DD282473A5 - Kuenstliche gencodierung fuer authentisches menschliches serum alkunin, dessen verwendung und verfahren zur herstellung desselben - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines strukturellen Gens mit der Kodierung fuer authentisches menschliches Serumalbumin - wahlweise ergaenzt durch eine fluszaufwaerts befindliche Triplette mit einer Kodierung fuer Methionin und wahlweise erweitert durch eine synthetische preprox-Fuehrungskodierungssequenz-, worin die Kodone der Nukleotidfolge selektiert wurden unter Beruecksichtigung eines nichtmenschliches Wirts, z. B. Hefe, der fuer die Expression von authentischen menschlichen Serumalbumin ausgewaehlt wurde. Offengelegt wird auch ein rekombinantes DNA-Molekuel, das besteht aus diesem strukturellen Gen, eingefuegt in einen Vektor, und aus einem Wirt, der mit diesem rekombinanten Molekuel von DNA transformiert wurde. Auszerdem wird ein Verfahren zur Herstellung von authentischem menschlichen Serumalbumin, das in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet wird, offengelegt.{Gen strukturell - Herstellung, Kodierung Serumalbumin authentisch-menschlich; Serumalbumin-Herstellung, menschlich-authentisch; Arzneimittel}

Description

ATG AAC TGG CTT ACT TTC ATC TCf TTG TTG TTC TTG TTC TCT TCT GCT TAC TCT ACA GGT GGT TTC AAG AGG.

Hierzu 12 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines strukturellen Gens mit der Kodierung für authentisches menschliches Serumalbumin - wahlweise ergänzt durch eine oberhalb befindliche Triplettkodierung für Methioium und wahlweise erweitert durch synthetische Prepro^#-Leader-Kodierunysfolge- auf ein Rekombinant - DWA-Molekül, welches dieses Gen in einen Vektor eingefügt enthält und einen mit diesem DNA-Molekül transformierten Wirt. Authentisches menschliches Serumalbumin wird in Arzneimitteln verwendet.

Charakteristik des hekannten Standes der Technik

Serumalbumin ist die Proceinhauptkomponente des Serums bei höheren Lebewesen. Es spielt bei der Aufrochterhaltung des osmotischen Gleichgewichts eine Rolle und ist beteiligt an der Bindung und dem Transport von schwer löslichen Stoffwechselprodukten aus einem Gewebe in ein anderes, besonders am Transport von freien Fettsäuren. Menschliches Serumalbumin wird in der Therapie für die Behandlung von Hypovolämie, Schock und Hypoalbuminämie eingesetzt. Verwendot wird es auch als Zusatz in der Perfusionsflüssigkeit für dia extrakorporeale Zirkulation. Außerdem wird menschliches Serumalbumin häufig als experimentelles Gen verwendet.

Menschliches Serumalbumin setzt sich zusammen aus einer einzigen langen Polypeptidkette, die annähernd 600 Aminosäurereste aufweist. Die Aminösäurefolge ist veröffentlicht. (Siehe z. B. Lawn, R. M. u. a., Nucelic Acids Research, Bd.9, Nr. 22 [1981 ], S. 6103-6113.) Kommerzielles menschliches Serumalbumin wird aus menschlichem Plasma hergestellt. Die Verfügbarkeit menschlichen Plasmas ist begrenzt.

Es muß eine sorgfältige Wärmebehandlung des aus menschlichem Plasma hergestellten Produktes durchgeführt werden, um eine potentielle Kontamination des Produktes durch den Virus Hepatitis B und den HIV-Virus zu vermeiden.

Da es eine der Besonderheiten des HIV-Virus ist, seine antigene Struktur häufig zu ändern, gibt es keine Garantien, daß er nicht wärmeresistente Varianten entwickeln wird.

Die Notwendigkeit eines künstlichen, authentischen menschlichen Serumalbumins, das in unbegrenzten Mengen hergestellt werden kann, ist offensicht'ich.

Es wurden verschiedene Versuche unternommen, unter Anwendung von Rekombinat-DNA-Methoden Produkte herzustellen.

welche dem reifen, menschlichen Serumalbumin entsprechend, und u. a. in den folgenden Patentanmeldungen veröffentlicht.

EP-A-O 073646 (Genentechn Inc), EP-A-O 079739 (The Upjohn Co.), EP-A-O 091 527 (President and Fellows of Harvard College) und EP-A-O 198745 (Genetica).

Alle oben genannten Patentanmeldungen sind von der Isolierung der mRNA aus der menschlichen Leber ausgegangen, und diese mRNA wurde zur Herstellung doppelsträngiger cDNA (oder deren Fragmente) genutzt. Anschließend wird die Kodonnutzung in den cDNA ihrer Natur nach für die menschliche Expression optimiert.

Es wird in Fachkreisen allgemein davon ausgegangen, daß die menschliche Kodonnutzung für die nie ht-menschliche Expression nicht ideal ist.

Vor der vorliegenden Erfindung wurden keine so langen DMA-Folgen erzeugt, wie sie für authentisches menschliches Serumalbumiri (strukturellen Gen = 1761 bp) erforderlich sind, in denen die Kodone für nicht-menschliche Expression optimiert

In EP-A-O 182 383 (Vepex Contractor Ltd. und MTA Szegedi Biologiai Központja) wird ein Verfahren für die Produktion von Oligo- und Polydeoxyribonukleotiden durch Synthetisierung des komplementären Strangs eines einsträngigen DNA-Stückes auf enzymatische Weise offengelegt. Diese Methode wurde teilweise im Verfahren für die Herstellung einer strukturellen Genkodierung für authentisches menschliches Serumalbumin (HSA) nach der vorliegenden Erfindung angewendet, sie wurde aber kombiniert mit einer neuen Technik zur Verbindung einiger großer Fragmente des Gens.

Ziel der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung wird ein neues Verfahren .ur Herstellung eines künstlichen strukturellen Gens mit der Kodierung für authentisch-menschliches Serumalbumin bereitgestellt, das die im Stand der Technik erwähnten Nachteile herkömmlicher Verfahren nicht aufweist

Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung von authentischem menschlichem Serumalbumin zur Verfügung gestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Dor vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, authentisches menschliches Serumalbumin mit Hilfe eine; künstlichen strukturellen Gens herzustellen, das eine Nukleotidfolge hut, in welcher die Kodone für nichtmenschliche Expression optimiert sind.

Dazu war es zuerst notwendig, ein künstliches strukturelles Gen zu entwickeln und ein Verfahren zur Herstellung dieses Gens zu erfinden.

Um das künstliche strukturelle Gen zu entwickeln, entschied man sich dafür, Kodone zu wählen, die besonders geeignet sind für die Hefeexpression als einem brauchbaren Beispiel der nicht-menschlichen Expression.

Die Kodone wurden aus Hefekodonen für stark expressierte Hefeproteine ausgewählt (Bonnetzen, J. L. und Hall, B. D. (1982), J. Biol. Chem. 257,3026-3031, und Sharp, P. M., Tuchy, T. M.F. und Mosurski, K. R. [1986], Nucleis Acids Res. 14, 5125-5143). Zunächst wurden die Kodone ausgewählt, die am häufigsten durch Hefe genutzt werden, dort aber, wo es angezeigt war, wurde das zweite oder dritte Kodon verwendet.

Für die Wahl des zweiten oder dritten Kodons gab es folgende Gründe: a) das Erscheinen solcher Restriktionsstellen zu vermeiden, die während der Montage des Gens genutzt werden, b) eine eindeutige Teilungsstelle für ein spezifisches Enzym zu schaffen und c) innerhalb der Teile des Gens, die chemisch synthetisiert und geklont werden müssen, Palindrome mit einer Lunge von 8 Basenpaaren oder mehr auszuschalten; mögliche Innenschleifen oder sekundäre Strukturbildungen innerhalb der einzelnen synthetischen Oligonukleotide zu vermeiden.

Nach einem Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Strukturelle Genkodierung für authentisches menschliches Serumalbumin geschaffen. Dieses Gen ist gekennzeichnet durch die Nukleotidfolge, in welcher die Kodone unter Berücksichtigung eines nicht-menschlichen Wirts für die Expression des authentischen menschlichen Serumalbumins ausgewält wurden, wodurch die Auswahl der Kodone so vorgenommen wurde, daß im ersten Fall die Kodone ausgewählt wurden, die am häufigsten vom gewählten nicht-menschlichen Wirt genutzt werder., und im zweiten Fall die Kodone ausgewählt werden, die vom nichtmenschlichen, gewählten Wirt an zweiter oder dritter Stelle genutzt werden, um das Auftreten solcher Restriktionsstellen zu vermeiden, die während der Montage des Gens genutzt werden,

um eine eindeutige Spaltungsstelle für ein spezhifisches Gen zu schaffen und um Palindrone mit einer Länge von 8 Basenpaaren oder mehr in den Teilen des Gens auszuschalten, die chemisch synthetisiert und geklont werden müssen. In einer Variante dieses Gesichtspunktes der Erfindung wird eine strukturelle Genkodierung für authentisches menschliches Serumalbumin und ein zusätzliches Initialmethionin geschaffen. Bei dieser Variante des Gens beginnt die Nukleotidfolge mit einer Triplettkodierung für Methionin, und der Rest der Nukleotidfolge kodiert wie oben für menschliches Serumalbumin, enn dieses Gen exprassiert wird, wird entweder authentisches menschliches Serumalbumin oder dessen Methionylderivat, in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionssystem, erzeugt.

Nach einer anderen Variante dieses Gesichtspunktes der Erfindung wird eine strukturelle Genkodierung für authentisches menschliches Serumalbumin geschaffen, erweitert durch eine oberhalb angeordnete Nukleoti'Jrolge, in welcher die Kodone unter Berücksichtigung eines nicht-menschlichen Wirtes gewält wurden und welches für folgende Aminosäurefolge kodiert:

Met-Lys-Trp-Val-Thr-Phr-Ile-Ser- Leu- Leu -Phe- Leu -Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser- Arg- GIy- VaI- Phe-Lys -Arg

Ein „strukturelles Gen" ist eine DNA-Folge, welche durch die Templat- oder Botschaft-RNA für ein spezielles Peptid oder Protein kodiert und (einen) Stoppkodon(e) einschließt.

Ein „funktionelles Gen" schließt heben einem strukturallen Gen Flankierungsfolgen ein. Diese Flankierungsfolgen weisen regulatorische Bereiche, beispielsweise eine Promoter-Folge und eine Transkriptionterminatorfolge, auf. Die Flankierungsfolgtn sollten für die speziellen Vektoren und Wirte optimiert werden, die für die Expression (und die Erzeugung) des Peptide oder Proteins, das durch das strukturelle Gen kodiert wird, verwendet werden.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung hat die strukturelle Genkodierung für authentisches HSA eine Nukleotidfolge, in welcher die Kodone unter Berücksichtigung der Hefeexpression von authentischem HSA ausgewählt werden.

Ob· ohl in der vorliegenden Patentbeschreibung nur Kodone veranschaulicht werden, welche unter Berücksichtigung der Heieexpression von authentischem HSA ausgewählt werden. Obwonl in der vorliegenden Patentbeschreibung nur Kodone veranschaulicht werden, welche unter Berücksichtigung der Hefeexpression ausgewählt wurden, gestatten es die hier beschriebenen Erkenntnisse Fachleuten, eine strukturelle Genkodierung für authentisches HSA zu entwickeln und zu konstruieren, i.. welcher die Nukleotidfolge Kodone hat, die unter Berücksichtigung eines anderen nicht-menschlichen Wirts, beispielsweise eines bakteriellen Wirt; oder eines Pflanzenwirts, ausgewählt worden sind.

In der vorliegenden Patentbeschreibung und in den Patentansprüchen wurde der Begriff „authentisches menschliches Serumalbumin" verwendet, um ein künstlich hergestelltes Protein nicht-menschlichen Ursprungs mit einer Aminosäurefolge zu definieren, welche der Aminosäurefolge des natürlichen, reifen, menschlichen Serumalbumins entspricht.

Nach einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Rekombinant-DNA-Molekül geschaffen, das ein strukturelles Gen nach der Erfindung, eingefügt in einen Vektor, aufweist.

Damit weist das Rekombinat-DNA-Molekül einem Vektor auf, in welchen ein funktionelles Gen (einschließlich eines strukturellen Gens nach der Erfindung) eingefügt wurde, worin die Flankierungsfolgen für den Vektor und den zu verwendenden Wirt abgestimmt sind.

Häufig verwendete Vektoren sind Plasmide von Bakterien, insbesondere E. coli, und Bakteriophagen, z. B. dem Lambda-Phag.

Spezielle Beispiele für diesen Aspekt der Erfindung werden in dem Teil der Patentbeschreibung offengelegt, welcher die bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung beschreibt.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Wirt oeschaffen, der mit einem Rekombinat-DNA-Molekül nach der Erfindung transformiert ist.

-6- 282<V73

Obwohl dia Kodone der Nukleotidfolge im strukturellen Gen (bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Ξι findung) unter Bezugnahme auf einen Hefewirt ausgewählt werden, sind Hefestämme nicht die einzigen Wirte, mit denen gearbeitet werden kann. Das für die Hofeexpression entwickelte strukturelle Gen kann auch für die bakterielle oder Pflanzenexpresion geeigi.:' sein.So kann der Wirt eine Hefezelle, z. B. Sacchormyces cerevisiae, eine bakterielle Zelle, wie E. coli oder Bacillus subtilis, oder eine Zelle einer Pflanze, wie Bohnenpflanzen, Erbsenpflanzen oder Tabakpflanzen, sein.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird einem Verfahren zur Herstellung einer strukturellen Gonkodierung für authentisches menschliches Serumalbumin geschaffen. Dieses Verfahren besteht aus den folgenden Schritten;

a) Entwicklung der Nukleotidfolgekodierung für authentisches menschliches Serumalbumin durch Auswahl von Kodonen unter Berücksichtigung eines nicht-menschlichen Wirts, der für die Expression von authentischem menschlichen Serumalbumin gewählt wurde, wodurch die Auswahl der Kodone so getroffen wird, daß im ersten Fall Kodone ausgewählt werden, die am häufigsten von dem gewählten nicht-menschlichen Wirt genutzt werden, und im zweiten Fall Kodone ausgewählt werden, die an zweiter oder dritter Stelle von dem gewählten nicht-menscchüchen Wirt genutzt werden, um das Erscheinen solcher Restriktionsstellen zu vermeiden, die während der Montage des Gens genutzt werden, um eine eindeutige Teilungsstelle zwischen einem 5'-Fragment und dem Rest des gesamten Gens zu schaffen und um Palindrome mit einer Länge von 8 Basenpaaren oder mehr innerhalb von Oügonukleotiduntereinheiten von zu klonenden Fragmenten auszuschalten;

b) Teilung der entwickelten Nukleotidfolge in ein 5'-Fragment, das chemisch zu synthetisieren ist, und einige zu klonende Fragmente, so daß r ich die Verbindungspunkte zwischen diesen eigenen Fragmenten an geeignet lozierten G-C-Dinukleotidfolgen bbfinden;

c) Modifikation der konstruierten einigen Fragmente von b) durch Ergänzung von deren konstruierten Nukleotidfolgen mit einer zusätzlichen Nukleotidfolge GGTAC am r'-Terminus, ausgenommen das mit dem 5'-Fragment von b) zu vereinende Fragment, und weitere Teilung dieser einigen Fragmente in Untereinheiten mit einem 3'-Nukleotid G, wobei diese Untereinheiten wiederum einzeln mit einer zusätzlichen Nukleotidfolge GGCC ergänzt werden;

d) einzelne chemische Synthetisierung der modifizierten, ergänzten Untereinheiten von c) in einsträngiger Form in der bekannten Weise und chemische Synthetisierung des 5'-Fragmentes von b) in doppe.lsträngiger Form in der bekannten Weise; q) anschließendes Klonen der synthetisierten Untereinheiten von d), beginnend beim 5'-Terminus der modifizierten, ergänzten einigen Fragmente von c), in einige einzelne Rekombinantvektoren auf die bekannte Weise, mit Hilfe von Adaptern und der enzymatischen Auffüllreaktion, um geklonte, doppelsträngige Fragmente dos Gens zu bilden, die den modifizierten, ergänzten einigen Fragmenten von c) entsprechen;

f) Montage der geklönten, doppelsträngigen Fragmente von e) durch Teilung der einigen Rekombinantvektoren von e), parweise, mit dem Enzym Kpnl bzw. dem Enzym Apal -einem an der geschaffenen 5'-Terminal-Kpnl-Restriktionsstelle und dem anderen an der geschaffenen 3'-Terminal-Apal-Restriktionsstelle -, um haftonde Enden zu schaffen, durch ein einzelsträngiges, spezifisches Enzym in der bekannten Weise stumpf gemacht werden - wobei ein Endnukleotid C bzw. ein Endnukleotid G bleiben -, gefolgt von der Spaltung mit einem anderen Restriktionsenzym mit einer Spaltungsstelle, die in beiden Rekombinantvektoren des in Frage kommenden Paares eindeutig ist, um zum einen einen linearen Vektor zu bilden, der ein geklöntes Fragment des Gens enthält, und zum anderen ein abgespaltenes Fragment des, Csns, wobei diese beiden Fragmente in der bekannten Weise enzymatisch mit i'en stumpfen Enden verbunden werden -wobei ein Dinukleotid G-C, das in die Nukleotidfolge des Gens eingezogen wird, t η der Verbindungsstelle gebildet wird - um einen Rekombinantvektor zu erhalten, der schließlich alle der einigen konstruierten Fragmente von b) in doppelsträngiger Form einschließt, und

g) Ergänzung des in f) geschaffenen Rekombinantvektors mit dem chemisch synthetisierten 5'-Fragment von d), um die vollständige strukturelle Genkodierung für authentisches, menschliches Serumalbumin zu bilden.

Das konstruierte strukturelle Gen mit 1761 Nukleotiden zur Kodierung von authentischem, reifen menschlichen Serumalbumin mit 585 Arr.inosäureresten wurde nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel in fünf große Fragmente unterteilt. Das erste Fragment wurde doppeltsträngig in der bekannten Weise synthetisiert, und das zweite bis fünfte Fragment wurden nach der Methode hergestellt, die in EP-A-O 182383 offengelegt wurde, wonach ein einzelner Strang chemisch synthetisiert und der komplementäre Strang enzymatisch synthetisiert werden.

Unter dem Ausdruck „eindeutige Spaltungsstelle" versteht man, daß die Spaltungsstelle für ein spezielles Enzym charakteristisch ist und daß sie sonst an keiner anderen Stelle in den zu verbindenden Fragmenten auftritt.

Die Methode der Verbindung von zwei Fragmenten mit ausgewälten Endnukleotiden wurde später auch bei der Konstruktion von Zwischenplasmiden angewendet, die zum Küfeexpressionsvektor führten.

Die Einzelheiten der Methoden der Erfindung werden in Verbindung mit den bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung beschrieben.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von authentischem menschlichen Serumalbumin durch Vermehrung eines Wirts geschaffen, der mit einem Vektor transformiert wurde, welcher eine Rekombinant-DNA-Folge unter Expression enthält, ebenso wahlweise Sekretionsbedingungen, und Isolierung des expressierten und "ahlweise sekretierten Proteinproduktes. Die charakteristischen Merkmale dieses erfindungsgemäßen Verfahrens sind a) die Verwendung eines Wirts, der mit einem Vektor transformiert wurde, welcher ein strukturelles Gen nach der Erfindung enthält, und b) die Isolierung von authentischem menschlichen Serumalbumin oder wahlweise von dessen Methionylderivat.

Bei einem bevorzugten Ausführjngsbeispiel dieses Gesichtspunkts der Erfindung ist der verwendete Wirt Saccharomyces cerevisiae, transformiert mit einem Shuttle-Vektor (E. coli-Hefe), der eine strukturelle Genkodierung für authentisches menschliches Serumalbumin aufweist, wobei dieses Gen aus einer Nukleotidfolge zusammengesetzt ist, in welcher die Kodone unter Berücksichtigung des Hefewirts ausgewählt wurden.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird authentisches menschliches Serumalbumin geschaffen, das aus dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren rösu'*iert. Dieses authentische HSA kann anstelle natürlichen, reifen HSA für alle Anwendungen eingesetzt werden.

Nach einem zusätzlichen Gesichtspunkt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung geschaffen, die authentisches menschliches Serumalbumin nach der Erfindung in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger- und/oder Verdünnungsmittel enthält. Geeignete Träger- und/oder Verdünnungsmittel sind die für natürliches HSA

verwendeten, beispielsweise Salzlösung, und es wird beispielsweise auf die US Pharmacopoeia zur Vormitilung von Richtlinien verwiesen. Das gleiche gilt für herkömmliche Zusätze, wie Präservative, pH-Wert-Regler, Puffer usw., Jie wahlweise einbezogen werden können.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen: Die Zeichnungen beziehen sich auf Plasmidkonstruktionen und ein Fluorograph. In den Zeichnungen ist

Abb. 1: die physische Karte des Coliplasmids pGB 1;

Abb. 2: die Karte des Plasmids pGB 2, das ein HIS3-Hefegen enthält;

Abb.3: die Karte des Plasmids pGB3-229T (a) und die Konstruktion durch die Schritte 1 und 2 des Grundexpressionsvektors

pPT2 HK, (c) über eine Zwischenkonstruktion pGB3-229TK° (b); Abb.4: die Karte von pGB 2 (HIS3 m PHC 5, PHO3); Abb. 5: die Karte von Plasmid pUC 18/623Γ» (a), welches den Promotor des PHO5-Hefegens enthält, und die Modifikationen

(1,2 und 3), die zur Konstruktion von Plasmid pUC 18V623P (b) und pUC 18V622 PH (c) führen; Abb.6: die physische Karte des Plasmids pPT2 HK₁ des Grundexpressionsvektors; Abb.7: die Konstruktion des Hefe-Ε. coli-Shuttle-Vektorplasmid pBY200; Abb.8: die Konstruktion vonjwei Expressionsvektorplasmiden pYHSA221 und pBY2/HSA, weiche die vollständige „HSA-Expressionspatrone" von pPT2/HSA enthalten;

Abb.9: das Ablaufschema der Konstruktion von Hefevektoren zur Expression eines synthetischen HSA-Gens; Abb. 10: das Fluorograph von ³⁶S-methioninmarkierten Proteinen, die mit Pferde-Anit-HSA-Serum immunoausgefällt und in

SDS-PoOolyakrylamid-Gel aufgelöst wurden; Abb. 11: die Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, das eine künstliche PrePro-Leader-Kodierungsfolge und eine

künstliche Genkodierung für HSA enthält (Nr. 1); Abb. 12: die Darstellung der Produkte der CNBr-Spaltung von gereinigtem, natürlichen HSA (A und C) und von der hefeerzeugten HSA (B und D), aufgelöst durch SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese. Das Commassie-gefärbte Gel

wurde auch einer Laserabtastung unterzogen (unter Verwendung des LKB-Ultro-Scan); Abb.13: eineWestern-Blot-Darstellung von HSA, exprtessiert und sekretiert durch Hefe, „YEprepro-HSA" (Spuren B und C), verglichen mit Proteinen, die durch YHSA-221 expression worden sind (Spuren D und E). Spur A zeigt eine gereinigte HSA-Probe.

Schema 1 - Karte des künstlichen HSA-Gens

I Il III IV V

G C G C G C

Ϊ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 21

Römische Zahlen: Große HSA-Fragmente: HSAI, II, III, IV, V.

Arabische Zahlen: Synthetische Oligodeoxyribonukleotide

HSA1,2,3... 24, enthalten jeweils am 3'-Terminus eine zusätzliche GGCC-Folge. Diese zusätzliche Folge wird in der HSA-Folge nicht sichtbar. Oligonukleotide HSA 7, 13 und 19 enthalten auch eine zusätzliche GGTAC-Folge am 5'-Terminus, die nicht in der abschließenden HSA-Folge sichtbar wird.

Wenn ein Oligonukleotid (HSA 1) mit einem Adaptermolekül ligiert wird, wird es beispielsweise als HSA1 + A bezeichnet (siehe Schema 2).

Wenn HSA1 + A in den allgemein verwendeten E.coli-Vektor pUC19 (Yannisch-Perron, C, Vieira, J„ und Messing, J., Gene 33, 103-119 (1985]) geklont wird, wird das gewonnene Plasmid als pHSA 1 bezeichnet.

Wenn HSA 2 + A in das oben gewonnene pHSA 1 geklont wird, wird das resultierende Plasmid pHSA (1-2) bezeichnet.

Nachfolgende Klonungen führen zu pHSA (1-6), und dieses Plasmid enthält das große Fragment HSAII, geklont in pUC19, und kann als pHSA Il bezeichnet werden.

Ebenso werden die großen Fragmente HSA III, HSAIV und HSA V aus den Oligonukleotiden 7-12,13-18 bzw. 19-24 gewonnen, was die Plasmide pHSA III, pHSA IV und pHSA V ergibt.

