JPH07500008A - 酵母プロモーター及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １３、組換え遺伝子の発現のための、請求の範囲１−９のいずれか１つに記載の ＤＮＡ配列の利用。

１４、プロモーターの各側に２つの反対の配向で挿入された組換え遺伝子の同時 発現のための、請求の範囲１３に記載の利用。

１５　薬剤又は農産物−食料品として興味深い蛋白質をコードする遺伝子の発現 のための、請求の範囲１３及び１４に記載の利用。

１６　請求の範囲１０−１２のいずれか１つに記載の組換え細胞を培養し、生産 された蛋白質を回収する、組換え蛋白質の生産の方法。

１７　薬剤又は農産物−食料品として興味深い蛋白質の生産のための、請求の範 囲１６に記載の方法。

１８　蛋白質が好ましくはヒト血清アルブミン又はその分子変異体の１つである 、請求の範囲１７に記載の方法。

明　細　書 酵母プロモーター及びその利用 本発明は分子生物学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は転写プロモー ター活性を有する新規ＤＮＡ配列、この配列を含むベクターの発現及び異種蛋白 質などの組換え蛋白質の生産のためのその利用に関する。本発明は又、このＤＮ Ａ配列を含む組換え細胞に関する。

分子生物学の分野における進歩により、微生物が異種蛋白質を生産できるように それを改変することが可能になった。特に多数の遺伝的研究がＥ、コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）バクテリアに集中した。しかしこれらの新規生産法の工業的用途は、特 にこれらの組換え微生物における遺伝子発現の効率の問題によりまだ限られてい る。かくしてこれらの生産系の性能を上げる目的で、多量の異種蛋白質の発現を 可能にする強いプロモーターを単離するための研究が行われてきた。Ｅ、コリの 場合、トリプトファン及びラクトースオペロンのプロモーターを特に挙げること ができる。

さらに最近になって、Ｓ、セレビシアエ（ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母にお いて、解糖に関連する遺伝子由来のプロモーターに研究が集中した。特に３−ホ スホグリセレートキナーゼ、ＰＧＫ遺伝子プロモーターに関する研究（Ｄｏｂｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、１０，１９８２．２６ ２５：Ｈｉｔｚｅｍａｎｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　１９８２．７７９１）、グリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒド ロゲナＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４．１９７９，９８３９；Ｍｕｓｔｉｅｔ 　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２５，１９８３．１３３）、アルコールデヒドロゲナーゼ 　１、ＡＤＨ１遺伝子に関する研究（Ｂｅｎｎｅｎｔｚｅを挙げることができる 。

近年、組換え蛋白質の生産のための宿主細胞としてクルイベロミセス（Ｋｌｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を用いるための遺伝的手段が開発された。Ｋ、ドロソフィ ラルム（Ｋ、ｄｒｏｓｏ　ｈｉｌａｒｕｍ）由来の２−ミクロン型プラスミド（ プラスミドｐＫＤ１−欧州特許第２４１゜４３５号明細書）が示され、組換え蛋 白質の生産のための非常に有効な宿生／ベクター系を確立することが可能になっ た（欧州特許第３６１゜９９１号明細書）。しかしこの系で用いられるプロモー ターは最適化されていない。特に問題のプロモーターは基本的に異種のプロモー ター、すなわち特にＳ、セレビシアエなどの他の微生物由来のプロモーターであ る。この状況は種々の欠点を生じ、特に転写機構におけるある要素（例えばトラ ンスーアクチベーター）の不在によりプロモーター活性が制限され、調節の不在 のために宿主細胞に関するある程度の毒性が示され、あるいはベクターの安定性 に影響がある。

このような状況下で、クルイベロミセスにおける強い同種プロモーターの欠如は 、この発現系の工業的利用における制限因子となっている。

ｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）ゲノムにおける転写プロモーターを有する領域を 同定し、クローニングし、配列決定した（図１を参照）。さらに具体的には、こ の領域はアルコールデヒドロゲナーゼＩＶをコードするに、ラクチス　ＡＤＨ４ 遺伝子（ＫＩＡＤＨ４）のプロモーターに対応する。この領域又はその誘導体あ るいはフラグメントは、クルイベロミセス属の酵母における組換え蛋白質の生産 のために非常に有効に用いることができる。この配列は他の宿主生物の場合にも 用いることができると理解される。

さらに得られたクルイベロミセスゲノムの領域の分析により二方向プロモーター 活性を示すことができた。この観察は、図１により示される領域の相補鎖も、他 の配向で作用するプロモーター活性を有することを示す。

さらに、得られたプロモーター活性のもうひとつの利点がその調節性にある。そ の結果、利用の条件に依存して（培地、株）、プロモーターの活性を調節するこ とができ、従って組換え遺伝子の発現を開始又は抑制することができる。

得られたプロモーター領域のもうひとつの利点はグルコースによる抑制の不在に ある。これはエタノールにより誘導され、グルコースにより抑制されないへ旦旦 遺伝子由来のプロモーターの最初の例を与えるので、この結果は驚（べき結果で ある。実際Ｓ、セレビシアエの場合、ＡＤＨｌ遺伝子が種々の非−発酵性炭素源 （グリセロール、エタノール、ラクトース、ピルビン酸塩）に対して発現される が、ＫＩＡＤＨ４と対照的にこの遺伝子の発現は培地にグルコースが添加される と非常に強く抑制（１９８１）３５５）。同様に、アスペルギルス　ニズランス （Δ互２ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）においてアルコールデヒドロゲ ナーゼ　■をコードするａｌｃＡの発現は、エタノールにより誘導されるがグル コースによる抑制に感受性である（Ｆａｌｅｎｂｏｋ、Ｊ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、よヱ（１９９１）１１）。

従って本発明の主題は、図１に示す配列又はその相補鎖あるいはこれらの配列の 誘導体の全体又は一部を含み、転写プロモーター活性を有するＤＮＡ配列にある 。

本発明で用いられる意味において誘導体は、図１に示す配列から構造的改変（突 然変異、欠失、置換、付加、フラグメント化など）により得られ、プロモーター 活性を保持しているいずれの配列も意味すると理解する。特に突然変異は１個又 はそれより多いヌクレオチドを含むことができ、付加及び／又は置換は調節要素 あるいは“ＵＡＳ”領域などのアクチベーター領域を含むことができる。

誘導体が製造される場合、その転写プロモーター活性は数通りの方法で示すこと ができ、特に耐性遺伝子又は相補性マーカーを研究中の配列の制御下に置くこと により示すことができる。当該技術分野において既知の他のいずれの方法もこの 目的に用いることができるのは明らかである。

本発明に従う誘導体の例としてさらに具体的には１、図２に配列を示す約５００ −ｂｐのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメント又は図３に配列を示す約７００−ｂ ｐのＳａ　ｌ　１−Ｈｌｎｄ　Ｔ　Ｉ　１７ラグメント、あるいは図１に示す配 列に相補的な鎖のヌクレオチド１及び７２３により区切られるフラグメントに対 応する約７００−ｂｐのＢｇｌＩＩ−３ａｃ■フラグメントを含むプロモーター を挙げることができる。

これらのプロモーターの構築は実施例に詳細に記載する。

図１に示す配列は、Ｓ、セレビシアエ　ＡＤＨ２構造遺伝子に由来する異種プロ ーブを用いてクルイベロミセス　ラクチスの全ゲノムＤＮＡをスクリーニングす ることにより得た約８−ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントから得た。実際に出願人 は、Ｓ、セレビシアエ遺伝子に対応する異種プローブを用いたハイブリッド形成 によりクルイベロミセスにおけるプロモーター領域をクローニングすることが可 能であることを示した。

