SU1630616A3

SU1630616A3 - Способ получени десульфатогирудина

Info

Publication number: SU1630616A3
Application number: SU864028035A
Authority: SU
Inventors: Хиннен Альберт; Мейхак Бернд
Original assignee: Циба-Гейги Аг (Фирма)
Priority date: 1985-08-29
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 1991-02-23
Also published as: IE58844B1; PH24715A; DE3678647D1; NO175871B; NO863458L; HUT42525A; FI863430A0; HU211207B; GR862209B; FI91280B; FI863430A; DK175093B1; PT83273A; PT83273B; CA1318616C; NO175871C; AU6203286A; JPH07110233B2; DD267739A5; NO863458D0

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к получению чужеродных полипептидов в дрожжевых клетках. Целью изобретени вл етс повышение выхода целевого продукта . Способ заключаетс в том, что; конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез десульфа- тогирудина путем объединени BamHI- Sall фрагмента векторной плазмиды р,Л)В20С размером 6,3 kb с гибридным промотором PH05-GAPDH, состо щим из BamHT-BstEHPH05-d parMeHTa плазмиды р 31/Y, св занного линкерами BglTI с промоторным фрагментом Bglll- EcoRIGAPDH плазмиды pGPDH-E и Hgal- BamKI-фрагментом плазмиды pMT350L размером 0,2 kb, кодирую;щм десуль- фатогирудин. Штамм Ј. cerevisiae GRF18 трансформируют полученной ДНК, культивируют клетки в среде, содержащей 0,03 г/л дисульфатиридина. 4 табл. § (Л

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к получению чужеродных полипептидов в дрожжевых клетках.

Цель изобретени - повышение выхо-1 да целевого продукта.

Способ заключаетс в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую гибридные промотор PH05-GAPDH, состо щий из Clo-SatI РН05, промоторного фрагмента плазми-, ды р 31/Y размером 545 Ър, св занного синтетическим1 линкером Bglll с Bglll- EcoRIGAPDH промоторным фрагментом - - плазмиды pGAI)H размером 266 bp Sal I- Hind Ill-фрагмент ппазмиды pIDB207/ /205-HIP размером 6,3 kb и EcoRI-HfndITJ-фрчгмент плазмиды pJDB207/pH05(FC:0)HTR размером 643 bp(

содержащий дисульфатогирудин Hgal- BamIII-фрагмент плазмиды p IL310L размером 0,2 kb трансформируют полученной рекомбинантной плазмидной ДНК штамм дрожжей S.cerevisiae GRIM8, культивируют трансформированные клетки , в жидкой культуральной среде, содержащей 0,03 г/л дегидрогенфосфата кали .

Пример 1. Конструирование РН05 промоторных делеций.

а) ВаЗЗ расщепление. Рекомби- нантный фаг М13мр9/НР05 Barn-Sal, содержащий БашНТ-ЯаИ-фрагмент РН05, используют в качестве источника РН05 промотора. 20 кг фага ДНК (RF: репликативна форма) расщепл ют ре05

со о о

CD

с

стрикционной эндонуклеазой Sail, получа линейную ДНК приблизительно

9kb, После экстрагировани смесью фенол/хлороформ ДНК осаждают этано- лом. ДНК повторно суспендируют в

10мК трис, рН 8,0, в концентрации 0,5 мкг/мл. 16 мк ДНК, отщепленной Sail, расщепл ют 2 eg экзонуклеазы BA131(BRL) в 100 мл 20 мМ трис, рН 8,0, 199 мм NaC, 12 мМ MgCl,

2 мМ CaClЈ и 1мМ ЭДТА. Аликвотные части 2 мкг ДНК кажда отбирают после 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мин инкубировани при ЗП°С и немедленно смешивают с 50 мкл фенола и 60 мкл TNE. После экстрагировани смесью фенол/хлороформ и осаждени этанолом, ДНК повторно суспендируют в 1 0 трис, рН 8,0, при концентрации 100 мкг/мл, Дл анализа степени экзонуклеолити- ческого отщеплени Ва131 0,Ь мкг ДНК дл каждого момента времени расщепл ют эндонуклеазой ВатНТ и анализируют на 1,5%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8,3 (90 мМ трис-IICl, рК 9,3, 90 мМ борной кислоты , 2,5 мГ1 ЕДТА) . В среднем 100 Ьр удал ют с каждого конца фрагмента за 1 мин Ва131 расщеплени .

б) Добавление EcoRI линкеров к обработанной Ва131 ЛНК. Дне ец. EcoRI линкеров (5 -GGAATTCC-3 , BRL) повторно суспендируют в 250 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЕДТА. 2 мкг EcoRI линкеров обрабатывают киназой в в 75 мкл 60 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgClfc, 15 Mil ДДТ, 10 мкМ АТР и 33 ед.т4 полинуклеотидной киназы. Через 1 ч при 37°С смеси дают остыть до комнатной температуры, а затем хран т при -20°С.

