WO2004088307A2 - Verfahren zum nachweis der expression rekombinanter proteine an einer zelloberfläche und zur immobilisierung und aufreinigung von zellen und proteinen - Google Patents

Verfahren zum nachweis der expression rekombinanter proteine an einer zelloberfläche und zur immobilisierung und aufreinigung von zellen und proteinen Download PDF

Info

Publication number
WO2004088307A2
WO2004088307A2 PCT/DE2004/000506 DE2004000506W WO2004088307A2 WO 2004088307 A2 WO2004088307 A2 WO 2004088307A2 DE 2004000506 W DE2004000506 W DE 2004000506W WO 2004088307 A2 WO2004088307 A2 WO 2004088307A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cysteine
cells
maleimide
cell
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/DE2004/000506
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004088307A3 (de
Inventor
Joachim Jose
Steffen Handel
Original Assignee
Universität des Saarlandes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universität des Saarlandes filed Critical Universität des Saarlandes
Publication of WO2004088307A2 publication Critical patent/WO2004088307A2/de
Publication of WO2004088307A3 publication Critical patent/WO2004088307A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting the expression of a polypeptide produced by recombination in a host cell transformed accordingly, the recombinant polypeptide being represented in or on the cell surface delimiting the host cell against the external medium surrounding it and at least one section accessible from the external medium having.
  • the cell is co-selected with the corresponding gene, which serves as an intrinsic marker, and can be used in further studies and applications.
  • the cellular surface display led to promising progress in the field of oral vaccines [5] and in the development of biological environmental adsorbents [6 l against this background, it is obvious that systems for the surface display of a wide range of molecules are required, as well as tools that allow the analysis and evaluation of these systems with regard to their efficiency.
  • the techniques in question must be suitable for automated processes in order to achieve a high throughput to enable. So far, however, in all cases the detection of the surface display has been dependent on special properties of the molecule to be displayed, namely either on its affinity for an antibody or on a specific catalytic activity. This has so far limited the promising strategy of the cellular surface display Limited number of candidate molecules.
  • the present invention is therefore based on the object of demonstrating a method which enables verification and quantification of the cellular surface display independently of the antigenic or catalytic properties of the molecule shown / shown.
  • One solution to this problem is to provide a method of the type mentioned at the outset which is characterized in that (a) the recombinant polypeptide is constructed in such a way that it has at least one amino acid cysteine in the accessible section in such a way that (b) the Exposing the host cell to an external medium containing a marker substance that specifically binds to cysteine, (c) inducing the binding reaction between cysteine and the marker substance, and (d) subsequently subjecting the host cell to a process for the detection of the cysteine-marker compounds subjects.
  • cell surface is understood to mean that shell of a cell which is in contact with the external medium.
  • the term cell surface consequently includes, in particular, the so-called “outer membrane” / "outer membrane” of Gram-negative bacteria, the Mureinsacculus of Gram-positive bacteria, which Cell wall of yeast, the cell wall of plant cells and the cytoplasmic membrane of animal cells.
  • target polypeptide The desired polypeptide or protein, which is produced by means of recombination in, on or on the cell surface of the host cell, is referred to below as "target polypeptide"
  • the marking according to the invention enables on the one hand the observation, control and detection of the surface display of target polypeptides using various methods, including flow cytometry, and on the other hand individual cells with cyst-containing proteins on their surface can be selected by means of FACS.
  • the method according to the invention enables monitoring (ie observation, control and detection) of the surface display of recombinant proteins and thus of the target polypeptides contained therein. without having to use specific antibodies or enzymatic reactions.
  • the method is easy to perform and can be easily used in combination with various analytical methods, including Western blots, spectrophotometry and flow cytometry.
  • the method according to the invention can also be used for protein purification or cell purification which express a specific recombinant polypeptide or protein which contains the target polypeptide.
  • Labeling with, for example, biotin-maleimide whole cells that express a single cysteine on their surface can be coupled to streptavidin-coated beads, streptavidin-agarose, or any other streptavidin-modified matrix, e.g. in liquid chromatography columns.
  • the cells which express the desired recombinant polypeptide or protein with one or more exposed cysteines on their surface can be enriched from a mixture of cells which do not express this polypeptide / protein and thus the target polypeptide.
  • cells which express an enzyme, an antibody or another functional protein on the surface can be immobilized in order to be used in continuous reactions.
  • cells can be attached to membranes to e.g. to be used for surface plasmon resonance experiments. If the recombinant polypeptide or protein provided with one or more cysteines according to the invention is released into the supernatant, e.g. by a site-specific protease, it can be purified in a single step using the affinity for streptavidin.
  • a great advantage of the method according to the invention is that a single amino acid, namely a single cysteine, is sufficient to detect the recombinant polypeptide or the target polypeptide.
  • Inherent cysteines can be used for labeling and purification, or if the protein is free of cysteines, a single cysteine can be added.
  • the recombinant polypeptide is preferably constructed in such a way that (a) a nucleic acid is provided which comprises the nucleotide sequence coding for the recombinant polypeptide and its representation on the cell surface, this nucleotide sequence in its region coding for the accessible section of the polypeptide at least one cysteine Has codon (TGT, TGC), which is either naturally contained in the region of the nucleotide sequence coding for the accessible section or is artificially introduced or incorporated into this region in such a way that (b) this nucleic acid is introduced into a host cell, and that (c) induces expression of this nucleic acid in the host cell.
  • a nucleic acid which comprises the nucleotide sequence coding for the recombinant polypeptide and its representation on the cell surface, this nucleotide sequence in its region coding for the accessible section of the polypeptide at least one cysteine Has codon (TGT, TGC), which is either naturally contained in the region of the
  • the incorporation of the cysteine codon can either be carried out as an insertion or as a substitution and in principle can be carried out at any point in the nucleotide sequence, provided that this point also encodes the accessible section of the recombinant polypeptide at least in such a way that the cysteine is contained in this accessible section.
  • the nucleic acid which comprises the nucleotide sequence coding for the recombinant polypeptide and its representation on the cell surface, can in particular be constructed in such a way that it codes for a fusion protein which consists of the target polypeptide represented in / on / on the cell surface and one for its expression and Representation necessary helper polypeptide exists, and that it consequently includes both the nucleotide sequence coding for the target polypeptide and for the helper polypeptide.
  • the at least one cysteine can either be present for the target polypeptide or in the nucleotide sequence coding for the helper polypeptide or can be incorporated provided it is expressed in the accessible portion of the recombinant polypeptide / protein.
  • a tried and tested embodiment of the nucleic acid codes for a fusion protein which consists of an N-terminal signal peptide, the target polypeptide (here also "passenger polypeptide”), a linker polypeptide and a C-terminal transport domain of an auto transporter.
  • the (possibly only) cysteine is preferably inserted into the linker region (FIG. 3).
  • a protease binding site may also be present or incorporated in the linker region, particularly one that is selective for IgA protease.
  • the transport domain of a car transporter can be chosen arbitrarily, but preferably such a transport domain is used which can form a ⁇ -barrel structure.
  • Preferred transport domains of an auto transport are selected from the group: E. coli ALDA I protein, Shigella flexneri SepA protein, Shigella flexneri IcsA protein, E.
  • the nucleic acid can be implemented as a vector which comprises elements for the replication, cloning and surface display of the recombinant polypeptide.
  • a preferred vector is the plasmid pET-SH4 with an autotransporter construct and the Xbal, Xhol and Bg / II interfaces (FIG. 3). If the coding region of a cysteine-free target polypeptide is inserted into the plasmid at these interfaces, the plasmid delivers the cysteine necessary for the labeling according to the invention in the accessible section of the recombinant polypeptide or protein,
  • the nucleic acid can be introduced into a host cell using the methods known and known in the art, such as, for example, electroporation.
  • Particularly suitable host cells to be used in the method according to the invention are bacterial cells, in particular Gram-negative bacterial cells, and among these preferably enterobacterial cells.
  • Bacterial cells from the group Escherichia coli, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Helicobacter mustelae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Rickettsia sp. and Neisseria sp. is selected.
  • the expression of the nucleic acid in the host cell can take place under the control of a generally known promoter.
  • a generally known promoter In the case of using Gram-negative bacteria as host cells, the use of the T7 / lacZ promoter or the promoter of pJM1013 is suggested.
  • Maleimide and / or a maleimide derivative is preferably used as the marker substance in the process according to the invention, the binding reaction with the cysteine being a Michael addition reaction, ie a Michael addition of cysteine to the double bond of various maleimide derivatives, the maleimide reaction with Sulfhydryl groups have already been used successfully in macromolecular prodrug concepts tl6] , and ebendo in the extension of the in vivo half-life of therapeutic antibody fragments [17] and in studies of the structure of bacterial receptors [7 ' 1] .
  • the binding reaction with the cysteine being a Michael addition reaction, ie a Michael addition of cysteine to the double bond of various maleimide derivatives
  • the maleimide reaction with Sulfhydryl groups have already been used successfully in macromolecular prodrug concepts tl6] , and ebendo in the extension of the in vivo half-life of therapeutic antibody fragments [17] and in studies of the structure of bacterial
  • maleimide derivatives Two forms are preferably used in the process according to the invention, namely biotinylated maleimide and fluorescein maleimide.
  • Biotinylated maleimide is particularly well suited for photometric detection and filter detection following Western blotting.
  • Fluorescein maleimide proposed as a preferred marker for fluorescence-activated cell sorting and flow cytometer analysis (FACS processes).
  • maleimide / maleimide derivative labeling it is proposed according to the invention to carry out the specific labeling of the sulfhydryl group of cysteines by alkylation using holoacetyl derivatives or by treatment with pyridyl disulfide derivatives.
  • an important advantage of the method according to the invention is that the method can be used on living cells.
  • Figure 1 the Michael addition of a sulfhydryl group to the double bond of a
  • FIG. 1 the structure (A) and the secretion mechanism (B) of the
  • a precursor protein is translocated across the inner membrane. As soon as it arrives at the periplasm, it folds the C-terminal part of the precursor like a porin-like structure as a so-called ß-barrel in the outer membranes, and the target peptide (the passenger) is translocated to the cell surface.
  • the signal peptide of the cholera toxin ß subunit and the ß barrel and the linker region of the adhesive AIDA-I from E. coli are used for autodisplays, as described in Maurer et al. is described fl0] .
  • SP signal peptide
  • DM inner membrane
  • PP periplasm
  • OM outer membrane
  • FIG. 3 the structure of the autotransporter fusion proteins for which various of the piasmids used code.
  • the neighborhoods of the target peptide insertion site necessary to obtain surface translocation are given as sequences. Restriction endonuclease cleavage sites are underlined. The signal peptidase cleavage site is indicated by an arrow.
  • the site-specific cleavage site for IgAl protease in the resulting fusion protein is in italics and the linear epitope for a mouse monoclonal antibody used as an internal control is in bold. The single cysteine used for labeling and detection is highlighted in black.
  • FP-CT contains four amino acids more than FP-ET, so the molecular weight is slightly higher.
  • the Cpol restriction site (not shown), which was used for cloning purposes, is 155 bp downstream of the underlined BgM restriction site.
  • Figure 4 the surface translocation and accessibility of FP-ET and FP-CT.
  • the outer membranes were prepared from E. coli JK321 pJM1013 (FP-ET) and JK321 pSH4 (FP-CT) and subjected to SDS gel electrophoresis on a 12.5% PA gel, followed by a Coomassie Brilliant Blue staining. (A). After transfer to a PVDF
  • Filter membrane was proteins by the epitope-specific monoclonal mouse antibody (B) or by biotin-maleimide
  • Marker proteins are given on the left in kDa.
  • Outer membranes were prepared (+) or not (-).
  • Natural outer membrane proteins OmpF / C and OmpA are indicated by arrows,
  • T trypsin-resistant, auto-transporter core embedded in membrane
  • FIG. 5 an inducible surface display and its detection by cyst-specific labeling with biotin-maleimide: outer membranes of £. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4 were prepared before (-) and 30 minutes after induction with LPTG (+) and subjected to SDS gel electrophoresis on a 12.5% PA gel with subsequent Coomassie brilliant blue staining (A) , After transfer to a PVDF membrane filter, the proteins were detected either by epitope-specific mouse monoclonal antibody Du 142 (B) or by biotin-maleimide coupling, followed by the addition of a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (C). The molecular weights of the marker proteins are given on the left in kDa. Natural outer membrane proteins OmpF / C and OmpA are indicated by arrows,
  • FIG. 6 a flow cytometric analysis of whole cells of E. coli, the FP-
  • E. coli BL21 (DE3) pLysS containing pET-SH3 (FP-ET) and BL21 (DE3) pLysS containing pET-SH4 (FP-CT) were exposed to EPTG 30 minutes after induction Fluorescein-maleimide labeled and subjected to flow cytometry. 10,000 cells were analyzed for each sample. The fluorescence of the cells is shown as a histogram, 30 minutes after induction with LPTG. The mean fluorescence from E. coli cells expressing FP-CT (328, B) is almost 11 times higher than the mean fluorescence from cells expressing FP-ET (30, A).
  • Figure 7 the time course of the induced surface display, monitored by
  • Fluorescein-maleimide labeling and flow cytometry cells that express FP-CT (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4 - black squares), and cells that express FP-ET (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET- SH3 - open circles) were induced with LPTG. Samples were taken at the times indicated and labeled with fluorescein-maleimide. For each sample, the mean fluorescence for 10,000 cells was determined using flow cytometry and plotted against time after induction.
  • Figure 8 the cell sorting in the flow cytometer (FACS) of E. coli cells
  • Adenodoxin (Adx), a naturally cysteine-containing protein.
  • E. coli cells BL 21 (DE3) which contain the plasmid pET-SH3, which contains the DNA coding for Adx and inserted through the XbaVBglil restriction sites, were labeled with fluorescin-maleimide and analyzed by flow cytometry [B].
