、 Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株が
好ましく用いられる。
【００２７】さらに、 Pichia pastorisの中でもプロテ
アーゼの生産性を突然変異等の手法により低下させた菌
株であれば、なお好ましい。プロテアーゼ生産性の低い
宿主を前記培地と組み合わせて培養する場合には、遺伝
子産物の分解を著しく抑制でき、産生される蛋白質をさ
らに効率よく多量に得ることができる。
アーゼの生産性を突然変異等の手法により低下させた菌
株であれば、なお好ましい。プロテアーゼ生産性の低い
宿主を前記培地と組み合わせて培養する場合には、遺伝
子産物の分解を著しく抑制でき、産生される蛋白質をさ
らに効率よく多量に得ることができる。
【００２８】前記酵母が産生する異種蛋白質は、宿主酵
母由来のプロテアーゼの作用により分解されうる蛋白質
であれば特に限定されない。具体的には、上記第１の製
造方法にて例示された異種蛋白質が挙げられる。
母由来のプロテアーゼの作用により分解されうる蛋白質
であれば特に限定されない。具体的には、上記第１の製
造方法にて例示された異種蛋白質が挙げられる。
【００２９】本発明の第２の製造方法に用いられる培地
としては、上記第１の製造方法にて例示された慣用の炭
素源，窒素源，無機塩類，増殖因子成分などを含む培地
が適用できる。培地の種類は、特に制限されず、培養す
る酵母宿主に応じて、天然培地、半合成培地及び合成培
地の中から適宜選択することができる。また、培地の形
態も特に制限されず、液体培地でも寒天やゼラチンを含
む固形培地であってもよい。好ましくは液体培地であ
る。
としては、上記第１の製造方法にて例示された慣用の炭
素源，窒素源，無機塩類，増殖因子成分などを含む培地
が適用できる。培地の種類は、特に制限されず、培養す
る酵母宿主に応じて、天然培地、半合成培地及び合成培
地の中から適宜選択することができる。また、培地の形
態も特に制限されず、液体培地でも寒天やゼラチンを含
む固形培地であってもよい。好ましくは液体培地であ
る。
【００３０】本発明の第２の製造方法においては、前記
培地に蛋白質の酵素分解物を通常の添加量より過剰に加
えた培地を用いる。この蛋白質の酵素分解物は、ペプチ
ドを主成分とする物質であり、詳しくは、動物肉、カゼ
イン、牛乳カゼイン、大豆、卵黄蛋白質、ゼラチン、ラ
クトアルブミン等の蛋白質を酵素、例えば、ペプシン、
またはトリプシン、パンクレアチン等の膵液等に由来す
るプロテア─ゼ等によって分解された分解物であり、ア
ミノ酸まで分解されない未分解のペプチドを含む物質が
用いられる。好ましくは、カゼイン、牛乳カゼインが、
ペプシンおよび／またはトリプシンによって分解された
物質が用いられる。前記蛋白質の酵素分解物としては、
具体的には、バクトペプトン（商標、 Difco社製）、ポ
リペプトン、ポリペプトンＳ、ポリペプトンＰ１、ポリ
ペプトンＹ（以上、商標、日本製薬製）、アシディケー
スペプトン、ゲリセートペプトン（以上、商標、ベクト
ンディクソン アンド カンパニー製）、ラクトアルブ
ミンハイドロリセート（商標、 Difco社製）、ペプトン
Ｉ、ペプトンＳ、ペプトンＴ（以上、商標、ICNbiochem
icals製）、ペプトン（商標、ミクニ製）、ペプトン
（商標、極東製薬製）、細菌用ペプトン（商標、Oxiod
Ltd.）等が挙げられる。好ましくは、バクトペプトン、
ポリペプトンＰ１、ペプトンＴ、ペプトンＩが用いられ
る。
培地に蛋白質の酵素分解物を通常の添加量より過剰に加
えた培地を用いる。この蛋白質の酵素分解物は、ペプチ
ドを主成分とする物質であり、詳しくは、動物肉、カゼ
イン、牛乳カゼイン、大豆、卵黄蛋白質、ゼラチン、ラ
クトアルブミン等の蛋白質を酵素、例えば、ペプシン、
またはトリプシン、パンクレアチン等の膵液等に由来す
るプロテア─ゼ等によって分解された分解物であり、ア
ミノ酸まで分解されない未分解のペプチドを含む物質が
用いられる。好ましくは、カゼイン、牛乳カゼインが、
ペプシンおよび／またはトリプシンによって分解された
物質が用いられる。前記蛋白質の酵素分解物としては、
具体的には、バクトペプトン（商標、 Difco社製）、ポ
リペプトン、ポリペプトンＳ、ポリペプトンＰ１、ポリ
ペプトンＹ（以上、商標、日本製薬製）、アシディケー
スペプトン、ゲリセートペプトン（以上、商標、ベクト
ンディクソン アンド カンパニー製）、ラクトアルブ
ミンハイドロリセート（商標、 Difco社製）、ペプトン
Ｉ、ペプトンＳ、ペプトンＴ（以上、商標、ICNbiochem
icals製）、ペプトン（商標、ミクニ製）、ペプトン
（商標、極東製薬製）、細菌用ペプトン（商標、Oxiod
Ltd.）等が挙げられる。好ましくは、バクトペプトン、
ポリペプトンＰ１、ペプトンＴ、ペプトンＩが用いられ
る。
【００３１】本発明の第２の製造方法に用いられる培地
は、通常、２W/V%程度しか含まれない前記蛋白質の酵素
分解物を培地の４W/V%以上含有する。好ましくは５W/V%
以上、さらに好ましくは６W/V%〜２０W/V%である。前記
酵素分解物の含有量を４W/V%以上にすることによって、
酵母が産生する異種蛋白質が該酵母由来の酵素によって
分解されることを抑制する効果が得られる。
は、通常、２W/V%程度しか含まれない前記蛋白質の酵素
分解物を培地の４W/V%以上含有する。好ましくは５W/V%
以上、さらに好ましくは６W/V%〜２０W/V%である。前記
酵素分解物の含有量を４W/V%以上にすることによって、
酵母が産生する異種蛋白質が該酵母由来の酵素によって
分解されることを抑制する効果が得られる。
【００３２】なお、産生される蛋白質等をさらに安定化
させるため、プロテアーゼ阻害剤（キモスタチン、ペプ
スタチン、フェニルメチルスルホニルフルオライド等）
を添加してもよい。その添加量は、通常１ｍＭ程度であ
る。
させるため、プロテアーゼ阻害剤（キモスタチン、ペプ
スタチン、フェニルメチルスルホニルフルオライド等）
を添加してもよい。その添加量は、通常１ｍＭ程度であ
る。
【００３３】培地のｐＨは、好ましくは、４．８〜８．
５である。さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５であ
り、この範囲で培養を行うと異種蛋白質が酵母由来のプ
ロテアーゼによって分解されることを抑制する効果がさ
らに高くなる。
５である。さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５であ
り、この範囲で培養を行うと異種蛋白質が酵母由来のプ
ロテアーゼによって分解されることを抑制する効果がさ
らに高くなる。
【００３４】培養温度は、一般に２０〜３５℃、好まし
くは２５〜３０℃である。
くは２５〜３０℃である。
【００３５】形質転換された酵母の培養は、通常当業者
が行う方法、培地を用いるものであれば特に制限はな
く、連続培養、回分培養、半回分培養等で、第１の製造
方法で例示した種々の炭素エネルギー源および／または
栄養源を用いて行うことができる。好ましくは、半回分
培養または連続培養であり、この培養方法によれば、培
地中の蛋白質の酵素分解物の濃度を自在にコントロール
することができる。
が行う方法、培地を用いるものであれば特に制限はな
く、連続培養、回分培養、半回分培養等で、第１の製造
方法で例示した種々の炭素エネルギー源および／または
栄養源を用いて行うことができる。好ましくは、半回分
培養または連続培養であり、この培養方法によれば、培
地中の蛋白質の酵素分解物の濃度を自在にコントロール
することができる。
【００３６】酵母により産生された異種蛋白質は、例え
ば、前記第１の製造方法にて例示された慣用の方法で培
養物から採取される。
ば、前記第１の製造方法にて例示された慣用の方法で培
養物から採取される。
【００３７】本発明の第３の製造方法は、異種蛋白質を
発現し得るように形質転換された酵母を、アルギニンを
０．２Ｍ以上含有する培地を用いて培養し、得られた培
養物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする。
発現し得るように形質転換された酵母を、アルギニンを
０．２Ｍ以上含有する培地を用いて培養し、得られた培
養物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする。
【００３８】本発明の第３の製造方法に使用される酵母
としては、異種蛋白質を産生し得る酵母であれば特に制
限されない。前記酵母は、天然型ピキア属酵母または修
飾ピキア属酵母を遺伝子組換え技術により、目的とする
遺伝子産物をコードする異種のＤＮＡ断片を、例えば、
第１の製造方法において例示した慣用の方法により宿主
に移入し形質転換することにより調製することができ
る。
としては、異種蛋白質を産生し得る酵母であれば特に制
限されない。前記酵母は、天然型ピキア属酵母または修
飾ピキア属酵母を遺伝子組換え技術により、目的とする
遺伝子産物をコードする異種のＤＮＡ断片を、例えば、
第１の製造方法において例示した慣用の方法により宿主
に移入し形質転換することにより調製することができ
る。
【００３９】好ましくはピキア属酵母であり、例えば P
ichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalop
hila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pi
chiaopuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salict
aria, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。さらに好ましくは、唯一の炭素源およびエネルギー
源としてメタノールを利用できるメタノール資化性（me
thylotrophic）酵母である。適切なメタノール資化性酵
母としては、具体的には栄養要求性 Pichia pastoris
ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）， Pichi
a pastoris ＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１
４）， Pichia pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１８０１７）、野生型 Pichia pastoris株（ＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）等が例示
される。第３の製造方法においては、メタノール資化性
酵母のなかでも、 Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株が
好ましく用いられる。
ichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalop
hila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pi
chiaopuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salict
aria, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。さらに好ましくは、唯一の炭素源およびエネルギー
源としてメタノールを利用できるメタノール資化性（me
thylotrophic）酵母である。適切なメタノール資化性酵
母としては、具体的には栄養要求性 Pichia pastoris
ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）， Pichi
a pastoris ＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１
４）， Pichia pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１８０１７）、野生型 Pichia pastoris株（ＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）等が例示
される。第３の製造方法においては、メタノール資化性
酵母のなかでも、 Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株が
好ましく用いられる。
【００４０】前記酵母が産生する異種蛋白質は、宿主酵
母由来のプロテアーゼの作用により分解されうる蛋白質
であれば特に限定されない。具体的には、上記第１の製
造方法にて例示された異種蛋白質が挙げられる。
母由来のプロテアーゼの作用により分解されうる蛋白質
であれば特に限定されない。具体的には、上記第１の製
造方法にて例示された異種蛋白質が挙げられる。
【００４１】本発明の第３の製造方法に用いられる培地
としては、上記第１の製造方法にて例示された慣用の炭
素源，窒素源，無機塩類，増殖因子成分などを含む培地
が適用できる。培地の種類は、特に制限されず、培養す
る酵母宿主に応じて、天然培地、半合成培地及び合成培
地の中から適宜選択することができる。また、培地の形
態も特に制限されず、寒天やゼラチンを含む固形培地で
あってもよいが、好ましくは液体培地である。
としては、上記第１の製造方法にて例示された慣用の炭
素源，窒素源，無機塩類，増殖因子成分などを含む培地
が適用できる。培地の種類は、特に制限されず、培養す
る酵母宿主に応じて、天然培地、半合成培地及び合成培
地の中から適宜選択することができる。また、培地の形
態も特に制限されず、寒天やゼラチンを含む固形培地で
あってもよいが、好ましくは液体培地である。
【００４２】本発明の第３の製造方法においては、前記
培地にアルギニンが０．２Ｍ以上含有される。好ましく
は０．２５Ｍ以上、さらに好ましくは０，２５Ｍ〜０．
３Ｍである。アルギニンの含有量を０．２Ｍ以上にする
ことによって、酵母が産生する異種蛋白質が該酵母由来
の酵素によって分解されるのを抑制する効果が得られ
る。
培地にアルギニンが０．２Ｍ以上含有される。好ましく
は０．２５Ｍ以上、さらに好ましくは０，２５Ｍ〜０．
３Ｍである。アルギニンの含有量を０．２Ｍ以上にする