配列のクローニングの詳細は実施例に示す。その後本発明の誘導体を実施例に記 載の通りに、これらの配列から調製することができる。

この組換えＤＮＡは、例えば図１に示すプロモーター配列又はその誘導体を含む ことができ、その中に制限部位が挿入され、“ポータプル”プロモーターとして この配列の利用を容易にする。

この組換えＤＮＡはさらに１個又はそれより多い構造遺伝子を含むのが好ましい 。これらは特に薬剤又は農産物−食料品として興味のある蛋白質をコードする遺 伝子であることができる。例えば酵素（特にスーパーオキシドジスムターゼ、カ タラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン等）、血液誘導体（血 清アルブミン、アルファー又はベーターグロブリン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、 フォンビルプラント因子、フィブロネクチン、アルファ１−アンチトリプシン等 ）、インスリン及びその変異体、リンホカイン（インターロイキン、インターフ ェロン、コロニー刺激因子［Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ　Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ８Ｆ等］、ＴＮ Ｆ、ＴＲＦ等）、成長因子（成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧ Ｆ、ＰＤＧＦ、、ＴＧＦ等）アポリポ蛋白質、ワクチン生産のための抗原性ポリ ペプチド（肝炎、サイトメガロウィルス、エプスタイン−パール、ヘルペス等） 、あるいは別の場合、ポリペプチドの融合体、例えば特に安定化部分に融合され た活性部分を含む融合体（例えばアルブミン又はアルブミンフラグメントとウィ ルスレセプター又はウィルスレセプターの一部［ＣＤ４など］の間の融合体）を 挙げることができる。

組換えＤＮＡは該構造遺伝子の発現産物の分泌を可能にするシグナルも含むのが さらに好ましい。これらのシグナルは問題の蛋白質の天然の分泌シグナルに対応 することができるが、異なる供給源からのものであることもできる。特に酵母属 に由来する分泌シグナル、例えばキラー毒素（Ｓｔａｒｋ　ａｎｄ　Ｂｏｙｃｌ 、　ＥＭＢＯＪ、　５　（１９８６）１９９５）又はアルファフエｏモン（Ｋｕ ｒ　ｊａｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｓルを用いることができる。

本発明の特定の態様の場合、組換えＤＮＡは発現プラスミドの一部を形成し、そ れは自律複製性又は組み込み性であることができる。

特に自律複製性ベクターは選ばれた宿主中で自律複製を行う配列を用いて得るこ とができる。特に酵母の場合、これらはプラスミド（ｐ　ＫＤｌ、２μ等）又は 別の場合染色体配列（ＡＲ３）に由来する複製起点であることができる。

組み込みベクターは、特に宿主ゲノムのある領域に相同の配列を用い、相同的組 換えによるベクターの組み込みを可能にすることにより得ることができる。

本発明の他の主題は、上記で定義したＤＮＡ配列を含む組換え細胞に関する。

細胞は酵母から選ばれるのが有利であり、タルイベロミセス属の酵母から選ばれ るのがより好ましい。しかし本発明は本発明のプロモーター領域が活性であるす べての組換え細胞を含むと理解される。

これらの細胞は、異種ＤＮＡの細胞中への導入を可能にするいずれの方法によっ ても得ることができる。そのような方法は特に形質転換、エレクトロポレーショ ン又は当該技術における熟練者に既知の他のいずれの方法であることもできる。

本発明のもうひとつの主題は、上記で定義した配列の、組換え遺伝子発現のため の利用に関する。

実施例に示す通り、本発明のＤＮＡ配列は実際に多量の組換え蛋白質の生産を可 能にする。

さらに本発明の配列の二方向プロモーター活性により、特に有利な利用が可能に なる。特にこれらの配列を用いて数個の組換え遺伝子を、２つの反対の配向で同 時に発現することができる。

有利なことに本発明は、プロモーターの各側に挿入された２個の組換え遺伝子を ２つの反対の配向で同時に発現するための、上記で定義された配列の利用に関す る。

有利なことに本発明の配列は、薬剤又は！１１産物−食料品として興味のある蛋 白質をコードする遺伝子の発現に用いることができる。例えば上記の蛋白質を挙 げることができる。

本発明は、その方法に従って上記で定義した組換え細胞を培養し、生産された蛋 白質を回収する組換え蛋白質の生産法の実行も可能にする。

蛋白質の例として上記の蛋白質を挙げることができる。

本発明の方法はヒト血清アルブミン又はその分子変異体の１つの生産に適用する のが好ましい。アルブミンの分子変異体は、アルブミンの多型性から得られる天 然の変異体、切断型又はアルブミンに基づくハイブリッド蛋白質を意味すると理 解される。

さらに本発明の特に有利な特徴は、プロモーターの活性を調節できることにある 。出願人は実際に、プロモーター活性がエタノールにより特異的に誘導されるこ とを示した。この目的の場合、誘導エタノールは培地に直接添加することができ 、あるいは培地中に導入される炭素源から発酵に関するその能力に従い宿主細胞 により細胞内で生産することもできる。従って調節はい（つかの条件下で得るこ とができるニーエタノールではなく、細胞によりエタノールに変換することがで きない炭素源を含む培地中で組換え細胞を培養することによる。この場合プロモ ーターの活性はエタノールを培地に添加することにより誘導される。

例えばに、ラクチス２３５９／１５２及びに、ラクチスＭＷ９８−８Ｃの場合、 細胞がグリセロールを含む培地上で培養されるとＫＩＡＤＨ４プロモーターは不 活性であるが、エタノールの添加後に誘導される。

−又は発酵可能な炭素源（例えばグルコース）を含む培地中で、発酵代謝に関す る欠失を有し、その結果この炭素源からエタノールを生産することができない組 換え細胞を培養することによる。この場合、プロモーターの活性は培地へのエタ ノールの添加、又は欠失段階より下流の段階に関与し、該欠失にかかわらずエタ ノールへの代謝が可能な別の発酵性糖の添加により誘導される。例えばｒａｇ２ 突然変異を有し、その結果ホスホグルコースイソメラーゼ活性を持たない株を用 いることができる。

この場合、ＫＩＡＤＨ４プロモーターはグルコース培地上で不活性であり、エタ ノール又はフルクトースの添加によりプロモーターの活性を誘導することができ る。

本発明の他の利点は、以下の実施例を読んで明らかになるであろう。

実施例は例示であり、制限ではないと考えるべきである。

ｂフラグメントのヌクレオチド配列。

図２＝ベクターｐＰ４−１５Ｋａｂ中の切断ＫＩＡＤＨ４プｃｒモー９−に対応 する約０．５−ｋｂのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列。

図３＝ベクターｐＹＧ１２９及びｐＹＧ１３０中の切断ＫＩＡＤＨ４プロモータ ーに対応する約０．７−ｋｂの５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのヌクレ オチド配列。