  • the mean fluorescence of these cells (271) was significantly increased compared to the mean fluorescence of cells expressing FP-ET (39) (E. coli BL 21 (DE3) pET-SH3) and used as a control [A ]
  • Bacterial strains, plasmids and culture conditions Bacterial strains, plasmids and culture conditions:
  • the E. coli strain JK321 (AompTproC leu-6 trpE38 entA zihl2 :: Tn! 0 dsbAwkari), which was used for the constitutive expression of fusion proteins in the car display, is known in the prior art [14 l
  • Cm R which was used for inducible expression, is commercially available, for example from Stratagene (La Jolla, USA).
  • the vector pETl ld was used, which is commercially available, for example from Novagen, Madison, USA.
  • E. coli TOP 10 F " mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) ⁇ 80 / cZ ⁇ M15 ⁇ / ⁇ cX74 deoR recAl ⁇ raD139 A (ara-leu) 7697 galü galK rpsL (Str) endAl nupG) and the vector pCR2.1-TOPO are used, both of which are commercially available, for example from Invitrogen, Groningen, the Netherlands.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetate
  • the plasmid pJM1013 has been described and characterized in previous studies [13] . It directs the epitope of a mouse monoclonal antibody to the cell surface, where this epitope can be released by a specific IgAl protease cleavage site if the protease is added to the cells externally (Fig. 3), the expression of the autotransporter fusion protein in pTM1013 is under the control of the strong constitutive promoter P TK t101 .
  • pSH4 which contains a single cysteine
  • the gene of the autotransporter domains of the plasmid pJM1013 was PCR PCR using the oligonucleotide primers sh017 (5'-tct aga ctc gag aga tct tgc cct gaa tat ttc aaa gg-3 ' ) and sh002 (5'-cac cac cag acg gtc cgt aag tg-3 ') amplified.
  • the primer sh017 adds the codon for a single cysteine (printed in bold) and contains an Xho I restriction site that can be used for control digestion.
  • the fragment which was obtained by PCR, was inserted into the vector pCR2, 1-TOPO and cleaved again with Xbal and Cpöl.
  • the plasmid pJM1013 was also digested with Xbal and Cpöl and the XbällCpol- ⁇ _.% Men ⁇ obtained by PCR was inserted. This resulted in the plasmid pSH4, as shown in FIG. 3.
  • the ⁇ ol interface introduced by means of PCR was used to differentiate between pJM1013 and pSH4.
  • pETl id vector backbone from Novagen (Madison, USA) was used for the inducible expression.
  • all Xbal and BgtII restriction sites of the vector were deleted in a first construction step.
  • a PCR with oligonucleotide primers sh023 (5'-cct agg ggg gaa ttg tta tcc gc-3 ') and sh024 (5' -tga tca cga tcc cgc gaa att aat acg-3 ') and the plasmid pETl ld as a template.
  • the PCR product was inserted into the vector pCR2, l-TOPO, again cleaved with Avrll and Bell, and ligated into the Xbal and -5 / TJ restricted vector pETl ld, resulting in pETl l-SH2.
  • This new vector which is characterized by the complete absence of Xbal and BgUl restriction sites, was cleaved with Ncol and BamHl.
  • the autotransporter domains which contained signal peptide, linear epitope, linker region and ⁇ -barrel coding regions, were PCR-analyzed using pJM1013 as template and the oligonucleotides sh015 (5'-cca tgg tta aat taa aat ttg gtg ttt ttt tta cag- 3 ') and sh016 (5'-tga tca tta tca gaa gct gta ttt tat ccc c-3') were amplified as primers.
  • the PCR fragment obtained was ligated into pCR2.1 TOPO.
  • Plasmid pET-SH4 was obtained by replacing the 200 bp Nüfel / C ol fragment in pET-SH3 with the corresponding fragment containing the only cysteine obtained by cleaving pSH4 with Ndel and Cpöl.
  • E.coli cells were grown overnight and the culture (1 mL) was used to inoculate LB medium (20 mL). The cells were grown at 37 ° C with shaking (200 rpm) for about 5 hours until an OD 578 of 0.7 was reached. After harvesting and washing with phosphate buffered saline (PBS), outer membranes were prepared using Hantke's rapid isolation method [5] . For the protease treatment of whole cells, E. coli cells were harvested, washed and resuspended in PBS (5 mL). Trypsin was added to a final concentration of 50 mgL '1 and the cells were incubated at 37 ° C for 5 minutes. Digestion was stopped by washing the cells three times with PBS containing 10% fetal calf serum (FCS) and the outer membranes were prepared as previously described.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the strain BL21 (DE3) pLysS, which contains one of the plasmids described (pET-SH3 or pET-SH4), was overnight in LB medium with a content of 50 ⁇ g ml "1 ampicillin and 34 ⁇ g ml " 1 Bred chloramphenicol. Chloramphenicol was used to maintain pLysS function and thus To achieve a stricter control, 1 mL of this overnight culture was used to inoculate LB medium (20 mL). The cells were grown at 37 ° C with shaking (200 rpm) for about 3 hours until an OD578 of 0.6 was reached. 1 mM LPTG (Roth, Düsseldorf, Germany) was added for induction. After 30 minutes (unless otherwise stated) the cells were harvested and the outer membranes were prepared as previously described.
  • Outer membrane preparations were diluted 1: 2 with sample buffer (100 mM Tris / HCl (pH 6.8) containing 4% SDS, 0.2% bromophenol blue and 20% glycerol. The samples were 10 minutes at 95 ° C boiled and analyzed on a 12.5% SDS-PA gel, proteins were visualized by Coomassie brilliant blue staining, and pre-stained molecular weight markers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) were used to calculate the apparent molecular weight of the outer membrane proteins Western blot analysis, gels were electroblotted onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes using a Mini Trans blot apparatus from Bio-Rad Laboratories (Munich, FRG) and the blotted membranes were blocked in TBS with 3% FCS overnight ,
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the whole cells were washed three times with 1 mL ice cold phosphate buffered saline (PBS) (10 mM sodium phosphate, 0.9% NaCl, 1 mM MgCl 2 [pH 7.4]), with 2% ⁇ -mercaptoethanol for 30 minutes incubated and washed five times with ice cold PBS.
  • PBS ice cold phosphate buffered saline
  • the cells were collected by centrifugation and the pellet was resuspended in 5 ml of biotin-maleimide (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) (100 ⁇ M in PBS containing 1% dimethylformamide) [7 l. After an incubation for 15 minutes at room temperature, the Cells washed three times with PBS as previously described.
  • a color reaction was achieved by adding 10 mL incubation buffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 100 mM Tris-HCl, pH 9.5), the 66 ⁇ L nitro blue tetrazolium chloride (50 mg mL “1 in 70% dimethylformamide) and 33 ⁇ L 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate disodium salt (20 mg mL "1 in H 2 0),
  • the cells were placed in 2 ml 0.1 M sodium phosphate buffer was resuspended and the OD578 was determined 1 ml of this solution was added to 200 ⁇ l o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside (ONPG, 4 mg / ml in PBS, pH 7.0) and at 28 5 ° C.
  • the cells were pelleted by centrifugation (10 minutes, 5000 ⁇ g, 4 ° C.) and the absorption of the supernatant was determined at 405 nm.
  • Activity corresponding to the cysteine molecules accessible on the cell surface was calculated in Miller units according to Giacomini [15 l reaction time (5 minutes) and reaction volume (1 ml) were kept constant throughout the measurement,
  • Example 1 Construction of a target peptide (passenger) with a single cysteine
  • the surface display of a target peptide contained in a recombinant protein, a so-called passenger, by means of an autodisplay in E. coli is based on the autotransporter secretion path [12] and requires the integration of the target peptide in a polyprotein precursor with a defined structure (FIG. 2).
  • an artificial gene must be constructed by PCR, which codes for an N-terminal signal peptide (SP), for the target peptide or the passenger, for a so-called linker peptide and for the C-terminal ⁇ -core.
  • SP N-terminal signal peptide
  • the precursor With the help of the SP the precursor is translocated over the inner membrane and the outer membrane translocation is facilitated by the ß-barrel ("ß-core"), which forms a porin-like structure.
  • ß-core ß-barrel
  • a linker peptide is required to obtain complete surface exposure of the target peptide / passenger protein [10] [11] (Fig. 2).
  • the plasmid pJM1013 [13] known in the art was used to construct the gene for a target peptide / passenger protein with a single cysteine.
  • the plasmid pJM1013 is described in detail by J. Maurer et al in J Bacteriol 1999, 181, 7014, and the content of this publication is hereby expressly incorporated by reference.
  • the plasmid pJM1013 codes for a precursor protein that facilitates an efficient surface display of an epitope for the monoclonal mouse antibody Du 142 under the control of the constitutive promoter P TK [13] .
  • the codon for a single cysteine and additionally a ⁇ % ol restriction site were inserted into the plasmid pJM1013 by PCR mutagenesis, whereby the plasmid pSH4 was obtained (FIG. 3). Because of these insertions, the proteins for which pJM1013 (epitope-containing fusion protein, FP-EP) and pSH4 (cysteine and epitope-containing fusion protein, FP-CP) code differ slightly in size. Both plasmids were transformed into E. coli JK 321, a strain well adapted to the auto-display of foreign target peptides / passenger proteins [141 > and the transport to the cell surface was analyzed,
  • Example 2 Probing the surface display of FP-EP, expressed by plasmid pJM1013, and FP-CT, expressed by plasmid pSH4:
  • differential cell fractionation has been a suitable tool to find out whether a target peptide / passenger is transported to the cell surface [10] [11] [2] [3 l.
  • FIG. 4A it was with this method possible to detect a protein of correct size in the outer membrane fraction of E. coli JK321, which contains plasmid pSH4, as in JK321 with plasmid pJM1013.
  • the expression was almost as high as for the natural outer membrane proteins OmpA and OmpF / C.
  • a similar protein was neither detectable in the cytoplasmic fraction nor in the inner membrane fraction (not shown).
  • FP-CT contains a single cysteine residue
  • a detection method based on the maleimide coupling was carried out: After SDS-PAGE, protein bands were transferred to a PVDF membrane filter in the same way as described previously for Western blot experiments. However, instead of using an antibody for the detection, as is customary in the prior art, biotin-coupled maleimide was added and a marking was carried out as described above under "Materials and Methods Used" (cf. also Table 1).
  • fusion proteins FP-CT and FP-ET were expressed by an inducible T7 / Lac promoter.
  • the artificial precursor gene coding for the autotransporter domain was inserted into the vector pETl id with a target peptide / passenger containing a single cysteine (FP-CT).
  • This plasmid vector which is commercially available, is specified for inducible protein expression.
  • the new plasmid obtained in this way was named pET-SH4 (FIG. 3). It enabled the inducible expression of the target peptide / passenger protein FP-CT from the T7 / Lac promoter derived from pETl ld.
  • the gene coding for FP-ET was used in the same way and the plasmid pET-SH3 was obtained (FIG. 3), which served as a control.
  • Both plasmids were transformed into the bacterial strain E. coli BL21 (DE3), which is freely available commercially and is commonly used for T7 / Lac promoter-mediated induction of expression. The subsequent protein expression was analyzed. As shown in FIG.
  • Example 5 Flow cytometric analysis of cells carrying a protein with a single cysteine
  • E. coli BL21 (DE3) pET-SH4 cells expressing FP.-CT were labeled with fluorescin-maleimide (Table 1).
  • fluorescin-maleimide Table 1
  • the cells were finalized diluted and subjected to flow cytometry using a FACSCalibur flow cytometer
  • E. coli BL21 (DE3) pET-SH3 expressing FP-ET (without cysteine) was treated in the same way before flow cytometer analysis and used as a control.
  • Figure 6 shows that the level of fluorescence from BL21 (DE3) expressing FP-CT was clearly distinguishable from the intrinsic background signal of the E. co // control expressing FP-ET. This shows that the maleimide coupling of a single cysteine in a protein that appeared on the E. coli surface is a practical, well-functioning labeling procedure for flow cytometer analysis. The next step was to investigate whether this specific and sensitive labeling enables the time course of the expression of recombinant proteins on the surface of E. coli to be monitored after induction. For this purpose, IPTG was added to the samples with E. coli BL21 (DE3) pET-SH4 cells to start the expression of FP-CT.
  • Example 6 Flow cytometric sorting of individual cells that carry a cysteine-containing protein on the surface
  • E. coli BL21 (DE3) pET-SH4 cells expressing FP-CT with a single cysteine and E. coli BL21 (DE3) pET-SH3 expressing FP-ET without cysteine were in a ratio of 1: 1 mixed, labeled with fluorescein-maleimide and analyzed by flow cytometry. As can be seen from FIG. 8C, this resulted in two cell populations in a sample, which could be distinguished by their fluorescence intensity. The relative fluorescence strengths of both cell populations were identical to those obtained when cells from BL21 (DE3) pET-SH3 (FP-ET) and pET-SH4 (FP-CT) were labeled and analyzed separately (FIG.
  • FIG. 8C a sorting window was defined in the mixed sample (FIG. 8C), so that cells with a fluorescence that corresponded to that of FP-CT-positive cells (FIG. 8B) were sorted out by the sorting module of the FACSCalibur cytometer. These cells were collected and, after a subset of cells were removed for growth and subsequent DNA analysis, flow cytometry again subjected ,.
  • Figure 8D shows the fluorescence distribution of the cells in the sorted sample. As can be seen, after only one round of cell sorting, a population with high fluorescence, corresponding to the FP-CT cells, was sorted out from the mixture of positive and negative cells.
  • the labeling method according to the invention consequently enables that from a mixture of cells which express a certain desired protein, for example an enzyme, and non-expressing cells, those cells which express the desired protein are selected quickly and with high throughput in order to optimize them Preserve cell population before it is used in an industrial or synthetic process.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • Adx contains five cysteines and an iron-sulfur cluster as a prosthetic group. Four of the five cysteines are involved in the binding of the [2Fe-2S] group. It is known in the prior art that apo-Adx is efficiently transported to the E. coli cell surface via the autotransporter path [2 The prosthetic group can be used after the transport to obtain active, electron-transferring holo-Adx [11 ] .