Wenn die großen Fragmente HSA Il und USA III in den Vektor pUC19 eingebunden werden, kann das resultierende Plasmid als pHSA (1-12) oder einfach als pHSA (ll-lll) bezeichnet werden.

Ebenso können, wenn HSAIV und HSA V als große Fragmente im Vektor pUC19 verbunden werden, für das resultierende Plasmid die Bezeichnungen pHSA (13-24) bzw. einfach pHSA (IV-V) verwendet werden.

Wenn HSA (ll-lll) und HSA (IV-V) verbunden werden, ergeben sie pHSA (H-V), in welchen annähernd der gesamte Kodierungsbereich von HSA (von 13-585 die Aminosäuren des reifen HSA-ohne das N-Terminal Met) geklont wird.

Wenn pHSA (H-V) mit dem Fragment HSAI in pUC19 ergänzt wird, wird das resultierende Plasmid pHSA bezeichnet.

Das Fragment HSAI wurde als partieller Duplex in zwei Formen synthetisiert (Schema 4).

Demzufolge erhält man zwei Versionen von pHSA, d. h., pHSA Nr. 1 und pHSA Nr. 2 (Schema 5).

Aus pHSA Nr. 2 kann das Met-HSA-Kodierungsgen gewonnen werden (als Fragment mit stumpfem Ende und mit Sacl-Ende, Schema 6).

Aus pHSA Nr. 1 kann das reife HSA-Kodierungsgen gewonnen werden (als Fragment mit stumpfem Ende und mit Sacl-Ende, Schema 7).

Der Met-HSA- oder der reife HSA-Kodierungs-DNA-Bereich können in den E.coli-Vektor pPT2HK, geklont werden, welcher den PHOö-Hefepromoter- + Signalfolgekodierungsbereich und den His3-Hefetranskriptionsterminator enthält. (Um pPT2/HSA zu erhalten.) Die Promotersignalfolge-HSA-Gen-1 erminatorkassette wird zur HSA-Expression in einen selbstreplizierenden Hefevektor pBY200 einbezogen.

Schema 2 - Beispiel für die Llgation eines üllgonukleotids mit einem Adaptermolekül

ρ — GGGCG

• HSA 1 +

pG G

CCCGGG— — CTTM

Adapter

ρ . ; GGGCCC G

CCCGGG CTTAA

HSA 1+A

Das Oligonukleotid HSA1 und der Adapter des oberen Stranges werden 5'-phosphoryliert, während das mit dem Adapter des unteren Strangs nicht geschieht.

Schema 3- Während des HSA-Klonens verwendete Adapter

Apal EcoRI

CGGACGGCGACGGCGACGGCGAGGC

CCCGGGCCTGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGCTTAA Adaptei .

Apal EcoRI

CGAGTATGCGACAGCTGG

CCCGGGCTCATACGCTGTCGACCTTAA Adapter 2

Apal Sacl EcoRI

CTGGAGCTCACTCTG

CCGGGACCTCGAGTCAGACTTAA Adapter 3

Adapter 1 wurde dazu verwendet, das Klonon der meisten der HSA-Oligonukleotide zu erleichtern.

Adapter 2 wurde für die Oligonukleotide HSA 16,17 und 18 verwendet.

Adapter3 wurde dazu genutzt, den Adapter 1 unterhalb des HSA-Gens zu ersetzen, um eine Sacl-Stelle einzufügen, die zum Klonen des HSA-Gens in den E. coli-Vektor pPT2HK, notwendig ist, der den Hefepromoter-und den Terminatbrbereich enthält.

Schema 4- HSA I-Fragmente

Pstl Sau3AI

Asp Ala His Lys Ser GIu VaI Ala His Arg Phe Lys GACGCTCACAAGTCTGAAGTCGCTCACAGATTCAAG

Nr. i ACGTCTGCGAGTGTTCAGACTTCAGCGAGTGTCTAAGTTCCTAG

Pstl Sau3AI

Bell Met Asp Ala His Lys Ser GIu VaIAIa His Arg Phe Lys GTGATCATGGACGCTCACAAGTCTGA-AGTCGCTCACAGATTCAAg Nr. 2 ACGTCACTAGTACCTGCGAGTGTTCAGACTTCAGCGAGTGTCTAAGTTCCTAG

Scheme 5- Klonen der vollständigen HSA-Gen-Verslonon In pUC19

Hind IU 5ριι3ΛΙ

EcoRI

pUC19

Pstl-EcoFU EcofU

Apal Src I Ec on I

Pstl Snu3Al

I

HSAI Sau3AI

I—l·

1, Hind III-EcoRI,

isolate small fragment 2, Sau3Al

ΛρηΙ Sac I EcoRI

H 1 1

Π III IV HSA (H-V)

DNA licjase

Pstl SsulAI

Apal Sac I EcoRI

pHSA No 1: HSA 1 = HSAI No 1 pHSA No 2: USA I = HSAI No 2

Schema 6- Gewinnung d&s Met-HSA-Kodierungs-DNA-Stucks aus pHSA Nr.2 Pstl Bell

-C T G C A CiT G Λ T C ΑΊ" G G A C G C T- -GACGTCACTAGTACCTGCGA-

RcI I

GATCAfGGACGCT

TACCTGCA

1 , m U η g bean η υ c 1 c η r> c

2 , S a c I

blunt-end

Met Asp Ala ATGGACGCT-

TACCTCCGA-

Sacl

--GAGC I C

---C T CGACi

Sac I

-'C A G C T C"

-C TCGAG

-GAGC Γ

-C S a c I e r.c

Anmerkung: Um den Met-HSA-Kodierungsbereich zu erhalten, wurde eine einzigartige Restriktionsstelle in HSAI (dann in pHSA) eingeführt, d. h. die Bcll-Erkennungsfolge in HSA | (dann in pHSA, was zur pHSA Nr.2-Version führt).

Mungbeannuclease blunt end

- Mung-BohnRnnuklease

- Stumpfes Ende

-GACGTCTGCGA-

Schema 7-· Gewinnung der reifen HSA-Kodierungs-DNA von pHSA Nr. 1

P s t I Stcl -C T GC AG Λ CGC T CAuC rc

-CTCCAG-

Ps t I

GACGCT-ACGTCTGCGA-

Sac I

-gac: J c- -C TCGAG-

I₁ KIe ii ow polymer τ se » d N T P 2, 5ac I

blunt-end

Asp Ala GACGCT-

CTGCGA-

-GAGCT

-C Sa c I end

Blunt-and - Stumpfes Ende

Schema 3- Konstruierte DNA-Folge zum Kodieren für reifes H3A

1/1

ASP ALA HIS LYS SER GLU VAI. ALA HIS ARG PHE LYS ASP LEU GLY GLU ASN PHE

GAC GCT CAC AAG TCT GAA GTC GCT CAC AGA TTC AAG GAT CTA GGT GAA GAA AAC TTC

' >HSAl

20/58

LYS ALA LEU VAL LEU ILE ALA PHE ALA GLN TYR LEU GLN GLN CYS PRO PHE GLU ASP HIS

AAG GCT TTG GTT TTG ATT GCT TTC GCT CAA TAC TTG CAA CAA TGT CCA TTC GAA GAC CAC.

L) HSA2

40/118

VAL LYS LEU VAL ASN GLU VAL THR GLU PHE ALA LYS THR CYS VAL ALA ASP GLU SER ALA

GTC AAG TTG GTC AAC GAA GTT ACT GAA TTT GCT AAG ACC TGT GTT GCT GAC GAA TCT GCT

60/178

GLU ASN CYS ASP LYS SER LEU HIS THR LEU PHE GLY ASP LYS LEU CYS THR VAL ALA THR GAA AAC TGT GAC AAG TCC TTG CAC ACT TTG TTC GGT GAC AAG TTG TGT ACT GTT GCT ACT

80/238

LEU ARG GLU THR TYR GLY GLU MET ALA ASP CYS CYS ALA LYS GLN GLU PRO GLU ARG ASN TTG AGA GAA ACT TAC GGT GAA ATG GCT GAC TGT TGT GCT AAA CAG GAA CCA GAA AGA AAC

¹ > H SA4

100/298

GLU CYS PHE LEU GLN HIS LVS AfP ASP ASN PRO ASN LEU PRO ARG LEU VAi. ARG PRO GLU GAA TGT TTC TTA CAA CAC AAG GAC GAC AAC CCA AAC TTG CCA AGA TTG GTT AGA CCA GAA

> HSA5

'U t- .-ortgesetzt

VAL ASP VAL MET CYS THR ALA PHE HIS ASP ASN GLU GLU THR PHE LEU LYS LYS TYR LEU GTC GAC GTT ATG TGT ACT GCT TTC CAC GAC AAC GAA GAG ACT TTC TTG AAG AAG TAC TTG

?HSA6 140/418

TYR GLU ILE ALA ARG ARG HIS PRO TYR PHE TYR ALA PRO GLU LEU LEU PHE PHE ALA LYS TAC GAA ATC GCC AGA AGA CAC CCA TAC TTC TAC GCT CCA GAA TTG TTG TTC TTC GCT AAG

/.RG TYR LYS ALA ALA PHE THR GLU CYS CYS GLN ALA ALA ASP LYS ALA ALA CYS LEU LEU

AGA TAC .AAG GCT GCT TTC ACT GAA TGT TGT CAA GCT GCC GAC AAG GCT GCT TGT TTG TTG

PRO LYS LEU ASP GLU LEU ARG ASP GLU GLY LYS ALA SER SER ALA LYS GLN ARG LEU LYS

AAG TTG GAC GAA TTG AGA GAC GAA GGT AAG GCT TCT TCC GCT AAG CAA AGA TTG AAG

CYS ALA SER LEU GLN LYS PHE GLY GLU ARG ALA PHE LYS ALA TRP ALA VAL ALA ARG LEU TGT GCT TCC TTG CAA AAG TTC GGT GAA AGA GCC TTC AAG GCC TGG GCT GTT GCT AGA TTG

HSA9 220/658

SER GLN ARG PHE FRO LYS ALA GLU PHE ALA GLU VAL SER LYS LEU VAL THR ASP LEU THR

TCT CAA AGA TTC CCA AAG GCT GAA TTT GCT GAA G(T ICT AAG TTG GTT ACT GAC TTG ACT

' ?IISA1O

LYS VAL HIS THR GLU CYS CYS HIS GLY ASP LEU LEU GLU CYS ALA ASP ASP ARG ALA ASP

AA3 GTT CAC ACT GAA TGT TGT CAC GGT GAC TTG TTG GAA TGT GCT GAC GAC AGA GCI GAC

^HSAlI

LEU ALA LYS TYR ILE CYS GLU ASN GLN ASP SER ILE SRR SER LYS LEU LYS GLU CYS CYS TTG GCT AAG TAT ATC TGT GAA AAC CAA GAC TCT ATC TCT TCT AAG TTG AAG GAA TGT TGT

SA12

GLU LYS PRO LEU LEU GLU LYS SER HIS CYS ILE ALA GLU VAL GLU ASN ASP GLU MET PRO GAA AAG CCA TTG TTG GAA AAG TCT CAC TGT ATC GCT GAA GTT GAA AAC GAC GAA ATG CCA

U,

•HSA13

ALA ASP LEU PRO SER LEU ALA ALA ASP PHE VAL GLU SER LYS ASP VAL CYS LYS AS VJ .VR

GCT GAC TTG CCA TCT TTG GCT GCT G-C TTC GTT GAA TCT .AAG GAC GTT TGT AAG AAC TAC

ALA GLU ALA LYS ASP VAL PHE LEU GLY MET PHE LEU TYR GLU TYR ALA ARG ARG HIS PRO

GCT GAA GCT AAG GAC GTT TTC TTG GGT ATG TTC TTG TAC GAA TAC GCT AGA AGA CAC CCA

' HISAl 4

ASP TYR SER VAL VAL LEU LEU LEU ARG LEU ALA LYS THR TYR GLU THR THR LEU GLU LYS

GAC TAC TCC GTT GTT TTG TTG TTG AGA TTG GCT AAG ACT TAC GAA ACT ACT TTG GAA AAG

^HSAlS 360/1078

CYS CYS ALA ALA ALA ASP PRO HIS GLU CYS TYR ALA LYS VAL PHE ASP GLU PHE LYS PRO TGT TGT GCT GCT GCT GAC CCA CAC GAA TGT TAC GCT AAG GTT TTC GAC GAA TTT AAG CCA

I ^HSAl 6

LEU VAL GLU GLU PRO GLN ASN LEU ILE LYS GLN ASN CYS GLU LEU PHE LYS GLN LEU GLY TTG GTT GAA GAA CCA CAA AAC TTG ATT AAG CAA AAC TGT GAA TTG TTC AAG CAA TTG GGT

HSA17

Schema 8, fortgesetzt

GLU TYR LYS PHE GLN ASN ALA LEU LEU VAL ARG TYR THR LYS LYS VAL PRO GLN VAL SER GAA TAC AÄG TTC CAA AAC GCT TTG TTG GTT AGA TAC ACT AAG AAG GTT CCA CAA GTC TCC

THR PRO THR LEU VAL GLU VAL SER ARG ASN LEU GLY LYS VAL GLY SER LYS CYS CYS LYS ACT CCA ACT TTG GTT GAA GTC TCT AGA AAC TTG GGT AAG GTT GGT TCT AAG TGT TGT AAG

I WSAl 8

HIS PRO GLU ALA LYS ARG MET PRO CYS ALA GLU ASP TYR LEU SER VAL VAL LEU ASN GLN CAC CCA GAA GCT AAG AGA ATG CCA TGT GCT GAA GAC TAC TTG TCT GTT GTT TTG AAC CM

LEU CYS VAL LEU HIS GLU LYS THR PRO VAL SER ASP ARG VAL THR LYS CYS CYS THR GLU TTA TGT GTT TTG CAC GAA AAG ACT CCA GTT TCT GAC AGA GTT ACT AAG TGT TGT ACT GAA

>HSA20

SER LEU VAL ASN ARG ARG PRO CYS PHE SER ALA LEU GLU VAL ASP GLU THR TYR VAL PRO VCT TTG GTT AAC AGA AGA CCA TGT TTC TCT GCC TTG GAA GTT GAC GM ACT TAC GTC CCA

HSA21 500/1498

LYS GLU PHE ASN ALA GLU THR PHE THR PHE HIS ALA ASP ILE CYS THR LEU SER GLU LYS MG GM TTT MC GCT GM ACT TTC ACT TTC CAC GCC GAC ATC TGT ACC TTG TCC GM MG

HSA22

GLU ARG GLN ILE LYS LYS GLN THR ALA LEU VAL GLU LEU VAL LYS HIS LYS PRO LYS ALA GM AGA CAA ATC AAG AAG CAA ACT GCT TTG GTT GAA TTG GTT MG CAC AAG CCA AAG GCT

' >HSA2:

THR LYS GLU GLN LEU LYS ALA VAL MET ASP ASP PHE ALA ALA PHE VAL GLU LYS CYS CYS ACT AAG GAA CAA TTG AAG GCT GTT ATG GAC GAC TTC GCT GCT TTC GTT GAA AAG TGT TGT

LYS ALA ASP ASP LYS GLU THR CYS PHE ALA GLU GLU GLY LYS LYS LEU VAL ALA ALA SER AAG GCT GAC GAC AAG GAA ACT TGT TTC GCT GAA GAA GGT AAG AAG TTG GTT GCT GCT TCT

¹ /I1SA24

GLN ALA ALA LEU GLY LEU

CAA GCT GCT TTG GGT TTC TAA TAG

A.imerkung: Di9 Positionen der ein3trängigen, c' - misch synthetisierten Oligodeoxyribonukleotide - als Ausgangsmaterial für die gesamte Eir.heit-werden in dieser Folge mi I feilen gekennzeichnet (ζ. Β. HSA I₁ HSA 2...).

Zu beachten ist auch, daS alle HSA-Oligonukleotide mit einer zusätzliche λ GGCC-S'-Terminalfolge und außerdem mit einer zusätzlichen GGTAC 5'-Terminalfolge im Falle der Oligonukleotido HSA7, HSA 13 und HSA 19 hergestellt wurden.

Schema 9 - Chemisch synthetisierte HSA-Oligonukleotic' ·, welche die großen Fragmente HSA II, HSA III, HSAIV und HSA V enthalten

HSA- Länge Position Anzahl der Fragmente: 24 Oligo- in rei-

nukleo- ferHSA-

tid- Kodie-

zahl rungsfolge

HSA 1 76 41-112 TAGGTGAAGAAAACTTCAAGGCTTTGGTTTTGATTGCTTTCGCTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGGGCC

TTtTtTt

HSA 2 77 113-:85 ACCACGTCAAGTTGGTCAACGAAGTTACTCAATTTGCTAAGACCTGTGTTGCTGACGAATCTGCTGAAAACTGGGCC

T T T. T T T t

HSA 3 75 186-256 TGACAAGTCCTTGCACACTTTGTTCGCTGACAÄGTTGTGTACTGTTGCTACTTTGAGAGAAACTTACGGTGGGCC

T-T T T t T t

HSA 4 70 257-322 AAATGGCTGACTGTTGTGCTAAACAGGAACCACAAAGAÄACCAATCTTTCTTACAACACAAGGACGGGCC

t τ t τ τ t τ

HSA 5 76 323- 394 ACAACCCAAACTTGCCAACATTCGTTAGACCAGAAGTCGACCTTATGTGTACTGCTTTCCACGACAACGAAGGGCC

TTT

HSA 6 β2 395-472 AGACTTTCTTCAAGAAGT AC T1C ΓACüAAATCGCCAGAAGACnCCCAT ACT TCTACGCTCCAGAATTGTTGTTCTTCGGGCC

Tt T T T T

IS) OO

Schema 9, fortgesetzt

HSA- Länge Position Oligo- in reifer

nukleo- HSA-Kodie-

tid- rungs-

folge folge

HSA 7 74 Δ73-537

ggtacctaagagatacaagcctgctttcactgaatgttgtcaagctgccgacaaggctgcttgtttgttgggcc

HSA 8 76 538-609

CCAAAG TTGGACGAATTGAGAGACGAAGGT AAGGCT TC TTCCGC TAAGC AAAGATTGAAGTGTGCTTCCTTGGGCC

T T- T t f T T

HSA 9 74 610-679

C AAAAGTTCGCTGΑΛACAGCCTTCAAGGCCTGGGCTGTTGCTAGATTGTCTCAAAGATTCCCAAiGGCTGGGCC

Tt

HSA 10 75 680-750

AATTTGCTGAAGTTTCTAAGTTGCTTACTGACTTGACTAAGGTTCACACTGAATGTTGTCACGG^-GACTTGGGCc

τ τ τ t τ τ ^λ

HSA 11 76 751-822

TTGGAATGTGCTGACGACAGÄCCTGACTTGGCTAAGTATATCTGTGAAAACCAAGACTCTÄTCTCTTCTAAGGGCC

TTTTT

HSA 12 76 823-394

TTGAAGGAATGTTGTGAAAiGCCATTGTTGGAAAAC "CTCACTGTATCGCTGAAGTTGAAAACGACGAAATGGGCC

T T TTTTT

HSA 13 79 395-S

GGTACCCAGCTGACTTGCCATCTTTGGCTGCTGACTTCGTTGAiTCTiAGGACGTTTGTAAGAACTACGCTGAAGGGCC

TTTfTTt

TT

Tt

M OO N

HSA 1Δ 81 965-1041 CTAAQGACGTTTTCTTGGGTATGTTCTTGTACGAATACGCTAGÜOACACCCAGACTACTCCGTTGTTTTGTTGTTGGGCC ^M

TTT^ ^A

Schema 9, fortgesetzt

HSA- Länge Position Oligo- in reifer

Nukleo- HSA-Ko-

tid- dierungs-

folge folge

HSA 15 79 1042-1116

AGATTCGCTAAGACTTACG-iACTACTTTGGAAAAGTGTTGTGCT-C

t t T t

TGCTGPCCCACACGAATGTTACGCTAAGGGCC

t ΐ t

is 76 1117-nee

GTTTTCCACGAATT7AAGCCA7TGGTTCAAGAACCACAAAACTTC^TTAAGCiAAACTGTGAATTGTTCAAGGGCC

τ t. ttttt

HSA 17 85 1189-1269

CAATTGGGTGAATACAACTTCCAAAACCCTTTGTTGCTTAGAT ACACTAAGAAGCTTCCACAAGTCTCCACTCCAACTTT

T T¹T T T t T T

CCGCC

73 1270-1338 GTTGAAGTCTCTACAAACTTGGGTAAGGTTGGT TC TAAGTGTTGTAAGCACCCAGAAGCTAAGAGAATGGGCC

ί τ τ τ τ τ τ

HSA 19 69 1339-1398

ggtacccatgtgctgaagactacttgtctgttgttttgaaccaattatgtgttttgcacgaaaagggcc

τ τ τ ΐ τ t

HSA 20 74 1399-1468

ACTCCAGTTTCTGACAGAGTTACTAAGTGTTGTÄCTGAATCTTTGGTTAACAGAAGÄCCATGTTTCTCTGGGCC

T T t T ί T ΐ

"SA 21 77 1465-1541 CCTTGGAAGTTGACGAASCTTACGTCCCAAAGGAAT TTAACGCTGAAACTTTCACTTTCCACGCCGACATCTGGGCC

τ t t τ τ t τ

HSA 22 77 1542-1614

TACCTTCTCCGΛAAAGGAA^CACAAATlAAGAAGCAAACTGCTTTGGTTGAATTGGTTAAGCACAAGCCAAAGGGCC

τ τ τ τ τ t t

Schema 9, fortgesetzt

HSA- Länge Fosition Oligo- in reifer

nukleo- HSA-Ko-

tid- dierungs-

folge folge

23 77 16^-1687 CC 1 AC 1 ΑΛΓ,ΰΛ ACAAI T ι,ηΛΓ,^Γ TGT T AT GGZ^--Cr₁ACT 1 CGC 1 GC Γ Τ 7 CCT TCAAAAGTCT TGT AAGCCT GACGGCCC

T t T T ΐ T

HSA 2A 78 1688-1761 ACAAGGAAACTTGTTTCGCTGAAGAAGCTAAGAAGTTGGTTGCTGCTTCTCAAGCTGCTTTGGGTTTGTAATAG

TTtTTrI

Chemisch synthetisierte HSA-Oligonukleotide. Längen werden zusammen mit der zusätzlichen 3'-Terminal-GGCC- und mit der zusätzlichen 5'-Terminal-GGTAC-Folge (für HSA 7,13 und 19) gegeben.

Zum Aufreihen von Teilen des HSA-Gens verwendete synthetische Prim ere

Wenn HSA-Oligonukleotide in den Vektor pUC 19 geklont wurden (oder ein anderes HSA-Nukleotid in einen vorher gewonnenen pHSA-Vektor geklont wurde), wurde ein Folgebildungsprimer GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGT, das vorher synthetisiert und als pKO-Primer I bezeichnet wurde (Simoncsits, A., Kalman, M., Cserpan, I. und Kari, C, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. No 14,1984, 321-322), dazu verwendet, die Folge der gewonnenen Klone zu überprüfen. Dieses Primer befindet sich zwischen den Nukleotidpositionen 348-369 der veröffentlichten pUC 19-Folge (Yanisch-Perron, C, Vieira, J. und Messing, J., Gene, 33 [' '85), 103-119) und wird dazu genutzt, alle einzeln geklonten HSA-Oligonukleotide (alle 24) aufzureihen.

Wenn die großen Fragmente HSAII und HSA III verbunden wurden, wurde der Verbindungspunkt durch ein synthetisches Prii er GCAGCCTTGTCGGCAGCTTG überprüft, das komplementär zur HSA-Genfolge zwischen den Nukleotidpositionen 508 und 527 (für reifes HSA) isst.

Die Verbindungsstelle von HSAIV und HSAV wurde unter Verwendung eines Primers CTTGCAAAACACATAATTGG überprüft, das zur HSA-Genfolge zwischen den Positionen 1374 und 1393 komplementär ist. Die Verbindungsstelle der großen Fragmente HSAIII und HSAIV in pHSA (H-V) wurde unter Verwendung des eigentlichen HSA 10-Oligonukleotids als Folgebildungsprimer überprüft.

Wenn die HSA-Gensynthese im Vektor pUC 19 abgeschlossen ist, erfolgt die Aufreihung des gesamten HSA-Kodierungsbereichs unter Verwendung von Plasmidtemplat und 10 verschiedenen Folgebildungsprimeren. Eine weitere Bestätigung der HSA-Kodierungsfolge wurde gewonnen, wenn diese aus dem pUC-19-Vektor in den Vektor M13 m 19 (Yanisch-Perron, C. usw.) eingesetzt und die Folgebildung an einsträngigen Phag-DNA-Templat unter Verwendung der gleichen 10 Primpere durchgeführt wurde.