ことによって、酵母が産生する異種蛋白質が該酵母由来
の酵素によって分解されるのを抑制する効果が得られ
る。
【００４３】なお、産生される蛋白質等をさらに安定化
させるため、プロテアーゼ阻害剤（例えば、キモスタチ
ン、ペプスタチン、フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド等）を添加してもよい。その添加量は、通常、１ｍ
Ｍ程度である。
させるため、プロテアーゼ阻害剤（例えば、キモスタチ
ン、ペプスタチン、フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド等）を添加してもよい。その添加量は、通常、１ｍ
Ｍ程度である。
【００４４】培地のｐＨは、好ましくは、４．８〜８．
５である。さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５であ
り、この範囲で培養を行うと異種蛋白質が酵母由来のプ
ロテアーゼによって分解されることを抑制する効果がさ
らに高くなる。
５である。さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５であ
り、この範囲で培養を行うと異種蛋白質が酵母由来のプ
ロテアーゼによって分解されることを抑制する効果がさ
らに高くなる。
【００４５】培養温度は、一般に２０〜３５℃、好まし
くは２５〜３０℃である。
くは２５〜３０℃である。
【００４６】形質転換された酵母の培養は、通常当業者
が行う方法、培地を用いるものであれば特に制限はな
く、連続培養、回分培養、半回分培養等で、第１の製造
方法で例示した種々の炭素エネルギー源および／または
栄養源を用いて行うことができる。好ましくは、半回分
培養または連続培養であり、この培養方法によれば、培
地中のアルギニンの濃度を自在にコントロールすること
ができる。
が行う方法、培地を用いるものであれば特に制限はな
く、連続培養、回分培養、半回分培養等で、第１の製造
方法で例示した種々の炭素エネルギー源および／または
栄養源を用いて行うことができる。好ましくは、半回分
培養または連続培養であり、この培養方法によれば、培
地中のアルギニンの濃度を自在にコントロールすること
ができる。
【００４７】酵母より分泌された異種蛋白質は、例え
ば、前記第１の製造方法にて例示された慣用の方法で培
養物から採取される。
ば、前記第１の製造方法にて例示された慣用の方法で培
養物から採取される。
【００４８】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するために実
施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されない。以下
の実施例および比較例で使用された各形質転換体の作成
方法は、後述の参考例１〜３に示した。
施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されない。以下
の実施例および比較例で使用された各形質転換体の作成
方法は、後述の参考例１〜３に示した。
【００４９】実施例１ （１）前培養 プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質産生株であ
る、凍結保存されていた Pichia pastoris ＨＢ−１６
株の菌体混濁液をＹＰＤ培地〔1W/V% イーストエキス
トラクト, 2 W/V% バクトペプトン（Difco 社製), 2 W
/V% グルコース含有〕５０ｍｌに植菌し、２４時間、３
０℃にて振盪培養した。
る、凍結保存されていた Pichia pastoris ＨＢ−１６
株の菌体混濁液をＹＰＤ培地〔1W/V% イーストエキス
トラクト, 2 W/V% バクトペプトン（Difco 社製), 2 W
/V% グルコース含有〕５０ｍｌに植菌し、２４時間、３
０℃にて振盪培養した。
【００５０】（２）本培養 初発培地としてＹ５Ｐ10Ｇ２Ｍ２培地（5 W/V% イース
トエキストラクト, 10W/V% バクトペプトン, 2 W/V%
グリセロール, 2W/V% メタノール含有）を用い、該培
地１リットルが入った３リットル容ミニジャーファーメ
ンターに、前培養で得られたＨＢ−１６株の培養液を濁
度（ 540ｎｍにおける吸光度）ＯＤ540≒１．０となる
ように植菌し、３０℃にて通気攪拌し高密度となるまで
培養した。通気量は、培養槽内を０．５kg/cm2に加圧し
た状態で任意の値に設定した。グリセロールが消費され
ている間は、蒸発量相当分のメタノールを培養槽に定速
流加した。培地中のグリセロールが消費し尽くされた後
に、培地中のメタノールにより蛋白質の産出が誘導され
る。培地中のプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白
質の存在は線溶活性および抗ウロキナーゼ抗体によるウ
ェスタンブロッティングによって確認した。培地中のメ
タノール濃度が２W/V%になるように流加速度を調節し
た。２Ｎ塩酸および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用い
て培地のｐＨを７．０に調整した。
トエキストラクト, 10W/V% バクトペプトン, 2 W/V%
グリセロール, 2W/V% メタノール含有）を用い、該培
地１リットルが入った３リットル容ミニジャーファーメ
ンターに、前培養で得られたＨＢ−１６株の培養液を濁
度（ 540ｎｍにおける吸光度）ＯＤ540≒１．０となる
ように植菌し、３０℃にて通気攪拌し高密度となるまで
培養した。通気量は、培養槽内を０．５kg/cm2に加圧し
た状態で任意の値に設定した。グリセロールが消費され
ている間は、蒸発量相当分のメタノールを培養槽に定速
流加した。培地中のグリセロールが消費し尽くされた後
に、培地中のメタノールにより蛋白質の産出が誘導され
る。培地中のプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白
質の存在は線溶活性および抗ウロキナーゼ抗体によるウ
ェスタンブロッティングによって確認した。培地中のメ
タノール濃度が２W/V%になるように流加速度を調節し
た。２Ｎ塩酸および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用い
て培地のｐＨを７．０に調整した。
【００５１】（３）異種蛋白質の採取 培養開始後、任意の時間にサンプリングした培養液を遠
心し（10000 rpm,５分間）、得られた培養上清を採取し
た。得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングによる解析を行った。その結
果を図１に示した。目的の異種蛋白質プロウロキナーゼ
／アネキシンＶ融合蛋白質は約９０ｋＤａの分子量をも
つ。この結果から培養時間が長くなっても分子量９０ｋ
Ｄａ未満の分解物が少ないことがわかる。また、得られ
た培養上清について参考例５に示すようにプロウロキナ
ーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量の指標となるＰＡ活
性を測定した。後述の比較例１で得られた培養上清につ
いてもＰＡ活性を測定し、本実施例にて得られた培養上
清のＰＡ活性と比較することによって得られたプロウロ
キナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の収率を求めた。そ
れによると、本実施例においては、比較例１と比べて収
率が約３５０％増大した。
心し（10000 rpm,５分間）、得られた培養上清を採取し
た。得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングによる解析を行った。その結
果を図１に示した。目的の異種蛋白質プロウロキナーゼ
／アネキシンＶ融合蛋白質は約９０ｋＤａの分子量をも
つ。この結果から培養時間が長くなっても分子量９０ｋ
Ｄａ未満の分解物が少ないことがわかる。また、得られ
た培養上清について参考例５に示すようにプロウロキナ
ーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量の指標となるＰＡ活
性を測定した。後述の比較例１で得られた培養上清につ
いてもＰＡ活性を測定し、本実施例にて得られた培養上
清のＰＡ活性と比較することによって得られたプロウロ
キナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の収率を求めた。そ
れによると、本実施例においては、比較例１と比べて収
率が約３５０％増大した。
【００５２】実施例２ 蛋白質発現時の培地のｐＨを７．５に調節したこと以外
は実施例１と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取
した。得られた培養上清について参考例４（１）に示し
たウェスタンブロッティングによる解析を行った。その
結果を図２に示した。この結果から培養時間が長くなっ
ても分子量９０ｋＤａ未満の分解物が極めて少ないこと
がわかる。本実施例で得られた培養上清についても実施
例１と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求めた。それに
よると比較例１と比べて収率が約４００％増大した。
は実施例１と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取
した。得られた培養上清について参考例４（１）に示し
たウェスタンブロッティングによる解析を行った。その
結果を図２に示した。この結果から培養時間が長くなっ
ても分子量９０ｋＤａ未満の分解物が極めて少ないこと
がわかる。本実施例で得られた培養上清についても実施
例１と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求めた。それに
よると比較例１と比べて収率が約４００％増大した。
【００５３】実施例３ 蛋白質発現時の培地のｐＨを８．２に調節したこと以外
は実施例１と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取
した。得られた培養上清について参考例４（１）に示し
たウェスタンブロッティングによる解析を行った。その
結果を図３に示した。この結果から培養時間が長くなっ
ても分子量９０ｋＤａ未満の分解物が極めて少ないこと
わかる。本実施例で得られた培養上清についても実施例
１と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求めた。それによ
ると比較例１と比べて収率が約５００％増大した。
は実施例１と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取
した。得られた培養上清について参考例４（１）に示し
たウェスタンブロッティングによる解析を行った。その
結果を図３に示した。この結果から培養時間が長くなっ
ても分子量９０ｋＤａ未満の分解物が極めて少ないこと
わかる。本実施例で得られた培養上清についても実施例
１と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求めた。それによ
ると比較例１と比べて収率が約５００％増大した。
【００５４】実施例４ （１）前培養 プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質産生株であ
る、凍結保存した Pichia pastoris ＵＭＰ２−３３株
の菌体混濁液（濁度ＯＤ540 ≒３０）１ｍｌを融解し、
ＹＰＤ培地（1W/V% イーストエキストラクト, 2 W/V%
バクトペプトン, 2 W/V% グルコース含有）５０ｍｌに
植菌し、２４時間３０℃にて培養した。
る、凍結保存した Pichia pastoris ＵＭＰ２−３３株
の菌体混濁液（濁度ＯＤ540 ≒３０）１ｍｌを融解し、
ＹＰＤ培地（1W/V% イーストエキストラクト, 2 W/V%
バクトペプトン, 2 W/V% グルコース含有）５０ｍｌに
植菌し、２４時間３０℃にて培養した。
【００５５】（２）本培養 Ｙ６Ｐ４Ｍ３培地（６W/V% イーストエキストラクト，
４％ バクトペプトン，３W/V% メタノール含有）を作
成し、ＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて該培地のｐＨを
６．５〜６．８に調整した。この培地５０ｍｌが入った
バッフル付３００ｍｌ三角フラスコに、前培養で得られ
た培養液を濁度ＯＤ540 ≒０．１となるように植菌し、
130rpm，30℃にて７２時間振盪培養した。
４％ バクトペプトン，３W/V% メタノール含有）を作
成し、ＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて該培地のｐＨを
６．５〜６．８に調整した。この培地５０ｍｌが入った
バッフル付３００ｍｌ三角フラスコに、前培養で得られ
た培養液を濁度ＯＤ540 ≒０．１となるように植菌し、
130rpm，30℃にて７２時間振盪培養した。
【００５６】（３）蛋白質の採取 上記培養液を遠心し（10000 rpm,５分間）、得られた培
養上清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（１）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図５に示した。レーン１はサイズマ
ーカー、レーン６は本実施例で得られた培養上清であ
る。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少な
いことがわかる。後述の実施例５〜８および比較例２に
て得られた培養上清についてもウェスタンブロティング
を行った。その結果も合わせて図５に示した。また、得
られた培養上清について参考例５に示すようにプロウロ
キナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量の指標となるＰ
Ａ活性を測定した。後述の比較例２で得られた培養上清
についてもＰＡ活性を測定し、本実施例にて得られた培
養上清のＰＡ活性と比較することによって得られたプロ
ウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の収率を求め