  • Example 8 Monitoring the surface expression of a target peptide passenger protein without cysteines or without accessible cysteines
  • the coding region of this target peptide / passenger protein is inserted into the Plasmid pET-SH4 used at the Xbal, Xh ⁇ l, or Bgl ⁇ l restriction site (Fig. 3). This leads to co-secretion of the cysteine derived from pET-SH4 and the surface translocation of the recombinant target peptide / passenger can be demonstrated by the co-secreted single cysteine.
  • This method is particularly suitable for the analysis of the surface display of enzymes, - in particular bacterial enzymes and especially esterases and oxidoreductases, - for which no specific antibody is available. Transport and surface accessibility are verified by cysteine labeling and subsequent Western blot-like experiments.
  • Example 9 Suitability of maleimide and maleimide derivatives for the labeling of cysteine according to the invention
  • the method according to the invention using maleimide and / or its derivatives is consequently also suitable for distinguishing a surface exposure from, for example, the periplasmic localization of a protein that one or more Contains cysteine.
  • Example 10 Use of the method according to the invention for protein purification
  • the gene for a specific IgAl protease cleavage site was inserted during the vector construction (described in the previous examples) (Fig. 3).
  • the external addition of a site-specific IgAl protease releases the target peptide / passenger protein with the attached cysteine if the corresponding gene has been inserted into the vectors pJM1013, pSH4, pET-SH3 or pET-SH4.
  • an additional cleavage site for a site-specific Protease e.g. Factor X, in N-terminal alignment with the cysteine used for purification.
  • the target peptide / passenger with the cysteine coupled to biotin-maleimide is released from the cell surface in a first step by using an IgAl protease and then the protein is e.g. using a strepavidin-coated column (or other strepavidin-coated support).
  • factor X releases the purified target peptide / passenger protein from the column, leaving behind the cysteine used for the purification.
  • Example 11 Use of the method according to the invention for the purification of cells
  • those cells are purified which express on their surface a particular, particularly desired, recombinant peptide or protein which has at least one accessible cysteine.
  • all cells are subjected to a labeling reaction with biotin-maleimide. Only those cells which express the particular, in particular desired, recombinant polypeptide or protein with the accessible cysteine (s) on their surface become actual in the course of this reaction marked with biotin-maleimide.
  • These labeled cells are then coupled to streptavidin-coated beads, streptavidin-agarose, or any other streptavidin-modified matrix, for example in liquid chromatography columns, and in this way enriched from the mixture of cells.
  • cells which have a Expressing an enzyme, an antibody or another functional protein on the surface can be immobilized for use in continuous reactions.
  • cells can be fixed to membranes with this method, for example in surface plasmon resonance experiments.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Das Verfahren zum Nachweis der Expression eines rekombinanten Polypeptids in/an/auf der Zelloberfläche seiner Wirtszelle zeichnet sich dadurch aus, daß man (a) das rekombinante Polypeptid derart konstruiert, daß es in einem dem äußeren Medium der Wirtszelle zugänglichen Abschnitt wenigstens einmal die Aminosäure Cystein aufweist, daß man (b) die Wirtszelle einem äußeren Medium aussetzt, welches eine Markersubstanz enthält, die spezifisch an Cystein bindet, daß man (c) die Bindungsreaktion zwischen Cystein und der Markersubstanz herbeiführt, und daß man (d) die Wirtszelle anschließend einem Prozess zur Detektion der Cystein-Marker­Verbindungen unterwirft.

Description

Verfahren zum Nachweis der Expression rekombinanter Proteine an einer Zelloberfläche und zur Immobilisierung und Aufreinigung von
Zellen und Proteinen
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines durch Rekombination erzeugten Polypeptids in einer demgemäß transformierten Wirtszelle, wobei das rekombinante Polypeptid in oder an der die Wirtszelle gegen das sie umgebende äußeren Medium abgrenzenden Zelloberfläche repräsentiert wird und wenigstens einen von dem äußeren Medium aus zugänglichen Abschnitt aufweist.
Die Darstellung eines Proteins mit einer bestimmten, gewünschten Funktion in großer Zahl an der Oberfläche einer lebenden Zelle ist eine herausfordernde Aufgabe mit zunehmender Bedeutung für viele Bereiche der Biochemie und Biotechnologie'1'. Durch die Darstellung von Enzymen werden ganze Zellbiofabriken erhalten, die für die betreffenden Substrate ohne Einschränkung zugänglich sind, und die in den meisten Fällen in industriellen Verfahren leichter zu handhaben, zu immobilisieren und zu stabilisieren sind als das freie Enzymmolekül [2l Ein reiner Biokatalysator kann durch einen einfachen Zentrifugationsschritt erhalten werden [3]. Die Darstellung bestimmter, mittels Rekombination erzeugter Proteine an der Oberfläche der Wirtszelle, das sogenannte "zelluläre Surface-Display" hat einen weiteren signifikanten Vorteil bei der Erstellung und Durchmusterung von Peptid- oder Proteinbanken für die Durchführung einer Laborevolution [4]. Durch die Wahl der richtigen an der Oberfläche exprimierten Struktur wird die Zelle mit dem entsprechenden Gen, das als intrinsische Markierung dient, co-selektiert und kann in weiteren Studien und Anwendungen verwendet werden. Erst kürzlich hat das zelluläre Surface-Display zu einem vielversprechenden Fortschritt in dem Bereich oraler Impfstoffe [5] und in der Entwicklung biologischer Umweltadsorptionsstoffe geführt [6l Vor diesem Hintergrund ist es offensichtlich, dass Systeme für das Surface-Display eines breiten Spektrums von Molekülen benötigt werden sowie Werkzeuge, welche die Analyse und Auswertung dieser Systeme hinsichtlich ihrer Effizienz erlauben, Die betreffenden Techniken müssen für automatisierte Prozesse geeignet sein, um einen hohen Durchsatz zu ermöglichen. Bisher ist jedoch in allen Fällen die Erfassung des Surface-Displays von besonderen Eigenschaften des darzustellenden Moleküls abhängig gewesen, nämlich entweder von dessen Affinität zu einem Antikörper oder von einer bestimmten katalytischen Aktivität, Dies hat die vielversprechende Strategie des zellulären Surface-Displays bisher auf eine begrenzte Zahl von Kandidatenmolekülen eingeschränkt.
Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren aufzuzeigen, welches eine Verifizierung und Quantifizierung des zellulären Surface- Displays unabhängig von den antigenen oder katalytischen Eigenschaften des angezeigten/dargestellten Moleküls ermöglicht.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens der eingangs genannten Art, das sich dadurch auszeichnet, daß man (a) das rekombinante Polypeptid derart konstruiert, daß es in dem zugänglichen Abschnitt wenigstens einmal die Aminosäure Cystein aufweist, daß man (b) die Wirtszelle einem äußeren Medium aussetzt, welches eine Markersubstanz enthält, die spezifisch an Cystein bindet , daß man (c) die Bindungsreaktion zwischen Cystein und der Markersubstanz herbeifuhrt, und daß man (d) die Wirtszelle anschließend einem Prozess zur Detektion der Cystein-Marker- Verbindungen unterwirft.
Unter Zelloberfläche wird im folgenden diejenige Hülle einer Zelle verstanden, die in Kontakt mit dem äußeren Medium steht, Der Begriff Zelloberfläche umfaßt infolgedessen insbesondere die sogenannte "äußere Membran"/" Außenmembran" von Gram negativen Bakterien, den Mureinsacculus von Gram positiven Bakterien, die Zellwand von Hefepilzen, die Zellwand von Pflanzenzellen und die Cytoplasmamembran tierischer Zellen.
Das gewünschte Polypeptid bzw. Protein, daß mittels Rekombination in, an oder auf der Zelloberfläche der Wirtszelle erzeugt wird, wird im folgenden mit "Zielpolypeptid" bezeichnet
Die Erfindung beruht auf der Kombination von zwei beobachteten Phänomenen: Erstens enthalten die in der Natur vorkommenden Oberflächenproteine (= Zeilhüllproteine = Proteine der Außenmembran) der Gram-negativen Bakterien, insbesondere Escherichia coli, faktisch keine Cysteine, die an der Oberfläche zugänglich sind [7]. Zweitens gibt es spezifische Markierungsverfahren für Cysteine, insbesondere die Michael-Addition von Cystein an die Doppelbindung von Maleinimid und seinen Derivaten [ ] [91 (Fig. 1).
Die erfindungsgemäße Markierung ermöglicht zum einen die Beobachtung, Kontrolle und den Nachweis des Surface-Displays von Zielpolypeptiden mit verschiedenen Methoden, einschließlich der Durchflusszytometrie, und zum anderen können einzelne Zellen mit cyst einhaltigen Proteinen an ihrer Oberfläche mittels FACS selektiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ein Monitoring (d.h. die Beobachtung, Kontrolle und den Nachweis) des Surface-Displays rekombinanter Proteine und damit der darin enthaltenen Zielpolypeptide. ohne dafür spezifische Antikörper oder enzymatische Reaktionen verwenden zu müssen. Das Verfahren ist leicht durchzuführen und kann ohne Aufwand in Kombination mit verschiedenen analytischen Verfahren, einschließlich des Western-Blots, der Spektralphot ometrie und Durchflusszytometrie, angewendet werden, Deshalb ist dieses Verfahren nicht nur beim Monitoring der Expression und Repräsentation rekombinanter Proteine an der Zelloberfläche der Wirtszelle von Vorteil, sondern ebenso als Werkzeug für analytische Zwecke und Selektionszwecke, insbesondere solche mit hohem Durchsatz, die auf Durchflusszytometrie basieren, Einzelne Zellen, die ein bestimmtes Polypeptid bzw. Protein an ihrer Oberfläche tragen, welches unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens markiert wurde, können mittels Zellsortierung im Durchflußzytometer (= FACS = jTuorescence Activated Cell Sorting) selektiert werden.
Das erfindungsgemäß Verfahren kann auch zur Proteinreinigung oder Reinigung von Zellen verwendet werden, die ein bestimmtes, rekombinantes Polypeptid bzw. Protein, welches das Zielpolypeptid enthält, exprimieren. Durch Markierung mit beispielsweise Biotin-Maleinimid können ganze Zellen, die ein einziges Cystein an ihrer Oberfläche exprimieren, an Streptavidin-überzogene Kügelchen, Streptavidin-Agarose, oder jede andere Streptavidin-modifizierte Matrix gekoppelt werden, z.B. in Flüssigchromatographiesäulen. Auf diese Weise können die Zellen, die das gewünschte rekombinante Polypeptid bzw. Protein mit einem oder mehrere exponierten Cysteinen an ihrer Oberfläche exprimieren, aus einer Mischung von Zellen angereichert werden, die dieses Polypeptid/Protein und damit das Zielpolypeptid nicht exprimieren. Ferner können mit dem erfindungsgemäß Verfahren Zellen, die ein Enzym, einen Antikörper oder ein anderes funktionales Protein an der Oberfläche exprimieren, immobilisiert werden, um in kontinuierlichen Reaktionen verwendet zu werden. Auf ähnliche Weise können Zellen an Membranen fixiert werden, um z.B. für Oberflächenplasmon-Resonanzexperimente verwendet zu werden. Wenn das erfindungsgemäß mit einem oder mehreren Cysteinen versehene rekombinante Polypeptid bzw. Protein in den Überstand freigesetzt wird, z.B. durch eine ortsspezifische Protease, kann es in einem einzigen Schritt unter Nutzung der Affinität für Streptavidin gereinigt werden.
Ein großer Vorteil der erfindungsgemäß Verfahrens besteht darin, dass eine einzige Aminosäure, nämlich ein einziges Cystein, zum Nachweis des rekombinanten Polypeptids bzw, des Zielpolypeptids ausreicht. Inhärente Cysteine können für die Markierung und Reinigung verwendet werden oder, wenn das Protein frei von Cysteinen ist, kann ein einziges Cystein hinzugefügt werden. Das Hinzufügen eines einzelnen Cysteins stört die natürliche Struktur und das Faltverhalten des Proteins weit weniger als die mindestens 5-8 Aminosäuren, die für die im Stand der Technik bisher eingesetzte 'Εpitop- Kennzeichnungsstrategie" = "Epitop-Tagging" notwendig sind [21], oder die 4-6 Aminosäuren, die für die bekannte "Ηis — Kerinzeichnungsstrategie" = "His-Tagging" notwendig sind [6]. (Bei diesen beiden Strategien wird das lineare Epitop eines monoklonalen Antikörpers mit dem rekombinanten Protein verbunden und die Oberflächentranslokation kann mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers in Western- Blots, indirekten Immunofluoreszenz- oder ELISA-artigen Experimenten verfolgt werden.)
Das rekombinante Polypeptid wird vorzugsweise derart konstruiert, daß man (a) eine Nukleinsäure bereit stellt, die die für das rekombinante Polypeptid und dessen Repräsentation an der Zelloberfläche kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei diese Nukleotidsequenz in ihrem für den zugänglichen Abschnitt des Polypeptids kodierenden Bereich wenigstens ein Cystein-Codon (TGT, TGC) aufweist, welches entweder natürlicherweise in dem für den zugänglichen Abschnitt kodierenden Bereich der Nukleotidsequenz enthalten ist oder artifiziell in diesen Bereich eingeführt bzw. eingebaut wird, daß man (b) diese Nukleinsäure in eine Wirtszelle einschleust, und daß man (c) die Expression dieser Nukleinsäure in der Wirtszelle herbeiführt.
Der Einbau des Cystein-Codons kann entweder als Insertion oder als Substitution durchgeführt werden und prinzipiell an jeder beliebigen Stelle der Nukleotidsequenz erfolgen, vorausgesetzt diese Stelle kodiert den zugänglichen Abschnitt des rekombinanten Polypeptids zumindest derart mit, daß das Cystein in diesem zugänglichen Abschnitt enthalten ist.
Die Nukleinsäure, die die für das rekombinante Polypeptid und dessen Repräsentation an der Zelloberfläche kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, kann insbesondere derart konstruiert sein, daß sie für ein Fusionsprotein kodiert, welches aus dem in/an/auf der Zelloberfläche repräsentierten Zielpolypeptid und einem für dessen Expression und Repräsentation notwendigen Helfer-Polypeptid besteht, und daß sie folglich sowohl die für Zielpolypeptid als auch die für das Helfer-Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfaßt.