Отожженные двунитевые EcoRI линкеры св зывают тупыми концами с ДНК- фрагментами, обработанными Ва131, 0,5 мкг ДНК, обработанной Ва131, инкубируют в течение 16 ч при комнатной температуре с 50-кратным избытком EcoRI линкеров, обработанных киназой и 20 мкл 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgClfe, .10 ДТТ, 4 мК АТР и 600 ед.Тц ДКК-лигазы. После инактивировани Т. лигазы (10 мин при ) избыток EcoRI линкеров отщепл ют 50 ед, EcoRI в- Объеме 50 мкл. ДНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ, .осаждают этанолом и повторно суспендируют в 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЕДТА (-ТЕ). Затем ДНК отщепл ют 5 ед. BamHI и полученную

смесь внос т в 1,5%-ный агарозный гель с низкой температурой плавлени i в трис-боратном буфере. Полосы окра-/ шивают этидиумбромидом и визуализируют длинноволновым УФ-светом при 366 нм. Широкие диффузные полосы между около 100 п.о. и 600 п.о. вырезают из гел , и ДНК экстрагируют.

. в) Дотирование в М13мр9. 3 мкг Ml Змр9 расщепл ют 15 ед. EcoRIи 15 ед. BamHI в объеме 50 мкл. После экстрагировани фенолом и осаждени этанолом ДНК повторно суспендируют в 50 мкл ТЕ. 5 мкл отрезков векторной ДНК (около 200 нг) смешивают с 10 мкл указанных образцов (ДНК-фрагменты, полученные из различных Ва131 переваров , как описано в примере 16) и лигируют в полном объеме 20 мкл в присутствии 60 мМ трис-HCl, рН 7,5,

6 мМ MgClii, 100 мМ ДТТ, 1 мМ АТР и и 200 ед.Т ДНК-лигазы в течение 15 ч провод т трансдукцию компетентных клеток штамма E.coli M101. Фаги выращивают и анализируют по размеру их ДНК-вставок путем отщеплени ре- стрикционными ферментами EcoRI и BamHI.

г)Определение Ва131 конечныхточек делеции определением последовательности аминокислотных остатков по Сангеру (делеции Sail сайта). Определение последовательностей провод т , использу систему дидеокси-ДНКопределени последовательностей. Конечные точки делеции приведены в табл.1.

д)Определение Ва131 конечных точек делеции определением последова- тельности аминокислотных остатков по Сангеру (делеции от BamHI сайта). Осуществл ют аналогичный набор Ва13) делеции, как описано в пунктах а-в за исключением того, что М13мр9 РН05 Barn-Sal вырезают с помощью BamHI. Ва131 расщепленные фрагменты обрабатывают EcoRI и Sail, и полученные фрагменты клонируют в MlЗмр9 расщепленный EcoRI и Sail. Конечные точки делеции приведены в табл.2,

е)Конструирование внутренних РН05 промоторных делеции. Набор Ва13Г делеции, описанный под пунктом г, приводит к получению левых РН05 промоторных фрагментов, заканчивающихс EcoRI сайтом, а Ва131 набор делеции, описанный в пункте д, приводит к получению правых РНС5 про 163061

моторных фрагментов, заканчивающихс EcoRJ-сайтом. Комбиниру левые и правые в различных положени х создают внутренние делеции, которые содержат EcoRJ линкерный сегмент по сайту делетированной ДНК. Отдельные внутренние делении конструируют, выреза левые и правые из М13мр9 производных рестрикционными эндонук- -jo леазами EcoRI и BamHI (левые) или EcoRI и Sail (правые) и выдел соответствующие Фрагменты с помощью электрофореза в м гком агарозном геле , как описано в пункте б. Эквимол р- з ные количества левых, правых и 200 нг BamHI и Sail расщепленных М13мр9 векторных ДНК лигируют, как описано в пункте в. После трансдук- ции в E.coli Ml01 белые п тна отби- 20 рают, определ ют RF и анализируют рестрикционным ферментативным анализом (BamHI, Sail, EcoRI). Куски, приведенные в табл.3, объедин ют дл создани специфических внутрен- 25 них делеции.

Пример 2. In vivo анализ внутренних делеции РН05 промотора.

Различные делеции, описанные в 30 примере 1, клонируют в плазмиду pJDB207(PH05), замен дикий тип РН05 Barn-Sal Фрагмента делетирован- ным вариантом. После трансформации дрожжевого штамма S.cerevisiae AH216. определ ют активность кислой фосфа- тазы. Анализ показьюает, что три зоны, существенные дл РН05 экспрессии , расположены в следующих положени х:40

1.между положени ми -349 и -383 (HAS1);

2.между положени ми -225 и -263 (HAS2);

3.между положени ми -87 и ,с -125 (ТАТА бокс).

ДНК фрагменты, содержащие HAS или ИА52 или HAS1 и ИА52 РН05 можно получить из рекомбинантного бага М13мр9 (РН05) путем отщеплени соответствую- 50 щими эндонуклеазами.

Пример 3. Конструирование слитых PH05-GAPDH гибридных промоторов .

В примерах 1 и 2 конструируют участки вокруг положений -365 ИА51 (РН05) и другой участок вокруг положени -180 ИА82 (РН05) РН05 гена - возможные кандидаты дл HAS с регули35

55

з 0 5

0 0

с

0

5

руемыми функци ми. HAS (PH05) содержитс в 68 п.о. BamHI-Cla-фрагмен- те, тогда как оба ИА51 (РН05) и Ш52 (РН05) содержатс в 368 п.о. BamHI-BstEII-фрагменте. Каждые два этих фрагмента сливают с двум различными GAPDH, которые включают ТАТА бокс и сайты инициировани транскрипции GAPDH.