た。それによると、本実施例においては、比較例２と比
べて収率が約２００％増大した。
養上清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（１）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図５に示した。レーン１はサイズマ
ーカー、レーン６は本実施例で得られた培養上清であ
る。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少な
いことがわかる。後述の実施例５〜８および比較例２に
て得られた培養上清についてもウェスタンブロティング
を行った。その結果も合わせて図５に示した。また、得
られた培養上清について参考例５に示すようにプロウロ
キナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量の指標となるＰ
Ａ活性を測定した。後述の比較例２で得られた培養上清
についてもＰＡ活性を測定し、本実施例にて得られた培
養上清のＰＡ活性と比較することによって得られたプロ
ウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の収率を求め
た。それによると、本実施例においては、比較例２と比
べて収率が約２００％増大した。
【００５７】実施例５ バクトペプトンの含有量を６W/V%としたこと以外は実施
例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図５において、レーン５は本実施例で得られた培養上清
である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が
少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につ
いても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例２と比べて収率が約３００％増
大した。
例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図５において、レーン５は本実施例で得られた培養上清
である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が
少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につ
いても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例２と比べて収率が約３００％増
大した。
【００５８】実施例６ バクトペプトンの含有量を８W/V%としたこと以外は実施
例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図５において、レーン４は本実施例で得られた培養上清
である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が
少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につ
いても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例２と比べて収率が約４００％増
大した。
例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図５において、レーン４は本実施例で得られた培養上清
である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が
少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につ
いても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例２と比べて収率が約４００％増
大した。
【００５９】実施例７ バクトペプトンの含有量を１０W/V%としたこと以外は実
施例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。図５において、レーン３は本実施例で得られた培養
上清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解
物が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清
についても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を
求めた。それによると比較例２と比べて収率が約４５０
％増大した。
施例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。図５において、レーン３は本実施例で得られた培養
上清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解
物が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清
についても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を
求めた。それによると比較例２と比べて収率が約４５０
％増大した。
【００６０】実施例８ バクトペプトンの含有量を１２W/V%としたこと以外は実
施例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。図５において、レーン２は本実施例で得られた培養
上清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解
物が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清
についても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を
求めた。それによると比較例２と比べて収率が約５００
％増大した。
施例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。図５において、レーン２は本実施例で得られた培養
上清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解
物が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清
についても実施例４と同様にＰＡ活性を測定し、収率を
求めた。それによると比較例２と比べて収率が約５００
％増大した。
【００６１】実施例９ Ｙ１Ｐ４Ｍ３培地（1W/V% イーストエキストラクト, ４
W/V% バクトペプトン, 3 W/V% メタノール含有）にお
いてバクトペプトンのかわりにポリペプトン（商標、日
本製薬製）を４W/V%含有する培地を用いたこと以外は実
施例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングによる解析を行った。その結
果を図６に示す。図６中、レーン１はサイズマーカー、
レーン３は本実施例で得られた培養上清である。この結
果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわ
かる。なお、後述の実施例１０〜１２および比較例３で
得られた培養上清についてもウェスタンブロッティング
を行った。それらの結果も合わせて図６に示す。また、
得られた培養上清について参考例５に示すようにプロウ
ロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量の指標となる
ＰＡ活性を測定した。後述の比較例３で得られた培養上
清についてもＰＡ活性を測定し、本実施例にて得られた
培養上清のＰＡ活性と比較することによって得られたプ
ロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の収率を求め
た。それによると、本実施例においては、比較例３と比
べて収率が約２００％増大した。
W/V% バクトペプトン, 3 W/V% メタノール含有）にお
いてバクトペプトンのかわりにポリペプトン（商標、日
本製薬製）を４W/V%含有する培地を用いたこと以外は実
施例４と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングによる解析を行った。その結
果を図６に示す。図６中、レーン１はサイズマーカー、
レーン３は本実施例で得られた培養上清である。この結
果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわ
かる。なお、後述の実施例１０〜１２および比較例３で
得られた培養上清についてもウェスタンブロッティング
を行った。それらの結果も合わせて図６に示す。また、
得られた培養上清について参考例５に示すようにプロウ
ロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量の指標となる
ＰＡ活性を測定した。後述の比較例３で得られた培養上
清についてもＰＡ活性を測定し、本実施例にて得られた
培養上清のＰＡ活性と比較することによって得られたプ
ロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の収率を求め
た。それによると、本実施例においては、比較例３と比
べて収率が約２００％増大した。
【００６２】実施例１０ ポリペプトンの含有量を６W/V%としたこと以外は実施例
９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。図
６において、レーン４は本実施例で得られた培養上清で
ある。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少
ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につい
ても実施例９と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例３と比べて収率が約３００％増
大した。
９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。図
６において、レーン４は本実施例で得られた培養上清で
ある。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少
ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につい
ても実施例９と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例３と比べて収率が約３００％増
大した。
【００６３】実施例１１ ポリペプトンの含有量を８W/V%としたこと以外は実施例
９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。図
６において、レーン５は本実施例で得られた培養上清で
ある。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少
ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につい
ても実施例９と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例３と比べて収率が約４００％増
大した。
９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。図
６において、レーン５は本実施例で得られた培養上清で
ある。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少
ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につい
ても実施例９と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例３と比べて収率が約４００％増
大した。
【００６４】実施例１２ ポリペプトンの含有量を１０W/V%としたこと以外は実施
例９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図６において、レーン６は本実施例で得られた培養上清
である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が
少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につ
いても実施例９と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例３と比べて収率が約４５０％増
大した。
例９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図６において、レーン６は本実施例で得られた培養上清
である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が
少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清につ
いても実施例９と同様にＰＡ活性を測定し、収率を求め
た。それによると比較例３と比べて収率が約４５０％増
大した。
【００６５】実施例１３ 6W/V% イーストエキストラクト, 10W/V% 蛋白質の酵
素分解物，3 W/V% メタノールを含有する培地を作成
し、ＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて該培地のｐＨを６．
５〜６．８に調整した。本実施例においては、蛋白質の
酵素分解物としてペプトンＩ（ICN biochemicals製）を
用いた。この培地５０ｍｌが入ったバッフル付フラスコ
に、実施例４の前培養で得られた培養液を濁度ＯＤ540
＝０．１となるように植菌し、130rpm，30℃にて７２時
間振盪培養した。実施例４と同様にして培養上清を採取
し、得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングにる解析を行った。その結果