図４＝プラスミドｐ６−４−９８の線図及びプラスミドｐ６−２２００−２及び ｐＰ４−３３の構築。

図５＝プラスミドｐＳＫ−Ｋａｎ４０１の線図及びプラスミドｐＰ４−Ｋａｎ及 びｐＰ４Ｒ−Ｋａｎの構築。

図６：プラスミドｐＰ４−ＧＵＳ及びｐＳＫ−ＧＵＳの構築及び図。

図７ニプラスミドｐＫａｎ７０７の線図及びファージＭ１３誘導体ｐＹＧ６４及 びｐＹＧ６５の構築。

図８ニブラスミドｐＹＧ６９及びｐＹＧ７０の構築及び図。

図９ニブラスミドｐＹＧ７２の構築及び図。

図１０ニブラスミドｐＹＧ４０４の線図及びプラスミドｐＹＧ４０４△Ｈの構築 。

図１１＝プラスミドｐＹＧ１２８の構築及び図。

図１２ニブラスミドｐＹＧ１３１及びｐＹＧ１３２の構築及び図。

図１３＝プラスミドｐＰ４−１５Ｋａｎ及びｐＰ４−６０Ｋａｎの構築及び図。

図１４・プラスミドｐＹＧ１２９及びｐＹＧ１３０の構築及び図。

図１５　実施例７．１．２に記載の案に従って染色され、プラスミドｐＰ４−Ｇ ＵＳを用いて形質転換された株ＭＷ９８−８Ｃにおけるβ−グルクロニダーゼ活 性の発現を示す本来のポリアクリルアミドゲル（５％）（線１−６が６個の独立 したクローンに対応する）。プラスミドｐＳＫ−ＧＵＳ　（標準）を用いて形質 転換された株ＭＷ９８−８Ｃから得た結果は線Ｃに示される。

図１６＝クーマシーブルーを用いて染色した後の、ベクターｐＹＧ１３２を用い て形質転換された株ＭＷ９８−８Ｃからのヒト血清アルブミンの分泌を示す８． ５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。列ａ−Ｃには、標準として用いたヒト血 漿（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）から抽出されたアルブミンを濃度を増加させてスポットし た（列島たり０．５．１．０及び１．５μｇ）。他の列は実施例７、２．１に記 載の培地から得た２５μｍの培養上澄み液に対応する。Ｇｌｕ、グル：＋　−７ ，：　Ｇ　１　ｕ／Ｅ　ｔ　ＯＨ，グルコース／エタノール；　Ｇ　Ｉ　Ｍ、グ リセロール；Ｇｌｙ／ＥｔＯＨ，グリセロール／エタノール。

図１７・クーマン−ブルーを用いて染色した後の、ベクターｐＹＧ１３２を用い て形質転換された株ＣＢ５２９３．９１からのヒト血清アルブミンの分泌を示す ８，５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。列ａ−Ｃには、標準として用いたヒ ト血漿（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）から抽出されたアルブミンを濃度を増加させてスポッ トした（列島たり０．５．１０及び１．５μｇ）。他の列は実施例７、２．１に 記載の培地から得た２５μｌの培養上澄み液に対応する。Ｇｌｕ、グルコース； 　Ｇ　１　ｕ／Ｅ　ｔ　ＯＨ，グルコース／エタノール；　Ｇ　Ｉ　Ｙ、グリセ ロール；　Ｇ　Ｉ　Ｙ／Ｅ　ｔ　ＯＨ，グリセロール／エタノール。

図１８：クーマシーブルーを用いて染色した後の、ベクターｐＹＧ１３０を用い て形質転換された株ＣＢ５２９３．９１からのヒト血清アルブミンの分泌を示す ８，５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。列ａ−Ｃには、標準として用いたヒ ト血漿（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）から抽出されたアルブミンを濃度を増加させてスポッ トした（列島たり０．５．１，０及び１．５μｇ）。他の列は実施例７°２．１ に記載の培地から得た２５μｌの培養上澄み液に対応する。Ｇｌｕ、グルコース ：Ｇ１ｕ／ＥｔＯＨ，グルコース／エタノール。

表１：全ＫＩＡＤＨ４プロモーター（１，２−ｋｂフラグメント、ＢｇＩＩＩ− ＢａｍＨＩフラグメントの形態［ｐＰ４−Ｋａｎ、ｐＰ４Ｒ−Ｋａｎ及びｐＰ４ −ＧＵＳコ、又は５ａｉｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態［ｐＹＧ１３１ 及びｐＹＧ１３２］）を用いて行った種々の構築のまとめ。

０．５−ｋｂのＳａｃｌ−ＢａｍＨＩフラグメント［ｐＰ４−１５Ｋａｎ］　； 図１に示すヌクレオチド配列の位置１−７２３に対応する０、７−ｋｂのＢｇｌ ＩＩ−３ａｃＩ７ラグメント［ｐＰ４−６０Ｋａｎ］　；図３にヌクレオチド配 列を示す０．６７−ｋｂの５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント［ｐＹＧ１２ ９及びｐＹＧ１３０］　）を用いて行った種々の構築のまとめ。

表３・ＫＩＡＤＨ４遺伝子の発現の調節の研究。実施例５に記載の案に従って示 されるＡＤＨＩＶ酵素活性の存在又は不在は、記号子又は−により示す。

一般的クローニング法 プラスミドＤＮＡの塩化セシウム／エチジウムプロミド勾配遠心、制限酵素を用 いた消化、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶出 、Ｅ、コリ中における形質転換などの分子生物学の標準的方法は文献に記載され ている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ ｌ”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、　、　１９８６：Ａｕ５ｕｂ ｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、（ｅｄｓ、）、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７）。

オリゴヌクレオチド一部位特定試験管内突然変異誘発を、Ｔａｙ　］　。

ｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１旦（１９８５）８ ７４９−８７６４）に記載の方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍから得たキットを用 いて行う。Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４　（１９７７）５４６３−５４６ ７）に記載のジデオキシ法に従い、ヌクレオチド配列決定を行う。

特定のＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、Ｍｕｌｌｉｓ　ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎ ａ　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、１５旦（１９８７）３３５−３５０）及び５ａ ｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３旦（１９８５）１３５０−１３５ ４）に記載の条件下で“ＤＮＡ熱サイクラ−”（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃ ｅｔｕｓ）を用い、製造者の勧告に従ったＰＣＲ反応（ポリメラーゼ−触媒連鎖 反応）により行う。

種々のクローニング段階及び発現ベクターの構築において以下のプラスミドを用 いた。

一置換ベクター　ラムダ−Ｌ４７：Ｌｏｅｎｅｎ　ａｎｄ　Ｂｒａｍｍａｒ、Ｇ ｅｎｅ　１０（１９８０）２４９−２５９；−プラスミドｐＢＲ３２２（Ｐｈａ ｒｍａｃ　ｉａ、Ｕｐｐｓａ　ｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）ニ ープラスミドｐＴＺ１９　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅ ｎ）ニ ープラスミドｐＳＫ−Ｋａｎ４０１：Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｆｕｋｕｈａｒａ、Ｇ ｅｎｅ　６９　（１９８８）１８１−１９２；−プラスミドｐＢＩ２２１　（Ｃ １ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳ Ａ）ニープラスミドｐＢＣＳＫ＋／−（Ｓｔｒａｔａｇ６ｎｅ、Ｌａ　Ｊ。

］　１　ａ、ＣＡ、ＵＳＡ）： −プラスミドｐＹＧ４０４　（欧州特許第３６１．９９１号明細書）。

−プラスミドｐＫａｎ７０７　（欧州特許第３６１．９９１号明細書）。

−バクテリオファージＭ１３ｍｐ７：Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

以下の株を本発明のプロモーターのクローニング、構築及び利用に用いた。

−Ｋ　ラクチスＣＢ５２３５９／１５２　（Ｎｏ、ＣＢ５２８９．９１）−Ｋ　 ラクチスＭＷ９８−８Ｃ（Ｎｏ、ＣＢ５５７９．８８）−に、ラクチスＣＢ５２ ９３．９１゜ ルイベロミセス　ラクチスＣＢ５２３５９／１５２の全ゲノムＤＮＡのライブラ リをスクリーニングすることにより、図１に示す配列を得た。