а)Конструирование дрожжевой генной библиотеки 30 мкг полной высокомолекул рной ДНК дрожжей дикого типа штамма S288C инкубируют в течение

30.мин при с 2 ед. EcoRI мети- лазы в 250 мкл EcoRI буфера метилировани . ДНК осаждают этанолом, повторно суспендируют в 500 мкп 25 мМ трис-HCl, рН 8,5, 2 мМ MgCla (EcoRF буфер) и расщепл ют EcoRI до тех пор, пока не получат распределение фрагментов ДНК по размерам с максимумом в области 30-50 т.п.о. Дрожжевые ДНК, расщепленные в услови х EcoRI , Фракционирую по размерам в градиенте сахарозы (5-20% сахарозы в 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА). 30 фракций по 0,4 мл кажда собирают с верхнего значени градиента. Фракци 16 содержит ДНК-фрагменты размером по 30-40 т.п.о. ДНК этой фракции 3 мкг осаждают этанолом и лигируют в течение 16 ч при 15°, в полном объеме 15 мкл с 15 мкг космидно- го вектора pYcTf линеаризированного EcoRI. Лигирование провод т 300 ед.Т ДНК-лигазы, использу описанную буферную систему. ДНК упаковываетс in vitro в бактериофаг /1/В, а собранные фаги используют дл трансдукции

Q f

E.coli штамма НВ101 (rk , mk , 1m , pro , гёс А), Эффективность трансдукции составл ет около 5000 устойчивых к ампициллину колоний на мкг рУс вектора.300 amp колоний отбирают и выращивают в LB среде.

б)Выделение дрожжевого GAPDH гена. Описанную генную библиотеку скринируют синтетическим олигонукле- отидом следующего строени : 5 - ССТССАТСТТССАССССССС-31 .

10 мкг олигонуклеотида обрабатывают киназой, использу 10 мклОГ32р-АТР (3000 Кюри/ммоль, 10 мкКюри/мкл Тф полинуклеотидной киназой. Положительное клонирование детектируют ав- торадиографически. Выдепение плазмид- ной ДНК приводит к получению гибрид- ного клонаt который содержит

20

25

2100 п.о. Hindi фрагмента, кодирующего GAPDH. Клонированный GAPDH , ген имеет ту же самую последователь ность, что и pgap 491.5

в) Получение GAPDH расположенных ниже промоторных. 649 п.о, Tagl-фрагента , который включает положени от 27 до 675 от ATG GAPDH гена выде ют , расщепл гибридную плазмиду 10 Tag, выдел ДНК-фрагмент на 1,2%- ном м гком агарозном геле и экстрагиру ДНК гор чим фенолом. Клонирование Tagl-фрагмента провод т в Clal- сайт pBR322. 1 мкг pBR322 отщеп-г 15 ют трем единицами Clal. 300 нг ли- гируют примерно с 300 нг вставки ДНК (649 Ьр Тг 1 фрагмент), использу 200 ед.Т ДНК-лигазы в 20 мкл. Трансформирование провод т в E.coli НВ101 на устойчивость к ампициллиу . ПЛазмидную ДНК получают и анализируют рестрикционным анализом. Ориентацию Tagl-фрагмента устанавливают, использу рестрикционную эндонуклеазу Пга в сочетании с BamHI. Выбирают плазмиду, котора содержит TagI сайт положени -675 вблизи HindIII-сайта pBR322. Эту плазмиду, обозначенную pBP322/GAPDH, линеаризируют, исполь- 30 зу BamHI, а расщепление Ва131 осуществл ют , как. описано в примере 1, за исключением того, что используют BglII-линкеры. Размер Ва131 укороченного Tagl-фрагмента определ ют 35 рестрикционным анализом (использу Bglll и-HindIII).

Пример 4. Экспрессирова- ние десульфатогирудина, контролируемое PH05-GAPDH гибридным промотором. 40

I. Регулирование нуклеотидной последовательности на 5 -окончании де- сулъфатогирудиночого Н, V, R гена.

Нуклеотидна последовательность, кодирующа десульЛатогирудин., начинаетс с GTT-кодона, сто щего после NH -терминального валина в конечном продукте. Дл удобного субклонировани и экспрессировани в E.coli ко- дирующую последовательность продолжают на 5 -окончании с помощью восьми нуклеотидон, включающих EcoRI-or- раничительный участок и ATG-иницииру- ющий кодон. Дл точного скелетного i сли ни гирудиновой кодирующей последовательности с последовательностью кодирующей РН05 сигнальный пептид, эти дополнительные нуклеотиды удал -

0

5

0 5 0 5

0

ют путем измерени EcoRI-ограничитель- ного участка в участок растущего окончани , добавлени синтетического олигонуклептида, содержащего участок распознавани HgAI в таком положении , что последующее расщепление с помощью Hgal происходит непосредственно сверху от GTT-кодона, . Ведение Hgal ограничительного участка перед десульфатогирудиновым геном, 8 мкг плазмиды pML310 (ЕР 168342) исчерпывающе расщепл ют с помощью ограничительной эндонуклеа- зы EcoRI ДНК, экстрагируют системой фенол/хлороформ и осаждают этанолом. Выступающие концы в положении 5 удал ют нуклеазой S,. ДНК рМЪЗ10/EcqRI в количестве 4 мкг расщепл ют в 100 мл смеси, состо щей из 250 мМ NaCl, 1 мМ ZnSO, 30 мМ ацетата натри при рН 4,6 с помощью 20 ед,/мл нуклеазы S (Сигма) в течение 45 мин при 37°С.