を図７に示す。レーン２は本実施例で得られた培養上清
である。なお比較のために、バクトペプトンを使用して
実施した実施例７で得られた培養上清についても同時に
ウェスタンブロッティングを行った（レーン１）。図７
中、矢印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質
のスポットを示す。この結果から、バクトペプトンを使
用した場合と同様に、ペプトンＩを使用した場合でも分
子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。ま
た、後述の実施例１４〜１７で得られた培養上清につい
てもウェスタンブロッティングを行った。それらの結果
も合わせて図７に示す。
素分解物，3 W/V% メタノールを含有する培地を作成
し、ＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて該培地のｐＨを６．
５〜６．８に調整した。本実施例においては、蛋白質の
酵素分解物としてペプトンＩ（ICN biochemicals製）を
用いた。この培地５０ｍｌが入ったバッフル付フラスコ
に、実施例４の前培養で得られた培養液を濁度ＯＤ540
＝０．１となるように植菌し、130rpm，30℃にて７２時
間振盪培養した。実施例４と同様にして培養上清を採取
し、得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングにる解析を行った。その結果
を図７に示す。レーン２は本実施例で得られた培養上清
である。なお比較のために、バクトペプトンを使用して
実施した実施例７で得られた培養上清についても同時に
ウェスタンブロッティングを行った（レーン１）。図７
中、矢印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質
のスポットを示す。この結果から、バクトペプトンを使
用した場合と同様に、ペプトンＩを使用した場合でも分
子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。ま
た、後述の実施例１４〜１７で得られた培養上清につい
てもウェスタンブロッティングを行った。それらの結果
も合わせて図７に示す。
【００６６】実施例１４ 蛋白質の酵素分解物としてポリペプトンＰ１（商標、日
本製薬製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にして
酵母を培養し、培養上清を採取した。図７において、レ
ーン３は本実施例で得られた培養上清である。この結果
から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。
本製薬製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にして
酵母を培養し、培養上清を採取した。図７において、レ
ーン３は本実施例で得られた培養上清である。この結果
から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。
【００６７】実施例１５ 蛋白質の酵素分解物としてペプトン（商標、極東製）を
用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養
し、培養上清を採取した。図７において、レーン４は本
実施例で得られた培養上清である。この結果から分子量
９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。
用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養
し、培養上清を採取した。図７において、レーン４は本
実施例で得られた培養上清である。この結果から分子量
９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。
【００６８】実施例１６ 蛋白質の酵素分解物としてペプトン（商標、ミクニ製）
を用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養
し、培養上清を採取した。図７において、レーン５は本
実施例で得られた培養上清である。この結果から分子量
９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。
を用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養
し、培養上清を採取した。図７において、レーン５は本
実施例で得られた培養上清である。この結果から分子量
９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。
【００６９】実施例１７ 蛋白質の酵素分解物としてラクトアルブミンハイドロリ
セート（商標、Difco製）を用いたこと以外は実施例１
３と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。図
７において、レーン６は本実施例で得られた培養上清で
ある。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少
ないことがわかる
セート（商標、Difco製）を用いたこと以外は実施例１
３と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。図
７において、レーン６は本実施例で得られた培養上清で
ある。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少
ないことがわかる
【００７０】実施例１８ 蛋白質の酵素分解物としてアシディケースペプトン（商
標、ベクトン ディクソン アンド カンパニー製）を
用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養
し、培養上清を採取した。得られた培養上清について参
考例４（１）に示したウェスタンブロッティングによる
解析を行った。その結果を図８に示す。なお比較のため
に、バクトペプトンを使用して実施した実施例７で得ら
れた培養上清についても同時にウェスタンブロッティン
グを行った（レーン１）。図８中、矢印でプロウロキナ
ーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。レー
ン２は本実施例で得られた培養上清である。この結果か
ら分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。また、後述の実施例１９〜２３で得られた培養上清
についてもウェスタンブロッティングを行った。それら
の結果も合わせて図８に示す。
標、ベクトン ディクソン アンド カンパニー製）を
用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養
し、培養上清を採取した。得られた培養上清について参
考例４（１）に示したウェスタンブロッティングによる
解析を行った。その結果を図８に示す。なお比較のため
に、バクトペプトンを使用して実施した実施例７で得ら
れた培養上清についても同時にウェスタンブロッティン
グを行った（レーン１）。図８中、矢印でプロウロキナ
ーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。レー
ン２は本実施例で得られた培養上清である。この結果か
ら分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。また、後述の実施例１９〜２３で得られた培養上清
についてもウェスタンブロッティングを行った。それら
の結果も合わせて図８に示す。
【００７１】実施例１９ 蛋白質の酵素分解物としてゲリセートペプトン（商標、
ベクトン ディクソンアンド カンパニー製）を用いた
こと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養し、培養
上清を採取した。図８において、レーン３は本実施例で
得られた培養上清である。この結果から分子量９０ｋＤ
ａ未満の分解物が少ないことがわかる。
ベクトン ディクソンアンド カンパニー製）を用いた
こと以外は実施例１３と同様にして酵母を培養し、培養
上清を採取した。図８において、レーン３は本実施例で
得られた培養上清である。この結果から分子量９０ｋＤ
ａ未満の分解物が少ないことがわかる。
【００７２】実施例２０ 蛋白質の酵素分解物としてペプトンＳ（商標、ICN bioc
hemicals製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にし
て酵母を培養し、培養上清を採取した。図８において、
レーン４は本実施例で得られた培養上清である。この結
果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわ
かる。
hemicals製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にし
て酵母を培養し、培養上清を採取した。図８において、
レーン４は本実施例で得られた培養上清である。この結
果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわ
かる。
【００７３】実施例２１ 蛋白質の酵素分解物としてペプトンＴ（商標、ICN bioc
hemicals製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にし
て酵母を培養し、培養上清を採取した。図８において、
レーン５は本実施例で得られた培養上清である。この結
果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわ
かる。
hemicals製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にし
て酵母を培養し、培養上清を採取した。図８において、
レーン５は本実施例で得られた培養上清である。この結
果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわ
かる。
【００７４】実施例２２ 蛋白質の酵素分解物としてポリペプトンＹ（商標、日本
製薬製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵
母を培養し、培養上清を採取した。図８において、レー
ン６は本実施例で得られた培養上清である。この結果か
ら分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。
製薬製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にして酵
母を培養し、培養上清を採取した。図８において、レー
ン６は本実施例で得られた培養上清である。この結果か
ら分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。
【００７５】実施例２３ 蛋白質の酵素分解物として細菌用ペプトン（商標、Oxio
d Ltd.製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にして
酵母を培養し、培養上清を採取した。図８において、レ
ーン７は本実施例で得られた培養上清である。この結果
から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。
d Ltd.製）を用いたこと以外は実施例１３と同様にして
酵母を培養し、培養上清を採取した。図８において、レ
ーン７は本実施例で得られた培養上清である。この結果
から分子量９０ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわか
る。
【００７６】実施例２４ （１）前培養 尿性トリプシンインヒビターの産生株である、凍結保存
した Pichia pastorisＩＭＵ３１００株（参考例３）の
菌体混濁液（濁度ＯＤ540 ≒６０）０．５ｍｌを融解
し、ＹＰＤ培地３ｍｌに植菌し、２４時間３０℃にて培
養した。
した Pichia pastorisＩＭＵ３１００株（参考例３）の
菌体混濁液（濁度ＯＤ540 ≒６０）０．５ｍｌを融解
し、ＹＰＤ培地３ｍｌに植菌し、２４時間３０℃にて培
養した。
【００７７】（２）本培養 ＮａＯＨおよびＨＣｌによってｐＨ６．０に調整された
Ｙ１Ｐ４Ｇ１Ｍ４培地（ 1W/V% イーストエキストラク
ト，4 W/V% バクトペプトン， 1W/V% グリセロール,
4W/V% メタノール含有）３ｍｌが入った試験管に、前培
養した培養液を濁度ＯＤ540 ≒１．０となるように植菌
し、130rpm，30℃にて振盪培養した。
Ｙ１Ｐ４Ｇ１Ｍ４培地（ 1W/V% イーストエキストラク
ト，4 W/V% バクトペプトン， 1W/V% グリセロール,
4W/V% メタノール含有）３ｍｌが入った試験管に、前培
養した培養液を濁度ＯＤ540 ≒１．０となるように植菌
し、130rpm，30℃にて振盪培養した。
【００７８】（３）蛋白質の採取 上記培養液を遠心し（10000 rpm,５分間）、得られた培
養上清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（２）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図９に示す。レーン１はサイズマー
カー、レーン３は本実施例で得られた培養上清である。
この結果から、本発明実施例で得られた培養上清には、
分子量２１ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。
なお、後述の比較例４で得られた培養上清についてもウ
ェスタンブロッティングを行った。その結果も合わせて
図９に示す。
養上清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（２）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図９に示す。レーン１はサイズマー
カー、レーン３は本実施例で得られた培養上清である。