Synthetische Prlmere zur Überprüfung des vollständigen HSA-Kodierungsbereichs in pUC19 oder in M 13m 19 Name des Primers Nukleotidposition im HSA-

Kodierungsbereich pKO-Primer I außerhalb von HSA, im lacZ-Teil

vonpUC19

pHSA-PrimeM 1587-1603

pHSA-Primer2 1398-1414

pHSA-Primer3 1195-1211

pHSA-Primer4 988-1007

pHSA-Primer5 795-809

pHSA-Primer6 582-597

pHSA-Primer7 382-398

pHSA-Primer8 178-192

pHSA-Primer9 66-85

Das letzte Primer (Primer 9) wurde auch dazu genutzt, die Verbindungsstelle von HSA (reife oder Met-Form) und Hefe-PH05-Promoter-Signalfolge zu überprüfen, wenn dasHSA-Gen auspUC19 in pPT2HK, eingesetzt wurde.

Materialien und Methoden	Boehringer
Enzyme Quelle	New England Biolabs (NEB)
Apal	Boehringer
EcoRI
Klenow-Polymerase	NEB
Enzyme Quelle	NEB
T4-DNA-Ligase	NEB
Kpnl	Boehringer
Sacl	NEB
BamHI	Pharmacia
Xbal	NEB
Mung-Bohnennuklease	NEB
Hind III	NEB
Sau 3Al	NEB
Ball	Boehringer
Pstl	Boheringer
Xhol	Calciochem
T4-Polynukleotidkinase	Merck
T1-RNase	NEB
ProteinaseK	NEB
Bell	REACTIFSIBF
Sail	Boehringer
Helicase
Glukuronidase

Isotope

Y-³²P-ATP (<5000Ci/mMol)

a-³²P-dATP (800CiVmMoI)

a-³⁵S-dATP (~ 1 200Ci/mMol) von Amersham

³⁵S-Methionin(~800Ci/mMol) von Amcrsham

Chemische Synthese von Oügodioxyribonukleotiden

Es wurde entweder die Phosphattriestermethode mit Hilfe eines manuellen DNA-Bank-Synthesizers (Omnifit) unter Verwendung von Monomer- oder/und Dimerbausteinen (Spraat, B. S. u. a., 1983, Tetrahedron Letters 24,5771) oder die Phosphoramidit-Methode unter Verwendung eines automatischen Gen-Assemblers (Pharmacia) nach den Anweisungen der Hersteller angewendet. Chemikalien wurden entweder von Cruachem (Phosphattriester-Chemie) oder von Pharmacia (Phosphoramidit-Chemie) bezogen.

5'-Phosphorylation der synthetischen Oligodeoxyribonukleotide

Die enzymatische Phosphorylation wurde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und ATP durchgeführt. In Abhängigkeit von den speziellen Erfordernissen, wurde diese Reaktion entweder mit radioaktivem oder nichtradioaktiven ATP ausgefühlt.

a) Phosphorylation mit V-³²P-ATP von hoher spezifischer Aktivität

Dieses Verfahren wurde für HSA-Oligonukleotide angewendet, um Hybridisierungssonden zu erhalten, oder für die 5'-Markierung von Folgebildungsprimeren, wenn die Folgebildungsreaktionen auf Plasmid-DNA-Templat ausgeführt wurden. Es wurden 1OpMoI Oligonukleotid in γ-³²Ρ-ΑΤΡ (7μΙ, -5000 Ci je mMol, lOmCi/ml), 25OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM MgCI₂ (2μΙ) und 10OmM DTT (1 μΙ) aufgelöst. Dazu wurden 0,5μΙ T4-Poiynukleotidkinase (10 Einheiten/μΙ) gegeben, und das Gemisch wurde 30min bei 37°C gehalten, gefolgt von einer Wärmebehandlung (100°C, 3min), um das Enzym zu inaktivieren. Die Lösung wurde, der weiteren Verwendung entsprechend, entweder mit Hybridisationspuffer oder mit sterilem Wasser verdünnt. Der Überschuß an nichtreagiertem Y-³²P-ATP wurde nicht entfernt.

b) Phosphorylierung mit Y-³²P-ATP mit niedriger spezifischer Aktivität

Dieses Verfahren wurde zur Kennzeichnung der HSA-Oligonukleotide vor deren Ligation mit den Adaptern angewendet. In 10μΙ Reaktionsvolumen, das 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ in 1OmM DTT enthielt, wurden 5OpMoI Oligonukleotid und 100 pMol Y-³²P-ATP (200 Ci/mMol) aufgelöst, und es wurde 1 μΙ T4-Polynukleotidkinase (10 Einheiten μΙ) zugesetzt. Nachdem man das Gemisch eine Stunde bei 37⁰C stehengelassen hatte, wurde es bei 100⁰C 3min lang einer Wärmebehandlung unterzogen.

c) Phosphorylation mit nichtradioaktivem ATP

Dieses Verfahren wurde beim oberen Strang von Adapter 1 und Adapter 2 sowie bei beiden Strängen von anderen, adapterähnlichen Molekülen, wie Adapter 3 und Oligonukleotiden von Fragment HSAI, angewendet.

Die Phosphorylation des oberen Stranges von Adapter 1 und Adapter 2 wurde an den Oligonukleotiden im großen Maßstab folgendermaßen ausgeführt.

Es wurden 2,2nMol Oligonukleotid und 2OnMoI ATP in 100 μΙ Reaktionsvolumen auflös;, das 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT und 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase enthielt. Die Reaktion wurde eine Stunde lang bei 37°C ausgeführt, gefolgt von einer Wärmebehandlung bei 100°C für die Dauer von 3 min.

Andere nichtradioaktive Phosphorylationen wurden im wesentlichen so ausgeführt, wie das für die Phosphorylation mit niedriger spezifischer Aktivität beschreiben wurde, im Maßstab von 5OpMoI, dem Reaktionsgemisch wurde jedoch kein radioaktiv markiertes Y-³²P-ATP zugesetzt.

Ligation von HSA-Oligonukleotiden mit dem Adapter (allgemeines Verfahren) Es wurden 25 pMol von 5'-³²P-phosphoryliertem HSA-Oligonukleotid mit 75 pMol 5'-phosphoryliertem oberen Strangadapternukleotid und mit75pMol nichtphosphoryliertem unteren Strangadapternukleotid in 50μΙ Reaktionsvolumen gemischt, das 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 1 mM ATP enthielt. Das Gemisch kühlte sich auf 15°C ab, und es wurden etwa 0,2 μΙ (etwa 80 Einheiten) T4-DNA-Ligase zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 15⁰C für die Dauer von 4 bis 16 Stunden ausgeführt. Es wurden 50μΙ von 1 M NaCI und 1μΙ Hefeträger-tRNA (10μρ/μΙ) zugesetzt, und dieOligonukleotide wurden mit 300 μΙ Ethanol in einem flüssigen Stickstoffbad für die Dauer von 2 min ausgefällt. Das Gemisch wurde 5 min lang mit 12000U/min zentrifugiert, das Pellet wurde getrocknet und in 10μΙ Gel-Füllpuffer aufgelöst, der 80% Formamid, 1OmM EDTA, 0,05% Xylenzyanol und 0,05% Bromophenol Blau enthielt. Die Trennung des ligierten HSA-Oligonukleotids vom nichtligierten (und vom Adapter) erf jlgte durch Aufbringung der obigen Lösung auf ein 10%iges Akrylamidgel, das keinen Harnstoff enthielt. Bei 400V wurde eine Gel-Elektrophorese für die Dauer von 3 bis 5 Stunden unter Verwendung von 10OmM TBE als Gel und Durchlaufpuffer (10OmM Tris, 10OmM Borsäure, 2mM EDTA, pH-Wert 3,3) durchgeführt. Nach der Radioautografie des Gels (2 bis 10min) wurden zwei größere radioaktive Bänder loziert, von denen das untere Band dem nichtligierten HSA-Oligonukleotid entsprach, während das obere Band dem adapterligierten HSA-Oligonukleotid entsprach. Das diesem letzteren entsprechende Gel-Stück wurde herausgeschnitten und in 50OmM NaCI (300μΙ) bei 37°C 10-16 Stunden lang getränkt. Die obenaufschwimmende Schicht wurde zweimal mit Phenol (gesättigt mit 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,0 300 μΙ) behandelt, und das Oligonukleotid-Adapter-Addukt wurde nach dem Zusatz von 30μΙ 3 M NaOAc, pH-Wert 5,2,1 μΙ Hefeträger-tRNA(10μg/μl)und 750μΙ Ethanol ausgefällt.

Das Pellet wurde mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in ΊΟμΙ sterilem Wasser aufgelöst, und es wird ein Aliquot in einem Pückard-Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt, um den Ertrag der Ligationsreaktion zu bestimmen. Der Ertrag lag, ausgehend vom ³²P-Phosphat-HSA-Oligonukleotid-Ausgangsmaterial, zwischen 20 und 50% (isolierte Ausbeute). 21 der 24 HSA-Oligonukleotide wurden mit Adapter 1 ligiert. Die Ausnahmen sind dieOligonukleotide HSA16,17 und 18, die mit Adapter i'ligiert wurden. (Für HSA16 war dieser neue Adapter offensichtlich notwendig, für HSA17 und 18 war es aber vielleicht keine besssre Wahl. Auf jeden Fall wurden diese drei Oligonukleotide gleichzeitig mit Adapter 2 ligiert.)

Bakterienstämme

Die meisten der HSA-haltigen Plasmidtransformationen und Vermehrungen wurden unter Verwendung von E.coli JM101 ausgeführt (Messing, J., Crea, R. und Seeburg, P. H., Nucleic Acids Res. 9, [1981], 304-321). Dieser Stamm hat folgenden Genotypus: SupE, thi, A(lac-proAB), F'. traD36, proAB, lacl^qZAM15.

Ein danr-E.coli-Stamm (GM 2) (Morinus, M. G. und Morris, N. R. [1973], J. Bact. 114,1143-1150) wurde für die Plasmidvermehrung verwendet, bevor die Bcll-Enzymmanipulation erforderlich war.

Während der Konstruktionen von pBY2/HSA Nr. 1 und pBY2/HSA Nr.2 wurde ein E.coli-Stamm (K 12), JF 1754-Stamm (hsd R hsdM* Iac gal met leu 13 his B) als Wirt verwendet; Referenzen: Stroms, R. K., McNeil, J. B., Khanendekar, P. S., An, G., P?rker, J.

und Friesen, J. D. (1979), J. Bacteriol. 140,73-82; Kiss, G. E., Amin, A.A. und Perlam, R. E. (19811, Molecular and Cellular Biology,

Die Mutationen leu B und hisBvon JF7754 können mit den entsprechenden Hefegenen (Ieu2 bis his3) komplementiert werden; Referenz: Struhl, K. und Davis, R.W. (1980), J. Mol. Biol. 136,309-332.

Hefestamm

AH 220 [a, trp 1, leu 2-3, 2-112, his3-11,3-15, pho5, pho3J, ein Labor-Haploid-Stamm, wurde von A. Hinnen, CIBA-CEiGY AG, Biotechnology Department, Basel, Schweiz, bezogen.

E.coli-Transformation mit Plasmid- und Phag vektoren

Sie wurde im wesentlichen so ausgeführt, wie sie von Hanahan, D. (in DNA-C'.oning - DNA-Klonung -, Bd. I, herausgegeben von Glover, D. M., IRC Press Limited, 1985, S. 109-135) beschrieben wurde, wobei gefrorene kompetente Zellen verwendet wurden, die nach Protokoll 3 dieses Beitrags hergestellt worden waren.

Hefetransformation

Hefesphäroplaste, die nach der Methode von Hinnen u. a. (Hinnen, A., Hicks, J. B. und Fink, G. R. (1978), Proc. Natl. Acad. Sei.: USA, 75,1929-1933) transformiert werden, wurden durch Helikasebehandlung von AH220 hergestellt.

Plasmldherstellung

Es wurde eine leicht modifizierte Version des alkalischen Schnellextraktionsverfahrens angewendet (Birnboim, H. C. und DoIy, J. [1979J, Nucleic Acids Res., 7,1513-1523).

Eine einzelne Kolonie wurde in ein LB-Medium (Mo"^!ct:c, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., S.440; 3ml) inokuliert, das 100 pg/mlAmpizillin enthielt, und die Kultur wurde 10 bis 18 Stunden bei 37⁰C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und wieder in 100 μΙ von Lösung I (50 mM Glukose, 25 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,1OmM EDTA) zur Suspension gebracht und bei Zimmertemperatur 5 min stehengelassen. Es wurden 200μΙ von frisch hergestellter Lösung Il (0,2 N NaOH, 1 % SDS) zugesetzt und die Lösung kurz gewirbelt, anschließend wurde sie für 5min auf Eis gegeben. Es wurde eiskalte Lösung III (150μΙ, 3 M Kaliumazetat-2 M Essigsäure) zugesetzt und das Gemisch kurz gewirbelt und dann für 15min auf Eis gegeben. Das Gemisch wurde 5min bei 12000U/min in der Zentrifuge behandelt, und 400μΙ der obenaufschwimmenden Schicht wurden mit der Pipette in ein frisches Röhrchen gegeben. Es wurden 800μΙ Ethanol zugesetzt, und das Gemisch wurde 5min stehengelassen, anschließend bei 12000 U/min 2 min lang rotiert. Das Pellet wurde wieder in 400μΔΙ von 10OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0, und 5OmM NaOAc, pH-Wert 6,5, aufgelöst, und es wurde 1 ml 95%iges Ethanol zugesetzt. Nachdem man das Gemisch 30 Minuten lang bei -20°C stehengelassen hatte, wurde es mit 12000U/min 2 min geschleudert. Das Pellet wurde getrocknet und in 100μΙ lOmMTris-HCI, pH-Wert 8,0 1 mM EDTA-Lösung aufgelöst, die 0,5 Einheiten T₁RNaSe enthielt, und die Lösung wurde bei 37 ⁰C 30min gehalten, dann mit 100μΙ Phenol, das mit 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,0, gesättigt war, extrahiert. Es wurde die wäßrige Phase (etwa 90 μΙ) genommen, 10 μΙ 3 M Natriumazetat, pH-Wert 5,2, wurden zugesetzt, gefolgt von 260 μΙ 95%igem Ethanol und dem schnellen Kühlen des Gemischs in einem flüssigen Stickstoffbad. Nach dem Zentrifugieren (12000U/min, 3min) wurde das Pellet wieder in 200μΙ von 0,3 M NaOAc, pH-Wert 5,2, aufgelöst, und es wurden 500μΙ 95%iges EtOH zugesetzt, um wie oben die Nuklcinsäure auszufällen (schnelle Abschreckung in einem Bad flüssigen Stickstoffs, gefolgt vom Zentrifugieren). Das Pellet wurde mit 1 ml 95%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 30μΙ sterilem Wasser aufgelöst.

Die Ausbeute an Plasmid-DNA wurde auf 3-5pg geschätzt. Für die Agarose-Gel-lilektrophorese und die Restriktionsanalyse wurden 1-2 μΙ der obigen Lösung verwendet, während 3μΙ für Folgebildungsreoktionen verwendet wurden. Wenn das oben gewonnene Plasmid für weitere Klonungsexperimente verwendet wurde, wurden 20μΙ der Lösung für die Linearisierung mit einem oder in der Regel mit zwei Enzymen, gefolgt von der Isolierung des linearen Vektors, verwendet.

Restriktionsenzymspaltung der Plasmid-DNA

Alle analytischen Restriktionsanalysen wurden nach den Empfehlungen des Herstellers ausgeführt, mit der Ausnahme, daß aus den Reaktionspuffern immer BSA weggelassen wurde.

Wenn ein bestimmtes Plasmid im präparativen Maßstab gespalten wird mit einem oder mehreren Enzymen gleichzeitig oder nacheinander, werden immer die Reaktionsbedingungen gegeben.

pUC19-Spaltung mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen

Im allgemeinen werden die ersten HSA-Oligonukleotide der groben HSA-Fragmente (II, III, IV und V) in den mit zwei verschiedenen Enzymen gespaltenen pUC-19-Vektor geklont. Nach diesem ursprünglichen Plan werden nur die Oligonukleotide HSA1, HSA7, HSA13 und HSA19, die vorher mit einem Adapter (Adapter 1) ligiert wurden, in pUC19 geklont. Während der Arbeit der Gen-Montage stellte sich jedoch heraus, daß es vorteilhafter (oder schneller) ist, zwei weitere HSA-Oligonukleotide, nämlich HSA4 und HSA17, in pUC19, statt in die entsprechenden pHSA-Zwischenvektoren zu klonen, a) pUC19-Spaltungmit PstlundEcoRI

Eswurden2μgpUC19in ΙΟΟμΙ Puffer mit hohem Salzgehalt (10OmM NaCI, 5OmMTHs-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1mM DTT) mit 20 Einheiten Pstl und 20 Einheiten EcoRI bei 37⁰C für die Dauer von 4 Stunden behandelt. Die DNA wurde ethanolausgefällt durch den Zusatz von 5μΙ von 3 M Natriumazetat, pH-Wert 5,2, und 300 μΙ Ethanol, Abschrecken des Gemischs in ainem Bad aus flüssigen Stickstoff für die Dauer von 2 min, gefolgt vom Zentrifugieren bei 12000U/min für die Dauer von 3min. Das Pelle: wurde getrocknet und in 60μΙ 4%igem Ficoll 400,0,05% Bromophenol Blau aufgelöst, und der lineare Vektor wurde nach Tren-.dng durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarosegel in 4OmM Tris-Azetat, 2mM EDTA-Puffer (TAE-Puffer) isoliert, gefolgt vom Elektroeluieren, der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung, unterstützt durch den Zusatz von 10μg Hefeträger-tRNA(Maniatis,T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), S. 164-166). Das gewonnene Pellet wurde in 10μΙ sterilem Wasser aufgelöst, und die Konzentration des linearen Vektors wurde nach der Minigel-Methode (ebenda, S.468-469) bestimmt

Dieser Vektor wurde zum Klonen verwendet: HSA1.

b) pUC19-Spaltung mit BamHlun EcoRI

Es wurden 2μρ pUC19 in 100μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt mit 20 Einheiten BamHI und 20 Einheiten EcoRI wie oben behandelt, und die Isolierung des linearen Vektors erfolgte im wesentlichen auf die gleiche Weise wie oben. Dieser Vektor wurde zum Klonen verwendet: HGA13, HSA17.

c) pUC19-Spaltung mit Xbal und EcoRI

Sie erfolgte unter Verwendung von 20 Einheiten Xbal und 20 Einheiten EcoRI für 2 Mg pUC19 im wesentlichen wie oben. Der Xbal-EcoRI-pUC19-Vektor wurde zum Klonen verwendet: HSA4, HSA7, HSA19.

Spaltung der pHSA-Zwischenvektoren mit Apal und EcoRI

20μΙ pHSA-Plasmid, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurt'en auf 100 μΙ mit einem Reaktionsvolumen aufgefüllt, das 6mM Tris-HCI, pH-Wert 7,4,6mM NaCI, 6mM MgCI₂,1 mM DTI und 40 Einheiten des Enzyms Apal enthielt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 37⁰C gehalten. Eine Probe von 2 μΙ wurde auf einem 0,5%'gen Agarosegel in TBE-Puffer (89mM Tris, 89mM Borsäure, 8 mM EDTA) behandelt. Wenn die Spaltung abgeschlossen zu sein scheint (nach 1 bis 4 Stunden) werden 10μ11 M NaCI, 5μ11 M Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 20 Einheiten EcoRI zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 4 bis 16 Stunden bei 37⁰C gehalten. Der lineare DNA-Vektor wurde mit Ethanol ausgefällt und auf einem 0,5%igen Agarosegel gereinigt, wie das oben für die Isolierung des linearen pUC19-Vektors beschrieben wurde. Diese Apal-EcoRI-Doppeldigestion wurde mit den folgenden Plasmiden durchgeführt: HSA1,2,4,5,7,8,9,10,11,13,14,15,17, 19,20,21,22,23.

Klonung von HSA-Oligopukleotid-Adapter-Komplexen In pUC19 oder In pHSA-Vektoren Allgemeines Verfahren

Etwa 0,1 μg des doppeltgespaltenen pUC19- oder pHSA-Vektors wurden mit 5pMol des HSA-Oligonukleotid-Adapter-Komplexes in 10μΙ Reaktionsvolumen gemischt, das 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,10tr.M DTT, 1 mM ATP und 80 Einheite.-T₄-DNA-Ligase enthielt, und das Reaktionsgemisch wurde 4 bis 16 Stunden bei 15°C gehalten. Das Gemisch wurde für die Dauer von 5 min auf 60°C erhitzt, und nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurden 1 μΙ ImMdNTP (das alle vier Deoxyribonukleosid-5-triphosphate bei einer Konzentration von 1mM enthielt) und 1 μΙ von 0,D Einheiten/μΙ Klenow-Polymerase zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur 15min stehengelassen. Dann wurde es für die Dauer von 10 Minuten auf 60⁰C erhitzt, und es wurden 4 μΙ steriles Wasser, 2 μΙ eines Puffers, der 250 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 5OmM MgCI₂ enthielt, ΙμΙνοη 10OmM DTT, 1 μ| von 1OmM ATP und 200 Einheiten T4-DNA-Ligase bei 15⁰Czugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 bis 20 Stunden lang bei 15°C gehalten und dann in gefrorene, kompetente E.coli-Zellen JM101 transformiert, wie das oben beschrieben wurde. Die auf LB-Platten, welche 100Mg/ml Ampizillin enthielten, gewonnenen Kolonien wurden auf eine LB-Ampizillin-Grundplatte und eine Nitrozellulose-Replikaplatte gebracht (Grunstein, M. und Hogness, D. [1975), Proc. Natl. Acad. Sei/ USA 72,3961). Die auf der Nitrozellulose-Replicaplatte gezogenen Kolonien wurden gelöst und r.'it der entsprechenden 5'-³²P-phosphatmarkierten HSA-Oligonukleotidsonde hybridisiert (Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J., Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, S.314-325). In der Regel wurden 4 bis 10 positive Kolonien in 3ml LB-Amizillin-Medium gezogen, und Plasmid-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt.

Dideoxy-Folgebildung auf dem Plasmidtemplat

Es wurde die Folgebildungsmethode der Superspule (Chen, E. Y. und Seeburg, P. H., DNA 4,165 [1985)) mit einigen Modifikationen angewendet. Es wurden 3μΙ Plasmid-DNA- hergestellt wie oben - mit 17 μΙ von 0,3M NaOH - 0,3mM EDTA bei Zimmertemperatur gemischt. Nach 5min wurden 3μΙ 2 M Ammoniumazetat-Essigsäure, pH-Wert 4,5, und 60μΙ Ethanol zugesetzt und das Gemisch 15min bei -80'C gehalten. Das Gemisch wurde zentrifugiert (12000U/min, 5min), und das Pellet wurde mit 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 10μΙ Puffer aufgelöst, der 7 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,7mM MgCI₂, 5mM ß-Merkaptoethanol, 0,1 mM EDTA und 0,25pMol des S'-³²P-phosphatmarkierten Folgebildungsprimers enthielt (die im Verlauf der Arbeit verwendeten Primere werden im Schema 10 und oben gezeigt. Gelegentlich wurde auch einer der HSA-Oligonukleotide als Folgebildungsprimer trotz der Tatsache verwendet, daß sie eine zusätzliche 3'-Terminal-GGCC-Folge enthalten). Das Gemisch wurde 15min auf 45⁰C erhitzt. Anschließend wurden 2pl-Aliquote mit der Pipette in einer Mikro-Titer-Platte in den Vertiefungen abgegeben. Es wurden 2μΙ jedes der vier Dideoxy-Terminationsgemische (Hong, G. F, Bioscience Reports, 2,907 [1982]) und 2 μΙ von 0,25 Einheiten/μΙ Klenow-Polymerase mit jedem der vier Primer-Templat-ANquote gemischt, und die Gemische wurden bei Zimmertemperatur 20min, anschließend 10min bei 5O⁰C gehalten. Jedem Reaktionsgemisch wurden bei 3μΙ Gel-Füllpuffer zugesetzt, der 80% Formamid, 1OmM EDTA, 0,05% Bromophenol Blau und 0,05% Xylenzyanol enthielt, und die Gemische wurden 2 min lang auf 100 ⁰C erhitzt. Die Gel-Elektrophorese wurde auf einem 6%igem Arkylamid-Gel ausgeführt, das 8M Harnstoff, 9OmM Tris,9OmM Borsäure, 2mM EDTA, pH-Wert 8,3, enthielt.