Das wenigstens eine Cystein kann in diesem Fall entweder für das Zielpolypeptid oder in der für das Helfer-Polypeptid kodierenden Nukleotidsequenz vorhanden sein bzw. eingebaut werden, vorausgesetzt es wird in dem zugänglichen Abschnitt des rekombinanten Polypeptids /Proteins exprimiert.
Eine in der Praxis bewährte Ausführungsform der Nukleinsäure kodiert für ein Fusionsprotein, welches aus einem N-terminalen Signalpeptid, dem Zielpolypeptid (hier auch "Passagierpolypeptid"), einem Linker-Polypeptid und einer C-terminalen Transportdomäne eines Autotransporters besteht.
Bei dieser Ausführungsform wird das (gegebenenfalls einzige) Cystein vorzugsweise in die Linkerregion eingesetzt (Fig. 3).
In der Linkerregion kann außerdem eine Protease-Bindungsstelle vorhanden bzw. eingebaut sein, insbesondere eine, die selektiv für IgA-Protease ist. Die Transportdomäne eines Autotransporters ist im Prinzip beliebige wählbar, vorzugsweise wird jedoch eine solche Transportdomäne eingesetzt, die eine ß-Fassstruktur ausbilden kann. Eine detaillierte Beschreibung solcher Transportdomänen eines Autotransporters ist in der WO 97/35022 offenbart, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Bevorzugte Transportdomänen eines Autotransportes sind ausgewählt aus der Gruppe: E. coli ALDA I Protein, Shigella flexneri SepA Protein, Shigella flexneri IcsA Protein, E. coli Tsh Protein, Serratia marcescens Ssp Protein, Helicobacter mustelae Hsr Protein, Bordetella ssp. Prn Protein, Haemophilus influenzae Hap Protein, Bordetella pertussis BrkA Protein, Helicobater pylori VacA Protein, Oberflächenprotein SpaP oder rOmpB oder SlpT von Rickettsia, IgA Protease von Neisseria oder Haemophilus und Varianten davon,
Die Nukleinsäure kann als Vektor realisiert sein, der Elemente für die Replikation, die Klonierung und das Surface Display des rekombinanten Polypeptids umfaßt. Ein bevorzugter Vektor ist das Plasmid pET-SH4 mit einem Autotransporter-Konstrukt und den Xbal, Xhol und Bg/II Schnittstellen (Fig. 3). Wenn die kodierende Region eines Cystein-freien Zielpolypeptids an diesen Schnittstellen in das Plasmid eingefügt wird, liefert das Plasmid das für die erfindungsgemäße Markierung notwendige Cystein in dem zugänglichen Abschnitt des rekombinanten Polypeptids bzw, Proteins, Das Einschleusen der Nukleinsäure in eine Wirtszelle kann mit den im Stand der Technik bekannten und geläufigen Methoden wie z.B. Elektroporation durchgeführt werden. Als in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Wirtszellen eignen sich vor allem Bakterienzellen, insbesondere Gram-negative Bakterienzellen, und unter diesen vorzugsweise Enterobakterienzellen.
Besonders geeignet sind Bakterienzellen , die aus der Gruppe Escherichia coli, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Helicobacter mustelae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Rickettsia sp. und Neisseria sp. ist ausgewählt sind.
In der Praxis hat sich vor allem die Bakteriengattung E. coli bewährt, und hierunter ganz besonders der Stamm E. coli JK321 (DSM 8860), der in der US 6,040,141 detailliert beschrieben ist, Auf den Inhalt dieser Patentschrift wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle kann unter der Kontrolle eines allgemein bekannten Promotors erfolgen. Im Fall der Verwendung von Gram-negativen Bakterien als Wirtszellen wird der Einsatz des T7/lacZ Promotors oder des Promotors von pJM1013 vorgeschlagen.
Als Markersubstanz in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise Maleinimid und/oder ein Maleinimidderivat eingesetzt, wobei die Bindungsreaktion mit dem Cystein eine Michael-Additions-Reaktion ist, d.h. eine Michael-Addition von Cystein an die Doppelbindung verschiedener Maleinimid-Derivate, Die Maleinimid- Reaktion mit Sulfhydryl-Gruppen wurde bereits in makromolekularen Prodrug- Konzepten erfolgreich angewendet tl6], und ebendo in der Verlängerung der in-vivo Halbwertzeit von therapeutischen Antikörperfragmenten [17] und in Untersuchungen der Struktur bakterieller Rezeptoren [7' 1 ].
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zwei Formen von Maleinimid-Derivaten bevorzugt angewendet, nämlich biotinyliertes Maleinimid und Fluoreszein- Maleinimid. Biotinyliertes Maleinimid eignet sich besonders gut für die photometrischen Detektion und Filterdetektion im Anschluß an ein Western-Blotting. Fluoreszein-Maleinimid wird als bevorzugter Marker für eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und Durchflusszytometer-Analyse (FACS-Prozesse) vorgeschlagen.
Im Verlauf der Entstehung vorliegender Erfindung hat sich erwiesen, daß ein einziges Cystein in dem an der Zelloberfläche präsentierten (Abschnitt des) rekombinanten Protein(s) ausreicht, um eine effiziente und nachweisbare Markierung durch beide Maleinimid-Derivate zu erhalten.
Als Alternative zu der Maleinimid-/Maleinimid-Derivat-Markierung wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, die spezifische Markierung der Sulfhydrylgruppe von Cysteinen durch Alkylierung mittels Holoacetyl-Derivaten oder durch Behandlung mit Pyridyl-disulfid-Derivaten durchzuführen.
Beide Markierungsverfahren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und geläufig [9] [27].
Eine bedeutsamer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren besteht nicht zuletzt darin, daß das Verfahren an lebenden Zellen anwendbar ist.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mit dazugehörigen Figuren näher erläutert. Die dargestellten Daten wurden mit Autodisplay, einem im Stand der Technik bekannt und geläufigen Surface-Display- System erhalten, das auf dem Autotransporter-Sekretionsmechanismus beruht [10' nl. Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber selbstverständlich auch in Kombination mit anderen Surface-Display-Systemen [22] [23] [4] [24] angewenciet werden. Es zeigen
Figur 1 : die Michael- Addition einer Sulfhydryl-Gruppe an die Doppelbindung einer
Maleinimid-Gruppe.
Figur 2: die Struktur (A) und den Sekretionsmechanismus (B) der
Autotransporterfamilie sezernierter Proteine, Durch die Verwendung eines typischen Signalpeptids wird ein Vorläuferprotein über die Innenmembran transloziert. Sobald es am Periplasma eintrifft, faltet sich der C-terminale Teil des Vorläufers wie eine porinartige Struktur als sogenanntes ß-Fass in die Außenmembranen, und das Zielpeptid (der Passagier) wird zu der Zelloberfläche transloziert. Für Autodisplays wird das Signalpeptid der Cholera-Toxin ß-Untereinheit und das ß-Fass sowie die Linkerregion des Adhesins AIDA-I von E. coli verwendet, wie in Maurer et al. beschrieben ist fl0].
SP = Signalpeptid; DM = Innenmembran; PP = Periplasma; OM = Außenmembran
Figur 3 : die Struktur der Autotransporter-Fusionproteine, für die verschiedene der verwendeten Piasmide kodieren. Die Umgebungen der ZieJpeptid- Insertionsstelle, die notwendig ist, um eine Oberflächentranslokation zu erhalten, sind als Sequenzen angegeben. Restriktionsendonuklease- Spaltungsstellen sind unterstrichen, Die Signalpeptidase-Spaltungsstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die ortsspezifische Spaltungsstelle für IgAl-Protease in dem erhaltenen Fusionsprotein ist kursiv gedruckt und das lineare Epitop für einen monoklonalen Maus-Antikörper, das als interne Kontrolle verwendet wurde, ist fett gedruckt. Das einzelne Cystein, das für die Markierung und Detektion verwendet wurde, ist schwarz hinterlegt. p = Plasmid, FP = Fusionsprotein; ET = epitophaltig, CT = Cystein enthaltendes "Cystop";
FP-CT enthält vier Aminosäuren mehr als FP-ET, daher ist das Molekulargewicht etwas höher. Die Cpol Restriktionsstelle (nicht dargestellt), die für Klonierungszwecke verwendet wurde, befindet sich 155 bp stromabwärts der unterstrichenen BgM Restriktionsstelle.
Figur 4: die Oberflächentranslokation und Zugänglichkeit von FP-ET und FP-CT.
Von E. coli JK321 pJM1013 (FP-ET) und JK321 pSH4 (FP-CT) wurden die Außenmembranen präpariert und einer SDS Gelelektrophorese auf einem 12,5 % PA-Gel unterworfen, gefolgt von einer Coomassie- Brillantblau-Färbung. (A). Nach der Übertragung auf eine PVDF-
Filtermembran wurden Proteine durch den epitop spezifischen monoklonalen Maus-Antikörper (B) oder durch Biotin-Maleinimid-
Kopplung, gefolgt von der Zugabe von Streptavidin-alkalische
Phosphatase-Konjugat (C) nachgewiesen. Das Molekulargewicht von
Markerproteinen ist links in kDa angegeben.
Trypsin +/- : Ganze Zellen wurden mit Trypsin behandelt, bevor die
Außenmembranen präpariert wurden (+), oder nicht (-).
Natürliche Außenmembranproteine OmpF/C und OmpA sind durch Pfeile gekennzeichnet,
T= trypsinbeständiger, in Membran eingebetteter Autotransporter-Kern
(siehe Fig, 2).
Figur 5: ein induzierbares Surface-Display und dessen Detektion durch cyst einspezifische Markierung mit Biotin-Maleinimid: Außenmembranen von £. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4 wurden vor (-) und 30 Minuten nach der Induktion mit LPTG (+) präpariert und einer SDS- Gelelektrophorese auf einem 12,5 % PA Gel mit anschließender Coomassie-Brillantblau-Färbung unterworfen (A). Nach der Übertragung auf einen PVDF-Membranfilter wurden die Proteine entweder durch epitopspezifischen monoklonalen Maus- Antikörper Du 142 (B) oder durch Biotin-Maleinimid-Kopplung, gefolgt von der Zugabe eines Streptavidin- alkalische Phosphatase-Konjugats (C) nachgewiesen. Die Molekulargewichte der Markerproteine sind links in kDa angegeben. Natürliche Außenmembranproteine OmpF/C und OmpA sind durch Pfeile gekennzeichnet,
Figur 6: eine durchflusszytometrische Analyse ganzer Zellen von E. coli, die FP-
ET (A) und FP-CT (B) exprimieren. E. coli BL21 (DE3) pLysS, enthaltend pET-SH3 (FP-ET) und BL21 (DE3) pLysS, enthaltend pET- SH4 (FP-CT), wurden 30 Minuten nach der Induktion mittels EPTG mit Fluoreszein-Maleinimid markiert und einer Durchflusszytometrie unterworfen. Für jede Probe wurden 10 000 Zellen analysiert. Die Fluoreszenz der Zellen ist als Histrograrrimkurve dargestellt, 30 Minuten nach der Induktion mit LPTG. Der Mittelwert der Fluoreszenz von E. coli Zellen, die FP-CT (328, B) exprimieren, ist fast 11 mal höher als der Mittelwert der Fluoreszenz von Zellen, die FP-ET (30, A) exprimieren.
Figur 7: den Zeitverlauf des induzierten Surface-Displays, überwacht durch
Fluoreszein-Maleinimid Markierung und Durchflusszytometrie, Zellen, die FP-CT exprimieren (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4 - schwarze Quadrate), und Zellen, die FP-ET exprimieren (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH3 - offene Kreise), wurden mit LPTG induziert. Zu den angegeben Zeitpunkten wurden Proben genommen und mit Fluoreszein- Maleinimid markiert. Für jede Probe wurde der Mittelwert der Fluoreszenz für 10 000 Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt und gegen die Zeit nach der Induktion aufgetragen.
Figur 8: die Zellsortierung im Durchflußzytometer (FACS) von E. coli Zellen, die
FP-CT exprimieren, nach der Markierung mit Fluoreszein-Maleinimid.
(A) Mittlere Fluoreszenz von Zellen, die FP-ET (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH3) exprimieren, markiert mit Fluoreszein-Maleinimid.
(B) Mittlere Fluoreszenz von Zellen, die FP-CT (£. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4) exprimieren, markiert mit Fluoreszein-Maleinimid.
(C) Mittlere Fluoreszenz einer 1: 1 Mischung von Zellen, die FP-ET exprimieren, und Zellen, die FP-CT exprimieren, nach der Markierung mit Fluoreszein-Maleinimid, Das Sortierungsfenster, das für die Selektion stark fluoreszenter Zellen verwendet wurde, ist als schwarzer Balken dargestellt,
(D) Mittlere Fluoreszenz von Zellen nach der FACS in dem in (C) beschriebene Sortierfenster.
Für jede Messung wurden 10 000 Zellen analysiert. Figur 9: die durchflusszytometrische Analyse des Surface-Displays von bovinem
Adenodoxin (Adx), einem von Natur aus cysteinhaltigen Protein. E. coli Zellen BL 21 (DE3), die das Plasmid pET-SH3 enthalten, welches die für Adx kodierende und durch die XbaVBglil Restriktionsstellen eingesetzte DNA enthält, wurden mit Fluorescin-Maleinimid markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert [B]. Die mittlere Fluoreszenz dieser Zellen (271) war im Vergleich zu dem Mittelwert der Fluoreszenz von Zellen, die FP-ET (39) (E. coli BL 21 (DE3) pET-SH3) exprimieren und als Kontrolle verwendet wurden, signifikant erhöht [A],
Verwendete Materialien und Methoden:
Bakterielle Stämme, Plasmide und Kulturbedingungen:
Der E. coli Stamm JK321 (AompTproC leu-6 trpE38 entA zihl2::Tn!0 dsbAwkari), der zur konstitutiven Expression von Fusionsproteinen im Autodisplay verwendet wurde, ist im Stand der Technik bekannt [14l
Der E. coli Stamm BL21 (DE3) pLysS (F ompΥ hsdSB (rB " mB ") gal dem (DE3) pLysS
(CmR), der für die induzierbare Expression verwendet wurde, ist kommerziell erhältlich, beispielsweise bei Stratagene (La Jolla, USA).