さらに特定するとライブラリは、Ｋ、ラクチスＣＢ５２３５９／１５２ＤＮＡを 置換ベクターラムダ−Ｌ４７のＢａｍＨＩ部位において酵素５ａｕ３Ａを用いて 部分的に消化した生成物をクローニングすることにより得た。ハイブリッド形成 に用いたプローブは、最初の７０ｂｐ以外のＳ、セレビシアエ　ＡＤＨ２構造遺 伝子のコード領域を含む９８０−ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグメント（ プローブＡ）である。このフラグメントはｐＢＲ３２２，ＡＤＲ２，ＢＳａと名 付けられたプラスミドから酵素的消化により得た（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、。

Ｃｅ１１　２３（１９８１）６０５−６１４；Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ｅｔａｌ、、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　（１９８３）６０５６１４；Ｒｕ５ｓｅｌｌ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８（１９８３）２６７４−２６８ ２）。

それにより約８−ｋｂフラグメントが単離され、それをプラスミドｐＢＲ３２２ のＢａｍＨＩ部位でサブクローニングし、プラスミドｐ６−４−９８を生成する （図４）。このプラスミドに運ばれるＢａｍＨＩ挿入片をその後制限酵素を用い てマツピングし、プローブＡならびにプラスミドｐＢＲ３２２，ＡＤＲ２，ＢＳ ａの約１１００−ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに対応する第２の プローブ（プローブＢ）を用いた分別ハイブリッド形成（ｄｉｆｆｅｒｅｎ、ｔ ｉａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）によりＫＩＡＤＨ４遺伝子のプロモータ ー領域をこのフラグメント上で位置決定した。

第２段階で、プラスミドｐ６−４−９８を酵素ＨｉｎｄｌＩＩで消化し、２．２ −ｋｂフラグメントを単離した。その後このフラグメントを標準的方法により精 製し、プラスミドｐＴＺ１９のＨｉｎｄ１１部位でサブクローニングし、プラス ミドｐ６−２２００−２を生成した（図４）。サブクローニングされたフラグメ ントの分析により、それがＫＩＡＤＨ４遺伝子の最初の１４コドン、ならびにそ の上流に位置する発現を調節する要素を含む領域を含むことが明らかにされる。

Ｂｇ１１１部位及びＡＴＧ翻訳開始コドンにより区切られた部分（約１．２−ｋ ｂフラグメント）を連鎖停止法（Ｓａｎｇｅ　ｒ　ｅ　ｔ　ａ　１．。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ／Ｓｃ　ｉ、　７４　（１９７７）　５４６３ ）を用いて配列決定した。このフラグメントの配列を図１に示す。

ＢａｍＨＩ制限部位を、プラスミドｐ６−２２００−２に存在する２、２−ｋｂ のＨｉｎｄｌＩＩ７ラグメント中に、ＫＩＡＤＨ４遺伝子のＡＴＧコドンに対し て−１６の位置で挿入することによりポータプルプロモーターを製造した。

この部位を挿入することにより、ＫＩＡＤＨ４プロモーター領域を排他的に含む １．２−ｋｂのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントを生成することが可能 になる。それは又、発現することが望まれているいずれの遺伝子も、それによっ て得たプロモーターの下流に導入することができるようにする。

ダブルプライマー法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂＰｒｅｓｓ、１９８９）を用い た特定部位の突然変異誘発により、ＫＩＡＤＨ４遺伝子の翻訳開始部位（ＡＴＧ ）に対して−１６の位置にＢａｍＨ１部位を導入した。この突然変異誘発に用い た合成オリゴデオキシヌクレオチドの配列を下記に示す。生成されたＢａｍＨＩ 部位に下線を施し、ＡＴＧをイタリックで示し、星印は最初の配列に対して改変 された塩基を示す。ＩＳ＝最初の配列；ＭＳ＝改変配列。

それにより得たプラスミドをｐＰ４−３３と呼ぶ（図４）。

表１はこの実施例に記載する構築をまとめたものである。

３．１．ａｐｈ遺伝子の発現のためのベクターの構築ニブラスミドｐＰ４−３３ のＤＮＡ　（実施例２を参照）をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＫＩＡＤ Ｈ４プロモーターを含む１．２−ｋｂフラグメントを生成した。その後、発現さ れると酵母にジエネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性（Ｇ４１８）を与える（ Ｊｉｍｅｎｅｚａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、ｒｅｆ）アミノグリコシド３″−ホスホ トランスフェラーゼ（Ｉ）（Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１４７　（１９８１）２１７）をコードする見且亘レポーター遺伝子の上流のそ れ自身のプロモーターの前で、プラスミドｐＳＫ−Ｋａｎ４０１のＢａｍＨＩ部 位にこのフラグメントを導入する。Ｅ、コリ中で増幅した後、挿入片の配向が異 なる２個の組換えプラスミドを得る。プラスミドｐＰ４−Ｋａｎの場合、１．２ −ｋｂフラグメントは且且亘遺伝子に関してＡＤＨ４の関係で観察された配向と 同一の配向であり、プラスミドｐＰ４Ｒ−Ｋａｎの場合は反対の配向である（図 ５を参照）。

３．２．ＧＵＳ及びａｐｈ遺伝子の発現のためのベクターの構築ニブラスミドｐ Ｐ４Ｒ−Ｋａｎを用い、それぞれのプロモーターを奪われた２個の異種遺伝子が １．２−ｋｂ　ＫＩＡＤＨ４プロモーターの各側に置かれた発現ベクターを構築 した。さらに特定すると、用いた異種遺伝子はニ ーその発現がＧ４１８耐性を与えるａｐｈ遺伝子、及び−その発現を酵素反応に より示すことができるＥ、コリ　β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子） である。

この構築を行うために、プラスミドｐＰ４Ｒ−ＫａｎをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。別に、Ｅ、コリβ−グルクロニダーゼ遺伝子をプラスミドｐＢＩ ２２１から、２．１−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ■フラグメントの形態で単離 した。その後後者を、記載の通りにして直鎖化したプラスミドｐＰ４Ｒ−Ｋａｎ 中に連結により導入し、ブラスミを有するプラスミドｐＢＩ２２１に由来する２ 、１−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ７ラグメントを、前以てＢａｍＨＩ及びＥ ｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＳＫ−Ｋａｎ４０１中に挿入することにより、 標準プラスミドを製造した。それにより得たプラスミドをｐＳＫ−ＧＵＳと呼ぶ （図６）。この構築物は、１．２−ｋ　ｂのＫＩＡＤＨ４プロモーターの不在に よってのみプラスミドｐＰ４−ＧＵＳと異なる。

３．３．ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする遺伝子の発現のためのベク ターの構築・ ヒト血清アルブミンの発現のための種々のベクターを構築するためにプラスミド ｐＹＧ４０４　（欧州特許第３６１．９９１号明細書を参照）の誘導体を製造し 、それは 一酵母レプリコン（天然のプラスミドｐＫＤ１の実際の全配列）、Ａ）をコード する遺伝子、ＨＳＡをコードする構造遺伝子の前にＳ。

セレビンアエ　ＰＧＫ遺伝子の直上流領域に対応する２５０ヌクレオチドの配列 がある、 一ジエネチシン（Ｃ；４１８）耐性を酵母に与えるａｐｈ遺伝子、及び−Ｅ　コ リに関するレプリコン及び選択マーカー（アンビンリン耐性を与えるｂｌａ遺伝 子）を含む。