ДНК экстрагируют смесью фонол/хлороформ и осаждают этанолом. ДНК (pML310/EcoRI/Si повторно суспендируют в 100 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, и инкубируют в присутствии 2 ед, щелочной фосфа- тазы кишечника теленка в течение 1 ч при 37°С. Энзим инактивируют в течение 1,5ч при 65°С, Концентрацию NaCl в инкубационной смеси устанавливают равной 150 мМ, Дефосфорилированную ДНК (рМЬЗЮ/ i- EcoRI/S /CIAP) очищают путем адсорбции на ионообменной .колонке ДН52 в буфере с низким содержанием солей (150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) и затем элюируют буферным раствором с высоким содержанием солей (1,5 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА). ДНК осаждают этанолом и повторно суспендируют в HgO в концентрации 0,8 мг/мл..

Олигонуклеотид формулы 5 - AGCGT.CGACCCT-3 синтезируют1 фосфотри- эфйрным методом. Получают самокомплементарную последовательность олиго- нуклеотидов, содержащую участок распознавани -GACCC-ограничительной эндонуклеазы HgAI. Отжиг двух одинар- ных нитей приводит к получению дву- нитевой ДНК-св зки из 12 пар азотис- - тих оснований.

Синтетический однонитевой олиго- деоксинуклеотид в количестве 1,2 мкг

фосфорилируют в 10 мкл системы, состо щей из 60 мМ трис-HCl с рН 7,5, 10 мМ MgClfc, 5 М МДТТ, 30.1 Ci (ft-32p ATP (30QO Ci ммоль 1 и 6 ед.Т4 поли- нуклеотидекиназы в течение 30 мин при 37 С с последующим замещением в течение 15 мин в присутствии 0,5 мМ АТР. Полученную смесь дополнительно инкубируют в течение 10 мин при 75°С с целью инактивации энзима и затем охлаждают до комнатной температуры дл отжига.

Меченную по iZP ДНК-св зку в количестве 0,6 мкг (170 лмол ) смеши- вают с 2,4 мкг (1,75 пмолей концов) pMl310/EcoRI(S,,)CIAP и лигатируют в 20 мл смеси, состо щей из 60 мК трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgClg, 5 мМ ДТТ, 3.5 мМ АТР 800 ед.Т4 ДНК-ли- газы, в течение 20 ч при 150°С. Лига зу инактивируют в течение 10 мин при 85°С и избыток молекул св зки удал ют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ ЭДТА с рН 7,5, 300 мМ ацетата натри с рН 6,0 и 0,54 объемов изо- пропанола. Через 30 мин пребывани при комнатной температуре ДНК суспендируют в 45 мкл лигатационной смеси и лигнируют в течение 6 ч при с образованием кольцевой ДНК.

Аликвоты лигазной смеси объемами 1 и 3 мл добавл ют к 100 мл обработанных кальцием трансформационных копетентных клеток E.coli HB101. Клет- ки оставл ют охлаждатьс во льду на 30 мин, затем инкубируют в течение 3 мин при 4.°С, охлаждают в течение 2 мин во льду и инкубируют в течение 1 ч при 37°С в 400 мкл среды SOS. Полученные клетки концентрируют до объема 100 мкл и нанос т на пластины с LB агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

iо

Двенадцать трансформированных агар

колоний индивидуально выращивают в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, Готов т плазмидную ДНК, Наличие синтетической олигонуклеотид ной св зки подтверждают определением последовательности аминокислотных остатков с использованием фрагмента однонитевой ДНК-затравки, котора гибридизуетс с кодирующей нитью гирудина. Клон, который содержит ДНК-св зку в правильнрм положении впереди гирудинового гена, обозначен как pML310L,

5 0

5

Q

5

II. Сли ние РН05 сигнальной по- . следовательности десульфатогирудино- вого структурного гена.

а7 Выделение десульфатогируди- нового фрагмента. 12 мкг ДНК-плазмиды pL310L исчерпывающе расщепл ют эндо- нуклеазами БатК и Pyul. После экстракции ДНК два указанных ограничительных фрагмента отдел ют, в 1 ,2%- ном агарозном геле в трис-борат-ЕДТА буфере, рН 8,3, Из гел выдел ют Pyul-BamHI-фрагмент размером 0,84 п,о, ДНК элюируют, Pyu-BamHI-фрагмент pM1310L дополнительно расщепл ют с помощью эндо- нуклеазы Hgal. В результате расщеплени образовываетс HgaI-BamHI-фраг- мент размером 198 п.о,, который содержит полную кодирующую последовательность дл зрелого десульфатоги- рудина. Дополнительное расщепление с помощью А1И1 не затрагивает этого фрагмента, но устран ет другой Hgal- фрагмент аналогичного размера.

Нужный KgaI-BamHI-фрагмент отдел ют от других фрагментов на 1,5%-ном агарозном геле в ТВЕ буфере и элюи- руют. ДНК очищают ионообменной хроматографией , осаждают этанолом, ДНК повторно суспендируют в HgO в концентрации 30 мкг/мл (0,2 пмоль/мкл)..

Выделение РК05 промоторного участка с частью РН05 сигнальной последовательности . Плазмида р31/РН05-ТРА18 имеет-РН05 промотор и РН05-сигналь- ную последовательностьt скелетно св занную с инородным структурным геном (t-PA). Фрагмент 584 п.о. BamHI-Ball содержит РН05-промотор и всю РН05-сиг- нальную последовательность, но с восемью нуклеотидами на 3 окончании.