Klonen der einzelnen HSA-Oligonukleotide (HSA 1,2,...24) Der ursprüngliche Plan sah folgendes vor:

Der gesamte HSA-Kodierungsbereich wurde in fünf Fragmente, HSAI, II, III, IV und V, unterteilt. Die vier letztgenannten Fragmente (II, III, IV und V) wurden weiter in 6-6 einsträngige Oligonukleotio's unterteilt (jeweils am 3'-Terminus mit G endend und durch chemische Synthese mit einer zusätzlichen GGCC-Folge versehen), was insgesamt 24 Oligonukleotide ergibt. Die großen HSA-Fragmente (II, III, IV und V) sollten durch konsekutives Klonen der synthetischen, einsträngigen Oligonukleotide (mit Hilfe eines Adapters) in pUC19- oder pUC19-abgeleitete pHSA-Vektoren gewonnen werden, was hier durch pHSAII veranschaulicht wird:

HSA1wirdinpUC19	geklont, um pHSA1	zu erhalten
KSA2wirdinpHSA1	geklont, um pHSA(1-2)	zu erhalten
HiiA3wirdinpHSA(1-2)	geklont, um pHSA(1-3)	zu erhalten
HSA4wirdinpHSA(1-3)	geklont, um pHSA(1-4)	zu erhalten
HSA5wirdinpHSA(1-4)	geklont, um pHSA(1-5)	zu erhalten
HSA6wirdinpHSA(1-5)	geklont, um pHSA(1-6)	oder
	pHSAII	üu erhalten

Ebenso wurde pHSAIII aus den Oligonukleotiden HSA7,8,9,10,11,12 gewonnen. pHSAIV wurde aus den Oligonukleotiden HSA13,14,15,16,17,18 gewonnen. pHSAV wurde aus den Oligonukleotiden HSA19, 20, 21,22,23,24 gewonnen.

Diese allgemeine Strategie wurde im allgemeinen für das Klonen von HSA-Oligonukleotiden mit Hilfe von Adipter 1 (siehe Schema 37) angewendet, in einigen Fällen aber gab es Abweichungen von diesem Verfahren. Die Gründe dafür waren entweder die Beschleunigung der Montage-Arbeit durch paralleles Klonen von mehr als einem Oligonukleotid innerhalb eines großen Fragments (wie im Fall von HSAII) oder die Lösung von Klonungsproblemen, die während der Arbeit auftraten.

Diese Ausnahmen waren:

HSA1 Oligonukleotid konnte als Ganzes nur mit Hilfe eines partiellen Duplexes (am 5'-Terminus von HSA1) geklont werden. HSA Il das große Fragment wurde als ,oHSA Il aus den vorher geklonten DNA-Segmenten HSA (1 -3) und HSA (4- 6) gewonnen. HSA15 Oligonukleotid konnte bei Erzielung der korrekten Folge nur mit Hilfe eines komplementären Oligonukleotids geklont werden, welches annähernd ²h des ursprünglichen HSA15 umfaßte.

HSA16 Oligonukleotid konnte nur mit Hilfe eines neuen Adapters (Adapter 2) geklont werden

HSA17 Oligonukleotid konnte nicht in pHSA(13-16) geklont werden, m das erwartete pHSA{13-17) zu erhalten. Obwohl die HSA17-Folge in den gewonnenen Plasmiden enthalten war, wurden Streichungen in den vorher geklonten Bereichen

beobachtet. Daher wurde HSA17 in pUC19 geklont

HSA18 Oligonukleotid wurde mit Hilfe von Adapter 2 in pHSA 17 geklont

HSAIV das große Fragment wurde aus den vorher geklonten DNA-Segmenten HSA (13-16) und HSA (17-18) gewonnen.

Schema 10 - Polyklonungsbereich von pUCI 9 (oder Mi3mp19) in \'erbindung mit den Folgebildungsprimeren

Umkehrprimer

AACAGCTATGACCATG Hind III Bstl

AACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTT^eA^e^CTGCAÜGTCGAC-.

pKO-Prizner J

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Primer-Referenzen, Umkehrprimer: Hong, G.F. (1981) Bioscience Reports 1,243-252.17-mer Primer: Duckworth, M.L., Gait, M.J., Goelet, P., Hong, G.F., Singh, M. undTitmas, R.¹" (1981), Nucleic Acids Res. 9,1961-1706. pKO-Primer I: Simoncsits, A., Kalman, M., Cserpän, I. und Kari, C. (1984) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. No. 14,321-322.

Klonung von HSA1 >n pUC19

Als versucht wurde, das Oligo-iukleotid HSA1, das mit dem Adapter 1 ligiert war (HSAI + Ai), indenBamHI-EcoRI-gespaltenen Vektor pUC19zu klonen, wob' i vas obon ausführlich beschriebene Klonungsverfahren angewendet werden sollte, konnte nicht der vollständige i iSA1 fjreir.it in der geklonten Form erreicht werden. Es wurdei. etwa 50 Klone, hybridisierend mit dem 5'-³²P-markierten Oligonukleotid HSA1, aufgereiht, und es wurde festgestellt, daß den meisten der Klone der 5'-Termina' ι -Rest von HSA1 fohlte (den übrigen fehlte mehr als ein Rest).

Es wurde dann eine neue Strategie angewendet, um die Klonung des vollständigen HSA1-Oligor.jkleotids zu erreichen. Als ein Klonungsvektor wurde Pstl-EcoRI-gespaltenes pUC19 verwendet, und in das Reaktionsgemi&ch wurde ein synthetischer, partieller Duplex einbezogen, mit einem Pstl-haftenden Ende am 5'-Terminus und einem 10 Nucleotide langen, Bevorstehenden Bereich am 3'-Terminus, wobei dieser letztgenannte Bereich zur ö'-Terminalboroich von HSA1 komplementär ist. Die Anwendung dieses „Helfer-Duplexes" wird im Schema 11 gezeigt.

Es wurden 0,1 \ig des Pstl-EchoRI-gespaltenen pUC19-Vektors mit 5pMol von HSA1 + Ai, 5pMol von 5'-phosphoryliertem GTGCGATC und 5pMol von 5'-phosphöryii.j! tem TCTTCACCTAGATCGCACTGCA in einem Reaktionsvolumen von 10μΙ gemischt, und das ganze Klonungsverfahren »,urde im wesentlichen nach dem allgemeinen Verfahren duichgeführt.

Als Sonde wurden 100 Kolonien durch Hybridisieruno mit d im 5'-markierten Oligonukleotid HSA1 überprüft. Von den 20 positiven Klonen wurden 10 für die Folgab dtrig mit Müvo des pKO-Pnmers 1 und des Umkehrprimers verwendet. Acht der aufgereihten Klone enthielten die richtige Folge Die Piasmid-DNA eines der richtigen Klone wurde im nächsten Schritt als pHSA 1 für die Apal-EcoRI-Doppeldigestion und zum K'onen des Oligonukleotiden HSA2 verwendet.

Schema 11

-CTGCA

pTAGGTGAAGAAAAC-

HSA 1+A₁ pAATTC-G-

Pstl-EcoRI cleaved pUC19

TTCGAAGGGCCC-

CCCr-CG-

-CTTAA

pGTGCGATC

ACGTCACGCTAGATCCACTTCTp ^1:he"¹^eT" duDlex

1, T4 DNA ligase

2, Klenow polymerase +dNTP

3, T4 DNA liaase

Pstl

Sau3AI

CTCl.-.GTGCGATCTAGGTGAAGAAAAC-GACGTCACGCTAGATCCACTTCTTTTG-

HSA 1 Apal

-ttcgaagggccc- -aagcttcccggg-

EcoRI -GAATTC-

-CTTAAG-

pHSA

Klonung von HSA 2 in pHSA 1

Es wurden 0,1 μρ von Apal-EcoRI-gespaltenem pHSA 1 mit 5μ,ΜοΙ HSA'i.' + A₁ in 10μΙ Reaktionsvolumen gemischt und die Klonungsschritte wie oben beschrieben aufgeführt (Schema 12).

Kolonien wurden replika-plattiert jnd mit dem 5'-³²P-HSA 2-Oligonukleotiden ils S >nde hybridisiert. Man erhielt 9 positive Kolonien, aus diesen wurde Plasmid-DNA hei gestellt, und sie wurden unter Ve¹ Wendung von pKO-Primer i aufgereiht. Fünf Klone enthielten die korrekte Folge HSA 2. Plasmid-DNA von einem der kurrek'jn Klone (pHSA (1-2)) wurde im nächsten Schritt zum Klonen des Oligonukleotiden HSA 3 verwendet.

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Klonung von HSA 3 in pHSA (1-2)

Es wurden 0,1 vq Apal-EcoRi-gespaltenes pHSA (1-2) mit 5pMol HSA 3 + Ai in 10μΙ Reaktionsvolumen reagiert, wie das oben beschrieben wurde (Schema 13).

Es wurden 187 Kolonien replika-plattiert und mit einer 5'-³²P-HSA 3-Oligonukleotidsonde hybridisiert. Von den 42 positiven Klonen wurden 10 für die Herstellung von Plasmid-DNA verwendet, und sie wurden unter Vorwendung des pKO-Primers I aufgereiht. Ein Klon war korrekt, und das daraus gewonnene Plasmid wurde als pHSA (1-3) bezeichnet.

pHSA (1-3) wurde später zum Klonen des HSA (4-6)-DNA-Segmentes verwendet (siehe unten).

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Klonung von HSA 4 in pUC19

In 10μΙ Reaktionsvolumenm wurden, wie oben beschrieben, 0,1 Mikrogr imm Xbal-EchoRi-gespaltener pUC 19 und 5pMol

HSA 4 + Ai reagiert (Schema 14).

Es wurden 110 Kolonien genommen, von denen 45 eine Hybridisierur g mit der 5'-³²P-HSA 4-Oligonukleotidsonde aufwiesen.

Von 4 positiven Klonen wurde Plasmid-DNA hergestellt, und alle 4 enthielten die korrekte HSA 4-Folge und die erwarteten Flankierungsbereiche. Das so gewonnene pHSA4 enthielt die regenerierte /bal-Stelle am 5'-Terminus von HSA4, die später am Verbindungspunkt zwischen HSA3- und HSA4-Oligonukleotid ausgeschaltot wurden konnte.

pHSA4 wurde im nächsten Schritt zum Klonen von HSA5 verwendet.

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Klonung von HSA S in pHSA4

Nach dam allgemeinen Verfahren wurden 0,1 Mg Apal-EcoRI-gespaltenes pHSA4 und 5 pMol HSA 5 + A₁ reagiert (Schema 15). Es wurden 65 Kolonien mit 5'-³²P-HSA 5-Oligonukleotidsonde hybridisiert, und 3 davon erwiesen sich als positiv. Aus den positiven Klonen wurde Plasmid-DNA hergestellt, wovon eine korrekt war, diese wurde als pHSA (4-5) bezeichnet und im nächsten Schritt zum Klonen von HSA 6 verwendet.

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Klonung von HSA 6 In pHSA (4- 5)

Nach d?m allgemeinen Verfahren wurden 0,1 pg Apal-EcoRI-gespaltenes pHSA (4-5) und 5pMol HSA 6 - A₁ reagiert (Schema

Es wurden 225 Kolonien repliziert und mit der 5'-³²P-HSA 6-Oligonukleotidsonde hybridisiert. Es erwiesen sich 72 als positiv, von denen 10 zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet werden. Von den 10 aufgereihten Plasmiden (Verwendung des pKO-

Primers I) enthielten 2 die korrekte HSA 6-Folge, eines dieser Plasmide wurde als pHSA (4-6) bezeichnet.

pHSA (4-6) wurde später zum Gewinnen von HSA (4-6)-DNA-Segment verwendet, das in pHSA (1-3) geklont wurde, um pHSA

(1-6) oder pHSA Il zu erhalten.

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-31- 232 473

Kionung von HSA 7 in pUC 19

Nach dem allgemeinen Verfahren wurden 0,1 pgXbal-EcoRI-gespaltenespuC 19und5pMol HSA 7 + A| reagiert (Schema 17). Die HSA 7-haltigen Klone wurden nach einer Farbreaktion ausgewählt. Nach der Transformation wurden die transformierten Zellen bei Vorhandensein von IPTG (IPTG: Isopropyl-ß-D-thiogalaktopyranosid) und X-GaI (X-GaI: 5-Bromo-4-Chloro-3-indoyl-ßgalaktosid) (Viecira, J. und Messing, J. [1982], Gene 19, 259-268) plattiert. Es wurde erwartet, daß weiße Kolonien auf blauem Hintergrund die korrekte HSA-Folge enthielten.

Zehn willkürlich herausgegriffene weiße Kolonien wurden in LB-Ampizillin-Medium inokuliert, und die aus diesen hergestellte Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des pKO-Primers I aufgereiht. Von diesen enthielten 7 die korrekte HSA-Folge, und eine wurde später als pHSA 7 zum Klonen von HSA 8 im nächsten Schritt verwendet.

Das Oligonukleotid HSA 7 als das erste Oligonukleotid des Fragments HSA III enthält eine zusätzliche GGTAC-5'-Terminalfolge, die eingeführt wurde, um diese Folge, welche zusammen mit dem nächsten C-Rest eine Kpnl-Stelle bildet, zum Verbinden des großen Fragments HSA III mit dem großen Fragment HSA Il verwenden zu können. Diese zusätzliche Folge sollte nach der Ausführung der relevanten Reaktionen verschwinden, deshalb wird diese Folge nicht als Teil von HSA 7 einbezogen, wenn sie bereits in pHSA 7 geklont ist, wie das im Schema 17 gezeigt wird.

Schema 17

/-.GATC D

pAATTC-G-

BamHI-EcoRI cleaved pUC19

dGGTACCTAAG-

TTTGTTGGGCCC G

CCCGGG CTTAA

HSA 7+Α_Ί

1, T4 DNA ligase

2, Klenow polymerase +dNTP

3, TA DNA ligase

Kr-ml -TCTAGGGTACCTAAG-

-AGATCCCATGGATTC-

HSA 7-

A pa I -TTTGTTGGGCCC-

-AAACAACCCGGC-

EcoRI -GAATTC-

-CTTAAG-

dHSA

tS9 CO

Klonung vun HSA 8 In pHSA 7

Nach dem allgemeinen Verfahren wurden 0,1 Mg Apal-EcoRI-gespaltenes pHSA 7 mit 5 pMol HSA 8 + A₁ reagiert (Schema 18). Mit der Hybridisierungssonde 5'-³²P-HSA 8 wurden 240 Kolonien geprüft, von denen 6 positiv waren. Von diesen wiei'un 2 nach der Folgebildung mit dem pKO-Primer I die korrekte HSA 8-Folge auf. Die Plasmid-DNA eines korrekten K'.ons wurde der allgemeinen Kfonungsstrategie als pHSA (7-8) unterzogen, um HSA 9 im nächsten Schritt zu kionen.

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Klonung von HSA 9 In pHSA (7-8)

Nach dem allgemeinen Verfahren wurden 0,1 pg Apal-EcoRI-gespaltenes pHSA (7-8) und 5 pMol HSA 9 + Ai reagiert

(Schema 19).

Es wurden 240 Kolonien replika-plattiert und mit der Oligonukleotidsonde 5'-³²P-HSA 9 hybridisiert. Aus 8 der 13 positiven Klone wurde Plasmid-DNA hergestellt und diese aufgereiht. Drei der 8 aufgereihten Klone enthielten das korrekte Plasmid pHSA (7-9).

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Klonung von HSA 1G In pHSA (7-9)

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Klonung von HSA 11 In pHSA (7-10)

Auf die übliche Weise wurden 0,1 pg Apal-EcoRI-gespaltenes pHSA (7-10) und 5 pMol HSA11 + A₁ rangiert (Schema 21). Es wurden 160 Kolonien replika-plattiert, und 9 davon erwiesen sich nach dem Hybridi' ieren r.iit der Gligonukleotidsonde 5'-³²P-HSA 11 als positiv. Die von den positiven Klonen gebildeten Plasmide wurden unter Veiwt>,.durig des pKO-Primers I aufgereiht. Es wurde festgestellt, daß ein Klon die erwartete Folge enthielt, und die aus diesem Klon hergestellte Plasmid-DNA wurde im nächsten Schritt als pHSA (7-11) verwendet.

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Klonung von HSA 12 In pHSA (7-11)

Nach dem allgemeinen Verfahren wurden 0,1 pg Apal-EcoRI-gespaltenespHSA (7-11) mit 5 pMol HSA 12 + A₍ reagiert (Schema 22).

Es wurden 240 Klone geprüft, von denen sich 11 nach der Hybridisierung mit der Oligonukleotidsonde 5'-³²P-HSA 12 als positiv erwiesen. Zwei von 10 aufgereihten (pKO-Primer I) Plasmid-DNA schienen korrekt zu sein, von denen eine später als pHSA (7-12) oder pHSA III, d. h., das große HSA III enthaltende Fragment verwendet wurde.

Die Folge von HSA (7-12) oder des HSA HI-Fragmentes wurde durch Folgebildung in den Vektoren M 13mp19 und mp18 bestätigt. pHSA III wurde mit Pstl und EcoRI gespalten, das kleine Fragment wurde isoliert und in Pstl-EcoRI-gespaltene Vektoren M 13mp 18 und mp 19 geklont. Aus den Rekombinanten wurde einsträngige Phag-DNA hergestellt, und sie wurden unter Verwendung des 17-mer Primers aufgereiht.

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Klonung von HSA 13 In pUC 19

Nach dem allgemeinen Verfahren wurden 0,1 pg BamHI-EcoRI-gespaltenespUC 19und5pMol HSA 13 + A_t reagiert (Schema 23).

Durch Hybridisierung mit der Sonde 5'-³²P-HSA 13 wurden 80 Klone geprüft, von denen sich 14 als positiv erwiesen. Aus 10 positiven Klonen wurde Plasmid-DNA hergestellt und unter Verwendung von pKO-Primnr I aufgereiht. Sechs davon waren mit dem erwarteten Plasmid pHSA 13 identisch.

Das Oligonukleotid HSA 13 enthält, wie HSA 7, die zusätzliche GGTAC-B'-Terminalfolge, da dieses Oligonukleotid das erste im großen Fragment HSAIV ist. In diesem Fall wurde auch eine Kpn I-Stelle gebildet, die später zur Verbindung der großen Fragmente HSA III und HSAIV verwendet werden kann, so daß diese zusätzliche Folge an der Verbindungsstelle entfällt.

pHSA 13 wurde im nächsten Schritt zum Klonen von HSA 14 verwendet.

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Klonung von HSA 14 In pHSA Nach dem allgemeinen Verfahren wurden 0,1 μοΑρΒί-ΕεοΡΙΙ gespaltenes pHSA 13 mit 5 pMolHSA14 + A< reagiert (Schema 24). Zwei der 160 durch Hybridisierung mit 5'-³²P-HSA 14 geprüften Klone waren positiv. Nach der Plasmidherstellung und der Folgebildung durch pKO-Primer I enthielt eine der beiden Plasmid-DNA die erwartete Folge. Sie wurde als pHSA (13-14) bezeichnet und im nächsten Schritt verwendet.

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Klonung von HSA 15 In pHSA (13-14)

Bei dem Versuch, HSA15 + A₁ nach dem allgemeinen Vorfahren in das APal-EcoRI-gespaltene pHSA (13-14) zu klonen, erhielt man eine große Zahl von Kolonien, die mit 5'-³²P-HSA15 hybridisieren, aber nach der Folgebildung der Plasmide konnte die erwartete HSA-15-Folge nicht festgestellt werden. Man erhielt stattdessen ein doppelt-mutiertes HSA15, bei dem an den Nukleotidpositionen 1072 und 1096 (Nukleotidpositionen in der reifen HSA-Genfolge) G->T-Mutation auftrat. Diese G-Reste wurden von T-Resten umschlossen. Die Möglichkeit, daß diese offenkundigen Mutationen nur auf zweideutige Gel-Ablesungen zurückzuführen waren, wie das manchmal bei der Verwendung eines Plasmid-DNA-Templats der Fall ist, konnte nach dem erneuten Klonen des interessieienden Bereichs in den M 13mp 19-Phagvektor ausgeschlossen werden. Da diese beiden Mutationen gleichzeitig in allen Fällen (es wurden 19 verschiedene positive Klone getestet) auftraten, mußte in diesem Fall die allgemeine Klonungsstrategie dahingehend geändert werden, daß ein komplementäres Oligonukleotid, das die Stellen der Mutationen in HSA 15 umfaßt, eingesetzt wurde.

Es wurde ein 42-meres, komplementäres Oligonukleotid hergestellt und in das Ligationsgemisch von 5'-Phosphat-HSA 15 einbezogen, ebenso wie Adapter 1. Eswurden 50 pMol von 5'-'¹²P-HSA 15 mit 100 pMol 5'-Fhosphat-42-mer, 10OpMoI 5'-Phosphadapter 1, oberer Strang, und 100 pMol 5'-Hydroxyladapter 1, unterer Strang, gemischt. Der partielle Duplex wurde, wie das oben beschrieben wurde, nach der Gel-Elektrophorese isoliert und ergab eine Ausbeute von 30% auf der Grundlage von HSA 15. Dieser partielle Duplex wird im Schema 25 als HSA15 + C + Ai bezeichnet.

Anschließend wurden 0,1 μς des Apal-EcoRI-ge^cpaltenunpHSA (13-14) mit 5 pMolHSA15 + C + A, reagiert, wobei die Reaktionen nach dem allgemeinen Verfahren ausgeführt wurden. Durch die 5'-³²P-HSA15-Sonde wurden 340 Klone getestet, und von den 17 positiven Klonen wurden 12 zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet. Sie wurden aufgereiht (pKC-Primer I), und 2 davon enthielten die erwartete Folge HSA 15. Diese Folge wurde durch erneutes Klonen des so gewonnenen Bereiches HSA (13—15) in den Phagvektor M 13mp 19 und durch Ausführung von Folgebildungsreaktionen an der einsträngigen DNA-Schablone bestätigt

Eines der richtigen Plasmide wurde als pHSA (13-15) im nächsten Schritt eingesetzt.

Schema 25

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Klonlerung von HSA 16 in pHSA (13-15)

Wenn HSA16 + Ai in Apal-EcoRI-geschnittene pHSA (13-15) kloniert wurde, hatten alle 16 sequenzierten positiven Klone eine 9-Basenpaardeletion am 5'-Terminus des HSA-16-Bereichs. Die erneute Untersuchung der Sequenz HSA 16 zeigte, daß ihr 5'-Terminalbereich und der 5'-Terminalbereich des unteren Strangs von Adapter 1 annähernd perfekt komplementär waren.

Vorgesehen war die Verwendung eines anderen Apal-EcoRI-Adapters ohne diesen komplementären Bereich (Adapter 2, siehe Schema 3). HSAOIigonukleotide wurden mit Adapter 2 auf genau die gleiche Weise wie mit Adapter 1 ligiort.

Es wurden 0,1 pg von mit Apal-EcoRI geschnittenem pHSAmit 5 pMol HSA16 + Aj nach dem allgemeinen Verfahren reagiert.

Von 60 Klonen waren nach der Hybridisierung mit einer 5'-³²P-HSA-16-Sonde· 24 positiv. Zehn der poxitiven Klone wurden zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet, sie wurden mit dem pKO-Starter I sequenziert, und zwei davon erwiesen sich als das

erwartete pHSA (13-16).

pHSA (13-16) wurde später zur Herstellung des HSA (13-16)-DNA-Bereiches verwendet, der in pHSA (17-18) kloniert wurde, um pHSA (13-18), d.h., pHSA IV, zu erhalten.

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Klonlerung von HSA17 In pUC19

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Klonierung von HSA18 In pHSA

Es wurden 0,1 μg mit Apa I-Eco Rl geschnittenes pHSA 17 mit 5 pMol HSA18 + A₂ reagiert (Schema 28) Von den 160 durch Hybridisierung mit einer 5'-³²P-HSA 18-Sonde getesteten Klonen waren 24 positiv. Aus 4 der positiven Klone wurde Plasmid-DNA hergestellt, die Sequenzierung erfolgte mit pKO-Starter I. Zwei Klone enthielten das korrekte Plasmid

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Klonlerung von HSA19 in pUC 19

Es wurden 0,1 pg mit Xbal-Eco Rl geschnittenes pUC 19 mit 5pMol HSA19 + A, nachdem allgemeinen Verfahren reagiert (Schema 29).

Transformierte JM101 -E. coli-Zsllen wurden auf eine LD-Ampizillinplatte bei Vorhandenseins von X-GeI und IPTG plattiert, wie das für pHSA7 beschrieben wurde. Es wurde Plasmid-DNA von 6 willkürlich herausgegriffenen weißen Kolonien hergestellt und unter Verwendung des pKO-Starters I sequenziert. Zwei von ihnen erwiesen sich als das korrekte pHSA HSA19 enthält, wie HSA 7 und HSA13, die zusätzliche GGTAC-Folge am 5'-Terminus. Diese Sequenz erleichtert, wie oben beschrieben wurde, die Verbindung des großen Fragmentes HSAV mit HSAIV (siehe auch unton).

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Klonleiung von HSA20 In pHSA19

Es wurden 0,1 pg mit Apa I-Eco Rl geschnittenes pHSA 19 mit BpMoI HSA20 + A₁ reagiert, wie das im allgemeinen Verfahren

beschrieben wurde (Schema 30).