ｐＹＧ４０４△Ｈと名付けられたこのプラスミドは、１遺伝子中に置かれたＨｉ ｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位が特定部位の突然変異誘発により破壊されたことによっての みｐＹＧ４０４と異なる。この改変によりプラスミドｐＹＧ４０４△Ｈ中に５ａ ｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態で存在するＬＡＣ４プロモーターを、 やはりＳａ　ｌ　１−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉフラグメントの形態でポータプルプロモ ーターとして構築されたＫＩＡＤＨ４プロモーターの異なる変異体で置換するこ とが可能になる。

３、３．１．プラスミドｐＹＧ４０４△の構築（図７−１０）：クローニングベ クターｐＹＧ４０４中のＨｉｎｄｌ　Ｉ　１部位の欠失を行うために、種々の段 階のサブクローニングを行い、中間構築物であるｐＹＧ７２　（図９）を得た。

このベクターはプラスミドｐＫａｎ７０７１１部位と共に除去されている。この 部位に特定部位の突然変異誘発を行うために、ａｐｈ遺伝子を有する１、３−ｋ ｂのＰｓｔｌフラグメントをプラスミドｐＫａｎ７０７からバクテリオファージ Ｍ１３ｍｐ７中にサブクローニングし、ベクターｐＹＧ６４　（図７）を得た。

以下のオリゴデオキシヌクレオチド：５’−ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＡＧＣ ＴＣＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＣＴＣＡ　ＣＣＧ−３’を用いた特定部位の突然変異 誘発（一般的クローニング法を参照）によりＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊し、ロイ シン１８５をコードするトリプレットＣＴＴをトリプレットＣＴＣで置換した。

この変更は得られる蛋白質配列を改変しない。得られたプラスミドはｐＹＧ６５ と呼んだ（図７）。プラスミドｐＹＧ７２の構築のために、ベクターｐＫａｎ７ ０７のバクテリアレプリコンを含む部分を、酵素ＥｃｏＲＩを用いた消化及びＴ ４　ＤＮＡリガーゼを用いた再環状化により単離し、中間プラスミドｐＹＧ６９ を生成した。後者に存在するａｐｈ遺伝子を含むＰｓｔＩフラグメントを、その 後プラスミドｐＹＧ６５に由来する突然変異した同等フラグメントにより置換し た。この構築物をｐＹＧ７０と呼んだ（図８）。ＥｃｏＲＩ及びＳａｃ　１部位 により結合されたｐＫＤｌの４．７−ｋｂ配列を、その後このベクターに導入し 、ｐＹＧ７２を得た（図９）。

ベクターｐＹＧ４０４△Ｈは、プラスミドｐＹＧ４０４　（欧州特許第３６１． ９９１号明細書）に由来する発現カセットを５ａｌＩ−Ｓａｃ■フラグメントの 形態でｐＹＧ７２の対応する部位に挿入することにより得た（図１０）。

３、３．２．　ポータプルＫＩＡＤＨ４プロモーター［５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩｒ Ｉ］の構築（図１１）ニ プラスミドｐＰ４−３３　（実施例２）に由来するＢｇｌｌＩ−ＢａｍＨＩフラ グメント上のＫＩＡＤＨ４プロモーターを以下の方法で改変し、それをプラスミ ドｐＹＧ４０４△Ｈに由来する発現ベクターにおいて用いるために適応させた プラスミドｐＰ４−３３を酵素Ｂｇｌｌｌ及びＢａｍＨＩで消化し、続いてムン グビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　ｎｕｃ　Ｉ　ｅａｓｅ）で処理し 、末端を平滑化した後、ＫＩＡＤＨ４プロモーターを有するｌ、２−ｋｂフラグ メントをアガロースゲルから単離し、前以て酵素ＣＩａＩで直鎖化し、ムングビ ーンヌクレアーゼならびにコラジアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）で処理 したベクターｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、 ＵＳＡ）中にサブクローニングした。この方法で得たプラスミド（ｐＹＧ１２８ 、図１１）は、ＫＩＡＤＨ４プロモーターを１．２−ｋｂのＳａ　Ｉ　１−Ｈｌ ｎｄ　ＩＩＩフラグメントの形態で単離することを可能にする。

３、３．３．ベクターｐＹＧ１３１及びｐＹＧ１３２の構築（図１２）発現ベク ターｐＹＧ４０４△Ｈ（実施例３．３．１．　）を酵素５ａｌＩ及びＨｉｎｄＩ ＩＩで消化すると、ＬＡＣ４プロモーターを上記のＫＩＡＤＨ４プロモーターで 置換することができるようになる。

このクローニングを行うために、ｐＫＤ１部分及び選択マーカーを含む８．７− ｋｂのＳａｌ　１−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメント、ならびにブレブローＨ５ Ａをコードする遺伝子を有する１、９−ｋｂのＨｉｎｄＩｒ　１−ＨｌｎｄＩ　 Ｉ　ＩフラグメントをベクターｐＹＧ４０４ΔＨから単離し、プラスミドｐＹＧ １２８に由来し、ＫＩＡＤＨ４プロモーターを有する１、２−ｋｂのＳａ　ｌ　 １−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントの存在下で連結した。２個のプラスミド をこの方法で得たニーｐＹＧ１３１　（図１２）、発現することが望まれている いずれの遺伝子もＫＩＡＤＨ４プロモーターの制御下で１個のＨｉｎｄｌ　１１ 部位に挿入することを可能にするクローニングベクターに対応、及び−ｐＹＧ１ ３２　（図１２）　、Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　１部位ニ導入すレタフレフローＨ５Ａ 遺伝子を含む以外はプラスミドｐＹＧ１３１と同一。

表２はこの実施例に記載の構築をまとめたものである。

４．１．ａｐｈ遺伝子の発現のためのベクターの構築プラスミドｐＰ４−Ｋａｎ 及びｐＰ４Ｒ−Ｋａｎ（実施例３．１．　）を用い、縮小形態（ｒｅｄｕｃｅｄ 　ｆｏｒｍ）のプロモーターを含む構築物を製造した。この目的のために、プラ スミドｐＰ４−Ｋａｎ及びｐＰ４Ｒ−Ｋａｎを図３に記載の略図に従って酵素Ｓ ａｃ　Ｉで消化し、その後連結した。

この操作により以下が可能になった 一ａｐｈ遺伝子の反対側に位置する約１７−ｋｂのＳａｃ　Ｉフラグメントの、 プラスミドｐＰ４−Ｋａｎからの切り出し。従って得られたプラスミド（ｐＰ４ −１５Ｋａｎ）において見且九遺伝子は、ＡＤＨ４に関連して観察される配向と 同一の配向で、図２に配列を示す０５−ｋｂのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメン トに対応する縮小プロモーターの制御下にある。

−ａｐｈ遺伝子の反対側に位置する約０．５−ｋｂのＳａｃ　Ｉフラグメントの 、プラスミドｐＰ４Ｒ−Ｋａｎからの切り出し。従って得られたプラスミド（ｐ Ｐ４−６０Ｋａｎ）においてａｐｈ遺伝子は、図１に示す配列の一部を形成する ０、７−ｋｂのＢｇｌ　Ｉ　ｌ−３ａｃＩフラグメント（ヌクレオチド１−７２ ３）に相補的な鎖に対応する縮小プロモーターの制御下にある。