Für die induzierbare Expression wurde der Vektor pETl ld verwendet, der kommerziell erhältlich ist, beispielsweise von Novagen, Madison, USA.
Für die Klonierung von PCR-Produkten wurden E. coli TOP 10 (F" mcrA A(mrr- hsdRMS-mcrBC) Φ80/ cZΔM15 Δ/αcX74 deoR recAl αraD139 A(ara-leu) 7697 galü galK rpsL (Str ) endAl nupG) und der Vektor pCR2.1-TOPO verwendet, die beide kommerziell erhältlich sind, beispielsweise bei Invitrogen, Groningen, Niederlande.
Die Züchtung der Bakterien erfolgte routinemäßig bei 37 °C in Luria-Bertani (LB) Nährmedium, das 100 mg Ampicillin pro Liter enthielt. Für Expressionsstudien wurde Ethylendiamintetraacetat (EDTA) zu einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben, und ß-Mercaptoethanol wurde zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben, Rekombinante DNA Techniken:
Das Plasmid pJM1013 wurde in früheren Studien beschrieben und charakterisiert [13]. Es lenkt das Epitop eines monoklonalen Maus-Antikörpers an die Zelloberfläche, wo dieses Epitop durch eine spezifische IgAl-Protease-Spaltungsstelle freigesetzt werden kann, sofern den Zellen extern die Protease zugefügt wird (Fig. 3), Die Expression des Autotransporter-Fusionsproteins in pTM1013 steht unter der Kontrolle des starken konstitutiven Promotors PTK t101.
Zur Konstruktion von pSH4, das ein einziges Cystein enthält, wurde das Gen der Autotransporter-Domänen des Plasmids pJM1013 mittesl PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer sh017 (5'-tct aga ctc gag aga tct tgc cct gaa tat ttc aaa gg-3') und sh002 (5'-cac cac cag acg gtc cgt aag tg-3') amplifiziert. Der Primer sh017 fügt das Codon für ein einziges Cystein hinzu (fett gedruckt) und enthält eine Xho I Restriktionsschnittstelle, die für Kontrolldigestionen verwendet werden kann. Das Fragment, das mittels PCR erhalten wurde, wurde in den Vektor pCR2, 1-TOPO eingesetzt und erneut mit Xbal und Cpöl gespalten. Das Plasmid pJM1013 wurde ebenfalls mit Xbal und Cpöl aufgeschlossen und das mittels PCR erhaltene XbällCpol-Ετ _.%men\ wurde eingefügt. Daraus resultierte das Plasmid pSH4, wie in Fig. 3 dargestellt. Die mittels PCR eingeführte ^ol-Schnittstelle wurde zur Differenzierung zwischen pJM1013 und pSH4 verwendet.
Für die induzierbar Expression wurde das im Handel erhältliche pETl ld Vektor- Backbone von Novagen (Madison, USA) verwendet. Für die anschließenden Klonierungsvorgänge wurden in einem ersten Konstruktionsschritt alle Xbal und Bgtll Restriktionsstellen des Vektors deletiert, Zu diesem Zweck wurde eine PCR mit Oligonukleotid-Primern sh023 (5'-cct agg ggg gaa ttg tta tcc gc-3') und sh024 (5'-tga tca cga tcc cgc gaa att aat acg-3') und dem Plasmid pETl ld als Matrize durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pCR2,l-TOPO eingesetzt, emeut mit Avrll und Bell gespalten, und in den Xbal- und -5 /TJ-eingeschränkten Vektor pETl ld ligiert, was zu pETl l-SH2 führte. Dieser neue Vektor, der durch das vollständige Fehlen von Xbal und BgUl Restriktionsstellen charakterisiert ist, wurde mit Ncol und BamHl gespalten. Die Autotransporter-Domänen, die Signalpeptid, lineares Epitop, Linkerregion und ß-Fass kodierende Regionen enthielten, wurden mittels PCR unter Verwendung von pJM1013 als Matrize und der Oligonukleotide sh015 (5'-cca tgg tta aat taa aat ttg gtg ttt ttt tta cag-3') und sh016 (5'-tga tca tta tca gaa gct gta ttt tat ccc c-3') als Primer amplifiziert. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in pCR2.1 TOPO ligiert. Nach der Spaltung mit Ncol und Bell wurde das Fragment in den Vektor pETl l-SH22 eingesetzt. Daraus resultierte das Plasmid pET-SH3, das wie für ρJM1013 beschrieben die Expression des identischen Autotransporter-Fusionsproteins ermöglicht, jedoch unter der Kontrolle eines induzierbaren T7/Lac-Promotors. Der 73c/T-Schnitt führt zu klebrigen Enden, die mit jenen kompatibel sind, die durch BamHl erzeugt werden. Plasmid pET-SH4 wurde durch Ersetzen des 200 bp Nüfel/C ol-Fragments in pET-SH3 durch das entsprechende Fragment erhalten, das das einzige Cystein enthielt, das durch Spaltung von pSH4 mit Ndel und Cpöl erhalten wurde.
Außenmembranherstellung:
E.coli Zellen wurden über Nacht gezüchtet und die Kultur (1 mL) wurde zum Beimpfen von LB Medium (20 mL) verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln (200 Upm) etwa 5 Stunden gezüchtet, bis eine OD578 von 0,7 erreicht war. Nach der Ernte und dem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden Außenmembranen nach der schnellen Isolierungsmethode von Hantke präpariert [ 5]. Für die Proteasebehandlung ganzer Zellen wurden E. coli Zellen geerntet, gewaschen und in PBS (5 mL) resuspendiert. Trypsin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mgL'1 zugegeben und die Zellen wurden 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Digestion wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit PBS, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthielt, gestoppt, und die Außenmembranen wurden wie zuvor beschrieben präpariert.
Für die induzierbare Expression wurde der Stamm BL21 (DE3) pLysS, der eines der beschriebenen Plasmide (pET-SH3 oder pET-SH4) enthält, über Nacht in LB Medium mit einem Gehalt von 50 μg mL"1 Ampicillin und 34 μg mL"1 Chloramphenicol gezüchtet. Chloramphenicol wurde eingesetzt, um die pLysS-Funktion aufrechtzuerhalten und damit eine strengere Kontrolle zu erreichen, 1 mL dieser Übernacht-Kultur wurde zum Beimpfen von LB Medium (20 mL) verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln (200 Upm) etwa 3 Stunden gezüchtet, bis eine OD578 von 0,6 erreicht war. 1 mM LPTG (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurde für die Induktion hinzugefügt. Nach 30 Minuten (wenn nicht anders angegeben) wurden die Zellen geerntet und die Außenmembranen wurden wie zuvor beschrieben präpariert.
SDS-PAGE und Western-Blot-Analvse:
Außenmembranpräparate wurden mit Probenpuffer (100 mM Tris/HCl (pH 6,8), der 4 % SDS, 0,2 % Bromophenolblau, und 20 % Glycerol enthielt, im Verhältnis 1:2 verdünnt. Die Proben wurden 10 Minuten bei 95°C gekocht und auf einem 12,5 % SDS-PA-Gel analysiert, Proteine wurden durch Coomassie-Brillantblau-Färbung sichtbar gemacht. Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) wurden zur Berechnung des scheinbaren Molekulargewichts der Außenmembranproteine verwendet. Für die Western-Blot-Analyse wurden Gele auf Polyvinyliden-Difluorid (PVDF)-Membranen unter Verwendung eines Mini Trans-Blot-Apparates von Bio-Rad Laboratories (München, BRD) elektrogeblottet und die geblotteten Membranen wurden in TBS mit 3 % FCS über Nacht blockiert.
Biotin-Maleinimid-Markierung von ganzen Zellen vor der Präparation der Außenmembran und dem Western-Blotting:
Nach der Ernte wurden die ganzen Zellen drei Mal mit 1 mL eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (10 mM Natriumphosphat, 0,9 % NaCl, 1 mM MgCl2 [pH7,4]), gewaschen, mit 2 % ß-Mercaptoethanol 30 Minuten inkubiert und fünf Mal mit eiskalter PBS gewaschen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet wurde in 5 ml Biotin-Maleinimid (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) (100 μM in PBS, enthaltend 1 % Dimethylformamid) resuspendiert [7l Nach einer Inkubation über 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen dreimal mit PBS wie zuvor beschrieben gewaschen. Zellen, die nach diesem Protokoll markiert waren, wurden für die Außenmembranherstellung und anschließendes Western-Blotting aufgebrochen. Nach dem Blotten wurden die Membranen in PBS mit 3 % FCS 1 Stunde blockiert, dann mit Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Gibco BRL, Gaithersburg, USA), 1 : 10 000 verdünnt in PBS mit 3 % FCS, 45 Minuten inkubiert, und vier Mal mit PBS gewaschen [26]. Durch Zugabe von 10 mL Inkubationspuffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5), der 66 μL Nitroblautetrazoliumchlorid (50 mg mL"1 in 70 % Dimethylformamid) und 33 μL 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat- Dinatriumsalz (20 mg mL"1 in H2O) enthielt, wurde eine Farbreaktion erhalten.
Immunodetektion des linearen Peptidepitops PEYFK, das als Kontrolle verwendet wird:
Zur Immunodetektion wurden Membrane 3 Stunden mit Anti-PEYFK- Antikörper Du 142 1131 im Verhältnis 1 :35 verdünnt in TBS mit 3 % FCS, inkubiert. Vor der Zugabe des sekundären Antikörpers wurden Immunoblots dreimal mit TBS gewaschen, das 0,1 % Tween 20 enthielt. Antigen-Antikörper-Konjugate wurden durch die Reaktion mit alkalische Phosphatase-gebundenem, sekundären Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (KPL, Gaithersburg, USA), 1: 10 000 verdünnt in TBS, das 3 % FCS enthielt, sichtbar gemacht. Eine Farbreaktion wurde durch Zugabe von 10 mL Inkubationspuffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5) erreicht, der 66 μL Nitroblautetrazoliumchlorid (50 mg mL"1 in 70 % Dimethylformamid) und 33 μL 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphate-Dinatriumsalz (20 mg mL"1 in H20) enthielt,
Biotin-Maleinimid-Markierung von ganzen Zellen und photometrische Analyse:
1 ml einer Übernacht-Kultur wurde zu 20 ml LB-Medium zugegeben, das 100 μg mL"1 Ampicillin enthielt. Die Zellen wurden bei 37 °C unter Schütteln bei 200 Upm gezüchtet, bis eine ODS78=3 erreicht war, lxlO9 Zellen wurden durch Zentrifugation bei 14 000 x g über 2 Minuten bei 4 °C geerntet. Alle Schritte wurden in 2 ml Eppendorf- Reaktionsröhrchen durchgeführt, Nach dreimaligem Waschen mit 1 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) wurden die Zellen in 1ml PBS mit einem Gehalt an 2 % ß-Mercaptoethanol 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach fünf Waschschritte mit 1 ml eiskalter PBS folgten. Die Zellen wurden bei 30 °C in 1 ml 500 μM Biotin-Maleinimid (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), aufgelöst in PBS mit einem Gehalt an 1 % Dimethylsulfoxid 25 Minuten inkubiert [7]. Nach dreimaligem Waschen mit eiskalter 3 % BSA haltiger PBS wurden die Zellen in 1 ml 3 % BSA haltger PBS 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wonach eine Zentrifügation folgte. Danach wurden die Zellen in Streptavidin-ß-Galactosidase-Lösung (6,5 μg mL"1 in PBS mit 2 % BSA) resuspendiert und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach vier Waschschritte mit eiskalter PBS folgten, Schließlich wurden die Zellen in 2 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer resuspendiert und die OD578 wurde bestimmt. 1 ml dieser Lösung wurde zu 200 μl o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG, 4 mg/ml in PBS, pH 7,0) zugegeben und bei 28 °C 5 Minuten inkubiert. Nach der Zugabe von 500 μl 1 Na2C03 wurden die Zellen durch Zentrifügation (10 Minuten, 5000 x g, 4 °C) pelletiert und die Absorption des Überstandes wurde bei 405 nm bestimmt. Die ß-Galactosidase- Aktivität, die den Cystein-Molekülen entspricht, die an der Zelloberfläche zugänglich sind, wurde in Miller-Einheiten nach Giacomini berechnet [15l Reaktionszeit (5 Minuten) und Reaktionsvolumen (1 ml) wurden während der gesamten Messung konstant gehalten,
Fluoreszein-Maleinimid-Markierung ganzer Zellen und durchflusszytometrische Analyse:
1 ml einer Übernacht-Kultur wurde zu 20 ml LB-Medium hinzugefügt, das 100 μg ml"1 Ampicillin enthielt. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln bei 200 Upm gezüchtet, bis eine erreicht war, lxl 09 Zellen wurden durch Zentrifügation bei 14 000 x g über 2 Minuten bei 4 °C geerntet. Alle Schritte wurden in 2 ml Eppendorf- Reaktionsröhrchen durchgeführt, Die Zellen wurden drei Mal mit eiskalter, sterilfiltrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in 1 ml 10 μM Fluoreszein-5- Maleinimid (F-M) (Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande), aufgelöst in PBS mit einem gehalt an 1 % Dimethylformamid, suspendiert und im Dunkeln bei 30 °C 10 Minuten inkubiert, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 20 mM DTT gestoppt wurde. Überschüssiges Fluoreszein-Maleinimid wurde durch fünfmaliges Waschen der Zellen mit 1 ml PBS entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert und auf eine End-OD578 von 0,05 für die anschließende FACS-Analyse verdünnt. Die Fluoreszenz wurde in einem Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm bestimmt. In den Figuren ist der Mittelwert der Fluoreszenz von 10 000 gemessenen Zellen angegeben.