この結果から、本発明実施例で得られた培養上清には、
分子量２１ｋＤａ未満の分解物が少ないことがわかる。
なお、後述の比較例４で得られた培養上清についてもウ
ェスタンブロッティングを行った。その結果も合わせて
図９に示す。
【００７９】実施例２５ （１）前培養 実施例４で用いた Pichia pastoris ＵＭＰ２−３３株
を用い、実施例４と同様にして前培養した。
を用い、実施例４と同様にして前培養した。
【００８０】（２）本培養 アルギニン０．２Ｍを含有するＹＰＭ３培地（ 1W/V%
イーストエキストラクト， 2W/V% バクトペプトン， 3
W/V% メタノール含有）を用い、ＮａＯＨおよびＨＣｌ
を用いて該培地のｐＨを６．５〜６．８に調整した。こ
の培地５０ｍｌが入ったバッフル付３００ｍｌ容三角フ
ラスコに、前培養で得られた培養液を濁度ＯＤ540 ≒
０．１となるように植菌し、130rpm，30℃にて７２時間
振盪培養した。
イーストエキストラクト， 2W/V% バクトペプトン， 3
W/V% メタノール含有）を用い、ＮａＯＨおよびＨＣｌ
を用いて該培地のｐＨを６．５〜６．８に調整した。こ
の培地５０ｍｌが入ったバッフル付３００ｍｌ容三角フ
ラスコに、前培養で得られた培養液を濁度ＯＤ540 ≒
０．１となるように植菌し、130rpm，30℃にて７２時間
振盪培養した。
【００８１】（３）蛋白質の採取 上記培養液を遠心し（10000 rpm,５分間）、得られた培
養上清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（１）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図１０に示す。図１０中、レーン６
はサイズマーカー、レーン３は本実施例で得られた培養
上清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解
物が少ないことがわかる。なお、後述の実施例２６およ
び２７で得られた培養上清についてもウェスタンブロッ
ティングを行った。それらの結果も合わせて図１０に示
した。また、得られた培養上清について参考例５に示す
ようにプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量
の指標となるＰＡ活性を測定した。後述の比較例５で得
られた培養上清についてもＰＡ活性を測定し、本実施例
にて得られた培養上清のＰＡ活性と比較することによっ
て得られたプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質
の収率を求めた。それによると、本実施例においては、
比較例５と比べて収率が約１００％増大した。
養上清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（１）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図１０に示す。図１０中、レーン６
はサイズマーカー、レーン３は本実施例で得られた培養
上清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解
物が少ないことがわかる。なお、後述の実施例２６およ
び２７で得られた培養上清についてもウェスタンブロッ
ティングを行った。それらの結果も合わせて図１０に示
した。また、得られた培養上清について参考例５に示す
ようにプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の量
の指標となるＰＡ活性を測定した。後述の比較例５で得
られた培養上清についてもＰＡ活性を測定し、本実施例
にて得られた培養上清のＰＡ活性と比較することによっ
て得られたプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質
の収率を求めた。それによると、本実施例においては、
比較例５と比べて収率が約１００％増大した。
【００８２】実施例２６ アルギニンの含有量を０．２５Ｍとしたこと以外は実施
例２６と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。図１０において、レーン４は本実施例で得られた培
養上清である。この結果から、分子量９０ｋＤａ未満の
分解物が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養
上清についても実施例２５と同様にＰＡ活性を測定し、
収率を求めた。それによると比較例５と比べて収率が約
１５０％増大した。
例２６と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。図１０において、レーン４は本実施例で得られた培
養上清である。この結果から、分子量９０ｋＤａ未満の
分解物が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養
上清についても実施例２５と同様にＰＡ活性を測定し、
収率を求めた。それによると比較例５と比べて収率が約
１５０％増大した。
【００８３】実施例２７ アルギニンの含有量を０．３Ｍとしたこと以外は実施例
２６と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図１０において、レーン５は本実施例で得られた培養上
清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物
が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清に
ついても実施例２５と同様にＰＡ活性を測定し、収率を
求めた。それによると比較例５と比べて収率が約２５０
％増大した。
２６と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
図１０において、レーン５は本実施例で得られた培養上
清である。この結果から分子量９０ｋＤａ未満の分解物
が少ないことがわかる。本実施例で得られた培養上清に
ついても実施例２５と同様にＰＡ活性を測定し、収率を
求めた。それによると比較例５と比べて収率が約２５０
％増大した。
【００８４】比較例１ 異種蛋白質の発現時の培地のｐＨを５．８に調節したこ
と以外は参考例４（１）に示した酵母を培養し、培養上
清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（１）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図４に示す。この結果から培養時間
が長くなるほど産生された蛋白質が分解され、分子量９
０ｋＤａ未満の分解物が実施例１〜３で得られた培養上
清に比べて多くなることがわかる。また、参考例５に示
すようにＰＡ活性を測定し、上述したように上記実施例
１〜３で求めた値と比較した。
と以外は参考例４（１）に示した酵母を培養し、培養上
清を採取した。得られた培養上清について参考例４
（１）に示したウェスタンブロッティングによる解析を
行った。その結果を図４に示す。この結果から培養時間
が長くなるほど産生された蛋白質が分解され、分子量９
０ｋＤａ未満の分解物が実施例１〜３で得られた培養上
清に比べて多くなることがわかる。また、参考例５に示
すようにＰＡ活性を測定し、上述したように上記実施例
１〜３で求めた値と比較した。
【００８５】比較例２ バクトペプトンの含有量を２W/V%としたこと以外は実施
例４と同様にして酵母を培養し、蛋白質を採取した。得
られた蛋白質について参考例４（１）に示したウェスタ
ンブロッティングによる解析を行った。その結果を図５
に示す。レーン７は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
４〜８で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤａ未
満の分解物が多いことがわかる。また、参考例５に示す
ようにＰＡ活性を測定し、上述したように上記実施例４
〜８で求めた値と比較した。
例４と同様にして酵母を培養し、蛋白質を採取した。得
られた蛋白質について参考例４（１）に示したウェスタ
ンブロッティングによる解析を行った。その結果を図５
に示す。レーン７は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
４〜８で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤａ未
満の分解物が多いことがわかる。また、参考例５に示す
ようにＰＡ活性を測定し、上述したように上記実施例４
〜８で求めた値と比較した。
【００８６】比較例３ ポリペプトンの含有量を２W/V%としたこと以外は実施例
９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。得
られた培養上清について参考例４（１）に示したウェス
タンブロッティングによる解析を行った。その結果を図
６に示す。レーン２は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
９〜１２で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤａ
のバンドがかなり薄くなり、ほぼ消失していることがわ
かる。また、参考例５に示すようにＰＡ活性を測定し、
上述したように上記実施例９〜１２で求めた値と比較し
た。
９と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。得
られた培養上清について参考例４（１）に示したウェス
タンブロッティングによる解析を行った。その結果を図
６に示す。レーン２は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
９〜１２で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤａ
のバンドがかなり薄くなり、ほぼ消失していることがわ
かる。また、参考例５に示すようにＰＡ活性を測定し、
上述したように上記実施例９〜１２で求めた値と比較し
た。
【００８７】比較例４ バクトペプトンの含有量を２W/V%としたこと以外は実施
例２４と同様にして酵母を培養し、蛋白質を採取した。
得られた蛋白質について参考例４（２）に示したウェス
タンブロッティングによる解析を行った。その結果を図
９に示す。レーン２は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
２４で得られた培養上清に比べて分子量２１ｋＤａ未満
の分解物が多いことがわかる。
例２４と同様にして酵母を培養し、蛋白質を採取した。
得られた蛋白質について参考例４（２）に示したウェス
タンブロッティングによる解析を行った。その結果を図
９に示す。レーン２は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
２４で得られた培養上清に比べて分子量２１ｋＤａ未満
の分解物が多いことがわかる。
【００８８】比較例５ アルギニンの含有量を０．１Ｍとしたこと以外は実施例
２５と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
得られた培養上清について参考例４（１）に示したウェ
スタンブロッティングを行った。その結果を図１０に示
す。レーン１は本比較例で得られた培養上清である。こ
の結果から産生された蛋白質が分解され、実施例２５〜
２７で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤａのバ
ンドが消失していることがわかる。また、参考例５に示
すようにＰＡ活性を測定し、上述したように上記実施例
２５〜２７で求めた値と比較した。
２５と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取した。
得られた培養上清について参考例４（１）に示したウェ
スタンブロッティングを行った。その結果を図１０に示
す。レーン１は本比較例で得られた培養上清である。こ
の結果から産生された蛋白質が分解され、実施例２５〜
２７で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤａのバ
ンドが消失していることがわかる。また、参考例５に示
すようにＰＡ活性を測定し、上述したように上記実施例
２５〜２７で求めた値と比較した。
【００８９】比較例６ アルギニンの含有量を０．１５Ｍとしたこと以外は実施
例２５と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングを行った。その結果を図１０
に示す。レーン２は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
２５〜２７で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤ
ａのバンドが消失していることがわかる。また、参考例
５に示すようにＰＡ活性を測定した。その結果、比較例
５で得られた培養上清と同等のＰＡ活性を示した。
例２５と同様にして酵母を培養し、培養上清を採取し
た。得られた培養上清について参考例４（１）に示した
ウェスタンブロッティングを行った。その結果を図１０
に示す。レーン２は本比較例で得られた培養上清であ
る。この結果から産生された蛋白質が分解され、実施例
２５〜２７で得られた培養上清に比べて分子量９０ｋＤ
ａのバンドが消失していることがわかる。また、参考例
５に示すようにＰＡ活性を測定した。その結果、比較例
５で得られた培養上清と同等のＰＡ活性を示した。
【００９０】参考例 参考例中の諸操作は、下記の雑誌、成書を参考として実
施した。 １．ラボマニュアル遺伝子工学、村松正實著、1989年、
丸善株式会社 ２．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、1980年、講談社 ３．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、1982年、講
談社 ４．Molecular Cloning, a laboratory manual、Second