р31/РН05-ТРА18 ДНК в количестве 8 мкг расщепл ют эндонуклеазой Ball (16 ч при 37ЙС). ДНК очищают .экстракции смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом, ДНК повторно суспендируют в при концентрации 0,7 мг/мл.

Правильное соединение между РН05 сигнальной последовательностью и кодирующим участком десульфатогирудина обеспечиваетс синтетической св зкой формулы:

(1)5 -CCAATCGA-3 ;

(2)3 -GGTTAGGT СААСА-5 .

Восемь нуклеотидов на 51 окончании св зи (S -CCAATCCA) представл ют собой часть РН05-сигнальной последовательности от участка Ball до рецессионного участка. П ть нуклео- тидов, выступающих над окончанием 5 - олигонуклеотида(2), соедин ютс с частком HgAI расщеплени на 5 . кончании десульфатогирудиновой одирующей последовательности.

Индивидуальные однонитевые олиго- уклеотиды (1) и (2) синтезируют JQ осфотриэфирным методом. Олигонук- еотиды (1) и (2) в количестве

1,1 мкг и 1.8 мкг соответственно инf ивидуально фосфорилируют на их 5

кончани х, смешивают в эквимол рных 15 оличествах и отжигают.

Фосфорилированную двунитевую ДНК-св зку в количестве 1,3 мкг (200 пмоль), лигиругот с 7 мг (1,8 пмоль) рЗГ/РН05-ТРА18 расщепленной с помо- J 20 щью Ball в 40 мл смеси, состо щей из 60 мМ трис-KCl, рК 7,5, 10 мМ MgCl2, 3,5 мМ АТР, 5 мМ ДТТ и 1400 ед.т ДНК-лигазы, при в течение 16 ч. Лигазу инактивирз ю г в течение 1 0 мин 25 при 85 ЙС. Избыток св зок удал ют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ ЭДТА, 300 мМ ацетата натри с рН 6,0 и 0,54 объема изопропанола. ДНК повторно суспендируют и дополнительно 30 расщепл ют эндонуклеазой BamHI. После экстракции ДНК смесью фенол/хлороформ и осаждени из этанола два указанных ограничительных фрагмента отдел ют в 1,2%-ном агарозном геле в 35 трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3. Из гел выдел ют 0,6 т.п.о. фрагмент. , ДКК элюируют и дополнительно очищают ДЕ52 ионообменной хроматографией и осаждением этанолом. RamHI-Hgal 40 ДНК-фрагмент размером 0,6 т.п.о, повторно суспендируют в при концентрации 40 мкг/мл.

Выделение pJDB207 дрожжевого векторного фрагмента. 9 мкг плазмиды Д5 pJDB207 РН05-ТРА(12-2) расщепл ют эндонуклеазой BamHI, ДНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ и осаждают этанолом, суспендируют в 50 мМ трис- НС1; рН 8,0, при концентрации о 0,1 мг/мл и расщепл ют 7 ед. щелочной фосфат зы кишечника теленка в течение 1 ч 37°С. Фосфатазу инак- тивировали в течение 1,5 ч при 65°С. ДНК очищают ДЕ52 ионообменной хро- „ матографией и осаждением этанолом. Крупный фрагмент BamHI размером 6,8 т.п.о. отдел ют в 1,2%-ном агарозном геле в грис-Гюрат-ЭДТА буфере при рН 8,3. ДНК элюируют и очищают с помощью ДЕ52 ионообменной хроматографии и осаждением этанолом. ДНК раствор ют в воде в концентрации 0,4 мг/мл (0,1 пмоль/мкл).

Лигатирование РН05 промоторного фрагмента и десульфатогирудинового структурного гена с pJDB207. Дрожже- вой вектор pJDB207, РН05-примотор- ный фрагмент с РН05-сигнальной последовательностью и десульфатогируди новый структурный ген выдел ют в виде фрагментов ДНК и лигируют их с образованием экспрессионной плазми- ды.

В течение 20 ч при 15°С в 10 мкл смеси, состо щей из 60 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ MgCLa, 5 мМ ДТТ, 1 мМ АТР и 400 ед.Тц ДНК-лигазы, провод т лигирование 0,3 пмолъ 0,6 т.п.о, BaHI-Hoal фрагмента р31/РН05-ТРА18 и 0,3 пмоль 0,2 т.п.о. Hoal-BaHI фрагмента рМ13101 с, 0,1 пмоль 6,8 т.п.о. BamHI фрагмента pJDB207P/PH05-TPA(12 2).

Аликвоту лигазной смеси объемом 1 мкл добавл ют к 100 мкл трансформационных компетентных клеток E.coli НВ101, Клетки высевают на LB-arapo- вые пластины, содержащие 50 мкг/мл ампициллина,

R

Арт колонии в количестве 24 ед, индивидуально выращивают в LB-среде в присутствии 100 мкг/мл ампициллина , Плазмидную ДНК анализируют с целью определени размера и ориентации вставки путем расщеплени ограничительной эндонуклеазой Pstl. Клон с правильной ориентацией вставки обозначают как pJDB207/PH05-HIR.

Получение плазмиды pJDB207/PH05/ (Eco)-HIR, С целью удобного соединени элементов YAS(PH05)GAPDH гибридного промотора с кодирующим участком десульфатогирудина, включающим РН05-сигнальную последовательность (как и в плазмиде pJDB207/PH05-HIR) EcoRI ограничительный участок ввод т в 5 нетранслированную область между исходными участками RHK и АТС кодирующей области.