Surface-Display
Die in den Beispielen genannten Daten zum Surface-Display eines rekombinanten Proteins wurden mit Hilfe von "Autodisplay", einem im Stand der Technik bekannten, effizienten Surface-Display-System erhalten, das für E. coli etabliert, Einzelheiten dieses Surface-Display-Systems sind von J. Maurer, J. Jose, T, F. und Meyer, in J Bacteriol 1997, 179, 794 [10] und von J. Jose, F. Hannemann und R, Bernhardt in ChemBioChem 2001, 2, 695 tll] beschrieben. Auf den Inhalt dieser Publikationen wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen, Dieses Surface-Display mittels Autodisplay basiert auf dem Autotransporter-Sekretionsmechanismus [12].
Anstelle von Autodisplay sind aber auch andere Systeme für die Analyse des Surface- Displays rekombinanter Proteine vostellbar, insbesondere unter Verwendung anderer Wirtszellen als E. coli.
Beispiel 1: Konstruktion eines Zielpeptids (Passengers) mit einem einzigen Cystein
Das Surface-Display eines in einem rekombinanten Protein enthaltenen Zielpeptids, eines sogenannten Passengers, mittels Autodisplay in E. coli beruht auf dem Autotransporter- Sekretionspfad [12] und erfordert die Integration des Zielpeptids in einen Polyproteinvorläufer mit definierter Struktur (Fig. 2). Für diesen Zweck muss ein künstliches Gen durch PCR konstruiert werden, das für ein N-terminales Signalpeptid (SP), für das Zielpeptid bzw, den Passenger, für ein sogenanntes Linkerpeptid und für den C-terminalen ß-Kern kodiert. Mit , Hilfe des SP wird der Vorläufer über die Innenmembran transloziert und die Außenmembran-Translokation wird durch das ß-Fass ("ß-core") erleichtert, das bzw, der eine porinartige Struktur bildet. Um die vollständige Oberflächenexposition des Zielpeptids/Passenger-Proteins zu erhalten, ist ein Linkerpeptid notwendig [10] [11] (Fig. 2). In den vorliegenden Beispielen wurde das im Stand der Technik bekannte Plasmid pJM1013 [13] verwendet, um das Gen für ein Zielpeptid/Passenger-Protein mit einem einzigen Cystein zu konstruieren. Das Plasmid pJM1013 ist von J. Maurer et al in J Bacteriol 1999, 181, 7014 ausführlich beschrieben, und auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Das Plasmid pJM1013 kodiert für ein Vorläuferprotein, das ein effizientes Surface-Display eines Epitops für den monoklonalen Maus- Antikörper Du 142 unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors PTK erleichtert [13]. Durch PCR-Mutagenese wurde in das Plasmid pJM1013 das Codon für ein einziges Cystein und zusätzlich eine ^%oI-Restriktionsstelle eingefügt, wodurch das Plasmid pSH4 erhalten wurde (Fig. 3). Aufgrund dieser Einfügungen unterschieden sich die Proteine, für die pJM1013 (epitophaltiges Fusionsprotein, FP-EP) und pSH4 (cystein- und epitophaltiges Fusionsprotein, FP-CP) kodieren, geringfügig in der Größe. Beide Plasmide wurden in E. coli JK 321 transformiert, einen an das Autodisplay fremder Zielpeptide/Passenger-Proteine gut angepassten Stamm [141 > und der Transport zu der Zelloberfläche wurde analysiert,
Beispiel 2: Sondierung des Surface-Displays von FP-EP, exprimiert von Plasmid pJM1013, und FP-CT, exprimiert von Plasmid pSH4:
Im bisherigen Stand der Technik war die differentielle Zellfraktionierung ein geeignetes Werkzeug, um herauszufinden, ob ein Zielpeptid/Passenger zu der Zelloberfläche transportiert wird [10] [11] [2] [3l Wie aus Fig. 4A hervorgeht, war es mit dieser Methode möglich, ein Protein korrekter Größe in der Außenmembranfraktion von E. coli JK321, die Plasmid pSH4 enthält, wie auch in JK321 mit Plasmid pJM1013 nachzuweisen. In beiden Fällen war die Expression annähernd so hoch wie bei den natürlichen Außenmembranproteinen OmpA und OmpF/C. Ein ähnliches Protein war weder in der Cytoplasmafraktion noch in der Innenmembranfraktion (nicht dargestellt) nachweisbar. Durch Western-Blot- Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Du 142 zum Nachweis des von pJM1013 kodierten Zielpeptids/Passengers ergaben beide Proteinbanden ein Signal (Fig. 4B), das ihre Identität als FP-CT (Bahn 1) bzw. FP-ET (Bahn 3) anzeigte. Als nächstes war zu zeigen, dass die Zielpeptid/Passenger-Domäne von FP-CT und FP- ET tatsächlich an der Zelloberfläche exponiert sind. Für diesen Zweck wurden ganze Zellen, die pJM1013 und pSH4 exprimieren, mit Trypsin behandelt, bevor die Außenmembranfraktionen präpariert wurden. Trypsin ist ein zu großes Molekül, um durch die Außenmembran hindurchzugehen. Daher ist die Degradation der Zielpeptid- /Passenger-Domäne durch Trypsin, das den ganzen Zellen zugefügt wird, ein klarer Hinweis auf seine Oberflächenzugänglichkeit. Wie aus Fig. 4A und 4B hervorgeht, führte die externe Trypsinzugabe zu der Degradation von FP-CP (Bahn 2) und FP-EP (Bahn 4). In Coomassie-gefärbten SDS-Gelen (Fig. 3A) war eine zusätzliche Proteinbande nachweisbar, die dem in der Membran eingebetteten und somit trypsinbeständigen ß- Kern entsprach (Fig, 2), Ein identischer, in der Membran eingebetteter, trypsmbeständiger Kern wurde bereits für andere Zielpeptide/Passenger-Proteine beschrieben, die im Autodisplay verwendet wurden fl0] [11].
Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass durch beide Fusionsproteine, FP-CT und FP-ET, die Zielpeptid-/Passenger-Domänen an die Zelloberfläche (= Außenmembran) von E. coli transloziert werden und dort frei zugänglich sind. Da FP- CT einen einzigen Cysteinrest enthält, wurde ein Nachweisverfahren auf der Basis der Maleinimid-Kopplung durchgeführt: Nach SDS-PAGE wurden in derselben Weise wie zuvor für Western-Blot-Experimente beschrieben, Proteinbanden auf einen PVDF- Membranfilter überführt. Anstatt jedoch - wie im Stand der Technik üblich - einen Antikörper für den Nachweis zu verwenden, wurde Biotin-gekoppeltes Maleinimid hinzugefügt und eine Markierung wie vorstehend unter "Verwendete Materialen und Methode" beschrieben durchgeführt (vgl, auch Tabelle 1).
Maleinimid wird durch die Michael-Addition kovalent an den Cysteinrest gebunden, und nach Zugabe von Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat und eines chromogenenen Substrates (X-Phosphat) wird eine nachweisbare Färbung erhalten. Fig, 4C zeigt, daß FP-CT durch diese Prozedur tatsächlich gefärbt wird, FP-ET hingegen nicht. Dieses Ergebnis bestätigt die Effizienz dieses erfindungsgemäßen Cystein- abhängigen, Antikörper-unabhängigen Filterdetektionstests. Beispiel 3: Photometrische Analyse von Zellen, die ein einziges Cystein tragen
Für diesen Zweck wurden identische Mengen mit jeweils 109 Zellen von E. coli JK321 pSH4, die FP-CT mit einem einzigen Cystein exprimieren, und Kontroll-E. coli JK321 pJM1013, die FP-ET ohne Cystein exprimieren, 25 Minuten mit 500 μM Biotin- Maleinimid wie vorstehend unter "Verwendete Materialien und Methoden" beschrieben inkubiert. Nach der Zugabe von Strepatividin-ß-Galactosidase-Konjugat wurden beide Zellproben 5 Minuten mit o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG), einem chromogenen Substrat für ß-Galactosidase, inkubiert. Die Freisetzung von 2-Nitrophenol aufgrund der enzymatischen Aktivität wurde durch Absorption bei 405 nm bestimmt, Zellen, die FP- CT mit einem einzigen Cystein exprimierten, wiesen eine ß-Galactosidase-Aktivität von 153 Miller-Einheiten auf [15] (Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten), während Kontrollzellen, die FP-ET ohne Cystein exprimierten, eine Aktivität von 23 Miller Einheiten zeigten (Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten). Daraus folgt - nach einer Bereinigung der von den Testzellen erhaltenen Werte durch die von den Kontrolzellen erhaltenenen Werte - dass Zellen, die FP-CT exprimieren, eine ß- Galactosidase- Aktivität von 130 Miller-Einheiten aufweisen. Dieser Unterschied in der Aktivität ist auf die spezifische Markierung von Cystein durch Biotin-Maleinimid zurückzuführen. Damit ist gezeigt, dass die Markierung eines einzigen Cysteins, das an der Zelloberfläche einer Bakterienzelle durch Autodisplay exprimiert wird, für die Analyse einer solchen geringen Anzahl von bakteriellen Zellen (109) mittels Photometrie ausreichend ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist folglich auch zur Verwendung in der Online-Überwachung der Proteinproduktion z.B. von Zellen in einem industriellen Verfahren gut geeignet. Es kann insbesondere in Fällen angewendet werden, in denen das Protein selbst das Produkt eines Prozesses ist, z.B. um reine Enzyme zu erhalten, oder auch in Fällen, in denen Zellen erforderlich sind, die hohe Zahlen eines Enzyms oder eines anderen fünktionellen Proteins exprimieren, bevor sie synthetischen Zwecken unterworfen werden. Beispiel 4: Induzierbare Oberflächenexpression eines Zielpeptids/Passenger- Proteins mit einem einzigen Cystein
Für viele industrielle oder synthetische Anwendungen ist es von großem Vorteil, die Expression des gewünschten rekombinanten Proteins auf Transkriptionsebene zu kontrollieren, Zum Beispiel ermöglicht dies die Produktion einer hohen Zahl von Zellen, bevor mit der Expression des rekombinanten Proteins durch Zugabe eines spezifischen Induktors begonnen wird. Um ein induzierbares Autodisplay-System zu erhalten und das erfindungsgemäße cysteinspezifische Markierungsverfahren in der Überwachung der kontrollierten Induktion einer Proteinexpression einzusetzen, wurden Fusionsproteine FP-CT und FP-ET von einem induzierbaren T7/Lac-Promotor exprimiert. Zu diesem Zweck wurde das künstliche Vorläufergen, das für die Autotransporter-Domäne kodiert, mit einem Zielpeptid/Passenger, der ein einziges Cystein (FP-CT) enthält, in den Vektor pETl ld eingesetzt. Dieser Plasmidvektor, der im Handel erhältlich ist, ist für die induzierbare Proteinexpression spezifiziert, Das neue Plasmid, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde als pET-SH4 bezeichnet (Fig. 3), Es ermöglichte die induzierbare Expression des Zielpeptid/Passenger-Proteins FP-CT von dem aus pETl ld stammenden T7/Lac-Promoter. Mit dem Gen, das für FP-ET kodiert, wurde auf gleiche Weise verfahren und dabei das Plasmid pET-SH3 erhalten (Fig. 3), welches als Kontrolle diente, Beide Plasmide wurden in den Bakterienstamm E. coli BL21 (DE3) transformiert, der im Handel frei erhältlich ist und üblicherweise für die T7/Lac- Promoter-vermittelte Induktion der Expression verwendet wird. Die anschließende Proteinexpression wurde analysiert. Wie in Fig, 5 dargestellt, konnte eine sehr große Menge an FP-CT in der Außenmembranfraktion von BL21 (DE3) pET-SH4 Zellen nach der Induktion mit LPTG nachgewiesen werden. Die Expressronsrate war noch höher als jene der natürlichen Außenmembranproteine OmpA und OmpF/C, Sie konnte sowohl in Coomassie-gefärbten SDS-Gelen (Fig, 5A) als auch durch Western-Blotting mit Antikörper DÜ142 (Fig. 5B) nachgewiesen werden.
Nach der Induktion konnte außerdem mittels der cysteinspezifischen Maleinimid- Kopplung eine einzige Proteinbande, entsprechend FP-CT, nachgewiesen werden (Fig. 5C), die in nicht-induzierten Zellen nicht nachweisbar war. Dieses Ergebnis stimmte mit jenen überein, die durch Western-Blot und Coomassie-Färbung von SDS-Gelen erhalten wurden, und zeigt, dass die T7/Lac-Promoter-kontrollierte Expression von FP-CT stringent war.