edition, T. Maniatis等編、1989年、コールドスプリ
ングハーバー・ラボラトリー ５．Methods in Enzymology 、65巻、L. Grossman 等
編、1980年、Academic Press ６．Methods in Enzymology 、68巻、R. Wu 編、1979
年、Academic Press
施した。 １．ラボマニュアル遺伝子工学、村松正實著、1989年、
丸善株式会社 ２．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、1980年、講談社 ３．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、1982年、講
談社 ４．Molecular Cloning, a laboratory manual、Second
edition, T. Maniatis等編、1989年、コールドスプリ
ングハーバー・ラボラトリー ５．Methods in Enzymology 、65巻、L. Grossman 等
編、1980年、Academic Press ６．Methods in Enzymology 、68巻、R. Wu 編、1979
年、Academic Press
【００９１】参考例１ プロウロキナーゼ／アネキシン
Ｖ融合蛋白質産生株 ＨＢ−１６株の作成 （１）発現ベクターの作成 プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の発現ベク
ターであるプラスミドｐＭＴ０２４（特表平５−５０８
６６４号）を該公報に記載の方法によって作成した。ｐ
ＭＴ０２４は、ＡＯＸ１プロモーターの支配下に、プラ
スミドｐＪＫ１（Gene(1991) 99, 235-241）から得られ
るムコール（Mucor ）レンニン由来のシグナル配列〔平
松等、J.Biol.Chem. (1989) 264, 16862〕、ｓｃｕＰＡ
ｃＤＮＡ、ヒルジンの第５０番目から第６４番目のアミ
ノ酸残基の１５のアミノ酸残基をコードする塩基配列、
およびアネキシンＶｃＤＮＡからなる。
Ｖ融合蛋白質産生株 ＨＢ−１６株の作成 （１）発現ベクターの作成 プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の発現ベク
ターであるプラスミドｐＭＴ０２４（特表平５−５０８
６６４号）を該公報に記載の方法によって作成した。ｐ
ＭＴ０２４は、ＡＯＸ１プロモーターの支配下に、プラ
スミドｐＪＫ１（Gene(1991) 99, 235-241）から得られ
るムコール（Mucor ）レンニン由来のシグナル配列〔平
松等、J.Biol.Chem. (1989) 264, 16862〕、ｓｃｕＰＡ
ｃＤＮＡ、ヒルジンの第５０番目から第６４番目のアミ
ノ酸残基の１５のアミノ酸残基をコードする塩基配列、
およびアネキシンＶｃＤＮＡからなる。
【００９２】（２）形質転換体の作成 Cregg らの方法〔 Cregg,.J.M.等，Mol. Cell. Biol.5
(1985) 3376-3385〕を用いて、ｐＭＴ０２４をＮｏｔＩ
消化した後、 Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株（ｈｉ
ｓ４）（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）に導入した。得ら
れたＨｉｓ+ の形質転換体を採取し、ＳＤ〔 0.67% YNB
（W/O アミノ酸）、2% デキストロース〕プレート上で
ストリークすることにより単一コロニーに分離し、３０
クローンを得た。得られた３０クローンをそれぞれＨＢ
−０１〜ＨＢ−３０と名付けた。これらの中から、フラ
スコ培養を実施して培養上清の線溶活性を測定すること
によって、プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質
発現ユニットが１コピー存在するＨＢ−１６株を選択し
た。
(1985) 3376-3385〕を用いて、ｐＭＴ０２４をＮｏｔＩ
消化した後、 Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株（ｈｉ
ｓ４）（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）に導入した。得ら
れたＨｉｓ+ の形質転換体を採取し、ＳＤ〔 0.67% YNB
（W/O アミノ酸）、2% デキストロース〕プレート上で
ストリークすることにより単一コロニーに分離し、３０
クローンを得た。得られた３０クローンをそれぞれＨＢ
−０１〜ＨＢ−３０と名付けた。これらの中から、フラ
スコ培養を実施して培養上清の線溶活性を測定すること
によって、プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質
発現ユニットが１コピー存在するＨＢ−１６株を選択し
た。
【００９３】参考例２ プロウロキナーゼ／アネキシ
ンＶ融合蛋白質産生株 ＵＭＰ２−３３株の作成 （１）発現ベクターの作成 プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の発現ベク
ターとして参考例１に示したｐＭＴ０２４（特表平５−
５０８６６４号）を準備した。また、変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターのを利用した発現プラスミドとしてｐＭＭ０
４２（特開平４−２９９９８４号公報）を準備した。ｐ
ＭＭ０４２は、変異型ＡＯＸ２プロモーター（特開平４
−２９９９８４号公報）（天然型ＡＯＸ２プロモーター
内翻訳開始コドンＡＴＧから上流−２５５位のＴをＣに
置換したもの）支配下に、ヒト血清アルブミンが発現さ
れる構造を有する。まず、ｐＭＴ０２４をＸｈｏＩ消化
して．２．３ｋｂのプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融
合蛋白質遺伝子断片を分離・回収した。一方、ｐＭＭ０
４２をＡｓｕIIとＢａｍＨＩとで消化して７．７ｋｂの
ベクター断片を分離・回収した。これら２つの断片の末
端をＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造製）を
用いて平滑化し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝
酒造製）を用いてライゲーションを行った。得られたＤ
ＮＡを大腸菌ＤＨ５（東洋紡製）に導入して形質転換
し、ミニプレップ法（上記Molecu1arcloning ）にて、
変異型ＡＯＸ２プロモーターによってプロウロキナーゼ
／アネキシンＶ融合蛋白質の分泌発現が支配される構造
をもつプラスミドを選択し、ｐＭＭ１０２と名付けた。
図１１にこのｐＭＭ１０２の構築工程を示し、また図１
２に制限酵素地図を示す。
ンＶ融合蛋白質産生株 ＵＭＰ２−３３株の作成 （１）発現ベクターの作成 プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質の発現ベク
ターとして参考例１に示したｐＭＴ０２４（特表平５−
５０８６６４号）を準備した。また、変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターのを利用した発現プラスミドとしてｐＭＭ０
４２（特開平４−２９９９８４号公報）を準備した。ｐ
ＭＭ０４２は、変異型ＡＯＸ２プロモーター（特開平４
−２９９９８４号公報）（天然型ＡＯＸ２プロモーター
内翻訳開始コドンＡＴＧから上流−２５５位のＴをＣに
置換したもの）支配下に、ヒト血清アルブミンが発現さ
れる構造を有する。まず、ｐＭＴ０２４をＸｈｏＩ消化
して．２．３ｋｂのプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融
合蛋白質遺伝子断片を分離・回収した。一方、ｐＭＭ０
４２をＡｓｕIIとＢａｍＨＩとで消化して７．７ｋｂの
ベクター断片を分離・回収した。これら２つの断片の末
端をＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造製）を
用いて平滑化し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝
酒造製）を用いてライゲーションを行った。得られたＤ
ＮＡを大腸菌ＤＨ５（東洋紡製）に導入して形質転換
し、ミニプレップ法（上記Molecu1arcloning ）にて、
変異型ＡＯＸ２プロモーターによってプロウロキナーゼ
／アネキシンＶ融合蛋白質の分泌発現が支配される構造
をもつプラスミドを選択し、ｐＭＭ１０２と名付けた。
図１１にこのｐＭＭ１０２の構築工程を示し、また図１
２に制限酵素地図を示す。
【００９４】（２）形質転換体の作成 ｐＭＭ１０２をＳｔｕＩ消化した後、塩化リチウム法を
用いて Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）
（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）に導入した。得られたＨ
ｉｓ+ の形質転換体を採取し、ＳＤ〔 0.67% YNB（W/O
アミノ酸）、2%デキストロース〕プレート上でストリー
クすることにより単一コロニーに分離し、１２０クロー
ンが得られた。これらのクローンをそれぞれ2W/V% カザ
ミノ酸, 2W/V% メタノール、 5W/V%イーストエキストラ
クト, 10W/V% バクトペプトンを含有する培地2 ｍｌの
入った試験管にて160rpm，29.5℃で３日間培養した。参
考例５に示した方法にてＰＡ活性を測定し、ＰＡ活性の
高い株を選択した。これらの中から、発現プラスミドが
２コピー存在するＵＭＰ２−３３株を選択した。
用いて Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）
（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）に導入した。得られたＨ
ｉｓ+ の形質転換体を採取し、ＳＤ〔 0.67% YNB（W/O
アミノ酸）、2%デキストロース〕プレート上でストリー
クすることにより単一コロニーに分離し、１２０クロー
ンが得られた。これらのクローンをそれぞれ2W/V% カザ
ミノ酸, 2W/V% メタノール、 5W/V%イーストエキストラ
クト, 10W/V% バクトペプトンを含有する培地2 ｍｌの
入った試験管にて160rpm，29.5℃で３日間培養した。参
考例５に示した方法にてＰＡ活性を測定し、ＰＡ活性の
高い株を選択した。これらの中から、発現プラスミドが
２コピー存在するＵＭＰ２−３３株を選択した。
【００９５】参考例３ ヒト尿性トリプシンインヒビタ
ー産生株 ＩＭＵ３１００株の作成 （１）成熟型ヒト尿性トリプシンインヒビター遺伝子の
カセット化 Kaumeyer等の報告〔J.F.Kaumeyer等，Nucl. Acids Res.
14(20), p7839-7850, 1986〕に従い、ヒト肝由来ｃＤ
ＮＡ λｇｔ１０ファージライブラリー（クローンテッ
ク製）からプラークハイブリダイゼーション法により尿
性トリプシンインヒビター（以下、ＵＴＩと略す）ｃＤ
ＮＡをクローニングした。得られたファージクローンか
らｃＤＮＡを制限酵素EcoRI で切り出し、プラスミドpU
C19 のEcoRI 部位にサブクローニングした（プラスミド
♯７、図１３）。得られたUTIcDNA の塩基配列（１位〜
１２２１位、塩基番号は上記Kaumyer 等の報告に従っ
た。以下同様）は、Kaumyer 等の報告している配列と一
致した。成熟型ＵＴＩをコードしている遺伝子は、上記
塩基配列（１位〜１２２１位）中、６６１位〜１１０１
位に担持されていることから、この領域のカセット化を
おこなった。プラスミド♯７を５０４位にて制限酵素Bb
eIで消化後、DNA Blunting kit（宝酒造製）で平滑末端
化し、さらにEcoRI で消化して得られたＵＴＩ遺伝子を
含むＤＮＡ断片をpUC19 の制限酵素SmaI-EcoRI部位間に
サブクローニングした（プラスミド#7/BbeI-ERI 、図１
３) 。
ー産生株 ＩＭＵ３１００株の作成 （１）成熟型ヒト尿性トリプシンインヒビター遺伝子の
カセット化 Kaumeyer等の報告〔J.F.Kaumeyer等，Nucl. Acids Res.
14(20), p7839-7850, 1986〕に従い、ヒト肝由来ｃＤ
ＮＡ λｇｔ１０ファージライブラリー（クローンテッ
ク製）からプラークハイブリダイゼーション法により尿
性トリプシンインヒビター（以下、ＵＴＩと略す）ｃＤ
ＮＡをクローニングした。得られたファージクローンか
らｃＤＮＡを制限酵素EcoRI で切り出し、プラスミドpU
C19 のEcoRI 部位にサブクローニングした（プラスミド
♯７、図１３）。得られたUTIcDNA の塩基配列（１位〜
１２２１位、塩基番号は上記Kaumyer 等の報告に従っ
た。以下同様）は、Kaumyer 等の報告している配列と一
致した。成熟型ＵＴＩをコードしている遺伝子は、上記
塩基配列（１位〜１２２１位）中、６６１位〜１１０１
位に担持されていることから、この領域のカセット化を
おこなった。プラスミド♯７を５０４位にて制限酵素Bb
eIで消化後、DNA Blunting kit（宝酒造製）で平滑末端
化し、さらにEcoRI で消化して得られたＵＴＩ遺伝子を
含むＤＮＡ断片をpUC19 の制限酵素SmaI-EcoRI部位間に
サブクローニングした（プラスミド#7/BbeI-ERI 、図１
３) 。
【００９６】ＵＴＩｃＤＮＡの塩基配列を精査した結
果、６６０位のＧをＣに置換することで新たに制限酵素
Aor51HI 認識部位が生じることが判明した。これによっ
て成熟型ＵＴＩ（上記Kaumyer 等の文献に開示される１
４７アミノ酸からなるＵＴＩ）のＮ末端に相当する部位
で遺伝子が開裂でき、以降の発現系構築に非常に有効で
あると考えられた。このことからU.S.E. Mutagenesis k
it（ファルマルシア製）を用いた部位特異的突然変異法
により、プラスミド#7/BbeI-ERI 上にて、上述のように
６６０位のＧをＣに置換し、プラスミドpKT-N を得た(
図１４）。変異導入用プライマーは、ＤＮＡ合成機 mo