４．２．プレプロ−Ｈ３Ａ遺伝子の発現のためのベクターの構築＝４、２．１． ポータプル切断ＫＩＡＤＨ４プロモーター［５ａｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ］の構築 （図１４）・ プラスミドｐＰ４−３３に由来し、全ＫＩＡＤＨ４プロモーターを有する１、　 ２−ｋ　ｂのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントの切断誘導体を、図１に 示す配列の位置５４１のＢｓｍＡ１部位とＡ　Ｄ　Ｈ４遺伝子のＡＴＧに関して −１６の位置のＢａｍ８１部位の間に位置するこのプロモーターの一部を酵素増 幅（ＰＣＲ）することにより得た。ＰＣＲ反応に用いたオリゴデオキシヌクレオ チドは以下であったー−５’−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＧＡＣＡＡＣＡＣＴ ＡＴＴＧＴＧＡＧ−３’、上記のＢｓｍＡ１部位の直上流に５ａｌＩ部位（下線 の配列）を導入、及び 一５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧ−３′、 構築物ｐＰ４−３３中に存在するＢａｍＨＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線の 配列）で置換。

４、２．２．ベクターｐＹＧ１２９及びｐＹＧ１３０の構築：ＰＣＲによって得 た６７２−ｂｐフラグメントを酵素５ａｉｌ及びＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで消化し、 アガロースゲルから精製し、ｐＫＤ１部分及びベクターｐＹＧ４０４△Ｈに由来 する選択マーカーを含む８．７−ｋｂのＳａ　Ｉ　１−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラ グメントと連結した。この連結は、同ベクターから単離したプレプローＨＳＡを コードする遺伝子を有する１、９−ｋｂのＨｉｎｄｌｌ　１−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　 Ｉフラグメントの存在下で行った。この方法で２つのフラグメントが得られたニ ーｐＹＧ１２９　（図１４）、発現が望まれているいずれの遺伝子も、切断ＫＩ ＡＤＨ４プロモーターの制御下で１個のＨｉｎｄ１１１部位に挿入することを可 能にするクローニングベクターに対応、及び−ｐＹＧ１３０　（図１４）、それ がＨｉｎｄＩ　Ｉ　１部位に導入されたブレプローＨ５Ａ遺伝子を含む以外はプ ラスミドｐＹＧ１２９と同一。

に対応する約０．７−ｋｂの５ａｌＩ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ７ラグメントのヌク レオチド配列を図３に示す。

５／　ＫＩＡＤＨ４遺伝子の発現の調節の研究この研究は、株に、ラクチスＭＷ ９８−８Ｃ及びに、ラクチス２３５９／１５２を用いて行った。

株ＭＷ９８−８　Ｃは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＣ上）をコードする 遺伝子に関する突然変異（ｒａｇ２）の故のＲａｇ２−表現型を有し、そのため グルコース培地上でエタノールを生産できない。株２３５９／１５２はＲａｇ２ ＋である。

Ｌｕｔｓｔｏｒｆ及びＭｅｇｎｅｔ　（Ａｒｃｈｉｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、１２６　（１９６８）９３３）により記載の方法を用いてＡＤ ＨＩＶ活性を示すことにより、ＡＤＨ４プロモーターの活性を種々の培養条件下 で測定した。得られた結果を表３にまとめる。

これらの結果は、ＫＩＡＤＨ４プロモーターの活性が特異的にエタノールにより 誘導され、グルコースの不在により抑制解除されないことを示す。実際に我々は 、驚くべきことにＳ　セレビシアエ　ＡＤＨ２又は抑制されないことを見いだし た（表３）。誘導エタノールは培地に添加するか、又はグルコースあるいはフル クトースなどの炭素源の発酵により細胞内で生産することができる（表３）。

我々は、解糖に含まれる遺伝子が突然変異し、そのためにグルコースからエタノ ールを生産することができない株を、本発明のベクターの発現のための宿主とし て用いることが有利であることも示した。実際にホスホグルコースイソメラーゼ をコードする遺伝子が欠失しているＭＷすることにより行われる。

さらに我々は驚くべきことに、株ＣＢ５２３５９／１５２及びＭＷ９８−８Ｃに おいて、単一の炭素源としてグリセロールを含む培地中でＫＩＡＤＨ４プロモー ターが不活性であることを見いだした。この結果は、グリセロールを含む種々の 非−発酵性炭素源上で活性なＳ、セレビシアエ　アルコールデヒドロゲナーゼＩ Ｉ遺伝子（ＡＤＨ２）のプロモーターに関する知見と異なる。

従ってこれらの結果は、ＣＢ５２３５９／１５２などのいくつかの株は、Ｒａｇ ”表現型を有していても、ＫＩＡＤＨ４プロモーターの発現の調節を可能にする ことを示す。単一の炭素源としてグリセロールの存在下で培養される細胞は、そ の遺伝子がＫＩＡＤＨ４プロモーター（非−誘導プロモーター）の制御下にある 蛋白質を生産しないが、培地にエタノールを添加することによりこの蛋白質の生 産を誘導することができる。

６／　クルイベロミセスの形質転換 ＤＮＡを酵母に導入することができる種々の方法を用いることができる。

用いる種々のクルイベロミセス株は、全細胞を酢酸リチウム及びポリエチレング リコールの存在下でＩｔｏ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ｂａｃｔｅ処理することにより 形質転換するのが有利である。エチレングリコール及びジメチルスルホキシドを 用いるＤｕｒｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ。

（Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１旦（１９９０）７）により記載の形質転換法も用い ることができる。例えばＫａｒｕｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　１８２　（１９８５）９０）により記載の方法に従ってエレクトロポレーシ ョンにより酵母を形質転換することも可能である。

別の案も欧州特許出願第３６１．９９１号明細書に詳細に記載されている。

７／　組換え蛋白質の生産のための発現ベクターの利用７．１．バクテリア蛋白 質の生産・ ？、１．１．　アミノグリコノド３′−ホスホトランスフェラーゼ（Ｉ）の生産 ： 発現プラスミドｐｐ４−Ｋａｎ及びｐＰ４Ｒ−Ｋａｎ　（実施例３．１）及びク ローニングプラスミドｐＳＫ−Ｋａｎ４０１　（標準）を用い、Ｋラクチス酵母 ＭＷ９８−８Ｃを形質転換した。ｐＰ４−Ｋａｎ及びｐｐ４Ｒ−Ｋａｎを用いて 形質転換された細胞は、２％のエタノール及び２００−４００μｇ／ｍｌの範囲 の投薬量のンエネチシンを含むＹＰＤ培地（酵母抽出物Ｌｏｇ／ｌ：ペブトン２ ０ｇ／ｌ；グルコース２０ｇ／ｌ）中でＧ４１８耐性を有するが、プラスミドｐ ＳＫ−Ｋａｎ４０１を用いて形質転換された細胞はンエネチンンに感受性である 。

この結果は。

一プラスミドｐＰ４−Ｋａｎ及びｐＰ４Ｒ−Ｋａｎを用いて形質転換さ１．２− ｋｂフラグメントが実際に機能的プロモーター活性を有することを示し、 一見旦互遺伝子が両構築物中で、すなわちＫＩＡＤＨ４プロモーターを含む１． ２−ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉフラグメントの配向に無関係に発現され たので、従ってこのフラグメントが実際に二方向プロモーター活性を有すること を示す。

形質転換の後、プラスミドｐＰ４−１５Ｋａｎ及びｐＰ４−６０Ｋａｎは、２％ のエタノール及び２００μｇ／ｍｌより多い投薬量のジエネチシンを含むＹＰＤ 培地中で培養された株ＭＷ９８−８Ｃにジエネチシン耐性を与える。

この結果は、１．２−ｋｂフラグメントにより運ばれるＫＩＡＤＨ４プロモータ ーの活性誘導体がフラグメント化により得られたことを明確に示している。それ はこのプロモーターの二方向活性を確証している。