15 мкл плазмиды pJDB207/PHO-HRI расщепл ют эндонуклеазой Dral, Полученные в результате четыре фрагмента отдел ют в 0,8%-ном агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере при рН 8,3. С гел регенерируют фрагмент ДНК размером 4,2 т.п.о., подвергают элюированию и осаждают этанолом. ДНК нов- торно суспендируют в концентрацией 0,6 мг/мл.

Каждый из двух синтетических

олигонуклеотидов, отвечающих формулам 5 -AATTCGATTACCAATGTTT-3 и 3 -GCTAATGGTTACAAA-5 . (2,3 мкг и 2,9 мкг соответственно) , подверга- ют действию киназы в 20 мкл смеси, состо щей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ Mp.de, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР и 20 ед.Т полинуклеотидокиназы. Через 45 мин при 37°С обе реакционные сме- си объедин ют, нагревают в течение 10 мин при 75°С и охлаждают до комнатной температуры. Отожженную олиго нуклеотидную св зку хран т при -20 С.

Фрагмент размером 4,2 -т.п.о. DrAT ДНК в количестве 6,5 мкг (2,3 пмоль) инкубируют в течение 16 ч при в присутствии 70-кратного избытка ки назированной и отожженной олигонук- леотидной св зки в 50 мкл смеси, состо щей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgClu, 5 мМ ДТТ, 3,5 мМ АТР и 800 едЛ 800 ед.Тф ДНК-лигазы. После инактивации Тф ДНК-лигазы в течение 10 мин при избыточные св зки удал ют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ ЭДТА, 300 мМ ацетата натри с рН 6,0 и 0,54 объема изопропанола. ДНК расщепл ют эндонуклеазами EcoRI и Hindlll, Полученные в результате фрагменты отдел ют в 1%-ном агароз- ном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3. Фрагмент размером 643 элюи- руют и осаждают этанолом, повторно суспендируют в концентрации 0,1 п моль/мл. Фрагмент EcoRI-Hindlll содержит РН05 сигнальную последовательность , кодирующую последовательность десульфатогирудина и обрыва- тель РН05 транскрипции.

Из плазмиды р31 /R выдел ли 534 п.о РН05-промоторный фрагмент. 10 мкг рЗ1/R расщепл ют эндонуклеазами EcoR и BamHI, Три фрагмента отдел ют в 0,6%-ном низкоплавком агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, BamHI-EcoRI-фрагмент размером 534 п.о содержит РН05 промотор, включающий

исходные участки mRHK.

i

6 мкг плазмиды pJDB207/PH05-HIR

расщепл ют с помощью BamHI и Hindlll Крупный 6,5 т.п.о, фрагмент отдел ют от других фрагментов в 0,6%-ном . агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере , рН 8,3.

Три описанных фрагмента ДНК с соответствующими липкими концами лиги- руют ТУ ДНК-лигазой в соотношении 534 п.о. BamHI-EcoRI РН05-промоторно- го фрагмента 0,2 пмоль, 643 п.о. EcoRI-HindIII-фрагмента (последова- - тельность кодирующа гирудин ) 0,2 пмоль, 6,5 т,п.о, BamHI-Hindlll векторного фрагмента 0,1 пмоль.

Аликвоту лигазной смеси в количестве 1 мкл добавл ют в 100 мкл обработанных кальцием трансформационных компетентных клеток E.coli HB01.

ь

Двенадцать трансформированных amp колоний индивидуально выращивают в LB-среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина , Плазмидную ДНК анализируют с помощью EcoRI и BamHI ограничительного расщеплени . Выдел ют один клон с ожидаемыми ограничительными фрагментами и обозначают pJDB207/PH05 (Eco)-HIR.

IV. Лигатирование YAS1 (РН05)- GAPDH гибридных промоторов с областью десульфатогирудина, кодирующей белок .

15 мкг плазмиды pJDB207/FH05 (Eco)- HIR расщепл ют с помощью EcoRI и Hindlll. Фрагменты ДНК отдел ют в 1%-ном агарозном геле в трис-борат- ЭДТА буфере, рК 8,3. Фрагмент 643 п.о. элюируют и осаждают этанолом, суспендируют в HjO в концентрации 0,1 пмопь/мкл. 6 мкг плазмиды pJDB207/PH05-HlP исчерпывающе расщепл ют эндонуклеазой Hindlll и Sail. Крупный 6,3 т,п.о. фрагмент / векторна часть) выдел ют электрофорезом, экстрагируют фенолом, осаждают этанолом , суспендируют в в концентрации 0,05 пмоль/мкл.10 мкл плазмиды pGAPDH-EI расщепл ют с помощью Bglll и EcoRI, Фрагмент 266 п.о. Bglll-EcoRI отдел ют на 1,2%-ном агарозном геле в трис- борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, элюируют, осаждают этанолом, суспендируют в HgO в концентрации 0,3 пмоль/мкг. 0,3 пмоль 548 п.о. фрагмента Sall- Bglll, содержащего УА51 (РН05), 0,3 пмоль 266 п.о. BglII-EcoRI-фраг- мента pGAPDHEI, 0,3 пмоль 643 п.о. ЕсоЕ1-Н1паШ-фрагмента рЛ)В207/РН05 (Eco)-HIR и 0,12 пмоль 6,3 п.о. SailHindIII-векторного фрагмента лигиру- ют в 20 мкл смеси, состо щей из 60 ;мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgCle., 5 мМ ДТТ, I мМ АТР и 400 ед.Тц ДНК-лигазы1 в течение 6 ч при , Аликвоты ли- газной смеси объемами 1 мкл и 3 мкл добавл ют к 100 мкл обработанных кальцием клеток E.coli HB101. Выделение плазмиды из атр колоний и ограничительный анализ с помощью Sail, Bglll, EcoRI и Hindlll провод т согласно описанному. Выбирают один положительный клон и ему присваивают обозначение pJDB207/PAPEI-HIR (YAS1). Аналогичную конструкцию создают с помощью 201 п,о. BgIII-EcoRI-фраг- мента, выделенного из pGAPDH-FI, Одной выделенной плазмиде дают обозначение pJDB207/PAPEI-HIR (YAS1). V. Лигирование YAS1 (PH05)-YAS2 (PHOS)-GAPDH гибридных промоторов с протеин-кодирующей областью десуль- фатогирудина. Плазмиды pJDB207/PAPEI10