del 392 （アプライドバイオシステム・ジャパン製）で
合成した。
果、６６０位のＧをＣに置換することで新たに制限酵素
Aor51HI 認識部位が生じることが判明した。これによっ
て成熟型ＵＴＩ（上記Kaumyer 等の文献に開示される１
４７アミノ酸からなるＵＴＩ）のＮ末端に相当する部位
で遺伝子が開裂でき、以降の発現系構築に非常に有効で
あると考えられた。このことからU.S.E. Mutagenesis k
it（ファルマルシア製）を用いた部位特異的突然変異法
により、プラスミド#7/BbeI-ERI 上にて、上述のように
６６０位のＧをＣに置換し、プラスミドpKT-N を得た(
図１４）。変異導入用プライマーは、ＤＮＡ合成機 mo
del 392 （アプライドバイオシステム・ジャパン製）で
合成した。
【００９７】次に、3'非翻訳領域のポリＡ配列を除去す
るために、pKT-N に担持された成熟型ＵＴＩ遺伝子の１
１４６位のSmaI部位にEcoRI リンカー（宝酒造製）を挿
入したプラスミドpKT-NCを作成した（図１４）。このpK
T-NCをAor51HI-EcoRI 消化することにより、5 ’末端が
成熟型ＵＴＩのＮ末端に相当しかつ3'非翻訳領域のポリ
Ａ配列が除去されたＵＴＩ遺伝子を得ることができる。
るために、pKT-N に担持された成熟型ＵＴＩ遺伝子の１
１４６位のSmaI部位にEcoRI リンカー（宝酒造製）を挿
入したプラスミドpKT-NCを作成した（図１４）。このpK
T-NCをAor51HI-EcoRI 消化することにより、5 ’末端が
成熟型ＵＴＩのＮ末端に相当しかつ3'非翻訳領域のポリ
Ａ配列が除去されたＵＴＩ遺伝子を得ることができる。
【００９８】（２）発現ベクターの作成 Chang （C.N.Chang 等，Mol.Cell.Biol.6,p1812-1819,
1986）等の報告をもとに、ピキア属酵母で利用可能な分
泌シグナルペプチドのひとつであるパン酵母インベルタ
ーゼシグナルペプチド（以下、ＳＵＣ２シグナルと略
す）に対応した合成ＤＮＡを作成した。その際、５’末
端がEcoRI 連結末端、３’末端が平滑末端となるように
した。また、参考例３（１）で作成したプラスミドpKT-
NCをAor51HI-EcoRI 消化し、５’末端が成熟型ＵＴＩの
Ｎ末端に相当し、かつ3'非翻訳領域のポリＡ配列が除去
されたＵＴＩ遺伝子を調製した。これらＳＵＣ２シグナ
ルに対応した合成ＤＮＡおよび成熟型ＵＴＩ遺伝子を、
ピキア属酵母での発現ベクターであるｐＡＯ８０７Ｎ
（特開平２−１０４２９０号公報）のクローニングサイ
トであるＥｃｏＲＩ部位に連結し、成熟型ＵＴＩ発現プ
ラスミドpKT310を作成した（図１５）。pKT310に連結さ
れたＳＵＣ２シグナル／ＵＴＩ遺伝子の塩基配列および
アミノ酸配列を図１６に示す。
1986）等の報告をもとに、ピキア属酵母で利用可能な分
泌シグナルペプチドのひとつであるパン酵母インベルタ
ーゼシグナルペプチド（以下、ＳＵＣ２シグナルと略
す）に対応した合成ＤＮＡを作成した。その際、５’末
端がEcoRI 連結末端、３’末端が平滑末端となるように
した。また、参考例３（１）で作成したプラスミドpKT-
NCをAor51HI-EcoRI 消化し、５’末端が成熟型ＵＴＩの
Ｎ末端に相当し、かつ3'非翻訳領域のポリＡ配列が除去
されたＵＴＩ遺伝子を調製した。これらＳＵＣ２シグナ
ルに対応した合成ＤＮＡおよび成熟型ＵＴＩ遺伝子を、
ピキア属酵母での発現ベクターであるｐＡＯ８０７Ｎ
（特開平２−１０４２９０号公報）のクローニングサイ
トであるＥｃｏＲＩ部位に連結し、成熟型ＵＴＩ発現プ
ラスミドpKT310を作成した（図１５）。pKT310に連結さ
れたＳＵＣ２シグナル／ＵＴＩ遺伝子の塩基配列および
アミノ酸配列を図１６に示す。
【００９９】（３）形質転換体の作成 参考例１（２）と同様に、Cregg 等の方法に従って、pK
T310を制限酵素StuI消化後、 Pichia pastoris GTS115
株に導入した。ＳＤ平板培地〔0.67W/V% ＹＮＢ（Ｗ／
Ｏ アミノ酸）、２W/V% デキストロース、1.5 W/V%
寒天含有〕で選択した形質転換体をＳＤ培地で培養後、
ＹＰＭ培地（１W/V% イーストエキストラクト、２W/V%
バクトペプトン、２W/V% メタノール含有）に１０％
植菌し、３０℃で４日間振盪培養した（130rpm，NR-1O
，大洋科学工業製）。参考例４（２）に示すウェスタ
ンブロッティングによって、培養上清中に発現されたＵ
ＴＩを検出し、良好な発現を示すＩＭＵ３１００株を得
た。
T310を制限酵素StuI消化後、 Pichia pastoris GTS115
株に導入した。ＳＤ平板培地〔0.67W/V% ＹＮＢ（Ｗ／
Ｏ アミノ酸）、２W/V% デキストロース、1.5 W/V%
寒天含有〕で選択した形質転換体をＳＤ培地で培養後、
ＹＰＭ培地（１W/V% イーストエキストラクト、２W/V%
バクトペプトン、２W/V% メタノール含有）に１０％
植菌し、３０℃で４日間振盪培養した（130rpm，NR-1O
，大洋科学工業製）。参考例４（２）に示すウェスタ
ンブロッティングによって、培養上清中に発現されたＵ
ＴＩを検出し、良好な発現を示すＩＭＵ３１００株を得
た。
【０１００】参考例４ ウェスタンブロッティング （１）プロウロキナーゼ／アネキシンＶ 7.5 ×9.0 ｃｍの大きさに切断したＰＶＤＦ膜イモビロ
ン（ミリポア製）に対し、ブロッティングユニット（フ
ナコシ製）を用いて、 180ｍＡ，１時間，室温にてブロ
ッティングを行った。ブロッティング終了後、ＰＶＤＦ
膜上にウェルの位置をボールペンで記入し、該ＰＶＤＦ
膜をＴＴＢＳ〔 100ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5
），0.9% ＮａＣｌ，0.1% Ｔｗｅｅｎ20〕を用いて1
5分間２回洗浄した。ＰＶＤＦ膜を10ｍｌの一次抗体溶
液とともにハイブリダイゼーションバッグ( 住友金属工
業製、スマイライトハイブリダイゼーションバッグＨＢ
100）に入れ、４℃にて一夜放置した。前記一次抗体溶
液としては、抗ＵＫウマＩｇＧ（ミドリ十字製）をＴＴ
ＢＳで2000倍に希釈して用いた。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ
で15分間３回洗浄した後、該膜を10ｍｌの二次抗体溶液
とともにハイブリダイゼーションバッグに入れ、ローテ
ーター上で室温にて３０分間ゆっくりと攪拌した。前記
二次抗体溶液としては、ビオチン化抗ウマＩｇＧヤギ抗
体（Vector Laboratories 製）をＴＴＢＳで 500倍に希
釈して用いた。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで15分間３回洗浄
した後、該膜を10ｍｌのビオチン標識ホースラディッシ
ュパーオキシダーセ（ＨＲＰ）／アビジン溶液とともに
ハイブリダイゼーションバッグに入れ、ローテーター上
で室温にて３０分間ゆっくりと攪拌した。ビオチン標識
ＨＲＰ／アビジン溶液としては、Vectastain ABC kit
（Vector Laboratories 製）のＡ液およびＢ液をそれぞ
れ２滴ずつＴＴＢＳ10ｍｌに添加攪拌し、３０分以上放
置した溶液を使用した。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで15分間
３回洗浄した後、該膜をアマーシャムＥＣＬウェスタン
ブロッティング検出システムのルミノール溶液（アマー
シャム製）に１分間浸析した。ＰＶＤＦ膜を風乾後、ハ
イブリダイゼ─ションバッグにはさみ、Ｘ線フィルムに
５秒〜１分間露光した。
ン（ミリポア製）に対し、ブロッティングユニット（フ
ナコシ製）を用いて、 180ｍＡ，１時間，室温にてブロ
ッティングを行った。ブロッティング終了後、ＰＶＤＦ
膜上にウェルの位置をボールペンで記入し、該ＰＶＤＦ
膜をＴＴＢＳ〔 100ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5
），0.9% ＮａＣｌ，0.1% Ｔｗｅｅｎ20〕を用いて1
5分間２回洗浄した。ＰＶＤＦ膜を10ｍｌの一次抗体溶
液とともにハイブリダイゼーションバッグ( 住友金属工
業製、スマイライトハイブリダイゼーションバッグＨＢ
100）に入れ、４℃にて一夜放置した。前記一次抗体溶
液としては、抗ＵＫウマＩｇＧ（ミドリ十字製）をＴＴ
ＢＳで2000倍に希釈して用いた。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ
で15分間３回洗浄した後、該膜を10ｍｌの二次抗体溶液
とともにハイブリダイゼーションバッグに入れ、ローテ
ーター上で室温にて３０分間ゆっくりと攪拌した。前記
二次抗体溶液としては、ビオチン化抗ウマＩｇＧヤギ抗
体（Vector Laboratories 製）をＴＴＢＳで 500倍に希
釈して用いた。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで15分間３回洗浄
した後、該膜を10ｍｌのビオチン標識ホースラディッシ
ュパーオキシダーセ（ＨＲＰ）／アビジン溶液とともに
ハイブリダイゼーションバッグに入れ、ローテーター上
で室温にて３０分間ゆっくりと攪拌した。ビオチン標識
ＨＲＰ／アビジン溶液としては、Vectastain ABC kit
（Vector Laboratories 製）のＡ液およびＢ液をそれぞ
れ２滴ずつＴＴＢＳ10ｍｌに添加攪拌し、３０分以上放
置した溶液を使用した。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで15分間
３回洗浄した後、該膜をアマーシャムＥＣＬウェスタン
ブロッティング検出システムのルミノール溶液（アマー
シャム製）に１分間浸析した。ＰＶＤＦ膜を風乾後、ハ
イブリダイゼ─ションバッグにはさみ、Ｘ線フィルムに
５秒〜１分間露光した。
【０１０１】（２）ＵＴＩ １５／２５マルチゲル（第一化学薬品製）を用いて、培
養上清をLeammli 法に従って還元条件下SDS-ポリアクリ
ルアミド電気泳動をした後、参考例４（１）と同様にＰ
ＶＤＦ膜にブロッティングした。免疫染色は、一次抗体
に抗ヒト・インター−α−トリプシンインヒビター抗体
（ＤＡＫＯ製）、二次抗体にビオチン化抗ウサギIgG ヤ
ギ抗体（Vector Laboratories 製）を用いて、参考例４
（１）と同様に処理した。
養上清をLeammli 法に従って還元条件下SDS-ポリアクリ
ルアミド電気泳動をした後、参考例４（１）と同様にＰ
ＶＤＦ膜にブロッティングした。免疫染色は、一次抗体
に抗ヒト・インター−α−トリプシンインヒビター抗体
（ＤＡＫＯ製）、二次抗体にビオチン化抗ウサギIgG ヤ
ギ抗体（Vector Laboratories 製）を用いて、参考例４
（１）と同様に処理した。
【０１０２】参考例５ ＰＡ活性の測定 ＰＡ活性は、Levin, E. G., らの方法（フィブリンプレ
ート法、J.Cell Bio.,94, 631-636, 1982）に従って測
定した。６０℃の２％寒天溶液（３０ｍｌ）に１００単
位／ｍｌのヒトトロンビンを２％寒天溶液の１／５０容
（６００μｌ）加えた後、すぐに５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）、 100ｍＭＮａＣｌ、0.1 ％
ＮａＮ3 中に１％ウシフィブリノーゲンを溶解した３７
℃の溶液を２％寒天溶液と等量（３０ｍｌ）混合した。
この混合液を水平なプレートに入れ、寒天を固化させ
た。固化した白濁の寒天層に直径４ｍｍの穴をあけ、サ
ンプルを２０μｌずつこの穴に注入し、３７℃にて１２
時間放置した。サンプルがＰＡ活性を有する場合、白濁
した寒天層には透明になった溶解円が認められるように
なった。この溶解円の直径を測定し、ウロキナーゼの標
準品（ミドリ十字製）との比較によりＰＡ活性を測定し
た。
ート法、J.Cell Bio.,94, 631-636, 1982）に従って測
定した。６０℃の２％寒天溶液（３０ｍｌ）に１００単
位／ｍｌのヒトトロンビンを２％寒天溶液の１／５０容
（６００μｌ）加えた後、すぐに５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）、 100ｍＭＮａＣｌ、0.1 ％
ＮａＮ3 中に１％ウシフィブリノーゲンを溶解した３７
℃の溶液を２％寒天溶液と等量（３０ｍｌ）混合した。
この混合液を水平なプレートに入れ、寒天を固化させ
た。固化した白濁の寒天層に直径４ｍｍの穴をあけ、サ
ンプルを２０μｌずつこの穴に注入し、３７℃にて１２
時間放置した。サンプルがＰＡ活性を有する場合、白濁
した寒天層には透明になった溶解円が認められるように
なった。この溶解円の直径を測定し、ウロキナーゼの標
準品（ミドリ十字製）との比較によりＰＡ活性を測定し
た。
【０１０３】
【効果】本発明の蛋白質の製造方法によれば、特に宿主
由来のプロテアーゼによって菌体によって産生された蛋
白質が分解されることを著しく抑制できるので、該蛋白
質を安定かつ多量に効率よく得ることができる。本発明
の第１の製造方法においては、酵母が異種蛋白質を発現
する時期に、培地のｐＨを所定の範囲に調節して該酵母
を培養するだけで、極めて簡易かつ安価な方法で該蛋白
質の分解を顕著に抑制することができる。また、本発明
の第２または第３の製造方法においては、酵母を、蛋白
質の酵素分解物またはアルギニンを所定量含有する培地
で培養するという極めて簡易な方法で該蛋白質の分解を
顕著に抑制することができる。さらに、本発明の第１の
製造方法において適用されるｐＨの範囲に調整され、か
つ第２、第３の製造方法において適用された蛋白質の酵
素分解物および／またはアルギニンを所定量含有する培
地で培養することにより、さらに大きな効果を得ること
が可能である。本発明の蛋白質の製造方法は、特にピキ
ア属酵母を用いて異種蛋白質を生産する場合に好適に用
いることができる。
由来のプロテアーゼによって菌体によって産生された蛋
白質が分解されることを著しく抑制できるので、該蛋白
質を安定かつ多量に効率よく得ることができる。本発明
の第１の製造方法においては、酵母が異種蛋白質を発現
する時期に、培地のｐＨを所定の範囲に調節して該酵母
を培養するだけで、極めて簡易かつ安価な方法で該蛋白
質の分解を顕著に抑制することができる。また、本発明