Mit der 5'-^3JP-HSA20-Ligonukleotidsonde wurden 160 Kolonien getestet, von denen sich 58 als positiv erwiesen. Plasmid-DN A,

die aus 11 positiyen Klonen hergestellt wurde, wurde 'jnter Verwendung des pKO-Starters I sequenziert, und acht von diesen

enthielten das korrekte Plasmid pHSA (19-20).

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Klonlerung von HOA 21 in pHSA(19-20) Es wurden 0,1 pg mit Apa I-Eco Rl geschnittenes pHSA (19-20) und 5pMol HSA21 + A₁ auf die üblicherweise miteinander reagiert (Schema 31).

Nach der Hybridisierung mit der 5'-³²P-HSA21-Sonde wurden 33 positive Klone von 240 gen.2?«ten festgestellt. Sechs positive Klone wurden zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet, und nach der Sequenzierung mit dem pKO-Starter I wurde festgestellt, daß 3 Klone das erwartete Plasmid pHSA(19-21) enthielten.

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Klonierung von HPA22 In pHRA(19~21)

Es wurden 0,1 pg mit Apa I-Eco Rl geschnittenes pHSA(19-21) und 5pMol HSA22 + A₁ auf die übliche Weise miteinander

reagiert (Schema 32).

Für die Hybridisierung mit der 5^r-"P-HSA22-Sonde wurden 80 Klone getestet, von denen sich 10 als positiv erwiesen. Die aus diesen hergestellte Plas^r .id-DNA wui de unter Verwendung des pKO-Starters I sequenziert, und es erwies sich nur eine als korrekt. Sie wird als pHSA( 19-22) bezeichnet.

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Klonlsrung von HSA23 in pHSA(19-22)

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(Schema 33).

Es wurden 160 Klone getestet, von denen 100 ->ine Hybridisierung mit der 5'-³²P-HSA23-Sonde aufwiesen. Aus 6 positiven Klonen wurde Plasmid-DNA hergestellt, und s.. wurden mit dem pKO-Startei I sequenziert. Drei davon enthielten die korrekte Sequenz HSA23 in der entsprechenden Umgebung. Eine davon wurde im nächsten Schritt als pHSA(19-23) verwendet.

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Klonierung von HSA23 in pHSA (13-23)

Es wurden 0,1 μg mit Apa I-Eco Rl geschnittenes pHSA(13-23) mit 5pMol HSA24 + A₁ auf die übliche Weise reagiert (Schema 34).

Von 160 Klonen wiesen 37 Hybridisierung mit der 5'-³²P-HSA24-Sonde auf. Von drei positiven Klonen wurde Plasmid-DNA hergestellt, und diese wurde mit dem pKO-ötarter I sequenziert. Zwei der genannten Plasmide enthielten die korrekte HSA24-Sequenz, von denen eine später als pHSA(19-24) oder als pHSAV verwendet wurde.

Die Sequenz von HSAV wurde nach der Reklonierung in das mit Pst I-Eco Rl geschnittene M 13mp18- und mp 19-Vektorpaar als Pst I-Eco Rl-Fragment, das aus pHSAV gewonnen wurde, bestätigt.

Ό	ro
CU	(N
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U U CJ

CJ CL

CJ U

U O

CJ U

H <

CJ O

CJ U

u cj

ο u

Verbindung der großen HSA-Fragmente

Obwohl geplant war, das Gen von HSA aus 5 großen Fragmenten (HSAI, II, III, IV und V) zusammenzubauen, wurde bisher nur die Synthese von HSAIII und HSAV demonstriert. HSAI ist ein flexibler 5'-Terminalbereich von HSA und wurde chemisch als relativ kurzes Pst I-Sage Al-Segment synthetisiert. (Siehe Schema 4.) HSAII und HSAIV wurden aus zwei Segmenten gewonnen, d. h., HSAII oder HSA(1-6) wurde aus HSA(1-3) und HSA(4-6) hergestellt, während HSAIV oder HSA(13-18) aus HSA(13-16) und HSA(17-18) gewonnen wurde. Während des Zusammenbaus der großen Fragmente HSAIl und HSAIV wurden solche Reaktionsserien angewendet, wie die Restruktionsdegestion, die entweder bei der Mung-Bohnen-Nukleasebehandlung oder bei der Klenow-Polymerase-+dNTP-Behandlung Anwendung finden. Diese Reaktionsbedingungen werden für die Erzielung von pHSAII und pHSA IV vollständig beschrieben, und bei der Manipulation mit großen HSA-Fragmenten wird auf ähnliche Reaktionen nur verwiesen.

Die Mung-Bohnen-Nuklease- und die Klenow-Polymerase-+dNTP-Behandlung werden angewendet, um die 5'- oder 3'überhängenden, einzelsträngigen DNA-Bereiche zu entfernen, die man nach dem Restriktionsenzymschneiden zur Herstellung von glatten Endun erhält. Durch die Mung-Bohnen-Nuklease werden 5'-überstehende Enden entfernt, während die Klenow-Polymerase--!-dNTP-Behandlung die 3'-überstehenden Enden beseitigt. Die letztere Behandlung füllt gleichzeitig das 5'-überstehendc Ende, um glatte Enden zu ergeben.

pHSAII

Das große HSAII-Fragment, kloniert in pUC 19 als pHSAIi, wurde aus den Segmenten HSA(1-3) und HSA (4-6) gewonnen, so daß pHSA(1-3) als Vektor zum Klonieren von HSA(4-6) verwendet wurde.

Es wurde 1 μg von pH3A(4-6) mit 10 Einheiten Xba I in 50pg Reaktionsvolumen behandelt, das 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ und 1 mM DTT (Puffer mit hohem Salzgehalt) enthielt. Temperatur 37⁰C, Dauer 1 Stunde. Die so gewonnene lineare Vektor-DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in 50μΙ Mung-Bohnen-Nukleasepuffer (3OmM Natriumazetat, pH-Wert 5,0,10OmM NaCI, 2mM ZnCI₂,10% Glyzerol, 0,5mg/ml denaturierte Kalb-Thymus-DNA) aufgelöst und mit 1 μΙ einer 10 Einheiten^l-Mung-Bohnen-Nuklease bei 37⁰C für die Dauer von 30min behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert, dann wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in 50μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt (siehe oben fOr die Xba I-Behandlung) aufgelöst, und dem Reaktionsgemisch wurden 20 Einheiten Eco Rl zugesetzt, wobei die Temperatui eine Stunde lang bei 37⁰C gehalten wurde. Nach der Ethanolausfällung wurde das kleine HSA (4-6)-Fragment durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarose-Gel (in TAE-Puffer) isoliert, gefolgt von der Elektroeluierung und Ethanolausfällung. Dieses Fragment hatte ein glattes Ende am 5'-Terminus und ein EcoRI-kohasives Ende am 3'-Terminus (Schema 35).

Es wurde 1 pg von pHSA(1-3) in 50μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt, der 6mM NaCI, 6mM Tris-HCI, pH-Wert7,4,6mM MgCI₂ und 1 mM DTT enthielt, aufgelöst und mit 10 Einheiten Apal bei 37⁰C eine Stunde lang behandelt. Nach der Ethanolausfällung wurde das Pellet in 50μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 7mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,7mM MgCI₂,5mM ß-Merkaptoethanol, 0,1 mM EDTA und 0,1 mM dNTP enthielt, und mit 0,5μΙ von 5 Einheiten/μΙ Klenow-Polymerase bei Zimmertemperatur 10min lang behandelt. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wurde das Pellet in 50 μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt aufgelöst, und es wurden 10 Einheiten von Eco Rl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden lang bei 37⁰C gehalten, dann wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt. Das große Vektorfragment mit einem glatten Ende und einem EcoRI-Ende wurde durch Elektrophorese auf 0,5%igem Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung und der Ethanolausfällung, isoliert (Schema35).

Der mit pHSA(1-3) geschnittene Vektor (0,1 μg) wurde mit dem HSA(4-6)-Fragment (etwa 0,03pg) in 10μΙ Reaktionsvolumen ligiert, das 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT, a ml ATP (Ligasepuffer) enthielt, und es wurden bei 15°C für 12 Stunden 80 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in gefrorene kompetente Zellen transformiert, und sie wurden dann auf LB-Ampizillinplatten plattiert. Von 110 replika-plattierten Kolonien wiesen 55 Hybridiserung mit der 5'-³²P-HSA4-Oligonukleotidsonde auf. Aus 10 positiven Klonen wurde Plasmid-DNA herbestellt und unter Verwendung des Starters sequenziert. Von diesen wiesen 2 die erwartete Folge an der Verbindungsstelle der Oligonukleotide HSA3 und HSA4 auf, und diese wurden später als pHSA(1-6) oder pHSAII verwendet (Schema 35).

(Die Folge von HSAII wur'de nach der Subklonierung in den mit Pstl-EcoRI geschnittenen M 13mp 18- und mp 19-Phagvektor bestätigt, und die Sequenzierungsreaktionen wurden an einzelsträngiger DNA-Matrize ausgeführt.)

Schema 35

Pstl Sau3Al ^ ψ 1

Apal EcoP.I 3 Ψ ζ

Xba I

pHSA(l-3)

1) Apal

2) Klenow pol.+dNTP

3) EcoRI

4) Isolation of linear vector

Pstl Sau3Al

blunt end FccP.I 3 ψ ^

Apal EcoPI

pHSA(4-6)

1) XbaI

2) Mung bean nuclease

3) EcoPI

4) Isolation of snail fragment

blunt end

Apa I^ EcoPI

τ, d::a ι -;case

PstK Sau3Al > ir 1

Apa I ^- EcoPI i i «

4) Isolierung des linearen Vektors

pn:;. 1

2) Mung-Bohnen-Nuklease

A) Isolierung des kleinen Fragments

N) OO N)

pHSAIV

Das große Fragment HSAIV wurde aus den vorher Monierten DNA-Segmenten HSA(13-16) und HSA(17-18) gewonnen, wobei der Vektor pHSA(17--18) zum Klonieren von HSA(13-16) verwendet wurde (Schema36).

Es wurde 1 \iq von pHSA(13-16) mit 20 Einheiten von Apal in 50 μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt für die Dauer von einer Stunde bei 37⁰C behandelt. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und in 50 μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mM dNTP enthielt, und bei Zimmertemperatur 10min lang mit 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, und das Pellet wurde in 50μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt aufgelöst, der 20 Einheiten Pst I enthielt, Dauer eine Stunde, Temperatur 37⁰C. Nach der Ethanolausfällung wurde das kleine Fragment durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarose-Gel, gefolgt von der Elektroeluierung, isoliert. Dieses Verfahren ergab das DNA-Segment HSA(13-16) mit einem glatten Ende und einem Pstl-kohäsiven Ende (Schema36).

Es wurde 1 Mg von pHSA(17-18) mit 10 Einheiten Bam Hl in 50μΙ eines Reaktionsvolumens geschnitten, das einen Puffer mit hohem Salzgehalt enthielt, Dauer eine Stunde, Temperatur 37⁰C. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und in 50 pg Mung-Bohnen-Nuklease aufgelöst, anschließend wurden über 30min bei 37⁰C10 Einheiten Mung-Bohnen-Nuklease zugesetzt. Nach der Phenolextraktion und der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt aufgelöst, und über eine Stunde wurde bei 37⁰C eine Menge von 20 Einheiten Pstl zugesetzt. Das Große, lineare Vektorfragment wurde mit Ethanol ausgefällt, durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarose-Gel (TAE-Puffer) gereinigt, gefolgt von der Elektroeluierung. Diese Reaktionsserie führte zu einem geschnittenen pHSA(17-18)-Vektor mit einem glatten Ende und einem Pstl-kohäsiven Ende (Schema36).

Der geschnittene pHSA(17-18)-Vektor (0,^g) wurde mit HSA(13-16) (etwa Ο,Οδμρ) in 10 μΙίί933βρυίίβΓΐί9ίβπ, der 80 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, Dauer 12 Stunden, Temepratur 15⁰C. Das Gemisch wurde dann in gefrorene kompetente JM101 -Zellen transformiert und auf LB-Ampizillinplatten plattier*. Durch Hybridisierung mit der 5'-³²P-HSA 16-Sonde wurden 230 Kolonien getestet, von denen 86 als positiv ermittelt wurden. Aus 10 Klonen wurde Plasmid-DNA hergestellt und unter Verwendung des pKO-Starter sequenziert. Fünf Plasmid-DNA wiesen die korrekte Verbindung zwischen den HSA16- und HSA17-Oligonukleotidbereichen auf, und sie wurden später als pHSA(13-18) oder pHSAIV verwendet (Schema36). (Die Folge von HSAIV wurde nach der Subklonierung in den Phagvektor M 13mp 18 und mp 19 bestätigt. Die Sequenzierung wurde auf einer einzelsträngigen DNA-Matrize durchgeführt.)

Schema 36

Pstl BamHI Apa I EcoRJ

ι, ι. I

λ V-

1) BamHI

2) mung bean nuclease

3) Pstl

4) -isolation of linear vector

Pstl blunt end Apal r _R, j 17 13 J Γ

Pstl BamHI j J 12

Pstl cemHI I I 13

Apal EcoP.I

14 15

\ Y

1) Apal

^; 2) Kl en ο ν/ pol .+d NTP

j 3} Pstl

j 4) isolation of small fraameni

blunt end 15 16

T4

Pstl BamHI Ap*I

* »13 14 15 16 17 18 i ♦

1 i ο a s e

^p* ^l EcoPI

-i H

pHSAIV .

2) Mung-Bohnen-Nuklease

4) Isolierung des linearen Vektors

4) Isolierung des kleinen Fragments Blunt end-Glattes Ende

pHSA(IMII)

In diesem Fall wurde pHSAIII als Vektor benutzt, um das HSAIII-Fragment zu Monieren (Sc¹- ima 37).

Vorbereitung des HSA HI-Fragments

Es wurden 5 Mg pHSA III mit 40 Einheiten Kpn I in 100 μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt bei 37 ⁰C 3 Stunden lang behandelt. Der geschnittene Vektor wurde mit Ethanol ausgefällt, und das Pellet wurde in 50 μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mM dNTP und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase enthielt, unü das Gemisch wurde 10min bei Zimmertemperatur gehalten. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wurde das Pellet in 50μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt aufgelöst, es wurden 40 Einheiten Eco Rl zugesetzt, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37 ⁰C gehalten. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, und das HSAIII-Fragment wurde durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung, isoliert. Das so gewonnene, HSAIII-enthaltende große Fragment hatte ein glattes Ende und ein Eco Rlkohäsives Ende (Schema 37).

Schneiden des pHSAII-Vektors

Es wurde 1pg vonpHSAII in 50μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt aufgelöst und mit 10 Einheiten Apa I bei 37⁰C für die Dauer von 2 Stunden behandelt. Nach der Ethanolausfällung wurde das Pellet in 50 \ig Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mM dNTP enthielt, und mit 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase bei Zimmertemperatur 10min behandelt. Das Gemisch wurde mit Phenol extrahiert, die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, und das Pellet wurde in 50 μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt aufgelöst, dann wurden 20 Einheiten Ecc Rl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 37⁰C gehalten, und die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt. Des große Vektorfragment wurde durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluiei ung, isoliert. Der so gewonnene lineare Vektor hatte ein glattes Ende und ein Eco Rlkohäsives Ende (Schema37).

Ligatlon

Es wurden 0,2Mg des geschnittenen pHSAII-Vektors mit 0,1 ug des Fragmentes HSAIII in 100μΙ Ligase-Puffer gemischt, und es wurden 80 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 14 Stunden lang bei 15°C gehalten, anschließend wurde es in JM101-E. coli-Zellen transformiert. Etwa 50% der ampizillinresistenten Kolonien wiesen Hybridisierung mit der 5'-³²P-HSA11 -Oligonukleotidsonde auf. Die aus 8 positiven Klonen hergestellten Plasmid-DNA wurden unter Verwendung eines synthetischen Starters, der komplementär mit einem Teil des Oligcöukleotids von HSA (zwischen dos Nukleotidpositionen 508 und 527 des reifen HSA-Gens) ist, sequenziert, und alle acht wiesen die ; ίr:h11gο Sequenz am Verbindungspunkt der großen Fragmente HSAII und HSAIII auf.

Schema 37

Söu3A1

Sau3Al

MCS (

II

EcoRI

4-+

1 ) Apa I

2) Klenow pol.+dNTP

3) EcoRI

4) isolation of linear vector

blunt end__EcoRIII t k

PamHI Kpnl

¹"-S. Γ

—— ί—t

blunt end \

Apal

III

Γ"

EcoRI

1) Kpnl

2) Klenow pol .+dNTP

3) EcoRI

4) isolation of small fragment

Apal

EcoRI

Sau3Al

MCST

II

Apal J

—H

ρΗ.?Λ( ! I- ! I !)

MCS: Mehrfechklonierungsstelle, von pUC 19 abgeleitet, enthält die Stellen, die sich flußaufwärts der Pstl-Stelle, einschließlich der Pst I-St-..

befinden.

4) Isolierung des linearen Vektors 4) Isolierung des kleinen Fragm&nts

Blunt End -Glattes Ende

ro oo ro

pHSA (IV-V)

In diesem Fall diente pHSA V als Vektor zum Klonieren de: ^r ragments KSAIV (Schema 18).

Vorbereitung des HSA IV-Fragmentes

Es wurden 2 μρvon pHSA IV mit 10 Einheiten von Apa I in 50 μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt bei 37⁰C für die Dauer von zwei Stunden behandelt. Der lineare Vektor wurde mit Ethanol aurgefällt, und das Pellet wurde in 50μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mMdNTPenthielt, und bei Zimmertemperatur wurden über 10min 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase zugesetzt. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wurde das Pellet in 50^ο0μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt aufgelöst, es wurden 40 Einheiten Pst I zugesetzt, und das Gemisch wurde zwei Stunden bei 37 ⁰C gehalten. Nach der Ausfüllung mit Ethanol wurde das kleine Fragment, das die HSA IV-Sequenz enthält, durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung, gereinigt. Das kleine Fragment hat ein Pstl-kohäsives Ende und ein glattes Ende (Schema 38).

Schneiden des pHSA V-Vektor»

Es wurden 2 pg von pHSA V mit 10 Einheiten von Kpn I in 50 μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt bei 37 ⁰C vier Stunden lang behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50 μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1mM dNTP und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase enthielt, und wurde 10min lang bei Zimmertemperatur gehalten. Nach der Extrakktion mit Phenol und der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50 μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt auflöst, und es wurden 40 Einheiten Pst I zugesetzt. Das Gemisch wurde vier Stunden lang bei 37⁰C gehalten. Nach der Ausfällung mii EÜtanol wirde der lineare Vektor durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung, gereinigt. Der so gewonnene geschnittene pHSA V-Vektor hat ein Pstl-kohäsives Ende und ein glattes Ende (Schema 38).

Ligation

Etwa 0,1 μg linearisierter pHSA V-Vektor und 0,05 μg eines HSA IV-enthaltenden Fragments wurden mit 80 Einheiten T4-DNA-Ligase in 10μΙ Puffer bei 15°C für die Dauer von vier Stunden behandelt. Nach derTransformation in JM101-E. coli-Zellen wurden die ampizillintestistente Kolonien mit einer 5'-³²P-HSA 16-Oligonkleotidsonde getestet, und etwa 40% erweisen sich als positiv. Acht Kolonien wurden zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet, sie wurden mit einem synthetischen Starter sequenziert, der mit einem Teil des HSA 19-Oligonukleotids (Nukleotidpositionen 1374-1393 im reifen HSA-Gen) komplementär ist, davon wiesen sieben die korrekte Sequenz am Verbindungspunkt zwischen den HSAIV- und HSA V-Bereichen auf.

Schema 38. Verbindung von HSAIV und HSA V

Pstl Kpnl "ΑρΛΐ

I

pHSA

BamHl

Pstl Kpnl

1

ι

BamHI

Pstl Kpnl

J J

J—t-H

Apa I

pHSA V

J Γ

EcoRI

1) Apal

2) Klenow pol.+dNTP

3) Pstl

4) isolation of small fragment

IV

blunt end

Bf TiHI

Pstl blunt end·'

"M DNi Ii aase

Ps 11 Kpnl

Apa I

ι I

-f—M-

IV

EanH I

SA f IV-Vi

4) Isolierung des kleinen Fr*.-mems Blunt end -Glattes Ende

1) Kpnl

2) Kl enow pci.+dNTP

3) Pstl

4) isolation of linear vector

Ppa.I . EcoPI

—H-

EcoRI

4) Isolierung des linearen Vektors

pHSA (IV-V) mit Apa I-Sac I-Eco Rl-Adapter (pHSA [IV-v'J-ASE)

pHSA (IV-V), das in der vorstehend beschriebenen Weise gewonnen wurde, enthält Adapter 1 flußabwärts des HSA-Kodierungsbereiches. Das Klonieren des HSA-Gens in den E.coli-Teil (ρΡΤ2ΗΝΊ) des E.coli-Hefe-Schüttelvektors verlangt eine flußabwärts gelegene Sac I-Stelle, deshalb muß diese Stelle irgendwie eingeführt werden. Es erscheint vorteilhaft, sie an dieser Stelle des Gen Zusammenbaus einzufügen.

Die offensichtlichste Möglichkeit, zu einer Sac I-Stelle zu kommen, scheint der Ersatz des Apa I-Eco Rl-Adapters 1 durch einen ähnlichen Adapter mit einer internen Sac I-Stelle zu sein (Adapter 3, siehe Schema 3).

DerHSAiiV-VJ-BereichwurdeauspHSAdV-VJalseiriPstl-Apal-FragmentisoliertundzusammenmitAdapterSIApal-Sacl-Eco Rl-Adapter) in das mit Pst I-Eco F)I geschnittene pUC 19 Moniert.

Isolierung des Fragmentes HSA (IV-V)

Es wurden 2 Mg pHSA (IV-V) mit 20 Einheiten Apa I in 50μΙ eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt bei 37"C drei Stunden lang behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50 μΙ eines Puffers mit hohem Salzgehalt augelöst, und es wurden 20 Einheiten Pst I zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei 37⁰C gehalten. Das Fragment HSA (IV-V) wurde durch Gel-Elektrophorese auf einem 2%igun Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung, gereinigt.

Llgation (Schema 39)

Es wurden 0,1 pg von Pst I-Eco Rl-geschnittenem pUC19 mit 0,05pg Apa I-Eco RI-HSA (IV-V)-Fragment und mit 5-5pMol von 5'-phosphorylierten Adapter-3-Oligonukleotiden in 20μΙ Ligisepuffer gemischt. Es wurden 80 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt und das Gemisch 14 Stunden lang bei 15⁰C gehalten. Nach der Transformation wurden ampizillinresistente Kolonien einem Screening auf zwei verschiedenen Replika-Platten mit der 5'-³²P-HSA 16-Oligonukleotidsonde oder mit einer 5'-³²P-Adapter 3-Niedrigstrangoligonukleotidsonde unterzogen.

Etwa 50% der Kolonien wiese eine Hybridisierung mit beiden Sonden auf. Positive Kolonien wurden zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet, und die Sequenzierung erfolgte sowohl mit dem reversen Starter als auch mit dem pKO-Starter I. Alle zehn Sequenzierung überprüften Klone erwiesen sich als korrekt.

Nachfolgend wird dieses pHSA (IV-V), das durch Einführung von Adapter 3 eine flußabwärts gelegene Sac I-Stelle aufweist, für die weiteren Schritte beim Zusammenbau des HSA-Gens verwendet.

ο·\

	U
M	ρ
«
O
U	Ό
W	Φ
I	>
M	(Π
4J	QJ
ω	γ-Ι
α,	υ

V-I OJ

ω'

ο υ

U) Ot-T-

(Λ

Q.

- υ m αϊ

QJ_ ω

rj (Λ

U)

C/)

Π3

UI

ca

a: ο

O.

α α

OC O

α.

pHSA (IV-V)

In diesem Fall diente pHSA (ll-lll) als Vektor zum Klonierren des Fragmentes HSA (IV-V) (Schema 40).

Schneiden des Vektors pHSA (IMII'

Es werden 2pg von pHSA (ll-lll) mit 40 Einheiten von Apa I in 50μΙ einer Pufferlösung mit niedi igem Salzgehalt bei 37⁰C fünf Stunden lang behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mM dNTP enthielt, und es wurden 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase zugesetzt. Das Gemisch wurde 10min lang bei Zimmertemperatur gehalten, dann wurde es mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgofällt. Das Pellet wurde in 50 μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt aufgelöst, und es wurden 20 Einheiten von Eco Rl zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 37°C 5 Stunden lang gehalten, dann wurde dor lineare Vektor durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von dem Elektroeluieren, isoliert.

Isolierung des Fragments HSA (IV-V)

Es wurden 2 \ig von pHSA (IV-V) in 50 μΙ Puffer mit niedrigem Salzgehalt aufgelöst und bei 37⁰C 5 Stunden lang mit 20 Einheiten Kpn I behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mM dNTP und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase enthielt. Das Gemisch wurde 10min lang bei Zimmertemperatur gehalten, dann wurde die DNA ausgefällt und in 50μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt aufgelöst und 20 Einheiten von Eco Rl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde fünf Stunden bei 37⁰C gehalten, dann wurde ein kleines Fragment, das den HSA (IV-V)-Bereich enthielt, durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt vom Elektroeluierren, isoliert.

Ligation

Etwa 0,1 μg linearisierter pHSA (IMII)-Vektor und 0,05 μρ des HSA (IV-V)-enthaltenden Fragments wurden in 10μΙ Ligasepuffer gemischt, der 80' inheiten T4-DNA-Ligase enthielt, und das Gemisch wurde 7 Stunden bei 15°C gehalten. Nach der Transformation in JM101-E.coli-Zellen wurdon ompizillinresistente Kolonien durch Hybridisierung mit einer 5'-³²P-HSA 21 Oligonukleotidsonde getestet, und etwa 40% der Kolonien erwiesen sich als positiv. Acht Kolonien wurden zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet, sie wurde unter Verwendung von 5'-³²P-HSA11 -Oligonukleotid als Sequenzierungsstarter sequenziert.

Alle acht hatten den richtigen Verbindungspunkt zwischen den HSA III- und HSA IV-Bereichen.

Der gesamte HSA (ll-V)-enthaltende Bereich von pHSA (H-V) wurde durch Sequenzierung auf Plasmidmalrize (pKO-Starter I und HSA1 - 8-Starter wurden verwendet) überprüft, und es wurde kein Fehler festgestellt.

Schema 40

Hindi	1	I böüj^	ll	II	1	l·	Apa I	. , Ape I	EcoRI
\					2		... \	., Kl enow poly	\
		i			3		*	. , EcoP.I	i
		Pstl		I-III)	1			inear vector i
		pKSA	I
					Blunt enα	r.erase + dN"
					MI ·
						solati on
				I
Hindi	II Sa^:	JA	II •	EcoRI
ν	J			f
				I

Ps ti

-L-A Kpnl

•pa: £coR:

IV

Samhl

pHSA(IV-V)

Slur.·: end

» IV

ι ~ ο

NA 1 -Ir-se

Sc c I

1., Kpnl

2., Kler.ov.· pc lyr.orase-i-ir.

3., hcoRI

srria 11 fr = c~er.t isolation

Apal EcoF.I

Hinein

II

Pstl

linear vector isolation - Isolierung des linearen Vektors Samll fragment isolation - Isolierung des kleinen Fragments Blunt end - glattes Ende

sa;ii-v;

Apal ice?.!

N) CO M

pHSA-Vektoren (Nr. 1, Nr.2)

Das Fragment HSA (Il—V) wurde mit dem Fragment HSA I durch Klonieren dieser beiden Fragmente in den pUC19-Vektor ergänzt

(Schema 14).

HSA (Il—V) könnte direkt als Fragment Sau 3AI-Eco Rl isoliert werden, das sich im Gen eine einzigartige Stelle Sau 3Al befindet.

Der pUC19-Vektorteil aber enthält zahlreiche Sau 3AI-Stellen, was die Restriktionsverdauung und die Fragmenttrennung erschwert. Zuerst wurde daher HSA (H-V) in einem Fragment Hind Ill-Eco Rl isoliert, was die weitere Sau 3AI-Behandlung

verkürzte.

Es wurden 5pg HSA (H-V) in 100μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt mit 40 Einleiten Hind III und 40 Einheiten Eco Rl bei 37⁰C drei Stunden lang behandelt. Das Gemisch wurde auf ein 0,5%iges Agarose-Gei (TAE-Puffer) aufgebracht, und nach der Elektrophorese erhielt man zwei Fragmente. Das kleinere Fragment wurde elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt.

Das Pellet wurde in 50μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt aufgelöst und mit 7,5 Einheiten Sau 3Al bei 37⁰C 14 Stunden lang behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert (2x), mit Ethanol ausgefällt, so daß in diesem Fall das große

Sau 3AI-ECO Rl-Fragment nicht durch Gel-Elektrophorese gereinigt wurde.

Es wurden zwei getrennte Ligationen aufgestellt, die jeweils den mit Pst I-Eco Rl-geschnittenen pUC19-Klonierungsvektor und das Sau 3AI-Eco RI-HSA (Il-V)-Fragment enthielten, sowie eines der beiden HSA I-Fragmente (als ein Gemisch von zwei

Oligonukleotiden, die einen Pst I-Sau 3AI-Adapter bilden).

Es wurden 0,2Mg des mit Pst I-Eco Ri-geschnittenen pUC19 und 0,1 yg des Fragmentes Sau 3AI-Eco Rl HSA (H-V) mit 5-5pMol von 5'phosphoryliertem HSAI Nr. 1 oder HSAI Nr.2 (Schema 4) in zwei getrennten Reaktionsgemische^ die 10μΙ Ligasepuffor enthielten, gemischt. Beiden Reaktionsgemischen wurden 80 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt, sie wurden 6 Stunden lang bei 15⁰C gehalten, dann in JM1U1-E. coli-Zellen transformiert. Die transformierten Gemische wurden auf LB-Ampizil'in-Platten plattiert. Kolonien wurden auf Nitrozellulosefilter doppeltrepliziert (2) und mit der 5'-³²P-HSA 5-Oligonukleotidsonde (erster Filtej) und mit der entsprechenden 5'-³²P-HSA I-Oligonukleotidsonde (zweiter Filter) hybridisiert. Etwa 80% der Kolonien wiesen Hybridisierung mit beiden Sonden in beiden Fällen auf. Plasmid-DNA wurde aus 4-4 Klonen der beiden Konstruktionen hergestellt, jnd sie wurde unter Anwendung des reversen Starters sequenziert, um die richtige Einfügung der HSA I-Versionen

In die pHSA-Vektoren zu überprüfen. Alle sequenzierten Konstruktionen waren korrekt.

Die gesamten HSAKodierungsbereiche von pHSA Nr. 1 und Nr. 2 wurden als Pst I-Eco Rl-Fragmente in die Phagvektoren M13mp18 und mp19 subkloniert, und die gesamte Sequenz wurde in mp19 unter Anwendung des 17mer Starters und des HSA

1-9-Starters geprüft. Die mp18-Konstruktionen wurden nur mit dem 17mer Starter geprüft.

Schema 41

Pstl

fco» I

-I ,

pi JCl

I¹SlI

I¹BU-I colll

j.

-I I-

ll'ntl III ίιλΐι3ΛΙ

Αρη I ^Γ·χ·Ι

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Isolate small fragment - Kleines Fragment isolieren

Die Kcnstruk tion des E. coli-Plasmlds mit der Hefepromoter- und den Tormlnatorsequenzen

1. Der Klonierungsausgangsvektor (pGB1, Abb. 1) wurde durch Modifikation des Plasmids pBR327 gewonnen (Soberon, X„ Covarrubias, L. und Bilivar, F. [1980]: Gene 9,287-305), aus dem die Stellen Pst I und Hind Il aus dem Ap*-l'.oi eich durch EMS- und HA-Mutagenese und wiederholte Restriktionsenzymverdauung ausgeschaltet wurden. Die Bedingungen für die Mutagenese wären die gleichen wie sie bei Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics (Experimente in der Molekulargenetik), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., beschrieben wurden.

Die Xho I-Stelle wurde als ein CCTCGAGG-Linker eingeführt, der an der einzigartigen (aufgefüllten) Ava I-Stelle eingefügt wurde.

2. Das Plasmid pGB2(HIS3):

Das 1327 bp-Fragment Barn Hl-Xho I, welches das gesamte klonk. ιύ ί iib3-Gen von Saccoromycas cerevisiae enthält (Storms, R.K., McNeil, J.B., Khandekar, P.S., An, G., Parker, J. und Friesen, J.D. [1979], J.Bacteriol. 140,73-82; und Struhl, K. [1985], Nucleic Acids Res. 13,8587-8601); wurde aus pYF92 ausgeschnitten (Stroms u.a., ebenda) (erhalten von Gyorgy B. Kiss, Institut für Genetik, Biologisches Forschungszentrum der ungarischen Akademie der Wissenschaften, Szeged, Ungarn) und als den eindeutigen Bam Hl- und Xho I-Stellen von pGB1 eingefügt, was zu pGB2 (HIS3) führt (Abb. 2).

3. Das Plasmid pGB3-229T, das den Transkriptionalterminatorbereich des Hefe-HIS3-Gens enthält.

Das Fragment Eco Rl-Kpn I von pGB2 (HIS3) wurde durch die 1327 bp-Tc®-Patrone (Eco Rl-Kpn I) von Plasmid pJDR158 ersetzt (Davison, J., Heustersprute, M., Merchez, M. und Brunei, E. [1984], Gene 28,311-318) (erhalten von John Davison, Unit of Molecular Biology, International Institute of Cellular and Molec jlar Pathology, 75, Avenue Hippocrate, B-1200 Brüssel, Belgien). Das Plasmid pGB3-229T enthält - neben der Ap*+ori-Patrone - das gesamte Tc®-Gen (mit einer zusätzlichen Sac I-Stelle am 3'-Ende) und den Transkriptionsterminatorbereich des HIS3-Gens (Abb.3a). Das pGB-229T wurde weiter modifiziert durch 1) Deletion der Kpn I-Stelle in pGB-229T, um pG83-229TK° (Abb.3 b) zu erhalten, und 2) Insertion von Promoterfragment Hind Ill-Sal I aus pUC18V622PH (von Abb.5), was zu pPT2HK, führt (Abb.3c).

4. Klonierung des Promoterbereichs von PHO5-Gen von Saccharomyces cerevisiae.

Das Gen PHO5 kodiert ein repressierbares Säurephosphataseexoenzym (orthophosphorische Monoesterphosphahydrolase [Säureoptimum], EC 3.1.3.2). Es ist Teil eines 8kb-Eco Rl-genomischen DNA-Fragments (Kramer, R. A., Andersen, N. [1980], Proc.Natl.Acad.Sci.USA??, 6541-6545, und Rogers, D.T., Lemire, J.M. und Bostian, K.A. [1982], Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, 2157-2161).

Um das Plasmid zu erhalten, das das PHO5-Gen aufweist (Davison u.a., ebenda), wurde eine Hefe-Gen-Bank (eine Cosmid-Bibliothek, die aus der genomischen DNA von S. cerevisia konstruiert wurde, das von Z. Feher, Debrecen Medical University, Debrecen, Ungarn, bezogen wurde) folgendermaßen gesichtet: ein Gemisch der rekombinanten Cosmid-DNA wurde mit Eco Rl verdaut. Aus Agarose-Gels wurden Eco Rl-Fragmente zu 8kb isoliert und an der Eco Rl-Stelle des Plasmids pGB2 (HIS3) rekloniert. Das das PHO5-Gen enthaltende Plasmid (pGB2 (HIS3, PHO5, PHO3) (Abb.4) wurde dann auf der Basis der Komplementierung der pho5-Muiation in den Hefesträngen DB-4 ausgewählt (Rogers u.a., ebenda) und AH220 (a, trpl, leu2-3,2-112, his3-11,3-15, pho5, pho3), bereitgestellt von A. Hinnen, CIBA-GEIGY, Basel; siehe Tait-Kamradt, A.G. Turner, K.J., Kramer, R. A., Elliott, Q. D., Bostian, S. J., Thill, G. P., Rogers, D.T. und Bostion K. [1986], Molec. anfi Cell Biol. 6,1855-1865).

5. Subklonierungdes PHOö-Gen-Promoterbereiches.

Der Promoter des repressierbaren sauren Phosphatasegens (PHO5) kann aus dem Plasmid pGB2 (HIS3, PHO5, PHO3) durch Restriktionsenzymverdauung mit Bam Hl + Sal I als ein 623-bp-Fragment herausgeschnitten werden (Meyhack, B., Bajwa, W., Rudolph, H. und Hinnen, A. [1982], EMBO J. 1,675-680). Dieses wurde an den Barn Hl-Sall-Stellen in pUC18 rekloniert, wodurch sich das Plasmid pUC18/623P (Abb. 5a) ergibt, in welchem die Sequenz der Einfügung durch Sequenzierung bestätigt und mit der aus der bekannten Literatur verglichen wurde (Meyhack, u. a., ebenda, und Arima, K., Oshima, T., Kubota, I., Nakamura, N., Mizunaga, T. undToh-e, A. [1983], Nucleic Acids Res. 11,1657-1672).

Das Bam HI-SaI I Fragment (623 bp) im pUC18/623P-Plasmid enthält die flußaufwärts gelegenen Aktivierungssequenzen von PHO5 und einen Teil der Kodierungssequenz (welche das N-Terminal-17-Aminosäuresekretionssignalpeptid und 10 weitere Aminosäuren vom N-Ende des reifen Genproduktes enthält).

Die Primärstruktur des Sekretionssignalkodierungsbereiches des PHO5-Gens lautet:

Met Phe Lys Ser VaI VaI Tyr Ser He Leu ^PROMOTER - ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA Bam HI

Ala AIa Ser Leu AIa Aan Ala GIy Thr GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA GGT ACC

Ball

Signalende

In dieser Struktur könnte die Kpn I-Stelle, die flußabwärts des „Signalend"-Kodons AIa liegt, als Klonierungsstelle (durch Kpn I, gefolgt vom Trimmen der 3'-überstehenden Sequenz, zu einem glatten Ende gemacht) für das HSA-Kodierungsgen verwendet werden, wenn sie um eine Base in die 5'-Richtung verschoben würde.

In pUC18/623P könnte die oben genannte Kpn I-Stelle nicht manipuliert werden, wenn nicht die flußaufwärts gelegene Kpn I-Stelle (x, Abb. 5a) aus dem Plasmid deletiert worden wäre. Das Plasmid wurde daher mit Sac I und Gam Hl geschnitten, gefolgt von der Schaffung glatter Enden durch Entfernung der überstehenden 3'-Terminalnukleotide vom Sac I-Ende und Füllen des Barn HI-Endes mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment und Nukleotidtriphosphaten (Schritt 1 in Abb.5). Nach der Re-Ligation und der Transformation, die zum Plasmid pUC18*/623P (Abb. 5b) führte, wurde die Barn HI-Stelle wiederhergestellt, und die Kpn I-Stelle flußabwärts vom „Signalend"-Kodon wurde eindeutig und damit für die weitere Manipulation und die In-vitro-Mutagenese (siehe unten) geeignet.

6. In vitro-Mutagenese der „Signalend"-Stelle:

Eine Ein-Basen-Verschiebung der Kpn I-Stelle zur Schaffung einer Spleißstelle, die mit dem „Signs!end"-Kodon (AIa) „ in Phase"

Um das 5'-glatte Ende des HSA-Gens mit der PHO5-Signalkodierungssequ9nz in der korrekten Phase ligieren zu können, muß die Kpn I-Stelle um eine Base in der 5'-Richtung verschoben werden. Es wurde festgestellt, daß die Deletierung des Adenosinrestes

(A) flußaufwärts der Kpn I-Stelle keinerlei Veränderungen in der Natur der kodierten Aminosäuren innerhalb der Signalsequenz herbeiführte:

Ser Leu AIa Asn Ala GIy Thr

TCT TTG GCC AAT GCA GGT ACC A...

WH K

WH.

Signalende

Ser Leu Ala Asn Ala VaI

TCT TTG GCC AAT GCG GTA CCA...

EaIl KpHT

Dsa Schneiden der modifizierten Sequenz mit Kpn I und das anschließende Entfernen der überstehenden GTAC-3'-Nukleotide mit dem DNA-Polymerase l-Klenow-Fragment-+dNTP erzeugt ein glattes Ende, an welchem die Kpn I-Stelle in exakter Übereinstimmung mit der Position des „Signalend"-Kodons (GCG) ist

Um die oben genannte strukturelle Änderung zu erreichen, wurde

das CCAAOTGCAGGTAC-Fragment von pUC18V623P GGTTACGTC das sich zwischen den

BaI I- und Kpn (-Stellen befindet, ersetzt durch einen synthetischen Linker CCAATGCGGTAC was zum Plasmid pUC18V622P

GGTTACGC führt. Der Austausch

wurde durch Sequenzierung bestätigt (Schritt 2 in Abb. 5).

Für weitere Klonierungszwecke wurde auch die Eco Rl-Stelle (flußaufwärts von PHO5-Promoter) durch eine neue Hind Ill-Stelle ersetzt durch Einfügen eines Hind Ill-Linkers (CAAGCTTG) an der aufgefüllten Eco Rl-Stelle (Schritt 3 in Abb. 5). Diese neue Konstruktion wurde als pUC18V622 PH bezeichnet (Abb. 5c).

7. Konstruktion von Plasmid pPT2HKi, ds die Hefeexpressionskassette enthält:

Das Plasmid pGB-229T (Abb.3) enthält eine Sac I- (SSt I-) und eine Kpn I-Stelle flLßaufwärts von Gen Tc*. Durch Einfügen von dem PHOß-Promoterbereich (an den eindeutigen Hind III- und SaI I-Stellen von pUC18*/ J22PH) würde die Kpn I-Stelle von pGB-229T überflüssig, folglich wurde die Kpn I-Stelle aus pGB3-223T durch Kpn I-Verdauung und Entfernung des überstehenden 3'-Endes durch Klenow-Polymerase-t-dNTP, Religation der glatten Enden und Transformation deletiert. Das neue Plasmid (pGB3-229TK°) (Abb.3), dem die Kpn I-Stelle fehlt, wurde mit Hind III und Sal I geschnitten, und das Hind IH-SaI I-Fragment von pUC18V622PH (welches die modifizierte ΡΗΟδ-Promoter- und Signalsequenz enthält) wurde eihkloniert, wodurch ein \etracyclin-sensitives Plasmid pPT2HK1 entstand (Abbildungen 3 und 6), das eine funktionell Hefeexpressionskassette trägt, di'e aus dem in-vitro-mutagenisierten PH05-Promoter- und Signalkodierungsbereich und dem Transkriptionsterminator des HIS3-Gens besteht.

8. Die Konstruktion des E. coli-Hefe-Schaukelvektorplasmids pBY200

Berücksichtigt werden müssen folgende Hauptpunkte:

- Nutzung der nützlichen Eigenschaften des „klassischen" E.coli-S. cerevisiae-Schaukelvektorplasmids pJDB207 (Beggs, J. D. (1981), Multiple-copy yeast plasmid vectors (Mehrfachkopie-Hefeplasmidvektoren). Von Wettstein, D., Friis, J., Kielland-Bradt, M. und Stenderup, A. [Hsg.], Molecular genetics in Yeast [Molekulargenetik in Hefe]. Alfred Benzon Symposium Bd. 16, 383-390), d. h., 1) relativ geringe Größe» im Vergleich zu vielen anderen Hefeklonierungsvektoren; 2) Replikation des Plasmids in Hefewirtszellen in großer Kopienzahl; 3) stabile Selektion der plasmidhaltigen Hefezellen (des Phenotyps leu 2) auf Grund des Vorhandenseins des LEU2-selektiven Markergens, wodurch 4) auch die Möglichkeit der direkten Selektion in leuB-E.coli-Wirten besteht;

- Enthaltung geeigneter Restriktionsenzymerkennungsstellen, die es mit dem E. coli-Plasmid pPT2HK1 kompatibel machen, welches die Hefeexpressionskassette (siehe oben) tregt, und mit dessen ^rPkombinanten Derivaten.

Das Plasmid pBY200 wurde durch zwei Klonierungsschritte hergestellt'' \ib.7):

1. f infügung der Patrone „LEU2 + 2μοπ" (ein3,4kb-Eco Rl-Fragment, das durch partielle Eco Rl-Verdauung vonpJDB207 (Beggs u. a., ebenda) gewonnen wurde, in die Eco Rl-Stelle von pBG1;

2. Auffüllen mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment (gefolgt von der Religation der glatten Enden) an derXba I-Stelle im „2 μ ori"-Bereich. Diese Modifikation hat keine Wirkung auf die Fähigkeit des Plasmids, sich in S. cerevisiaezu replizieren. Klonierung der HSA-Gene (Nr. 1, Nr.2) in den pPT2HK,-E. coli-Vektor

Der pPT2HK_rE. coli-Vektor wird in den Abbildungen 3 und 6 gezeigt, ebenso dessen modifizierter Signalsequenzbereich. Seine Hauptmerkmale vom Standpunkt der HSA-Ger.klonierung bestehen darin, daß es den HefePHOö-Promoter und die PHO5-Signalsequenz sowie einen Hefetranskriptionsterminator (HIS3) enthält. Die Promoter-Signalsequenz- und Terminatorbereiche sind durch eindeutige Restriktionsstellen getrennt, so daß das HSA-Kodierungsgensegment (strukturelles HSA-Gen) zwischen diesen beiden Bereichen eingefügt werden kann

Im pPT2HK|-Vektor sind die Restriktionsstellen, die zum Einfügen des HSA-Gens genutzt werden, die Kpn I- und die Sac I-Stelle.

-67- 232 473

Die Kpn I-Stelle am Ende der Signalsequenz (Führungspeptidkodierungsbereich) wurde vorher von den Autoren verlagert, so daß nach dem Kpn I-Schneiden, gefolgt vom Trimmen des resultierenden 3'-üborstehenden Bereichs, ein glattes Ende gebildet wurde, und dieses glatte Ende fällt exakt mit dem Ende des Führungspeptidkodierungsbereiches zusammen (Schema 24). Die Sac I-Stelle befindet sich flußaufwärts des HIS3-Terminatorbereiches, und die Sac I-Schneidung wird nach dem Schneiden von Kpn I und der Bildung des glatten Endes durchgeführt.

Schneiden von pPT2HK₁

Es wurden 2 μg pPT2HK, mit 20 Einheiten Kpn lin 50μΙ Puffer mit niedrigem Salzgehalt bei 37⁰C 2 Stunden lang behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50 μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 mM dNTP und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase enthielt, und das Reaktionsgemisch wurde 10min lang bei Zimmertemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in 50μΙ Puffer mit niedrigem Salzgehalt aufgelöst, und es wurden 20 Einheiten Sac I zugesetzt, gefolgt von der Inkubation bei 37⁰C für die Daue;· von fünf Stunden. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das große Vektorfragment durch Elektrophorese, auf einem 0,5%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung, isoliert.

Schneiden von pHSA Nr. 1 zum Schaffen von Fragment HSA Nr. 1

Fs wurden 2MgpHSANr. 1 in 50μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt aufgelöst und mit 20 Einheiten Pst I bei37°C2 Stunden lang behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50μΙ Klenow-Puffer aufodiöst, der 0,1 mM dNTP und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase enthielt, und das Reaktionsgemisch wurde 10min bei Zimmertemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in 50μΙ Puffer mit niedrigem Salzgehalt aufgelöst, und es wurden 20 Einheiten Sac I zugesetzt. Das Gemisch wurde fünf Stunden lang bei 37⁰C gehalten, anschließend auf ein 0,5%iges Agarose-Gel (TAE-Puffer) gebracht. Das kleinere Fragment wurde nach Elektrophorese, gefolgt von Elektroeluieiung, isoliert.

Schneiden von pHSA Nr.2 zur Schaffung des Fragments HSA Nr.2

pHSA Nr. 2 wurde neu aus einem Stamm dam¹"¹ E. coli isoliert, um mit dem BcI I-Enzym arbeiten zu können, das sensitiv für die Adeninmethylierung ist.

Es wurden 2μg pHSA Nr.2 in 50μΙ Puffer aufgelöst, der 75mM KCI, 6mM Tris-HCI, pH-Wert 7,4,1OmM MgCI₂ und 1 mM DTT enthielt, und mit 20 Einheiten BcI I bei 50⁰C fünf Stunden lang behandelt. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50μΙ von Mung-Bohnen-Nukleasepufferaufgelöst und 10 Einheiten Mung-Bohnen-Nuklease bei 37 "C über die Dauer von 30min zugesetzt. Nach der Extraktion mit Phenol und der Ausfällung mit Ethanol wurde das Pellet in 50μΙ Puffer mit niedrigem Salzgehalt aufgelöst, und es wurden 20 Einheiten Sac I zugesetzt.

Das Gemisch wurde fünf Stunden lang bei 37⁰C gehalten. Das kleinere Fragment, welches HSA Nr. 2 enthielt, wurde auf die gleiche Weise isoliert, wie das für HSA Nr. 1 beschrieben wurde.

Ligationen

Es wurden 0,1 μg von geschnittenem pPT2HK, und 0,2 μg des Fragmentes HSA Nr. 1 oder HSA Nr. 2 in 10μΙ Liyasepuffer gemischt, und es wurden 80 Einheiten T4-DNA-Ligasn zugesetzt. Die Reaktionsgemische wurden 15 Stunden lang bei 15°C gehalten, dann wurden sie in JM101 -E. coli-Zellen transformiert, gefolgt von der Plattierung auf LB-Ampizillinplatten. Kolonien wurden durch Hybridisierung mit einer 5'-³²P-HSA 5-Cligonukleotidsonde getestet, und etwa 10% erwiesen sich als positiv. Von 5-5-Rekombinanten wurde Plasmid-DNA hergestellt, und sie wurde unter Anwendung von HSA-Starter 9 sequenziert. Die richtige Verbindung der PHO5-Führungssequenz und dar HSA-Kodierungssequenz wurde in 2 Fällen für HSA Nr. 1 und in 3 Fällen für HSA Nr. 2 erzielt. Diese Plasmide werden als pPT2/HSA Nr. 1 bzw. pPT2/HSA Nr. 2 bezeichnet.

Bei diesen Konstruktionen wird das HSA-Gen in ein E. coli-Plasmid zwischen eine Hefepromotor-'und Signalsequenz und einen Hefetranskriptionsterminator Moniert. Beim nächsten Schritt sollte diese „HSA-Expressionspntrone" in einen E. coli-Hefe-Schaukelvektor übertragen werden.

Schema 42

PHO-5 promoter * leader peptide coding region

Pstl HSA

CTGCAGACGCT ββ"

Apal EcoRI

4- I

Sacl

W\

terminator

pHSA No 1

s~- TTGGCC A A TGCGGT ACC f—L

Sacl pPT2HK

1). Pstl

2). Klenow polymerase +CNTP

3). Sacl

Apal

Asp Ala HSA Jiunt-end GACGCT «—····

nature HSA coding region

1). Kpnl

2). Klencw polymerase i-dNTr

3). Sacl

τ terminator -TTGGCCAATGCG j—(

Sacl

Ti DNA ligase

Asp Ala HSA T TGGCC A AT CCGCACSC Τ——·- · '

pPT2/HSA No 1

Sacl

terminator ^ Apal EcoRI

Bell

^ TGATCfiTGGACGCT—a.».wi ^ | t.

pHSA No 2 Sacl

1). Bell

2). Mung bean nuclease

3). Sacl

Met As= Ala πSA Dlunt-end ATGG^CCCT—»♦»

coding region

t Sacl

Ti DNA ligase

' '·:: Asp Ala HSA TTGCCCAATGCGATGGACGCT in '

Sacl

pPT2/HSA No 2

termina tor

/ snows the putative peptide processing site

PHO5 promoter+ leader peptide - PHOS-Promoter-undFührungspeptidkodierungsbeteich

coding region

Mungbeannuclease - Mung-Bohnen-Nuklease

Blunt end - Glattes Ende

Mature HSA coding region - Reifer HiSA-Kodierungsbereich

χ zeigt die putative Peptidverarbeitungsstelle.

Kionlerung der HSA-Expresslonspatrone in pBYZOO und pJDB207

Der Hefe-Ε. coli-Schaukelvektor pBY200 enthält sowohl den Hefe- als auch den E. coli-Replikationsursprung, einen Ap®-Bereich und ainen Leu2-Marker. Dieses Plasmid kann mit den Enzymen Hi.id III und Xho I geschnitten werden, so daß das resultierende große Fragment ane oben genannten Bereiche behä t, und ns kann als Vektor zum Klonleren der HSA-Expressionspatrone dienen, die aus dem Schneiden von pPT2/HSA mit Wind n, jnd Xho I gewonnen wurden (Abb.8).

Schneidern von pBY200

Es wurden 5jjg pBY 200 in 100μΙ Puffer aufgelöst, der 5OmM NaCI, 1OmM Tnx-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ und 2mM DTT (Puffer mit mittlerem Salzgehalt) enthieli, una mit 40 Einheiten Hind III und 60 Einheiten Xho I bei 37⁰C 6 Stunden lang behände t. Das große Fragment wurde durch Gel-Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarose-Gel in TAE-Puffer, gefolgt von der Elektroeluierung, isoliert.

Schneiden von pJDB 207

Ebenso wurde das Hefe-Ε. coM-Schaukelvektorplasmio mit den Restriktionsenzymen Hind III und Sai I unter den gleichen Bedingungen geschnitten, wie sie oben für pBY 200 beschrieben wurden, wobei aber 45 Einheiten Sal I anstelle von Xho I verwendet wurc'en. Das große Vektorfragment (Abb. 8) wurde durch Elektrophorese isoliert und durch Elektroeluierung vom Agarosegel gereinigt.

Schneiden von pPT2/HSA

Es wurden 5μg pPT2/HSA Nr. 1 oder pPT2/HSA Nr. 2 wie oben in 100μΙ Puffer mit mittlerem Salzgehalt aufgelöst und mit den Enzymen Hind III und Xho I behandelt. Das größere Fragment wurde in beiden Fällen durch Elektrophorese auf ainem 0,G%igen Agarose-Gel, gefolgi von der Elektroeluierung, isoliert.

Ligation

Es wurden 0,2pg mit Xh Hind lll-geschnittenes pBY 200 getrennt entweder mit 0,2pg des Xho I-Hind Ill-Fragments von pPT2/HSA Nr. 1 oder mit 0,2 μg des Xho |-Hind HI-Fragments von pPT2/HSA Nr. 2 in 10 μΙ Ligasepuffer gemischt, und beiden Gemischen, die 15 Stunden lang bei 15°Cgehaicen wurden, w'irden 80 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt. Die Reaktionsgemische wurden in gefrorene kompetente C. coli-Zellen (JF 1754) transformiert, gefolgt von der Plattierung auf LB-Ampizillinplatten. Ähnliche Bedingungen wurden für die Ligation des Xho I-Hind HI-Fragmentes von pPT2/HSA Nr. 1 in das mit Hind III- und SaI l-geschnittene pJDB 207 angewenoat.

Selektion und Analyse von pBY2/HSA Nr. 1- und pBY2/HSA Nr.2 Rekombinanten Die auf LBAmpizillinplatten gezogenen Kolonien wurden auf 1) eine Minimalplatte M 9, die 2upg/ml Methionin und 20 pg ie Milliliter Histidin (aber kein Leuzin) enthielt, 2) eine LB-Tetracyclin-Platte und 3) einen Nitrozellulosefilter auf eine Ampiziüon-LB-Platte gebracht. Die auf dem Nitrozellulosefilter gezogenen Kolonien wurden lysiert und mit der ³²P-markierten HSA 6-Oligonukleotidsonde hybridisiert Es wurden positive Kolonien, die auf Platte 2 tetracyclin-sensitiv waren und eine leu-Komplementation auf Platte 1 aufwiesen (d. h., nicht au? Platte 2, wohl aber auf Platte 1 wuchsen), ausgewählt und aus diesen Plasmid-DNA hergestsllt (etwa 20% de: gesamten, auf der LB-Ampizillinplatte gewonnenen Kolonien wiesen den erwarteten Phenotypaufden Platten 1-3 auf). Rekombirant-Plasmid-DNA wurden mit den Gemischen von Xho I und Hind III geschnitten, und das Schneiden wurde durch Elek!rophorese auf einem 0,5%igen Agarose-Gel in TBE-Piiffer überprüft. Nach dieser Doppelschneidung ergaben sowohl pBY2/HSA Nr. 1 als auch p3Y2/HSA Nr. 2 zwei Fragmente, deren Größen der Größe der Ausgangsfragmente pBY 200, pPT2/HSA Nr. 1 bzw. pPT2/HSA Nr. 2 entsprachen. Gleichzeitig führte das Schneiden mit Kpn I in beiden Fällen zu einem linearisierten Vektor. Um die Struktur von pYHSA 221 zu steuern, wurde das Rekombinantplasmid mit Xba I geschnitten, was zwei Fragmente mit Größen ergab, wie sie aus der physikalischen Karte zu erwarten war.

Alle Plasmidkonstruktionen und Klonierungsschritte, die zu den Hefeexpressionsvektoren führen, welche das HSA-Gen enthalten, wurden in der Abb. 9 zusammengefaßt.

Expression des synthetischen HSA-Gens in rekombinanten Hefezellen

Transformation von Hefezellen end Kulturbedingungen für die Induktion des PHO5-Promctors Das synthetische HSA-Gen wurde in einer Reihe von Manipulationen, die oben detailliert beschrieben wurden, unter die Kontrolle des Hefepromotors PHO5 gestellt, wobei diese Manipulationen zur Konstruktion des Hefe-Ε. coli-Schaukelplasmids pBY2/HSA Nr. 1 und pBY2/HSA Nr.2 und von pYHSA 221 (Abb.8) führten. Hefezellen (LL 20; Leu 2-? 112, His 3-11,15; Storm u.a., ebenda) wurden entweder durch die Sphäroplast-PEG-Methode von Beggs, J. D. (Nature 275,104 (1978]) oder durch die Methode von Ito, H. u.a. (J. Bacteriol. 153,163 [1983]) transformiert.

Die rekombinanten Hefezellen wurden auf der Grundlage ihres His"*-, LeiT-hhänotyps ausgewählt und auf das Vorhandensein der transformierenden Plasmide durch erneutes Isolieren dieser Plasmide aus 10-ml-Kulturen nach der Methode von Holm u.a. (Gene 12,169 [1986]) und Analysieren ihrer Struktur durch Schneiden mit Restriktionsenzymen und Elektrophorese auf Agarose-Gel (1 %) getestet. Die rekombinanten Hefezellen enthielten in jedem Fall transformierende Expressionsvektorplasmide in der entsprechenden Größe und Struktur. Diese Zellen wurden in einem YNB-Medium (Difco) gezogen, das 2% Glukose und 0,15% KH2PO4 enthielt bis zu einem OD₆Oo-WeIl von 2,0, geemtet und in ein YNB-Medium mit niedrigem Phosphatgehalt (das 30mg

KH₂PO₄ ;e Liter zur Aktivierung des PH05-Promoters enthält) verdünnt, dann wurden sie erneut über 60 Stunden gezogen, bevor sie geerntet wurden (ODeoo-Wert ~ 2,0). Die Zellen wurden dann mit 0,1 M Na-Phosphatpuffer gewaschen, in einem hundertstel Volumen des gleichen Puffers, der 1 % Triton X-100,0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthielt, wieder zur Suspension gebracht und durch Wirbeln mit Glaskugeln (Sigma, Typ IV, 250-300Mm) gebrochen. Als Alternative dazu wurden die Zellen gewaschen und in 1M Sorbitol wieder zur Suspension gebracht und mit ß-Glukuronidase (Boehringer, 1%iger Lösung) in 10OmM ß-Merkaptoethanol bei 30"C inkubiert, um Protoplasten herzustellen, die dann mit 1 % Triton X-100lysiert wurden. Zellextrakte wuiden durch Zentrifugieren bei 10000 Umdrehungen/min für die Dauer von 15min geklärt, was die sogenannte „periplcsmische Fraktion" ergab, in welcher HSA durch folgende immunologische und elektrophoretisch^ Methoden analysiert und geprüft wurde

ELISA-Mik.otest

Dl-i ELISA-Platten wurdet mit Anti-HSA-Ab (aus Pferdeserum gereinigt, ein Erzeugnis von HUMAN, Ungarn, auf Protein A-bepharose 4ß-Kolonnen) überzogen und mit 0,5% Gelatine (Sigma) gesättigt. In geeigneten Verdünnungen wurden 100μΙ des geklärten Hefezellenextrflktes auf die überzogenen Vertiefungen aufgebracht und eine Stunde lang bei 37 ⁰C inkubiert.

Die HSA-Anti-HSA-Ab-Bindung wurde durch eine he > ömmliche Farbreaktion unter Verwendung des biotinylierten Meerrettichperoxidase-Streptavidin-Komplexes, H₂O₂ als Substrat und Ortho-Phenylendiamin als Entwickler überwacht.

Serienverdünnungen von 2pg bis 15pg an gereinigter HSA (Reanal, Ungarn) je Vertiefung wurden zur Eichung als Referenz verwendet. Eine tausendfache Verdünnung des menschlichen Serums wurde als positive Kontrolle verwendet, gelatineüberzogene Vertiefungen sowie Extrakte von nichtrekombinanten Hefezellen (LL 20, wie für die HSA-Analyse bearbeitet) dienten als negative Kontrollen bei den ELISA-Mikrotests. Die Farbreaktionen wurden in einem Mikroplattenlesegerät der Cambridge Life Sciences Ltd., Großbritannien, ausgewertet.

Immunoausfällung von ^lsS-methlonlnmarkierten Proteinen

Die Ganzzellenproteine der rekombinanten Hefezellen wurden 16 Stunden lang bei 30⁰C mit ³⁶S-Methionin markiert, wozu die Hefezellen in einem YNB-Medium mit „niedrigem Methionin-, niedrigem Phosphatgehalt", das 40μ0ί an ³⁶S-Methionin je Milliliter enthielt, kultiviert wurden.

Zu 10⁸-Zelläquivalenten von geklärten Zellysaten (0,5ml) wurden 20pl-Pferde Anti-HSA-Serum über die Dauer von 90 Minuten bei 4 ⁰C in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 8,0, gegeben. Die Immunoausfällungen wurden au' 1 ml Protein A-Sepharose (Pharmacia) über 90 Minuten bei 4°C adsorbiert und gewaschen. Immunoausgefällte Proteir.e wurden aus Protein A-Sepharose-Kugeln (Conner, G.E. u.a., J. Exp. Med. 156,1475,1982) eluiert und auf einem 15%igen SDS-Polyakrylamid-Gfcl aufgelöst und fluorographiert. Geklärte Extrak e von ³⁵S-methioninmarkierten, nichtrekombinanten LL 20-Zellen und die eines rekombinanten Hefestammes, der das Hepatitis B-Oberllächen-Antigen (HBsAg) expression, wurden als Kontrollen verwendet.

Ergebnisse

Die Hüfezellen, die mit den Plasmiden pBY2/HSA Nr. 1 und pYHSA 221 transformiert wurden, wiesen eine aktive Produktion des HSA-Proteins auf, die leicht durch den EI.ISA-Test festgestellt werden und mit einem spezifischen, gegen HSA gerichteten Antiserum ausgefällt werden konnte.

Nach dem ELISA-Mikrote3t lag der Ante'l von HSA zwischen 3 und 8% des gesamten Zellproteins.

Abb. 10 zeigt das Fluorograph der³⁵S-methioninmarkierten Proteine, die ausderporinlasmischen Fraktion gewonnen und mit Ziegen-Anti-HSA-Serum immunoausgefällt und in SDS-Polyakrylamid-Gel aufgelöst wurden.

Spur M - "C-Proteinmolekulargewichtsmarkermix (BRl.);

Spur A - rekombinantes ³⁵S-HBsAg, ausgefällt mit Anit-HBsAg-Antikörpern; Spur B - markiertes HSA, produziert in der Rekombinanthefe, ausgefällt mit Anti-HSA-Serum; Spuren C und D zeigen das Fehlen von Querimmunoreaktionen des Anti-HSA-Serums mit dem HBsAg-haltigen Hefelysat bzw. des Anti-HBsAg-Serums mit dem HSA-Lysat.

Die elektrophoretische Mobilität des immunoausgefällten HSA war etwa die gleiche wie die des 67-kd-markierten Proteinmarkers. Dieses Ergebnis weist daraufhin, daß die Mehrheit des HSA-Proteins, das durch die Exprossionsvektorkonstruktion mit dem vollständigen Signalpeptid des PHO5-Gens in den psriplasmischen .Saum sekretiert wird, korrekt verarbeitet wird, was zu einem Proteinprodukt mit der Größe des reifen (natürlichen) HSA führt.

Zwei unabhängige Immunobübertragungsex^rimente (Western-Transfers) zeigten ein Protein von derselben Molekularmasse.

Reinigung des expresslerten HSA von Hefekulturen Im Labormaßstab

Eine 500-ml-Kultur von Hefezellen, die mit pBY2/HSA oder ρ YHSA 221 transformiert worden waren, wurde bei 30°o auf einen OD_Mo-Wert von 2,0 (in der Regel 24 bis 28 Stunden) in einem 0,67%igei. YNB-Medium (Difco) gezogen, das 0,15% (Gew./Vol.) KH₂PO₄,20 mg/l L-Histidin und 2% (Gew./Vol.) Glukose enthielt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 2000 x g für die Dauer von 5min aufgefangen und erneut in 1010,67%igen (Gew./Vol.) YNB-Meriiurn zur Suspension gebracht, das 30mg/l KH₂PO₄,0,1 % (Gew./Vol.) KCI, 20mg/l L-Histidin und 2% (Gew.-Vol.) Glukose enthielt. Nach 60 Stunden Kulturwachstum (auf OD₆₀₀ = 1,8-2,0) wurden die Zellen durch Zentrifugieren (4000 χ g, 5 min) geerntet, zweimal mit eiskaltem, destilliertem Wasser gewaschen und erneut in 200 Milliliter 0,1 % Triton X-100,0,5M NaCI, 2OmM Tris/HCI, pH-Wert 7,5,100rr,.VI ß-Merkaptoethanol und 1 mM PMSF zur Suspension gebracht. Die Zellen wurden 60s lang in einem vorgekühlten Glaskugel-Zellhomogenisator (Modell: Braun MSK) homogenisiert. Der Zellextrakt wurde durch schnelles Zentrifugieren (mit 20000 χ g, 4°C, bei einer Dauer von 30 min) geklärt. Der pH-Wert des geklärten Lysats wurde (durch den tropfenweisen Zusatz von 1M HCI) auf 4,8-5,0 abgestimmt, dann wurde eine gesättigte Lösung von (NH₄I₂SO₄ bis zu einer Endkonzentration von 6U% Sättigung zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang in einem Eiswasserbad gerührt, dann 30 Minuten bie 18000U/min (2⁰C) in einer Sorvall-Zentrifuge RC-5C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 100ml von 5OmM Bis-Tris-Puffer, pH-Wert 6,5, aufgelöst, gefolgt von einer über Nacht durchgeführten Dialyse anhand von 20 Volumen des gleichen Puffers. Das dialysierte Lysat wurde 30min lang zentrifugiert (18000U/min, 2°C), und die klare, obenaufschwimmende Schicht wurde auf eine Kolonne Superose MONO Q HR 5/5 (Pharmacia) gebracht, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war.

Die Anionenaustsuschchromatographle sowie alle anschließenden chromatographischen Reinigungsschritte wurden auf einem FPLC-System von Pharmacia ausgeführt.

Nach einem kurzen linearen Gradienten von NaCI (0,CM), 1 M) wurden Proteine, eluierend mit 0,1 M NaCI (isokratisches Eluicrenl), aufgefangen und anhand von 0,05 M Na-Phosphutpuffer, pH-Wert 7,5, dialysiert. Diese Fraktion wurde der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie auf einer Alkyl-Superose HR 5/5-Kclonno unterzogen.

Der obigen dialysierten Fraktion wurc'e festes Natriumsulfat zugesetzt, wobei die Endkonzentration auf 2,0 M abgestimmt wurde, und die Probe wurde auf die Alkyl-Superose HR 5/5-Kolonne gegeben, die mit 2 M (NH₄I₂SO₄ in 5OmM Na-Phosphatpuffer äquilibriert wurde. Gebundene Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von (NH₄)JSO₄ mit abnehmender Konzentration eluiert. Die HSA-haltige Fraktion wurde bei etwa 1,2 M (Na₄I₂SO₄ eluiert, was durch SDS-PAGE der eluierten Fraktionen überwacht wurde.

Gel-Flltrierung

Die . HSA"-Fraktion aus dem vorausgegangenen Schritt wurde durch Ultrafiltrierung in einer Amicon-gerührten Zelle (Filter: PM-30) konzentriert, dann auf eine Superose-Kolonne 12 HR 10/30 gebracht, die mit 50 mM Na-Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, welche 0,15 M NaCI enthielt, äquilibriert worden war. Die erste große Spitze nach der Gel-Filtrierung enthielt stark gereinigtes monomeres HSA, wie durch SDS-PAGE nach Laemmli, U. K„ Nature 227,680 (1970), getestet wurde. Zusätzliche Analysen schlossen PAGE-Untersuchungen unter „natürlichen" Bedingungen, IEF und begrenztes Schneiden mit CNBr (Barsh, G.S. und Byers, P. H., 1981, Proc. Natl, Acad. Sei. USA 78,5142-5146) ein.

Molekulareigenschaften von HSA, das aus Rekomblnanthefe gereinigt wurde Es wurde gezeigt, daß das aus Hefezellen gereinigte HSA als einzelnes 68 Kilodalton-Proteinband in SDS-Polyakrylamid-Gelen läuft, was darauf hinweist, daß es die gleiche Molekularmasse wie reifes, natürliches HSA hat.

Elektrophorese unter natürlichen Bedingungen (ausgeführt auf 10-15%igen PHAST-GeIs von PHARMACIA nach den Anweisungen des Herstellers) zeigte, daß das Verhalten der durch Hefe produzierten HSA ähnlich dem des natürlichen, reifen HSA war und daß as auch eine ähnliche Tendenz zur Bildung von Doppel-, Dreifach- und Multimerkomplexen hat, wahrscheinlich durch die zufällige Bildung von intermolekularen-S-S-Brücken.

'Jas Fehlen von Glykosylation bei in Hefe produziertem HSA wurde durch Con A-Sepharose-Chromatographie bewiesen:

Man ließ 500 μg eines partiell gereinigten Proteinextraktes, der aus HSA-produzierenden Hefezellen gewonnen worden war, sich an 750μΙ gequollene Con A-Sepharose (Pharmacia) in 1,5ml Puffer binden, der 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,4, und 0,5M NaCI enthielt. Die Suspension wurde bei 4"C langsam über Nacht geschüttelt, und die Con A-Sepharose wurde vom Puffer (der ungebundene Proteine enthielt!) getrennt, dazu wurde 10min lang bei 12000 χ g zentrifugiert. Dann wurde das Con A-Sepharose-Gel mit 100ml des gleichen Puffere durch Filtern durch einen 25-mm-Kreis eines Whatrnan-GF/A-Filters gewaschen.

Die gebundenen Proteine wurden durch einen Puffer eluiert, der 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 6,8,0,25M -D-Methylmannosid (Serva) u.id 0.25M NaCI enthielt.

Die ungebundenen und die gebundenen (an Con Λ-Sepharose) Proteinfraktionen wurden anhand von 1OmM Tris-HCI (pH-Wert ö,8) dialysiert und 1) einer SDS-PAGE-Untersuchung nach Laemmli, U. K. (Nature 227,680 [1970]) und 2) einem ELISA-Test unterzogen, um das Vorhandensein von HSA zu kontrollieren. Ein ähnliches Verfahren wurde bei einer Fraktion gereinigtem HSA angewendet.

In beiden Fällen zeigten die SDS-PAGE- und ELISA-Tests in der Fraktion von Con Α-bindenden Proteinen das Fehlen jedes 68 kd-Proteins sowie von allen Proteinen mit immunologischen Reaktionen mit Anti-HSA-Ab. Das HSA wurde quantitativ aus der Proteinfraktion gewonnen, die sich bei Einsatz der Probe nicht an Con A-Sepharose gebunden hat.

Aus den Ergebnissen läßt sich stark auf 'Jas Fehlen von GIy kosylation in den HSA-Molekülen, die in Hefe produziert wurden, schließen.

Vor der Peptidkartierung durch begrenzte Proteolyse wurden die Proben bei Vorhandensein von 0,5% (Gew./Vo¹) SDS ohne den Zusatz eines Rcduzierungsmittels wärmedenaturiert und für die Dauer von 10 bis 20 Minuten enzymatischen Verdauungen unterzogen. Gearbeitet wurde mit Subtilisin, Thermolysin, Trypsin und Papain. Da? Schneiden mit CNBr wurde so ausgeführt wie das von Barsh u.a. (ebenda) beschrieben wurde.

Abb. 12 zeigt das Schneidemuster mit CNBr von natürlichem HSA (A und C) (in de· oben beschriebenen Weise aus kommerziellen Quellen gereinigt) und von hefeproduziertem HSA (B und D), wie es durch die SDS-PAGE-Trennung von geschnittenen Poly peptiden demonstriert wird. Nach der Verdauung wurden SDS und ß-Merkaptoethanol auf Konzentrationen (Gew./Vol.) von 2,5% bzw. 10% zugesetzt. Die Proben wurden auf ei" PHAST-GeI (Pharmacia) mit einem Gradienten von 8-25% gebracht, und din Elektrophorese wurde nach den Anweisungen r.s Herstellers in einem PHARMACIA-PHAST-System durchgeführt. Die ermittelten Ergebnisse zeigen, daß das aus Rekomoirianthefe gereinigte HSA-Schneidmuster durch proteolytische Enzyme und Zyanogennromid aufweist, die canen von natürlichem HSA ähnlich sind (wobei die .Anmerkung zu machen ist, daß hefeproduziertes HSA unter den angewendeten Bedingungen weniger zugänglich für die Papainverdauung als natürliches HSA ist).

Eine Piobe des aus Hefe gereinigten HSA wurde der N-Terminalsequenzierung auf einem Gasphasensequenziergerät von Applied Bioxystems, Modell 470A, unterzogen. Das Ergebnis der Sequenzierung zeigte keine anderen Aminosäurereste als die erwarteten.

Konstruktion von Plasmidvekto.en, welche die Sekretion von HSA in das Kulturmedium fördern Die experimentelle Strategie für die Konstruktion neuer Expressionssekretionsvektoren bas.&rte auf der Feststellung, daß Prä-pro-l iSA in vitro durch Hefeendpeptidase KEX2 korrekt verarbeitet wird und reifes Asp-Ala-HSA ergibt (Bathurst, I. C. u. 1., 1987, Science, 235,348-350). Das natürliche N-Terminal-HSA-Präpro-Führungspeptid wurde als eine Folge bestimmt, welches die Sekretion von HSA aus der Rekombinanthefe fördern kann.

Die Folge der 103-meren synthetischen DNA-Fragmentkodierung für das HSA-Präpro-Führungspeptid wurde folgendermaßen aufgebaut:

S Ser TCT

L Leu TTG

L Leu TTG

F Phe TTC

M Met ATG

K Lys AAG

W Trr TUG

V VaI GTT

T Thr ACT

F Phe TTC

-72

- 282 473

V \al GTT

F Phe TTC

K Lys AAG

L Leu TTG

F Phe TTC

S Ser TCT

S Ser TL

A Ala GCT

Y Tyr TAC

R Arg AGGCCTG

S Ser TCT

R Arg AGA

GATCAAAAACACTAAAATATAATCAAA

I lie ACC

G GIy GGT

Stu 1

Jie Sequenz (27 Nukleotide) flußaufwärts des ATG-Kodons wurde so aufgebaut, daß sie dem flußabwärts gelegenen Ende eines starken, konstitutiven Hefepromotors eng homolog ist, d. h., dem der Genkodierung für Glyzeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH; Holland, J. P. und! lolland, M. J., 1979, J. Biol. Chem. 254,9839-9845). Zu den weiteren charakteristischen Merkmalen der oben genannten DNA-Sequenz gehören die Nutzung der häufigsten Hefekodone sowie einer „idealen" KEX2-Schneidestelle (K-R; Kurjan, J., Hershkovitz, I., 1982, Cell 30,933-943), die ck-rch die AAG AGG-Kodone kodiert wird, welche - nach dieser Konstruktion - mit einer Stu I-Restriktionsendonukleaseverdauungsstelle zusammenfallen.

1. Konstruktion des Plasmlds pHSA-T mit dem Gen für HSA Nr. 1 und dem Hefe-Hls3-Transkrlptinnstemlnator

Das 1,8kb-Hind Ill-Sac I-Fragment von pHSA Nr. 1 (d.h., das für HSA kodierende Gen) wurde . 3-229TK⁰ (Abb.3b) an den

Stellen Hind III und Sac I Moniert. Vor diesem Klonierungsschritt wurde die Pst I-Stelle (die sii HisS-Terminatorbereich befindet) deletiert, da sie nach der Einfügung des HSA-Gens doppelt würde.

Es wurden 0,5μς pGB23-229TK° mit 10 Einheiten Pst I in 20 Mikroliter eines Puffers mit rnittle Salzgehalt bei 37"C zwei Stunden lang behandelt. Nach der Extraktion mit Phenol und der Ausfällung mit Ethanol wuruu das Pellet in 50μΙ Klenow-Puffer aufgelöst, der 0,1 rnlvl dNTP und 2,5 Einheiten Klenow-Polymorase enthielt, und das Reaktionsgemisch wurde 40min bei Zimmertemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das DNA-Pellet wurde in 100μΙ Ligasepuffer aufgelöst, und es wurden 50 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt. Die Ligasereaktion wurde 15 Stunden lang bei 15°C durchgeführt, anschließend erfolgte die Transformation von E. coli JM 109. Plasmide (von etwa 30% aller Transformanton) ohne Pst I-Stelle (die als pGB3T bezeichnet wurden) wurden ausgewählt und folgendermaßen für die Einfügung des HSA-Gens verwendet:

a) Eo wurden 2Mg mit 10 Einheiten Sac I in Puffer mit niedrigem Salzgehalt bei 37°C über die Dauer von 4 Stunden in einem Endvolumen von 20μΙ verdaut. Dann wurde der Puffer auf das Optimum für die Hind HI-Verdauung abgestimmt, es wurden 10 Einheiten Hind III zugesetzt (Endvolumen 40 μΙ), und die Behandlung wurde fur weitere 4 Stunden bei 37°C fortgesetzt, der 2,06kb-Vektor wurde in 0,8% Agarose-Gel abgetrennt.

b) Wie oben beschrieben, wurden 5 pg pHSANr.1 durch Sac I und Hind III verdaut. Das 1,8kb-HSA-Fragment wurde aus 0,8% Agaros6-Gel isoliert.

c) Die Ligation des 2,06kb-pGB3T-Vektors und der 1,8kb-HSA-Einfügung wurde in 20μΙ Ligationsgemisch (das 80 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt) bei 15⁰C für die Dauer von 16 Stunden durchgeführt. E. coli JM109-Zellen (Yanisch-Perron, C. u.a., ebenda) wurden transformiert. Plasmide, die aus Tetracyclin-sensitiven Transformanten isoliert wurden, wurden auf ihr P striktionsenzymverdauungsmuster geprüft, durch Doppelverdauung mit Sal I und Xho I. Das resultierende Plasmid wurde als pHSA-T bezeichnet (Abb. 11).

2. Einfügung eines starken, konstitutiven Promoters und der künstlichen Präpro-Führungssequenz in pHSA-T; Konstruktion des Plasmlds pGprepro*HSA-T (Abb. 11)

a) Klonierung der künstlichen Präpro*-Führungskodierungssequenz flußabwärts des GAPDH-Promoters.

Es wurden 0,5μ3 M 13/GPD-3-(RF)-DNA (Bitter, G.A. und Egan, K.M. [1984], Gene 32,263-274) mit 5 Einheiten von Eco Rl in Puffer mit mittlerem Salzgehalt bei 37⁰C für die Dauer von 2 Stunden behandelt, gefolgt von der Verdauung durch 5 Einheiten an Bam Hl für weitere zwei Stunden bei 37⁰C in einem Puffer mit hohem Salzgehalt. Die Verdauungen wurden durch Phenolextraktion und Ethanolausfällung beendet. Das DNA-Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 5μΙ H₂O zur Ligasereaktion mit dem künstlichen HSA-Präpro-Führungselement aufgelöst.

Das Ligationsgemisch enthielt die mit Eco Rl-Bam Hl-behandelte M13/GPD-3-DNA, 1 pMol des synthetischen doppelsträngigen 103-meren DNA-Fragments (mit der Kodierung für das Präpro*-Führungselement) und 80 Einheiten T4-DNA-Ligase in 15μΙ Ligasepuffer. Die Ligasereaktion wurde bei 15⁰C über 16 Stunden ausgeführt, anschließend wurden E.coli JM109 transformiert.

Die Phagtransformanten wurden auf die Inserten des 103-meren Barn Hl°-Eco Rl-Präpro*-Führungskodierungsfragmentes nach der Didecxynukleotidsequtinzierungsmethode gesichtet.

Die Transformanten, welche die HSA-Präpro*-Führungskodierungssequenz hinter dem GAPDG-Promoter enthielten, wurden als M 13/Gprepro»KR bezeichnet (AbD. i '·). („KR" bezeichnet Lys-ARg und G steht für den GAPDH-Promoter).

Klonierung des HSA-Gens hinter der GAPDH-Promoter-Präpro'-Sequenzfuf.lon: Konstruktion des pGprepro*HSA-T

a) ,/HSA-T wurde mit Pst 10,5 μg DNA, 5 Einheiten Pst 1,4 Stunden bei 37⁰C) verdaut, und das geschnittene, 3'-überstehende Ende wurde durch Behandlung mit Klenow-Polymerase glatt gemacht. Das linaarisierte Plasmid wurde dann weiter mit 5 Einheiten Hindlll (4 Stunden bei 37⁰C) geschnitten, gefolgt von der Extraktion mit Phenol und der Ausfällung mit Ethanol.

b) Die Sequenz GAPDH-Promoter + künstliche Präpro»-Führungskodierung wurde aus M13/Gprepro»KR durch gleichzeitige Verdauung von 5μg Plasmid-DNA mit 20 Einheiten Hind III und 20 Einheiten Stu I (5 Stunden bei 37°C in Puffer mit mittlerem Salzgehalt) isoliert. Das O,75kb-Promoter + prepro*Fragment wurde durch Elektrophorese in 1 % Agarose-Gel isoliert, elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.

c) Das gereinigte Promoter -I- prepro"-Fragment wurde in den mit Pst I (glatt) -Hindlll-behandelten Vektor pHSA-T ligiert (in einem 20-pl-Gemisch, bei 15°C für die Dauer von 16 Stunden), gefolgt von der Transformation von E.coli JM101. Das resultierende Plasmid, pGprepro HSA-T (Abb. 11) wurde durch Kartierung der Restriktionsendonukleaseschneidesteüen getestet. ·

Konstruktion dos Hefe-E.coli-Schaukelvektors mit der prepro*-HSA-Expresslonssaktretlonskassette

Die prepro*-HSA-Expressionskassette wurde aus pGprepro*-HSA-T isoliert (durch Hind III- + Xho I-Verdauung, 2 pg DNAi'n 20μΙ Puffer mit hohem Salzgehalt, 10 Einheiten Hindill und XHo I, bei 37⁰C für die Dauer von 10 Stunden, gefolgt von der elektrophoretischen Trennung auf einem 0,8%igen Agarose-Gol, der Elektroeluierung, der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung). Das Fragment Hindlll-Xho I wurde dann in ρ JDB 207 (zwischen den Stellen Hind III und Sail) ligiert, was zu YEp/Gprepro*HSA (Abb. 11) führte, das zur Transformation von Hefe LL20 verwendet wurde. Hefetransformanten wurden auf

YNB-Agar-Platten (ohne Leuzin) ausgewählt.

Die Expression und Sekretion von HSA wurde in Schüttelflaschenkulturen getestet, wie das unten beschrieben wird.

Expression und Sekretion von HSA durch Rekombinanthefe, die mit pYEprepro*HSA transformiert wurde (YEprepro*-HSA) Eine einzelne Kolonie von Hefe-YEprepro^#HSA wurde in 10ml YNB-Medium geimpft, das 2% Glukose und 200pg/ml Histidin enthielt, und die Zellen wurden über Nacht bei 30⁰C unter ständigem Schütteln gezogen. Ein Milliliter der Über-Nacht-Kultur wurde in 200ml des oben genannten Mediums verdünnt und weiter auf einen OD^-Wert - 2,0 gezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (6000 U/min, 4⁰C, 15 min) ausgefällt, die obenaufschwimmende Schicht wurde abgenommen und unter Verwendung einer gerührten Amicon-Ultrafiltrationszelle mit einem PM-30-Filter zehnfach konzentriert. Das konzentrierte Zellmedium wurde dann über Nacht anhand von 2OmM Tris/Glyzin, pH 8,3, I mM EDTA, 5mM ß-Merkaptoethanol und 0,01 %

SDS dialysiert.

Das sekretierte HSA wurde durch quantitative E JSA-Mikrountersuchung bestimmt, wie das oben beschrieben wurde.

Es wurde festgestellt, daß von dem Hefezellen-YEprepro HSA wenigstens 3000pg HSA je 100ml Kulturmedium produziert

wurde.

Das sekretierte HSA wurde der SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen, gefolgt vom Immunotransfer und der

Färbung nach herkömmlichen Methoden.

Es wurde gezeigt (Abb. 13), das reifes HSA (68 kd) zwar das Hauptprodukt im Kulturmedium war, daß aber auch ein Fragment von HSA mit einer Molekularmasse von 46-48 kd festgestellt wurde, welches etwa 1 /3 des gesamten produzierten HSA darstellt. Das reife HSA zu 68 kd konnte leicht durch eine Reihe chromatögraphischer Schritte und Gel-Filterung (auf Superose 12 HR'°/30) gereinigt werden, wie das oben in Verbindung mit der Reinigung des expressierten HSA von Hefekulturen im Labormaßstab

beschrieben wurde.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung eines strukturellen Gens mit der Kodierung für authentisches menschliches Serumalbumin, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Aufbau einer Ni;kleotidfo!ge mit einer Kodierung für authentisches menschliches Serumalbumin durch Selekiiemng von Kodonen unter Berücksichtigung eines nichtmenschlichen Wirts, der für die Expression des authentischen menschlichen Serumalbumins gewählt wurde, wobei der Kodone so vorgenommen wird, daß im eisten Fall die am häufigsten durch den gewählten nichtm anschlichen Wirt verwendeten Kodone selektiert wurden und im zweiten Fall die von dem gewählten nichtmenschlichen Wirt an zweiter oder dritter Stelle verwendeten Kodone selektiert werden, um das Auftreten solcher Restriktionsstellen zu vermeiden, die während des Zusammenbaus des Gens zu nutzen sind, um eine eindeutige Schneidestelle für ein spezifisches Enzym zu schaffen und um innerhalb von Oligonukleotiduntereinheiten von Fragmenten, die zu klonieren sind, Palindrome mit einer Länge von 8 Basenpaaren oder mehr auszuschalten,

b) Teilen der konstruierten Nukleotidfolge in ein 5'-Fragment, das chemisch zu synthetisieren ist, und einige zu Monierende Fragmente, so daß die Verbindungspunkte zwischen diesen einigen Fragmenten sich an G-C-Dinukleotidfolgen von geeigneter Position befinden,

c) Modifizieren der konstruierten einigen Fragmente von

b) durch Ergänzung von deren konstruierten Nukleotidfolgen mit einer zusätzlichen Nukleotidfolge GGTAC am 5'-Terminus, ausgenommen das Fragment, das mit dem 5'-Fragment von b) zu verbinden ist, und weiteres Teilen dieser einigen Fragmente in Untereinheiten mit einem 3'-Nukleotid G, wobei diese Untereinheiten wiederum einzeln ergänzt werden durch eine zusätzliche Nukleotidfolge GGCC,

d) einzelnes chemisches Synthetisieren der modifizierten, ergä lzten Untereinheiten von c) in einzelsträngiger Form auf die bekannte Weise und chemisches Synthetisieren des 5'-Fragmentes von b) in doppelsträngiger Form auf die bekannte Weise,

e) konsekutives Klonieren der synthetisierten Untereinheiten von d), beginnend beim 5'-Terminus der modifizierten einigen ergänzten Fragmente von c), in einige einzelne Rekombinantvektoren auf die bekannte Weise mit Hilfe von Adaptern und der enzymatischen Auffüllreaktion zur Bildung von klonierten, doppelsträngigen Fragmenten des Gens, die den modifizierten, ergänzten einigen Fragmenten von c) entsprechen,

f) Zusammenbau der klonierten, doppelsträngigen Fragmente von e), durch Schneiden der einigen Rekombinantvektoren von e), paarweise, mit dem Enzym Kpn I bzw. dem Enzym Apa I - einem an der geschaffenen 5'-Terminal-Kpn I-Restriktionsstelle und dem anderen an der geschaffenen 3'-Terminal-Apa I-Restriktionsstelle - um kohäsive Enden zu bilden, die durch ein einzelsträngiges spezifisches Enzym auf die bekannte Weise zu glatten Enden gemacht werden - Lassen eines Endnukleotids C bzw. eines Endnukleotids G -, gefolgt vom Schneiden mit einem anderen Restriktionsenzym mit einer Schneidestelle, die in beiden Rekombinantvektoren des in Frage kommenden Paares einzigartig ist, um einerseits einen linearen Vektor zu schaffen, der ein kloniertes Fragment des Gens enthält, und andererseits ein abgeschnittenes Fragment des Gens, wobei diese beiden Fragmente auf die bekannte Weise enzymatisch an den glatten Enden verbunden werden -wobei am Verbindungspunkt ein Dinukleotid G-C gebildet wird, das in die Nukleotidfolge des Gens einbezogen wird -, um einen Rekombinantvektor zu erhalten, der schließlich alle die einigen konstruierten Fragmente von b) in doppelsträngiger Form einschließt, und

g) Ergänzen des in f) erhaltenen Rekombinantvektors mit dem chemisch synthetisierten 5'-Fragment von d) zur Bildung des vollständigen strukturellen Gens mit der Kodierung für authentisches menschliches Serumalbumin.

Verfahren zur Herstellung eines strukturellen Gens nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei a) der gewählte nichtmenschliche Wirt Hefe ist,
bei b) der konstruierte Nukleotidfolge lautet

GAC GCT CAC AAG TCT GAA GTC GCT CAC AGA TTC AAG GAT

CTA GGT GAA GAA AAC TTC AAG GCT TTG GTT TTG ATT GCT

TTC GCT CAA TCA TTG CAA CAA TGT CCA TTC GAA GAC CAC

GTC AAG TTG GTC AAC GAA GTT ACT GAA TTT GCT AAG ACC

TGT GTT GCT GAC GAA TCT GCT GAA AAC TGT GAC AAG TCC

TTG CAC ACT TTG TTC GGT GAC AAG TTG TGT ACT GTT GCT

ACT TTG AGA GAA ACT TAC GGT GAA ATG GCT GAC TGT TGT

GCl AAA CAG GAA CCA GAA AGA AAC GAA TGT TTC TTA CAA

CAC AAG GAC GAC AAC CCA AAC TTG CCA AGA TTG GTT AGA

CCA GAA GTC GAC GTT ATG TGT AC^T GCT TTC CAC GAC AAC

GAA GAG ACT TTC TTG AAG AAG TAC TTG TAC GAA ATC GCC

AGA AGA CAC CCA TAC TTC TAC GCT CCA GAA TTG TTG TTC

TTC GCT AAG AGA TAC AAG GCT GCT TTC ACT GAA TGT TGT

CAA GCT GCC GAC AAG GCT GCT TGT TTG TTG CCA AAG TTG

GAC GAA TTG AGA GAC GAA GGT AAG GCT TCT TCC GCT AAG

CAA AGA TTG AAG TCT GCT TCC TTG CAA AAG TTC GGT GAA

AGA GCC TTC AAG GCC TGG GCT GTT GCT AGA TTG TCT CAA

AGA TTC CCA AAG GCT GAA TTT GCT GAA GTf TCT AAG TTG

GTT ACT GAC TTG ACT AAG GTT CAC ACT GAA TGT TGT CAC

TCT CAC TGT ATC GCT GAA GTT GAA AAC GAC GAA ATG CCA

GCT GAC TTG CCA TCT TTG GCT GCT GAC TTC GTT GAA TCT

AAG GAC GTT TGT AAG AAC TAC GCT GAA GCT AAG GAC GTT

TTC TTG GGT ATG TTC TTG TAC GAA TAC GCT AGA AGA CAC

CCA GAC TAC TCC GlT GTT TTG TTG TTG AGA TTG GCT AAG

ACT TAC GAA ACT ACT TTG GAA AAG TGT TGT GCT GCT GCT

GAC CCA CAC GAA TGT TAC GCT AAG GTT TTC GAC GAA TTT

AAG CCA TTG GTT GAA GAA CCA CAA AAC TTG ATT AAG CAA

AAC TGT GAA TTG TTC AAG CAA TTG GGT GAA TAC AAG TTC

CAA AAC GCT TTG TTG GlT AGA TAC ACT AAG AAG GTT CCA

CAA GTC TCC ACT CCA ACT TTG GTT GAA GTC TCT AGA AAC

TTG GGT AAG GTT GGT TCT AAG TGT TGT AAG CAC CCA GAA

GCT AAG AGA ATG CCA TGT GCT GAA GAC TAC TTG TCT GTT

GTT TTG AAC CAA TTA TGT GTT TTG CAC GAA AAG ACT CCA

GTT TCT GAC AGA GTT ACT AAG TGT TGT ACT GAA TCT TTG

GTT AAC AGA AGA CCA TGT TTC TCT GCC TTG GAA GTT GAC

GAA ACT TAC GTC CCA AAG GAA TTT AAC GCT GAA ACT TTC

ACT TTC CAC GCC GAC ATC TGT ACC TTG TCC GAA AAG GAA

AGA CAA ATC AAG AAG CAA ACT GCT TTG GTT GAA TTG GTT

AAG CAC AAG CCA AAG GCT ACT AAG GAA CAA TTG AAG GCT

GTT ATG GAC GAC TTC GCT GCT TTC GTT GAA AAG TGT TGT

AAG GCT GAC GAC AAG GAA ACT TGT TTC GCT GAA GAA GGT

AAG AAG TTG GTT GCT GCT TCT CAA GCT GCT TTG GGT TTG

TAA TAG

in welcher die Pfeile die Teilungspunkte zwischen dem ersten 5'-Fragment, das chemisch zu

synthetisieren ist, und 4 zu klonierenden Fragmenten,

in c) die ergänzten, einzelsträngigen Untereinheiten der modifizier ten Fragmente von b) lauten

taggtgaagaaaacitc.aaggctttggttttgattgctttcgctcaatacttgcaacaatgtccattcgaagggcc

accacgtcaagttggtcaacgaagttactgaatttgctaagacctgtgttgctgacgaatctgctgaaaactgggcc

tgacaagtccttgcacactttgttcggtgacaagttgtgtactgttgctactttgagagaaacitacggtgggcc

aaatggctgactgttgtgctaaacaggaaccagaaagaaacgaatgtttcttacaacacaagga-

CGGGCC

acaacccaaacttgccaagattggttagaccagaagtcgacgttatgtgtactgctttccacgacaacgaagggcc

agactttcttgaagaagtacttgtacgaaatcgccagaagacacccatacttctacgctccagaattgttgttcttcggggcc

ggtacctaagagatacaaggctgctttcactgaatgttgtcaagctgccgacaaggctgcitgttt gttgggcc

ccaaagttggacgaattgagagacgaaggtaaggcttcttccgctaagcaaagattgaagtgtgc ttccttgggcc

caaaagttcggtgaaagagcctrcaaggcctgggctgttgctagattgtctcaaagattcccaaag gctgggcc

aatttgctgaagtttctaagttggttactgacttgactaaggttcacactgaatgttgtcacggtga cttgggcc

ttggaatgtgctgacgacagagctgacttggctaagtatatctgtgaaaaccaagactctatctct tctaagggcc

ttgaaggaatgttctgaaaagccattgttggaaaagtctcactgtatcgctgaagttgaaaacgac gaaatgggcc

ggtacccagctgacttgccatctttggctgctgacttcgttgaatctaaggacgtttgtaagaact acgctgaagggcc

ctaaggacgttttcttgggtatgttcttgtacgaatacgectagaagacacccagactactccgtt gttttgttgttgggcc

agattggctaagacttacgaaactactttggaaaagtgttgtgctgctgctgacccacacgaatgt tacgctaagggcc

gttttcgacgaatttaagccattggttgaagaaccacaaaactrgattaagcaaaactgtgaattg ttcaagggcc

caattgggtgaatacaagttccaaaacgctttgttggttagatacactaagaaggttccacaagtc tccactccaactttgggcc

gttgaagtctctagaaacttgggtaaggttggttctaagtgttgtaagcacccagaagctaagag aatgggcc

ggtacccatgtgctgaagactacttgtctgttgttttgaaccaattatgtgttttgcacgaaaagg

actccagtttctgacagagttactaagtgttgtactgaatctttggttaacagaagaccatgtttc tctgggcc

ccttggaagttgacgaaacttacgtcccaaaggaatttaacgctgaaactttcactttccacgccg acatctgggcc

taccttgtccgaaaaggaaagacaaatcaacaagcaaactgctttggttgaattggttaagcaca agccaaagggcc

gctactaaggaacaattgaaggctgttatggaccacttcgctgctttcgttgaaaagtgttgtaa ggctgacgggcc

acaaggaaacttgtttcgctgaagaaggtaagaacttggttgctgcttctcaagctgctttgggtt tgtaatagggcc

in c) die synthetisierten Untereinheiten von d) konsekutiv in vier einzelne E-coli-Vektoren kloniert werden mit Hilfe der Adapter

ApaI Eco RI

CGGACGGCGACGCCGACGGCCACCG
CCCGGGCCTGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGCTTAA
ApaI Eco RI

CGAGTATGCGACAGCTGG
CCCGGGCTCATACGCTGTCGACCTTAA
in f) das einzelsträngige spezifische Enzym Klenow-Polymerase ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß ein strukturelles Gen hergestellt wird, welches eine flußaufwärts angeordnete Nukleotidfolge mit einer Kodierung für Methionin aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß ein strukturelles Gen hergestellt wird, welches durch eine flußaufwärts angeordnete Nukleotidfolge erweitert wird, in welcher die

Kodone unter Berücksichtigung eines nichtmenschlichen Wirtes selektiert wurden und welches für die Aminosäurerfolge kodiert

Met-Lys^Trp-Val-Thr-Phe-lle-Ser-Leu-Leu-Phe-Ley-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser - Arg - GIy - VaI - Pje - Lys - Arg.

5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleotidfolge, welch β die Aminosäurefolge kodiert, folgende ist