лоний и анализируют ограничительным расщеплением. Выбирают единичные колонии и их плазмидные ДНК обозначают как pJDB207/PAPEI-HIR(YASl+YAS2) и pJDB207/PAPEI-HIR(YASl+YAS2).

Пример 5. 31 п.о. ДНК-последовательность вл етс достаточной дл выполнени функций фосфат-конт- ролирующего элемента.

31 п.о. последовательность из верхней области РН05-промотора (положение от -381 до -351), ограниченна двум боковыми делеци ми Д1 0 и /М 3 (пример 1е), может потенциально содержать регул торный сигнал. Это предположение может быть проверено путем синтеза двух комплементарных олиго- нуклеотидов, имеющих следующие струк20 туры: 5ЧААТТССАААТАТАТАТТАААТТАССА

CGTTTTCGCAG-3 и З1 -GCTTTATATATAATTT AATCGTGCAAAA GCGTCTTAA-S .

Эта последовательность содержит

t5

/

31 п.о, последовательность% к кото-

HIR(YAs l)) HpJDB207/PAPEl HIR(YASl) 25 рОй прташают ЕсоК ограничительные

в количестве 3 мкг кажда расщепл ют с помощью Bglll. После экстракции фенолом и осаждени этанолом 3 рецессивные окончани ДНК заполн ют в реакции с E.coli ДНК-полимеразой (фраг- 30 мент Кленова), Энзим инактивируют в течение 10 мин- при . ДНК дополнительно расщепл ют с помощью Sail и 7,2 т.п.о, фрагменты выдел ют электрофорезом на м гком агарозном геле, 35 экстракцией фенолом и осаждением этанолом . Каждый фрагмент повторно сус- . пендируют в НгО в концентрации 0,05 пмоль/мкл. Такие фрагменты содержат гирудин-кодирующую область, 40 большинство векторных последовательностей и любой из двух различных GAPDH промоторных элементов, выде ленных из pGAPDH-EI или pGAPDH-FI,

участки. Такие участки EcoRI позвол ют легко осуществл ть полимеризацию последовательности с образованием

мультимеров.

а) Клонирование 31 п.о. элемента в вектор LT98. Каждый из двух синтетических олигонукле отидов, вз тых в количестве 50 пмоль, обрабатывают 20 ед. ТЧ полинуклеотидокиназы в 20 мл смеси, состо щей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мК MgClfc, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, Через 45 мин инкубации при 37 °С обе реакционные смеси объедин ют , нагревают в течение 10 мин при 75°С и охлаждают до комнатной .. температуры, Отожженные олигонуклео- тиды хран т при -200С. Киназированные и отожженные олигонуклеотиды в колиПлазмиду p31/Y расщепл ют с помо- 45 честве пмоль лигируют в течение щью BstEII, инкубируют с помощью 30 мин в объеме, равном .15 мкл. Затем добавл ют EeoRI-фрагмент LT98 векторной ДНК (0,075 пмоль) и. инкубиE .coli ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова ) согласно описанному и расщепл ют с помощью Sail. Фрагмент 649 п.о. отдел ют на м гком агарозном геле и регенерируют экстракцией фенолом и осаждением этанолом.

О.,3 пмоль Ь49 п.о, фрагмента р31/Ј включающего YAS1-YAS2 (РН05) промо- торный элемент и 0,15 пмоль каждого из 7,2 т.п.о. фрагментов лигируют и трансформируют в клетки E.coli НВ101. Плазмиды получают из amp ко50

55

руют в течение 6 ч. После трансформации клеток E.coli HB101 плазмиды выдел ют и анализируют путем расщеплени с помощью BamHI, выбирают индивидуальные плазмиды-с 1, 2, 3, 4 или 5 фрагментами EcoRI и провод т определение последовательности аминокис-. лотных-остатков (по методу Сангера),, Показано, что культиплетные 31 п,о. элементы клонированы в ориентации от головы к хвосту.

31 п.о. последовательность из верхней области РН05-промотора (положение от -381 до -351), ограниченна двум боковыми делеци ми Д1 0 и /М 3 (пример 1е), может потенциально содержать регул торный сигнал. Это предположение может быть проверено путем синтеза двух комплементарных олиго- нуклеотидов, имеющих следующие струк0 туры: 5ЧААТТССАААТАТАТАТТАААТТАССА

CGTTTTCGCAG-3 и З1 -GCTTTATATATAATTT AATCGTGCAAAA GCGTCTTAA-S .