７１．２　β−グルクロニダーゼの生産（図１５）・プラスミドｐＰ４−ＧＵＳ 及びｐＳＫ−ＧＵＳ　（実施例３．２）を用いてに、ラクチス株ＭＷ９８−８Ｃ （ｕｒａ３１ｙｓＡ　ａｒｇＡ）を形質転換し、アルギニン（２０ｍｇ／ｌ）及 びリジン（３０ｍｇ／ｌ）を補足したＳＤ合成培地（“酵母窒素ベースＷ１０ア ミノ酸“領３７％、グルコース２％）上でウラシルに関するプロトトロフィー（ ｐｒ。

ｔｏｔｒｏｐｈｙ）に関して組換え細胞を選択した。

組換え細胞をＹＰＤ　（１０ｍｌ）中で定常期まで培養した。その後細胞を、Ｅ ｐｐｅｎｄＯｒｆ管中でガラスピーズを用いて破り（ｒｕｐｔｕｒｅｄ）、遠心 し、上澄み液を非−変性条件下でミニゲル（ｍｉｎｉｇｅ＋）（５％アクリルア ミド）電気泳動により分析した。用いたケル及び緩衝液はＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ２８３　（１９８０）２１４−２１６）に記載さ れている。

２０−４０μｇの蛋白質に相当する試料をアクリルアミドゲル（５％）電気泳動 により分離した。移動は４°Ｃで２０ｍＡの電流下にて６０分間行った。

５ｍｇ／ｍｌのジメチルホルムアミド中に５０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ○４ｐＨ７，０ 及び５０　ｕ　ｇ／ｍ　Ｉの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロ ニド（Ｘ−Ｇｌｕ）を含む染色液中にゲルを浸すことにより、β−グルクｏニダ ーゼ活性を示す（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　Ｒ，Ａ、。

ゲルはバンドが分離されるまでこの溶液中で３７°Ｃに保った。

得られた結果を図１５に示す。示されているゲルは、列１−６においてプラスミ ドｐＰ４−ＧＵＳを用いて形質転換されたＭＷ９８−８Ｃ細胞に対応するバンド を明確に示し、本発明のプロモーター領域を含まないプラスミドｐＳＫ−ＧＵＳ を用いて形質転換されたＭＷ９８−８Ｃ細胞に対応するノブナルは列Ｃに見られ ない。

さらに、プラスミドｐＰ４−ＧＵＳ及びｐＳＫ−ＧＵＳを用いて形質転換された 細胞をンエネチンン（２００ｍｇ／Ｉ）を補足したＹＰＤ培地上でも培養した。

ｐＰ４−ＧＵＳを含む形質転換細胞はこの抗生物質に対する耐性を取得したが、 ｐｓＫ−ＧＵＳを含む標準株は感受性のままである。

これらの結果は１２−ｋｂフラグメントの二方向プロモーター活性４プロモータ ーの各側に２つの反対の配向で挿入された２個の異種遺伝子を同時に発現できる ことを示している。

７、２．　＠乳類蛋白質の生産ニ ア、２．１．全ＫＩＡＤＨ４プロモーターの制御下におけるプレプロ−ＩＳＡ遺 伝子の発現（図１６−１７）　・発現プラスミドｐＹＧ１３２を用い、Ｋ、ラク チス酵母株ＭＷ９８−８Ｃ（Ｒａｇ２−、グルコースからエタノールを生産でき ない）及びＣＢ５２９３．９１　（Ｒａｇ２“、グルコースを代謝してエタノー ルを生産）を形質転換した０ジエネチシン（２００ｍｇ／ｌ）を補足したＹＰＤ 培地上で組換え細胞を選択した後、３角フラスコ中の２８℃にてグルコースの存 在下のＭ９ＥＬ１０培地（１０ｇ／Ｉの酵母抽出物を補足したＭ９培地［Ｍａｎ ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、上記で引用］）中で、撹拌しながら形質転換細胞を 約２０時間予備培養した。その後この予備培養物を用い、１０−３の希釈にて、 Ｍ９ＥＬ１０培地（５０ｍｌ）を含む３００−ｍ＋の３角フラスコに種々の炭素 源の存在下で（グルコースのみ［２０ｇ／　Ｉコ、又はグルコース［２０ｇ／Ｉ ］及びエタノール［２０ｇ／ｌ］、あるいはグリセロールのみ［２０ｇ／Ｉ］又 はグリセロール［：２０ｇ／］］及びエタノール［２０ｇ／＋１）接種した。

組換え細胞を２８℃で撹拌しながら５日間培養した後、各培養物の上澄み液の細 胞−非含有試料を回収し、等量のＬａｅｍｍｌｉ　２Ｘ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ　 ｉ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７　［１９７０１６８０）と混合した。９６°Ｃに１０ 分間加熱した後、等量の２５μｍの上澄み液に含まれる蛋白質を８５％５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル上で分離した（２５ｍＡ）。その後ゲルをクーマシーブ ルーで染色することによりアルブミンの分泌を視覚化し、濃度測定により評価し た（ＳｈｉｍａｚｕＣ３９３０デンソトメ−ター）。

図１６は株ＭＷ９８−８Ｃ／ｐＹＧ１３２の場合に得られた結果を示し、その場 合、培地に添加されたエタノールの存在下で細胞を培養すると多量のアルブミン 分泌が観察される。対照的に細胞がグルコース又はグリセロールの存在下で培養 されると上澄み液中のＨ３Ａは検出されない。

株ＭＷ９８−８Ｃ／ｐＹＧ１３２の場合に得られた結果と対照的に、形質転換細 胞ＣＢ５２９３．９１／ｐＹＧ１３２は上記の培養条件のすべてにおいてＨ５Ａ を生産することができる（図１７）。しかしエタノールが細胞代謝の産物である 培養と比較して、培地に添加されたエタノールが含まれる培養の場合にアルブミ ン生産は２−３倍高い。

これらの結果は、上記の実施例で記載した宿主／ベクター系の、誘導条件下でバ クテリア又は哺乳類由来の多量の組換え蛋白質を生産する能力を確証している。

例えばエタノールの存在下でグリセロール又はグルコースを含む培地中の株ＣＢ ５２９３．９１／ｐＹＧ１３２における３角フラスコ中のアルブミン生産は、濃 度測定により１９０−２００ｍｇ／ｌと評価された（図１７）。

アルブミン生産はグルコースの存在により減少しないので、これらの結果はＫＩ ＡＤＨ４プロモーターのグルコースによる抑制の不在も確証ローＨ３Ａ遺伝子の 発現（図１８） 発現プラスミドｐＹＧ１３０を用い、Ｋ、ラクチス株ＣＢ５２９３９１　（Ｒａ ｇ２’″）を形質転換した。ジエネチンン（２００ｍｇ／Ｉ）を補足したＹＰＤ 培地の組換え細胞を選択した後、前実施例に記載の通りに形質転換細胞を予備培 養し、培養した。７．２．１．に記載の通りに培養上澄み液の試料の電気泳動に よりアルブミン分泌を評価した。ＫＩＡＤＨ４プロモーターの切断誘導体の場合 に得られた結果を図１８に示す。宿主／ベクター系ＣＢ５２９３．９１／ｐＹＧ １３０は明らかに組換えアルブミンを生産し、分泌することができる。プラスミ ドｐＹＧ１３２（全ＫＩＡＤＨ４プロモーター）の実施例の場合と同様に、アル ブミン生産は単一炭素源としてグルコースを含む培地中で観察されるが全プロモ ーターと比較して少量である。対照的にグルコース及びエタノールを含む培地中 の細胞の培養は、Ｈ３Ａ生産を２−３倍に増加させる（図１８）。