の第２または第３の製造方法においては、酵母を、蛋白
質の酵素分解物またはアルギニンを所定量含有する培地
で培養するという極めて簡易な方法で該蛋白質の分解を
顕著に抑制することができる。さらに、本発明の第１の
製造方法において適用されるｐＨの範囲に調整され、か
つ第２、第３の製造方法において適用された蛋白質の酵
素分解物および／またはアルギニンを所定量含有する培
地で培養することにより、さらに大きな効果を得ること
が可能である。本発明の蛋白質の製造方法は、特にピキ
ア属酵母を用いて異種蛋白質を生産する場合に好適に用
いることができる。
【図１】実施例１で得られた培養上清についてウェスタ
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
【図２】実施例２で得られた培養上清についてウェスタ
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
【図３】実施例３で得られた培養上清についてウェスタ
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
【図４】比較例１で得られた培養上清についてウェスタ
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
ンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真
である。図中、ＳＭはサイズマーカーを示す。また、矢
印でプロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポ
ットを示す。
【図５】実施例４〜８および比較例２で得られた各培養
上清についてウェスタンブロッティングを行った結果を
示す図面に代わる写真である。図中、矢印でプロウロキ
ナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：サイズマーカー レーン２：実施例８で得られた培養上清 レーン３：実施例７で得られた培養上清 レーン４：実施例６で得られた培養上清 レーン５：実施例５で得られた培養上清 レーン６：実施例４で得られた培養上清 レーン７：比較例２で得られた培養上清
上清についてウェスタンブロッティングを行った結果を
示す図面に代わる写真である。図中、矢印でプロウロキ
ナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：サイズマーカー レーン２：実施例８で得られた培養上清 レーン３：実施例７で得られた培養上清 レーン４：実施例６で得られた培養上清 レーン５：実施例５で得られた培養上清 レーン６：実施例４で得られた培養上清 レーン７：比較例２で得られた培養上清
【図６】実施例９〜１２および比較例３で得られた各培
養上清についてウェスタンブロッティングを行った結果
を示す図面に代わる写真である。図中、矢印でプロウロ
キナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：サイズマーカー レーン２：比較例３で得られた培養上清 レーン３：実施例９で得られた培養上清 レーン４：実施例１０で得られた培養上清 レーン５：実施例１１で得られた培養上清 レーン６：実施例１２で得られた培養上清
養上清についてウェスタンブロッティングを行った結果
を示す図面に代わる写真である。図中、矢印でプロウロ
キナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：サイズマーカー レーン２：比較例３で得られた培養上清 レーン３：実施例９で得られた培養上清 レーン４：実施例１０で得られた培養上清 レーン５：実施例１１で得られた培養上清 レーン６：実施例１２で得られた培養上清
【図７】実施例１３〜１７で得られた各培養上清につい
てウェスタンブロッティングを行った結果を示す図面に
代わる写真である。実施例７で得られた培養上清を比較
のために用いた。図中、矢印でプロウロキナーゼ／アネ
キシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：実施例７で得られた培養上清 レーン２：実施例１３で得られた培養上清 レーン３：実施例１４で得られた培養上清 レーン４：実施例１５で得られた培養上清 レーン５：実施例１６で得られた培養上清 レーン６：実施例１７で得られた培養上清
てウェスタンブロッティングを行った結果を示す図面に
代わる写真である。実施例７で得られた培養上清を比較
のために用いた。図中、矢印でプロウロキナーゼ／アネ
キシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：実施例７で得られた培養上清 レーン２：実施例１３で得られた培養上清 レーン３：実施例１４で得られた培養上清 レーン４：実施例１５で得られた培養上清 レーン５：実施例１６で得られた培養上清 レーン６：実施例１７で得られた培養上清
【図８】実施例１８〜２３で得られた各培養上清につい
てウェスタンブロッティングを行った結果を示す図面に
代わる写真である。実施例７で得られた培養上清を比較
のために用いた。図中、矢印でプロウロキナーゼ／アネ
キシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：実施例７で得られた培養上清 レーン２：実施例１８で得られた培養上清 レーン３：実施例１９で得られた培養上清 レーン４：実施例２０で得られた培養上清 レーン５：実施例２１で得られた培養上清 レーン６：実施例２２で得られた培養上清 レーン７：実施例２３で得られた培養上清
てウェスタンブロッティングを行った結果を示す図面に
代わる写真である。実施例７で得られた培養上清を比較
のために用いた。図中、矢印でプロウロキナーゼ／アネ
キシンＶ融合蛋白質のスポットを示す。 レーン１：実施例７で得られた培養上清 レーン２：実施例１８で得られた培養上清 レーン３：実施例１９で得られた培養上清 レーン４：実施例２０で得られた培養上清 レーン５：実施例２１で得られた培養上清 レーン６：実施例２２で得られた培養上清 レーン７：実施例２３で得られた培養上清
【図９】実施例２４で得られた各培養上清についてウェ
スタンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる
写真である。図中、矢印で尿性トリプシンインヒビター
のスポットを示す。 レーン１：サイズマーカー レーン２：比較例４で得られた培養上清 レーン３：実施例２４で得られた培養上清
スタンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる
写真である。図中、矢印で尿性トリプシンインヒビター
のスポットを示す。 レーン１：サイズマーカー レーン２：比較例４で得られた培養上清 レーン３：実施例２４で得られた培養上清
【図１０】実施例２５〜２７および比較例４，５で得ら
れた各培養上清についてウェスタンブロッティングを行
った結果を示す図面に代わる写真である。図中、矢印で
プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポット
を示す。 レーン１：比較例４で得られた培養上清 レーン２：比較例５で得られた培養上清 レーン３：実施例２５で得られた培養上清 レーン４：実施例２６で得られた培養上清 レーン５：実施例２７で得られた培養上清 レーン６：サイズマーカー
れた各培養上清についてウェスタンブロッティングを行
った結果を示す図面に代わる写真である。図中、矢印で
プロウロキナーゼ／アネキシンＶ融合蛋白質のスポット
を示す。 レーン１：比較例４で得られた培養上清 レーン２：比較例５で得られた培養上清 レーン３：実施例２５で得られた培養上清 レーン４：実施例２６で得られた培養上清 レーン５：実施例２７で得られた培養上清 レーン６：サイズマーカー
【図１１】ｐＭＭ１０２の構築工程を示す図である。
【図１２】ｐＭＭ１０２の制限酵素地図である。
【図１３】＃７／ＢｂｅＩ−ＥＲＩの構築工程を示す図
である。
である。
【図１４】＃７／ＢｂｅＩ−ＥＲＩからｐＫＴ−ＮＣの
構築工程を示す図である。
構築工程を示す図である。
【図１５】ｐＫＴ−ＮＣおよびｐＡＯ８０７Ｎの制限酵
素地図、およびｐＫＴ３１０の構築工程を示す図であ
る。
素地図、およびｐＫＴ３１０の構築工程を示す図であ
る。
【図１６】ｐＫＴ３１０に担持されたＳＵＣ２シグナル
／成熟型ＵＴＩ遺伝子の塩基配列及びそれによってコー
ドされるアミノ酸配列（一文字表記）を示す図である。
／成熟型ＵＴＩ遺伝子の塩基配列及びそれによってコー
ドされるアミノ酸配列（一文字表記）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 三浦 正巳 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 小林 薫 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 異種蛋白質を発現し得るように形質転換
された酵母を、該異種蛋白質の発現と同時期に、培地の
ｐＨを６．５〜８．５に保持して培養し、得られた培養
物から該異種蛋白質を採取することを特徴とする異種蛋
白質の製造方法。 - 【請求項２】 異種蛋白質を発現し得るように形質転換
された酵母を、蛋白質の酵素分解物を４W/V%以上含有す
る培地にて培養し、得られた培養物から該異種蛋白質を
採取することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 - 【請求項３】 異種蛋白質を発現し得るように形質転換
された酵母を、アルギニンを０．２Ｍ以上含有する培地
にて培養し、得られた培養物から該異種蛋白質を採取す
ることを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 - 【請求項４】 酵母がピキア属酵母であることを特徴と
する請求項１、２または３記載の異種蛋白質の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22469095A JPH0947295A (ja) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | 蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22469095A JPH0947295A (ja) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | 蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0947295A true JPH0947295A (ja) | 1997-02-18 |
Family
ID=16817716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22469095A Pending JPH0947295A (ja) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | 蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0947295A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100241266B1 (ko) * | 1997-08-19 | 2000-02-01 | 성재갑 | 재조합 효모에서 인간 알파-인터페론을 고수율로 생산하는 방법 |
| CN1111200C (zh) * | 1997-08-06 | 2003-06-11 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 重组鱼生长激素基因工程酵母菌pichia pastoris |
| WO2010058616A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | グルタミン酸高含有酵母の製造方法 |
| WO2010058527A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | グルタミン酸高含有酵母の製造方法 |
-
1995
- 1995-08-08 JP JP22469095A patent/JPH0947295A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1111200C (zh) * | 1997-08-06 | 2003-06-11 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 重组鱼生长激素基因工程酵母菌pichia pastoris |
| KR100241266B1 (ko) * | 1997-08-19 | 2000-02-01 | 성재갑 | 재조합 효모에서 인간 알파-인터페론을 고수율로 생산하는 방법 |
| WO2010058616A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | グルタミン酸高含有酵母の製造方法 |
| WO2010058527A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | グルタミン酸高含有酵母の製造方法 |
| JP2010148517A (ja) * | 2008-11-18 | 2010-07-08 | Asahi Breweries Ltd | グルタミン酸高含有酵母 |
| JP4503700B1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-07-14 | アサヒビール株式会社 | グルタミン酸高含有酵母の製造方法 |
| US9005683B2 (en) | 2008-11-18 | 2015-04-14 | Asahi Group Holdings, Ltd. | Method for producing yeast with high glutamic acid content |
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