Эта последовательность содержит

5

/

31 п.о, последовательность% к кото-

5 рОй прташают ЕсоК ограничительные

мультимеров.

а) Клонирование 31 п.о. элемента в вектор LT98. Каждый из двух синтетических олигонукле отидов, вз тых в количестве 50 пмоль, обрабатывают 20 ед. ТЧ полинуклеотидокиназы в 20 мл смеси, состо щей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мК MgClfc, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, Через 45 мин инкубации при 37 °С обе реакционные смеси объедин ют , нагревают в течение 10 мин при 75°С и охлаждают до комнатной .. температуры, Отожженные олигонуклео- тиды хран т при -200С. Киназированные и отожженные олигонуклеотиды в коли

1716

б) Клонирование в pJDB207. Олиго- меры 3 п.о. испытывают на их промо- тор-контролирующую функцию путем их встраивани вверх от F элемента GAPD промотора. Плазмиду pJDB207/PAPEI- EGI(YASl) укорачивают с получением плазмиды с вычеркнутым элементом YAS1. Такую плазмиду расщепл ют с помощью Sail и Bglll, очищают на геле и выдел ют крупный векторный фрагмент , В независимой реакционной смеси эту же плазмиду расщепл ют с помощью BamHI. Рецессивные З1 окончани заполн ют ДНК-полимеразой Кле- нова, использу дл этой цели все четыре НТФ. Участки с тупыми концами расшир ют с помощью фосфорплирован- ньк BglII-св зок и после расщеплени с помощью Sail и Bglll путем очистки на геле выдел ют ДНК фрагмент , имеющий приблизительную длину 400 п.о. Крупный векторный фрагмент лигируют с Sall-Bglll фрагментом длиной около 400 п.о. с использованием Тц ДНК-лигазы. После трансформации E.coli HB101 и выделени плазмиды получают плазмиду, не содержащую РН05 YAS. Такую плазмиду обозначают как pJDB207/GAPFI-EGI. Эту плаэмиду расщепл ют с помощью Bglll и она служит вектором дл клонировани 31 п.о олигомеров. 1 198, содержащую 1, 2, 3, 4 или 5-олигонуклеотидных вставок , расщепл ют с BamHI. Фрагменты различного размера выдел ют очисткой в геле и независимо лигируют с pJDB207/GAPFI-EGi; разрезанной эндо- нуклеазой Bglll. Смесь расщепл ют с Bglll дл удалени нежелательного повторно лигированного вектора без ДНК-вставки и затем используют дл трансформации E.coli HB101, Полученные плазмиды анализируют ограничительным аналичом с помощью Sail и Dral (участок внутри GAPDH промотор- ной части).

Пример 6. Экспресси полипептидов .

Штамм CPF18 разновидности Saccha- romyces cerevisiae трансформируют полученными плазмидами.

Клетки трансформантов S.cerevisiae CPF18 выращивают в 10 мл среды Difco без аминокислот, в которой добавлено 2% глюкозы и 20 мг/л L-гистиди- на, в 50 миллиметровой Эрленмейеров- ской колбе, при встр хивании в тече 5 0 о 5

0

5

ние 24 ч при 30°С до плотности 3x10 кл./мл. Эти клетки промывают 0,9%-ным раствором Nad и используют дл инокул ции 50 мл минимальной среды с низким Р: ., полученной согласно рецепту дл среды Difco Jeast Nitrogen Base (без аминокислот, но содержащей 0,03 г/л , I г/л КС1 и 10 г/л L-аспарагина вместо ( 2% глюкозы и 1 г/л L-гистидина). Культуры инокулируют до достижени плотности пор дка 4x10 кл./мл и перемешивают со скоростью 200 об,/мин в течение 42 ч при 30°С.

Дрожжи секретируют десульфатоги- рудиновые соединени в культураль- ный бульон. После ферментации в течение 22 ч из культуральной среды отбирают образец объемом в 10 мл и его обогащают протеинами путем обес- соливани и концентрировани на колонке . Колонку дважды промывают 1,5 мл системы вода - ацетонитрил (9:1) - 0,1% трифторуксусной.кислоты . Десульфатогирудиновые соединени элюируют с колонки системой вода - ацетонитрил - 0,1% трифторуксусной кислоты (3:2 об./об,). Элтоат в количестве 2 мл концентрируют до конечного объема 400 мл, Десулх атогиру- дин идентифицируют анализом с применением жидкостной хроматографии высокого давлени , провод сравнение с аутентичным десульфатогирудином и с помощью пробы на ингибирование тромбина .

Claims

Полученные результаты представлены в табл о 4, Формула изобретени

Способ получени десульфатогируди- на, предусматривающий выделение и очистку целевого продукта, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода целевого продукта и упрощени способа, конструируют ре- комбинантную плазмидную ДНК, содержащую гибридный промотор PH05-GAPDH, состо щий из Clal-Sall PH05 промотор- ного фрагмента плазмиды p31/Y размером 545 Ьр, св занного линкером Bglll с Bglll-EcoRI GAPDH промотор- ным фрагментом плазмиды pGADHs-разме- ром 266 Gbp, SalIr-HindIll-фрагмент плазмиды pJDB207/PH05-HIP размером 6,3 kb, EcoRI-HindIII-фрагмент плазмиды pJDB207/PH05(F,co)-HIR размером 643 Ьр, кодирующий десульфатогиру21

1630616

; 22

Продолжение табл.3