Ｋ、ラクチス株２３５９／１５２の試料を、ブタペスト条約の条件下で１９９１ 年６月４日、Ｂａａｒｎ、Ｈｏ１１ａｎｄのＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖ ｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＣＢＳ）に番号ＣＢ５２８９．９ １として寄託した。Ｋ、ラクチス株ＣＢ５２９３．９１は、ブタベスト条約の条 件に従って１９９１年６月１１日に寄託された株ＣＢ５１０６５に対応する。

表１ １１０　１２０　１３０　１４０　１５０　１６ｃ１１４１　Ａ？ＣＡＡ？？Ｇ Ｇ？　Ｔ〒丁フＣ？？ＣＣ？　Ｃ？Ｃ？？？ＣＧＣ？　？？’ＴＣ丁ＣＣＣＣＣ ＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡ　ＣＡＡbＡＴＡＣＪＡ　１２００ ｍ２０１　ＣＡＣＡＣＧＣＡＡＴ　Ｇ　１２１１Ｆ詳誉１ １８１　テテ丁？テｉ丁丁フフ　ＣテＣ丁Ｃ丁テＣτ＾　入子ＧＧ＾τＣ入入Ｇ ＣＡ丁Ｃ入Ｃ丁入Ｃτ　丁Ａ丁ＣへＣ入Ａ丁丁　丁へ丁Ｃへbτ丁Ｔ丁　２４０ ２４１　↑ＣＣλ入τＧ入τＧ　ＴＴＧＣＣλＴテＧＣＣＣτ丁ＧテテＧＧＣＣ 丁フＣフＣＧ入ＡＣテ入ＧテＣＣＧテＣテ　ｉ丁Ｃ丁ＧＧ丁噬■■@３００ ３０１　＾Ｃ丁７ＧＧ丁ＧＡＧ　ＧＧＡ＾Ａ？？Ｃ？τ　＾ＧＣＡＣ？ＧＧＡＣ 〒ＧＣＧＣτＧ丁Ｇ八　τ入？（へへＣＣτＧ７　テ＾λ入■e入了＾入　３６ ０ ３６１　ＣＡＡＧＧＡＧテｃａ’ｒｒ丁丁丁Ｃｋ入〒Ｔ　ＧＡＣＡＡＴｉ７ＣＴ 　ＴｋＴＣ人τ丁Ｇ丁Ｃ丁ＣテＧＧＧ入？ＣＡ　Ａτ丁ＧＧH？丁丁丁　４２０ ４２１　Ｃ丁ＴＣＣ？ＣＹ（”？　ｎｃＧｃＴＴＴＴｃ　？ＣＣＣＣＣＡＣＣＡ 　ＡＣＡＡＣＡＣＡｇｇ　ａｔｃｃ　４６４１１０　１２０　１３０　１４０　 １！１０　１６０１１０　１２０　１３０　＋４０　１５０　１６０１　ｇｔｃ ｇａｃＧｃＧＡ　ＧＡＣＡＡＣＡＣ？Ａ　？ＴＧ？ＧＡＧＡＡＡ　ｋＧＧｃＡｃ ＴｃｈＡ　ＡＡ＾ＧＣＧＭ：ＣＴ　ＣＣＧ丁ＴＡ`ＴＴＧ　６０ ”””　ｒ＋ｇ’＝−、ｅ　４ Ｆｉｇ冒ｅ６ 遺伝子、Ａ Ｆ名−ｒｅ９ −Ｕ ｈｄ　、ａＰｈ …コ 一＝　ｐＹＧ７２ （δＪ　ｋｂｌ ５ａｃｌ　ＰＧＫｓ、ｃ ｂｌａ　ｌ　７）ｈｎｄｌｌ＋ ζイ Ｉｄ Ａ　ＩＲｌ ＩＲＩＰｌｅｌＮ ｃ　ＬＡＣ４＜・ 消化　万ミξ、８−一一う２．イ２！ ５．１°５，５Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　１１ Ｏ ０１２３４Ｃ５６ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ Ｆｉｇｕｒｅ　１６ Ｆｉｇｕｒｅ　１７ Ｆｉｇｕｒｅ　１８ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年２月２１日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．図１に示す配列又はその相補鎖、あるいはこれらの配列の誘導体の全体又は 一部を含み、転写プロモーター活性を有するＤＮＡ配列。
2. ２．図２に示す約０．５−ｋｂのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメント又は図３に 示す約０．７−ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの全体又は一部を 含む、請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列。
3. ３．図１に示す配列に相補的な鎖のヌクレオチド１及び７２３により区切られた フラグメントに対応する約０．７−ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｓａｃｌフラグメントの 全体又は一部を含む、請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．請求の範囲１−３のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ。
5. ５．さらに１個又はそれより多い構造遺伝子を含む、請求の範囲４に記載の組換 えＤＮＡ。
6. ６．該構造遺伝子の発現産物の分泌を可能にするシグナルも含む、請求の範囲５ に記載の組換えＤＮＡ。
7. ７．構造遺伝子が薬剤又は農産物一食料品として興味深い蛋白質をコードする、 請求の範囲５及び６に記載の組換えＤＮＡ。
8. ８．構造遺伝子が酵素（特にスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、アミ ラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン等）、血液誘導体（血清アルブミン、 アルファー又はベーターグロブリン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、フォンビルブラ ント因子、フィブロネクチン、アルファ１−アンチトリプシン等）、インスリン 及びその変異体、リンホカイン（インターロイキン、インターフェロン、コロニ ー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等］、ＴＮＦ、ＴＲＦ等） 、成長因子（成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、 ＴＧＦ等）アポリポ蛋白質、ワクチン生産のための抗原性ポリペプーチド（肝炎 、サイトメガロウイルス、エプスタインーバール、ヘルペス等）、あるいは別の 場合、ポリペプチドの融合体、例えば特に安定化部分に融合された活性部分を含 む融合体（例えばアルブミン又はアルブミンフラグメントとウィルスレセプター 又はウィルスレセプターの一部［ＣＤ４など］の間の融合体）から選ばれる蛋白 質をコードする、請求の範囲７に記載の組換えＤＮＡ。
9. ９．自律複製性又は組み込み性であることができる発現プラスミドの一部を形成 する、請求の範囲４−８に記載の組換えＤＮＡ。
10. １０．請求の範囲１−９のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列又は組換えＤＮＡを 含む組換え細胞。
11. １１．酵母である、請求の範囲１０に記載の組換え細胞。
12. １２．クルイベロミセス属の酵母である、請求の範囲１１に記載の組換え細胞。
13. １３．組換え遺伝子の発現のための、請求の範囲１−９のいずれか１つに記載の ＤＮＡ配列の利用。
14. １４．プロモーターの各側に２つの反対の配向で挿入された組換え遺伝子の同時 発現のための、請求の範囲１３に記載の利用。
15. １５．薬剤又は農産物一食料品として興味深い蛋白質をコードする遺伝子の発現 のための、請求の範囲１３及び１４に記載の利用。
16. １６．請求の範囲１０−１２のいずれか１つに記載の組換え細胞を培養し、生産 された蛋白質を回収する、組換え蛋白質の生産の方法。
17. １７．薬剤又は農産物一食料品として興味深い蛋白質の生産のための、請求の範 囲１６に記載の方法。
18. １８．蛋白質が好ましくはヒト血清アルブミン又はその分子変異体の１つ線ある 、請求の範囲１７に記載の方法。