Beispiel 5: Durchflusszytometrische Analyse von Zellen, die ein Protein mit einem einzigen Cystein tragen
Zellen von E. coli BL21 (DE3) pET-SH4, die FP.-CT exprimieren, wurden mit Fluorescin-Maleinimid markiert (Tab. 1). Zu diesem Zweck wurden Proben einer Zellsupension mit einer
Figure imgf000024_0001
mit 500 μM Fluorescin-Maleinimid 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, nachdem sie 30 Minuten mit LPTG induziert worden waren. Nach Beendigung der Reaktion und Entfernung von überschüssigem Markierungsreagens durch wiederholtes Waschen mit Puffer wurden die Zellen auf eine endgültige
Figure imgf000024_0002
verdünnt und einer Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSCalibur Durchflusszytometers unterzogen, E. coli BL21 (DE3) pET-SH3, das FP-ET (ohne Cystein) exprimiert, wurde auf gleiche Weise vor der Durchflusszytometer-Analyse behandelt und als Kontrolle verwendet. Fig. 6 zeigt, dass die Stärke der Fluoreszenz von BL21 (DE3), das FP-CT exprimiert, deutlich von dem intrinsischen Hintergrundsignal der E. co//-Kontrolle, die FP-ET exprimiert, unterscheidbar war. Dies zeigt, dass die Maleinimid-Kopplung eines einzigen Cysteins in einem Protein, das auf der E. coli Oberfläche erschien, eine praktikable , gut funktionierende Markierungsprozedur für die Durchflusszytometer-Analyse ist. Als nächstes wurde untersucht, ob diese spezifische und sensitive Markierung die Überwachung des Zeitverlaufs der Expression rekombinanter Proteine auf der Oberfläche von E. coli nach der Induktion ermöglicht. Zu diesem Zweck wurde den Proben mit E. coli BL21 (DE3) pET-SH4 Zellen IPTG hinzugefügt, um die Expression von FP-CT zu starten. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben genommen, mit Fluoreszein-Maleinimid wie zuvor beschrieben markiert und anschließend durch Durchflusszytometrie analysiert, Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, stieg der Mittelwert der Fluoreszenz von 10 000 analysierten Zellen über einen Zeitraum von 90 Minuten für jede Probe kontinuierlich an, während die mittlere Fluoreszenz von Kontrollzellen, die FP-ET exprimierten, sich nur leicht verschob. Dies gibt die kumulative Anzahl von FP-CT Molekülen wieder, die auf der Oberfläche von E. coli aufgrund der Induktion der Expression durch LPTG erschienen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnise, dass die Cystein-Markierung durch Michael-Addition an Derivate von Maleinimid eine einfach durchzuführende und effiziente Methode zur Überwachung des Erscheinens rekombinanter Proteine auf der Zelloberfläche nach Induktion der Expression ist und im Hoch-Durchsatzverfahren wie der Durchflusszytometrie anwendbar ist. Die Vorteile dieser Markierungs- und Detektionsmethode sind offensichtlich: es sind nur minimale Mengen von Zellen notwendig, die in weniger als einer Stunde markiert werden können. Zusätzlich kann die durchflusszytometrische Analyse markierter Zellen innerhalb von Sekunden durchgeführt und automatisiert werden, Der Gehalt eines rekombinanten Proteins kann selbst in einer kleinen Probe rasch und, falls erwünscht, automatisch bestimmt werden kann. Dies kann z.B. zur Online-Überwachung der Proteinexpression an der Oberfläche lebender Zellen in industriellen Prozessen genutzt werden,
Beispiel 6: Durchflusszytometrische Sortierung einzelner Zellen, die ein cysteinhaltiges Protein an der Oberfläche tragen
Zellen von E. coli BL21 (DE3) pET-SH4, die FP-CT mit einem einzigen Cystein exprimieren, und E. coli BL21 (DE3) pET-SH3, die FP-ET ohne Cystein exprimieren, wurden in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt, mit Fluoreszein-Maleinimid markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie aus Fig. 8C hervorgeht, resultierten daraus in einer Probe zwei Zellpopulationen, die durch ihre Fluoreszenzstärke unterschieden werden konnten. Die relativen Fluoreszenzstärken beider Zellpopulationen waren mit jenen identisch, die erhalten wurden, wenn Zellen von BL21 (DE3) pET-SH3 (FP-ET) und pET-SH4 (FP-CT) markiert und getrennt analysiert wurden (Fig. 8A bzw. Fig. 8B), In der gemischten Probe wurde ein Sortierfensters definiert (Fig. 8C), so dass Zellen mit einer Fluoreszenz, die jener von FP-CT-positiven Zellen entsprach (Fig. 8B), von dem Sortiermodul des FACSCalibur Zytometers aussortiert wurden. Diese Zellen wurden gesammelt und - nachdem eine Teilmenge von Zellen für das Wachstum und die anschließende DNA-Analyse entfernt worden war -, erneut einer Durchflusszytometrie unterzogen,. Fig. 8D zeigt die Fluoreszenzverteilung der Zellen in der sortierten Probe. Wie erkennbar ist, wurde nach nur einer Runde Zellsortierung eine Population mit hoher Fluoreszenz, entsprechend den FP-CT Zellen, aus der Mischung von positiven und negativen Zellen heraussortiert. Zur Verifizierung der Identität der Zellen, die durch diese Prozedur sortiert worden waren, wurde die zuvor entfernte Teilmenge von Zellen verdünnt und adäquate Verdünnungen auf Agarplatten ausplattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Anzahl einzelner Zellklone, die durch diese Prozedur erhalten wurde, entsprach der Zahl, die durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde, Das bedeutet, dass die Zellen das Markierungs- und Sortierungsprotokoll ohne Verlust überstehen. Aus zehn der erhaltenen einzelnen Zellklone wurde Plasmid DNA isoliert und einer Restriktionsanalyse unterworfen, In dieser Analyse wurde die Tatsache ausgenutzt, dass pET-SH4 eine . 7?oI-Restriktionsstelle enthält, die in pET-SH3 fehlt (Fig. 3). Alle analysierten Zellklone enthielten Plasmid pET-SH4. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Markierung eines einzigen Cysteins, das in einem Protein an der Zelloberfläche exprimiert wird, die Selektion entsprechender Zellen aus einer heterogenen Population durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ermöglicht. Das erfindungsgemäße Markierungsverfahren ermöglicht folglich, daß aus einer Mischung von Zellen, die ein bestimmtes gewünschtes Protein, z.B. ein Enzym, exprimieren, und nicht-exprimierenden Zellen diejenigen Zellen, die das gewünschte Protein exprimieren, schnell und mit hohem Durchsatz selektiert werden, um eine optimierte Zellpopulation zu erhalten, bevor sie in einem industriellen oder synthetischen Prozess angewendet wird. Für die Zellsortierung wurden 270 000 Zellen der Mischung analysiert und insgesamt 86 000 Zellen aussortiert. Aufgrund des Sortierverfahrens waren die selektierten Zellen stark verdünnt. Daher musste ein viel größeres Volumen dieser Zelllösung durch den Durchflusszytometer laufen, bevor 10 000 Zellen, die feststehende Anzahl von Zellen für jedes Experiment, auf Fluoreszenz analysiert waren, Dies führte zu dem Auftreten eines Peaks geringer Fluoreszenz (Fig. 8D), der keine wachsenden Zellen enthielt und von dem daher angenommen wird, dass er aus Pufferverunreinigungen besteht. Beispiel 7: Cystein-Markierung von bovinem Adrenodoxin, das an der E. coli Oberfläche exprimiert wird
Für den Nachweis, daß auch natürlich vorkommende Cysteine in Zielpeptiden/Passenger- Proteinen, die auf der E. coli Oberfläche (= Außenmembran) exponiert werden, mit dem erfindungsgemäße Verfahren markierbar und detektierbar sind, wurde das Ferredoxin der bovinen Nebennierenrinde, Adrenodoxin (Adx) ausgewählt. Adx enthält fünf Cysteine und einen Eisen-Schwefel-Cluster als prothetische Gruppe, Vier der fünf Cysteine sind an der Bindung der [2Fe-2S]-Gruppe beteiligt. Im Stand der Technik ist bekannt, dass apo- Adx effizient über den Autotransporter-Pfad zu der E. coli Zelloberfläche transportiert wird [2 Die prothetische Gruppe kann nach dem Transport eingesetzt werden, um aktives, elektron-transferierendes holo-Adx zu erhalten [11]. Für den hier beschriebenen Nachweis wurden die Untersuchungen auf das Surface-Display von apo-Adx beschränkt. Zu diesem Zweck wurde die kodierende Region von Adx in den Vektor pET-SH3 eingesetzt, und die Oberflächentranslokation wurde wie zuvor beschrieben verifiziert. Mit Zellen einer Übernachtkultur wurde frisches Medium beimpft, anschließend inkubiert wurde, bis ein exponentiales Zellwachstum erhalten wurde. Die Adx-Expression wurde durch Zugabe von IPTG über 30 Minuten induziert. Zellen wurden geerntet, auf eingestellt und mit Fluoreszein-5-Maleinimid wie zuvor beschrieben markiert. Fig. 9B zeigt, dass diese Behandlung im Vergleich zu Kontroll- pET-SH3 -Zellen zu einer deutlich erhöhten Fluoreszenz von Zellen führte (Fig. 9A). Damit ist gezeigt, dass die erfindungsgemäße Markierungs- und Detektionsmethode zur Überwachung der Expression von Zielpeptiden/Passenger-Proteinen geeignet, die inhärente (d.h. eigene, natürliche) Cysteine enthalten.
Beispiel 8: Überwachung der Oberflächenexpression eines Zielpeptids Passenger- Proteins ohne Cysteine oder ohne zugängliche Cysteine
Zur Überwachung der Oberflächenexpression eines Zielpeptids/Passenger-Proteins ohne oder ohne vom äußeren (umgebenden) Medium aus zugängliche Cysteine mittels Autodisplay wird die kodierende Region dieses Zielpeptids/Passenger-Proteins in das Plasmid pET-SH4 an der Xbal, Xhόl, oder Bglϊl Restriktionsstelle eingesetzt (Fig. 3). Dies führt zu einer Co-Sekretion des Cysteins, das von pET-SH4 abgeleitet ist, und die Oberflächentranslokation des rekombinanten Zielpeptids/Passengers kann durch das co- sezernierte einzige Cystein nachgewiesen werden. Diese Verfahren eignet sich insbesondere für die Analyse des Surface-Displays von Enzymen, - im speziellen von bakteriellen Enzymen und hierunter vor allem von Esterasen und Oxidoreduktasen, - für die kein spezifischer Antikörper verfügbar ist. Der Transport und die Oberflächenzugänglichkeit wird durch Cystein-Markierung und anschließende Western- Blot-artige Experimente verifiziert.
Beispiel 9: Eignung von Maleinimid und Maleinimid-Derivaten für die erfindungsgemäße Markierung von Cystein
Kontrollzellen von E. coli, die Zielpeptide/Passenger-Proteine ohne Cysteine exprimieren, waren immer negativ, unabhängig von der angewendeten Detektionsmethode (Fig, 4C, 7, 8A), E. coli Zellen ohne Plasmid waren ebenso negativ (nicht dargestellt). Da das Periplasma von E. coli bekanntermaßen eine Reihe von Proteinen mit frei zugänglichen und reaktiven Cysteinen enthält [19, 20], beweisen diese Ergebnisse, dass Maleinimid und die Maleinimid-Derivate, die in dieser Studie verwendet wurden, nicht imstande waren, die Außenmembranbarriere zu durchdringen. Offensichtlich waren sie weder hydrophob genug, um durch die asymmetrische Lipid- Doppelschicht hindurchzugehen, noch klein genug, um durch die hydrophiler Poren zu gelangen, die von den Porinen bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz von Maleinimid und/oder dessen Derivate, mit anderen Worten: die erfindungsgemäße Maleinimid-abhängige Markierungs- und Detektionsmethode, ist infolgedessen auch dazu geeignet, eine Oberflächenexposition von zum Beispiel der periplasmatischen Lokalisation eines Proteins zu unterscheiden, das ein oder mehrere Cysteine enthält. Beispiel 10: Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Proteinreinigung
Zu diesem Zweck wurde das Gen für eine spezifische IgAl-Protease-Spaltungsstelle während der (in den vorstehenden Beispielen beschriebenen) Vektor-Konstruktion eingefügt (Fig. 3). Die externe Zugabe einer ortsspezifischen IgAl-Protease setzt das Zielpeptid/Passenger-Protein mit dem anhaftenden Cystein frei, wenn das entsprechende Gen in die Vektoren pJM1013, pSH4, pET-SH3 oder pET-SH4 eingesetzt wurde, Außerdem kann eine zusätzlichen Spaltungsstelle für eine ortsspezifische Protease, z.B. Faktor X, in N-terminaler Ausrichtung zu dem Cystein, das zur Reinigung verwendet wird, eingesetzt werden. Im Anschluß an die erfindungsgemäße Biotin-Maleinimid- Markierung wird in einem ersten Schritt durch Einsatz einer IgAl-Protease das Zielpeptid/ der Passenger mit dem an Biotin-Maleinimid gekoppelten Cystein von der Zelloberfläche freigesetzt und danach das Protein z.B. mit Hilfe einer Strepavidin- beschichteten Säule (oder eines anderen Strepavidin-beschichteten Trägers) gereinigt. In einem zweiten Schritt setzt der Faktor X das gereinigte Zielpeptid/Passenger-Protein von der Säule frei, wodurch das zur Reinigung verwendete Cystein zurückbleibt.
Beispiel 11: Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Aufreinigung von Zellen
Aus einer Mischung verschiedener Zellen werden diejenigen Zellen aufgereinigt, die ein bestimmtes insbesondere gewünschtes rekombinantes Peptid oder Protein an ihrer Oberfläche exprimieren, welches wenigstens ein zugängliches Cystein aufweist. Zu diesem Zweck werden alle Zellen einer Markierungsreaktion mit Biotin-Maleinimid unterworfen, Allein diejenigen Zellen, die das bestimmte, insbesondere gewünschte rekombinante Polypeptid bzw. Protein mit dem (den) zugänglichen Cystein(en) an ihrer Oberfläche exprimieren, werden im Verlauf dieser Reaktion tatsächlich mit Biotin- Maleinimid markiert. Diese markierten Zellen werden anschließend an Streptavidin- überzogene Kügelchen, Streptavidin-Agarose, oder jede andere Streptavidin-modifizierte Matrix gekoppelt, z.B. in Flüssigchromatographiesäulen und auf diese Weise aus der Mischung von Zellen angereichert, In entsprechender Weise können Zellen, die ein Enzym, einen Antikörper oder ein anderes funktionales Protein an der Oberfläche exprimieren, immobilisiert werden, um sie in kontinuierlichen Reaktionen einzusetzen. Außerdem können Zellen mit dieser Methode an Membranen fixiert werden, um sie z.B. in Oberflächenplasmon-Resonanzexperimenten zu verwenden.
Literaturzitate:
[I] G. Georgiou, C. Stathopoulos, P. S, Daugherty, A. R. Nayak, B. L. Iverson, R. Curtiss, 3rd, Nat Biotechnol 1997, 15, 29,
[2] J. Jose, R. Bernhardt, F. Hannemann, J Biotechnol 2002, 95, 257,
[3] P. C. Schultheiss E, Schwab H, Jose J, JMol CatalB: Enz 2002, 18, 89,
[4] P. S. Daugherty, M. J, Olsen, B. L. Iverson, G, Georgiou, Protein Eng 1999, 12,
613, [5] B, Stentebjerg-Olesen, L. Pallesen, L. B, Jensen, G. Christiansen, P, Klemm,
Microbiology 1997, 143, 2027. [6] C. Sousa, P. Kotrba, T. Ruml, A. CeboUa, V. De Lorenzo, J Bacteriol 1998,
180, 2280, [7] C, Bos, D. Lorenzen, V. Braun, J Bacteriol 1998, 180, 605. [8] D, G. Smyth, O. O, Blumenfeld, W. Königsberg, Biochem J 1964, 91, 589. [9] F. Kratz, U. Beyer, M. T. Schutte, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1999, 16,
245. [10] J. Maurer, J. Jose, T. F. Meyer, J Bacteriol 1997, 179, 794.
[I I] J. Jose, F. Hannemann, R, Bernhardt, ChemBioChem 2001, 2, 695. [12] J. Jose, F. Jahnig, T, F. Meyer, Mol Microbiol 1995, 18, 378. [13] J. Maurer, J, Jose, T. F. Meyer, J Bacteriol 1999, 181, 7014.
[14] J, Jose, J. Kramer, T. Klauser, J, Pohlner, T, F. Meyer, Gene 1996, 178, 107. [15] A. Giacomini, V. Corich, F, J, Ollero, A. Squartini, M, P. Nuti, FEMS Microbiol
Lett 1992, 79, 87, [16] F. Kratz, R. Muller-Driver, I. Hofmann, J, Drevs, C, Unger, JMed Chem 2000,
43, 1253. [17] A. P, Chapman, P, Antoniw, M, Spitali, S. West, S. Stephens, D. J, King, Nat
Biotechnol 1999, 17, 780. [18] J. J. Falke, A. F. Dernburg, D. A, Sternberg, N, Zalkin, D. L, Milligan, D. E.
Koshland, Jr., JBiol Chem 1988, 263, 14850. [19] J. C. Bardwell, K. McGovern, J, Beckwifh, Cell 1991, <57, 581. [20] X. Zhan, M. Schwaller, H. F. Gilbert, G. Georgiou, Biotechnol Prog 1999, 15,
1033. [21] E. Veiga, V. de Lorenzo, L. A. Fernandez, Mol Microbiol 1999, 33, 1232. [22] E. J, Kim, S. K. Yoo, Lett Appl Microbiol 1999, 29, 292. [23] T. A. Ueda M, Biotechnol Adv 2000, 18, 121.
[24] H. Wernerus, J. Lehtio, P. Samuelson, S, Stahl, J Biotechnol 2002, 96, 67. [25] K. Hantke, Mol Gen Genet 1981, 182, 288, [26] E. A, Bayer, M. Safars, M. Wilchek, AnalBiochem 1987, 161, 262 [27] Wong, Chemistry ofprotein Conjugation and Cross-Linking, Boca Raton, CRC
Press, 1993
Tabelle 1 : Maleinimid-Cystein- Verbindungen an der Zelloberfläche und Detektionsmethoden
Figure imgf000033_0001

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verfahren zum Nachweis der Expression eines durch Rekombination erzeugten Polypeptids in einer demgemäß transformierten Wirtszelle, wobei das rekombinante Polypeptid in oder an der die Wirtszelle gegen das sie umgebende äußeren Medium abgrenzenden Zelloberfläche repräsentiert wird und einen von dem äußeren Medium aus zugänglichen Abschnitt aufweist, dadurch gekennzeichnet, a) daß man das rekombinante Polypeptid derart konstruiert, daß es in dem zugänglichen Abschnitt wenigstens einmal die Aminosäure Cystein aufweist, b) daß man die Wirtszelle einem äußeren Medium aussetzt, welches eine Markersubstanz enthält, die spezifisch an Cystein bindet , c)daß man die Bindungreaktion zwischen Cystein und der Markersubstanz herbeiführt, d) und daß man die Wirtszelle anschließend einem Prozess zur Detektion der
Cystein-Marker- Verbindungen unterwirft .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Polypeptid konstruiert wird, indem man a) eine Nukleinsäure bereit stellt, die die für das Polypeptid und dessen Repräsentation an der Zelloberfläche kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei diese Nukleotidsequenz in ihrem für den zugänglichen Abschnitt des Polypeptids kodierenden Bereich wenigstens ein Cystein-Codon aufweist, welches entweder natürlicherweise in dem für den zugänglichen Abschnitt kodierenden Bereich der Nukleotidsequenz enthalten ist oder artifiziell in diesen Bereich insertiert wird, b) diese Nukleinsäure in eine Wirtszelle einschleust, und c) die Expression dieser Nukleinsäure in der Wirtszelle herbeiführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure für ein Fusionsprotein kodiert, welches aus dem in/an/auf der Zelloberfläche repräsentierten Ziel-Polypeptid und einem für dessen Expression und Repräsentation notwendigen Helfer-Polypeptid besteht, und daß sie die für das Ziel-Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz sowie die für das Helfer-Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure für ein Fusionsprotein kodiert, welches aus Signalpeptid, Ziel-Polypeptid, Linker- Polypeptid und Transportdomäne eines Autotransporters besteht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Gram-negative Bakterienzelle, insbesondere eine Enterobakterienzelle ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterienzelle, ausgewählt aus der Gruppe Eschericha coli, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Helicobacter mustelae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Rickettsia sp. und Neisseria sp. ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Markersubstanz Maleinimid und/oder ein Maleinimidderivat und die Bindungsreaktion eine Michael- Additions-Reaktion ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Maleinimidderivat biotinyliertes Maleinimid ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozess zur Detektion von Cystein-Maleinimid-Verbindungen und/oder Cystein-Maleinimidderivat- Verbindungen ein photometrischer Prozess ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Prozess zur Detektion von Cystein- Maleinimid- Verbindungen und/oder Cystein-Maleinimidderivat- Verbindungen ein Western-Blot ist.
12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Maleinimidderivat Fluoreszein- Maleinimid ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Prozess zur Detektion von Cystein- Maleinimid- Verbindungen und/oder Cystein-Maleinimidderivat- Verbindungen ein Fluoreszenzaktiveirter Zellsorting-Prozess ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Markersubstanz ein Haloacetyl-Derivat und die Bindungsreaktion eine Alkylierung ist
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Markersubstanz ein Pyridyl- Disulfid-Derivat und die Bindungsreaktion eine Konjugationsreaktion ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit lebenden Zellen durchgeführt wird,
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Aufreinigung von Proteinen.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Aufreinigung von Zellen, die das gewünschte, durch Rekombination erzeugte Polypeptid oder Protein exprimieren.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Ganzzellbiokatalysationsprozess gekoppelt bzw. kombiniert ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Überprüfung der Enzym- oder Protein-Expression eines Ganzzellbiokatalysators vor, während oder nach einem synthetischen oder industriellen detoxifizierenden Prozesses.
PCT/DE2004/000506 2003-03-28 2004-03-13 Verfahren zum nachweis der expression rekombinanter proteine an einer zelloberfläche und zur immobilisierung und aufreinigung von zellen und proteinen WO2004088307A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10314413.7 2003-03-28
DE10314413.7A DE10314413B4 (de) 2003-03-28 2003-03-28 Verfahren zum Nachweis der Expression rekombinanter Proteine an einer Zelloberfläche und zur Immobilisierung und Aufreinigung von Zellen und Proteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004088307A2 true WO2004088307A2 (de) 2004-10-14
WO2004088307A3 WO2004088307A3 (de) 2004-11-25

Family

ID=33103136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2004/000506 WO2004088307A2 (de) 2003-03-28 2004-03-13 Verfahren zum nachweis der expression rekombinanter proteine an einer zelloberfläche und zur immobilisierung und aufreinigung von zellen und proteinen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10314413B4 (de)
WO (1) WO2004088307A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011029881A3 (en) * 2009-09-09 2011-10-06 Autodisplay Biotech Gmbh A method for binding a recombinant polypeptide to a carrier
WO2012038508A1 (en) * 2010-09-23 2012-03-29 Autodisplay Biotech Gmbh Surface display of polypeptides containing a metal porphyrin or a flavin

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997035022A1 (de) * 1996-03-15 1997-09-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Berlin Exportsysteme für rekombinante proteine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4344350C2 (de) * 1993-12-23 1995-09-21 Max Planck Gesellschaft Bakterien zur Herstellung stabiler Fusionsproteine und Verfahren zu deren Nachweis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997035022A1 (de) * 1996-03-15 1997-09-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Berlin Exportsysteme für rekombinante proteine

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAUGHERTY PATRICK S ET AL: "Development of an optimized expression system for the screening of antibody libraries displayed on the Escherichia coli surface" PROTEIN ENGINEERING, Bd. 12, Nr. 7, Juli 1999 (1999-07), Seiten 613-621, XP002296794 ISSN: 0269-2139 in der Anmeldung erw{hnt *
GEORGIOU G ET AL: "DISPLAY OF HETEROLOGOUS PROTEINS ON THE SURFACE OF MICROORGANISMS: FROM THE SCREENING OF COMBINATORIAL LIBRARIES TO LIVE RECOMBINANT VACCINES" NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, Bd. 15, Januar 1997 (1997-01), Seiten 29-34, XP002950292 ISSN: 1087-0156 in der Anmeldung erw{hnt *
JOSE JOACHIM ET AL: "Cellular surface display of dimeric Adx and whole cell P450-mediated steroid synthesis on E. coli" JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, Bd. 95, Nr. 3, 23. Mai 2002 (2002-05-23), Seiten 257-268, XP002296795 ISSN: 0168-1656 in der Anmeldung erw{hnt *
KRATZ FELIX ET AL: "A novel macromolecular prodrug concept exploiting endogenous serum albumin as a drug carrier for cancer chemotherapy" JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, Bd. 43, Nr. 7, 6. April 2000 (2000-04-06), Seiten 1253-1256, XP002296797 ISSN: 0022-2623 in der Anmeldung erw{hnt *
MAURER JOCHEN ET AL: "Autodisplay: One component system for efficient surface display and release of soluble recombinant proteins from Escherichia coli" JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Bd. 179, Nr. 3, 1997, Seiten 794-804, XP002296793 ISSN: 0021-9193 in der Anmeldung erw{hnt *
SCHULTHEISS EVA ET AL: "Functional esterase surface display by the autotransporter pathway in Escherichia coli" JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B ENZYMATIC, Bd. 18, Nr. 1-3, 13. September 2002 (2002-09-13), Seiten 89-97, XP002296796 ISSN: 1381-1177 in der Anmeldung erw{hnt *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011029881A3 (en) * 2009-09-09 2011-10-06 Autodisplay Biotech Gmbh A method for binding a recombinant polypeptide to a carrier
US9482663B2 (en) 2009-09-09 2016-11-01 Autodisplay Biotech Gmbh Method for binding a recombinant polypeptide to a carrier
WO2012038508A1 (en) * 2010-09-23 2012-03-29 Autodisplay Biotech Gmbh Surface display of polypeptides containing a metal porphyrin or a flavin

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004088307A3 (de) 2004-11-25
DE10314413B4 (de) 2015-08-06
DE10314413A1 (de) 2004-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69632827T2 (de) Materialen und methoden im zusammenhang mit bindung und präsentation von substanzen auf zelloberflächen
DE60207740T2 (de) Muteine von menschlichem mit neutrophiler Gelatinase-assoziiertem Lipocalin und damit verwandte Proteine
EP1675623B1 (de) Ubiquitin oder gamma-kristallin-konjugate zur verwendung in therapie, diagnose und chromatographie
DE69434083T2 (de) Expression eines fusionspolypeptides, das ohne leadersequenz aus dem cytoplasma transportiert wird
DE69233008T2 (de) Fusionierung von Peptiden und Proteinen mit Thioredoxin und thioredoxin-ähnlichen Molekülen
DE69434784T2 (de) Bakterielle ausscheidungsproteine und darauf beruhende azelluläre impfstoffe
EP1844150B1 (de) Rekombinante expression von proteinen in einer disulfidverbrückten, zweikettigen form
DE60215461T2 (de) Serpin von bifidobakterien
DE19926068C1 (de) Muteine des Bilin-Bindungsproteins
DE69632625T2 (de) Mykrobakterielle proteine, mikroorganismen welche diese produzieren und ihre verwendung als impfstoff und zum nachweis von zuberkulose
DE60310385T2 (de) Sekretion von proteinen mit mehreren disulfidbindungen in bakterien und verwendungen davon
DE112006003608T5 (de) Verfahren zur Präsentation von Zielproteinen an der Zelloberfläche unter Verwendung von Bacillus Anthracis-Exosporium
DE10053224A1 (de) Verfahren zur Exposition von Peptiden und Polypeptiden auf der Zelloberfläche von Bakterien
DE3744595A1 (de) Verfahren zur gentechnischen herstellung von antikoerpern
DE60111783T2 (de) Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretierten proteinen und herstellung von protein-arrays
EP0886678B1 (de) Exportsysteme für rekombinante proteine
Rapoza et al. The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane
DE69223502T2 (de) Gen für die glykoprotease aus pasteurella haemolytica
EP1567643B1 (de) Gemisch mindestens zweier fusionsproteine sowie ihre herstellung und verwendung
DE10314413B4 (de) Verfahren zum Nachweis der Expression rekombinanter Proteine an einer Zelloberfläche und zur Immobilisierung und Aufreinigung von Zellen und Proteinen
DE69535705T2 (de) Funktionelles aufspüren und/oder expressionsvektoren bei mycobakterien
DE4344350C2 (de) Bakterien zur Herstellung stabiler Fusionsproteine und Verfahren zu deren Nachweis
DE60021719T2 (de) Mikrobielle proteinexpressionssysteme
EP1019543B1 (de) Verfahren zum identifizieren einer nukleinsäure
WO2002024904A2 (de) Verfahren zur herstellung von ribonukleinsäure (rns)

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase