CN111206057A - 一种微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法，包括以下步骤：（1）将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种到发酵培养基中进行发酵；（2）发酵24 h后，加入脂肪酶和萃取剂继续发酵；本方法丁酸丁酯的产量最高达到16.77 g/L，收率为0.30 g/g。与传统的化学法生产的丁酸丁酯相比，生物法所得的天然丁酸丁酯更加适合应用于食品及化妆品等行业，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种生物发酵与酯化萃取相结合生产丁酸丁酯的方法。
背景技术
丁酸丁酯是一种应用广泛的短链脂肪酸酯，作为溶剂广泛用于有机合成过程；因具有梨、菠萝样香气，是调制食品、饮料及日用化妆品、香精等不可缺少的原料，也是我国GB2760-86 规定允许使用的食用香料。此外，丁酸丁酯在低温下具有与航空柴油相似的理化性质，可直接用作航空燃料，是一种更高附加值的燃料添加剂。丁酸丁酯天然存在于菠萝、香蕉和草莓等水果中，然而含量非常低。传统生产工艺以丁酸和丁醇为原料、浓硫酸为催化剂，通过酯化反应合成，该工艺虽然技术成熟、产品收率高，但存在副反应多、设备腐蚀严重、 “三废”排放量大等弊端。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，产品纯度高，然而收率较低、 底物和酶成本较高，限制了其大规模应用。 因此， 迫切需要开发新型生产工艺，实现丁酸丁酯的高效合成。生物发酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物质为原料，具有反应条件温和、产品纯度高、过程绿色环保等优势；且生物发酵合成的丁酸丁酯更受消费者青睐（约1100元/千克），其价格要远远高于化学合成的丁酸丁酯（约 60元/千克），因此，在食用香精和日化香料等领域具有更广泛的市场。
生物发酵法合成丁酸丁酯能以溶剂梭菌（Clostridium sp.）发酵单糖获得丁醇，通过外源添加丁酸和脂肪酶，催化丁酸和丁醇酯化获得。溶剂梭菌在丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol, ABE）发酵过程中，具有产酸期（主要是丁酸）和产醇期（主要是丁醇）两个阶段，在产酸期合成的丁酸可诱导丁醇合成酶基因的表达并转化成丁醇。丁醇具有脂溶性的特性，在较低浓度下（10 g/L左右） 可裂解细胞膜，对细胞产生毒害作用。因此，与生物乙醇或其它化学品发酵相比，生物丁醇的合成浓度和收率较低，限制了其大规模开发与应用。通过生物转化法把丁醇转化成更高附加值并对细胞无毒性的丁酸丁酯也为生物丁醇的高值化转化提供了新的思路。
目前，国外研究人员已开展了生物发酵法合成丁酸丁酯的工作，基于合成类型分为三类：
1）一步发酵法直接合成丁酸丁酯，即以单糖为底物直接发酵合成丁酸丁酯，目前最高为0.05 g/L;
2）基于溶剂梭菌ABE发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁酸和脂肪酶合成丁酸丁酯，目前报道最高为22.4 g/L（以70 g/L木糖为底物并添加7.9 g/L丁酸以及5 g/L脂肪酶）;
3）基于产丁酸梭菌发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁醇和脂肪酶合成丁酸丁酯，目前报道最高为36.9 g/L（以50 g/L葡萄糖为底物并添加5 g/L脂肪酶以及连续补加10 g/L丁醇以及以及5 g/L脂肪酶）。由于酪丁酸梭菌只能生产丁酸而不产丁醇，且丁酸和丁醇是1:1酯化成丁酸丁酯，这意味着其丁醇总添加量必定大于18.45 g/L。
与一步发酵法合成丁酸丁酯相比，基于溶剂梭菌 ABE 发酵和产丁酸梭菌发酵可合成较高产量的丁酸丁酯，然而发酵过程需添加大量的底物和脂肪酶，提高了生物法合成丁酸丁酯的成本。因此，迫切需要利用代谢工程和过程工程等手段，消除对前体物和脂肪酶的依赖；本发明通过将丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌混菌发酵的手段成功消除了对前体物（丁醇、丁酸）的依赖。
发明内容
发明目的：为了解决丁酸丁酯生物合成方法对前体物依赖造成成本过高的问题，本发明提供了一种微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法。
技术方案：本发明所述一种微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法，包括以下步骤：
（1）将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种到含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵；
（2）发酵24 h时，加入0-10 g/L脂肪酶；同时，外源加入萃取剂，萃取剂：发酵液=1:2；
（3）继续发酵，发酵温度35-39 ℃，发酵时间为60-168 h，萃取剂可以原位萃取中发酵液中产生的丁酸丁酯。
所述脂肪酶为诺维信435脂肪酶或者固定化南极假丝酵母B脂肪酶。
所述萃取剂包括但不限于生物柴油、油醇、十二烷、十六烷。
所述丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1~1:4。
所述丙酮丁醇梭菌分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），菌株号为ATCC 824；所述酪丁酸梭菌分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum），菌株号为ATCC 25755。
所述活化的丙酮丁醇梭菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%；所述活化的酪丁酸梭菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%。
所述发酵过程pH调控在4.0-8.0。
丙酮丁醇梭菌本身可分泌少量的脂肪酶，为提高脂肪酶分泌量，步骤（1）所述发酵24 h后，加入0-10 g/L脂肪酶，同时外源加入萃取剂（生物柴油、煤油、十六烷），萃取剂：培养基=1:2；萃取剂可以原位萃取中发酵液中产生的丁酸丁酯，很大程度上减少了后续分离成本。
步骤（1）所述活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%；所述含有葡萄糖的发酵培养基配方为：0.5-2.0 g/L NaCl， 0.5-2.0 g/L K2HPO4，0.5-2.0 g/L KH2PO4，1.0-5.0 g/L 酵母粉，0.2-1.0 g/L MgCl2·6H2O，0.1-0.6 g/L NH4Cl，0.01-0.05 g/L CaCl2·2H2O，0.5-2.0 g/L FeCl2·4H2O，0.1-0.5 g/L KCl，葡萄糖30-90g/L，溶剂为水，调节pH至6.0-6.5，通氮气10-20 min，121℃灭菌15 min；所述发酵条件为：发酵温度35-39 ℃，发酵时间为60-168 h，发酵pH为4.5-7.0，转速0-200 rpm。
优选地，采用的萃取剂为十二烷，发酵结束后将有机相进行旋蒸得到高纯度丁酸丁酯，萃取剂十二烷也可重复使用。
优选地，脂肪酶添加量为5 g/L。
优选地，所述含有葡萄糖的发酵培养基中葡萄糖浓度为60 g/L。
优选地，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度37 ℃，发酵时间144 h，发酵pH为6.0，转速66 rpm。
优选地，当丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1时，在丙酮丁醇梭菌生长一天后再接种酪丁酸梭菌丁酸丁酯产量更高。
优选地，若丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌同时接种时，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的最优接种比例为1:4。
所述丙酮丁醇梭菌的活化培养基配方为0.5-2.0 g/L NaCl，0.5-2.0 g/L K2HPO4，0.5-2.0 g/L KH2PO4，1.0-5.0 g/L 酵母粉，0.2-1.0 g/L MgCl2·6H2O，0.1-0.6 g/LNH4Cl，0.01-0.05 g/L CaCl2·2H2O，0.5-2.0 g/L FeCl2·4H2O，0.1-0.5 g/L KCl，葡萄糖30-90 g/L，溶剂为水，调节pH至6.0-6.5；活化条件为：将丙酮丁醇梭菌以接种量5 % v/v接种到活化培养基中，35-39 ℃、100-200 rpm活化48-96 h，每隔12 h调节pH至4.5-7.0。
其中，丙酮丁醇梭菌分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），菌株号为ATCC 824，商业菌株。它是ABE发酵中典型的高产丁醇菌株的代表，其整个发酵过程可以分为产酸产溶剂两阶段，其在产酸阶段消耗24-40 %的糖，生成4-6 g/L有机酸（乙酸、丁酸）。当发酵液pH值下降到时一定值时，酸开始向溶剂转化，虽然溶剂（丁醇、乙醇）不断生成，但是酸的浓度基本维持不变。其可在 ABE 发酵后期可合成高浓度的丁醇（18.65g/L），酶活检测发现，菌株可内源性表达脂肪酶。通过添加油性诱导剂，如生物柴油可提高脂肪酶的产量，丁酸丁酯的浓度提高到2.65 g/L。
其中，酪丁酸梭菌分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum），菌株号为ATCC 25755，商业菌株。酪丁酸梭菌是国内外研究最多的产丁酸菌株，属于革兰氏阳性芽孢杆菌，有机化能专性厌氧型。以五碳糖或六碳糖作为碳源底物发酵时，其主要产物为丁酸，同时生成乙酸、二氧化碳和氢气等副产物。对强酸、高温、高盐等恶劣环境具有较高的耐受性，生命力较强，并且具有培养条件相对简单，丁酸产量、得率、纯度相对较高、发酵稳定性较好等优点，此外其发酵副产物氢气也是一种清洁、高效的绿色能源，因此被认为是最具商业化开发潜力的产丁酸菌株。
有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：
1)本发明通过运用混菌发酵的手段，一个菌株生产丁醇一个菌株生产丁酸，消除了生物法生产丁酸丁酯过程中前体物（丁酸/丁醇）的添加，从而实现丁酸丁酯的高效绿色合成。
2)本发明通过添加萃取剂十二烷，可以原位萃取出丁酸丁酯，将微生物混菌发酵与原位萃取相结合，很大程度上降低了后续的分离成本。最终能够得到纯度较高的丁酸丁酯，同时相应的萃取剂也能得到回收循环使用。
3)该方法降低了工业生产丁酸丁酯的成本，且使用的是可再生和可持续原料的天然底物组分制成的天然酯，具有重要的应用价值。
4)该发明成果将丰富和发展丁酸丁酯生物合成的理论和实践，实现丁酸丁酯的绿色和高效合成；同时也为生物发酵法合成其它短链脂肪酸酯，如乙酸乙酯、丁酸乙酯等提供新的思路和借鉴，在理论和实际应用方面均具有重要价值。
附图说明
图1 不同萃取剂对最终丁酸丁酯产量的影响；
图2丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种时间最优时发酵液中产物浓度变化图；
图3丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例最优时发酵液中产物浓度变化图。
具体实施方式
丙酮丁醇梭菌分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），菌株号为ATCC 824，商业菌株。
酪丁酸梭菌分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum），菌株号为ATCC 25755，商业菌株。
实施例1 不同萃取剂对最终丁酸丁酯产量的影响
（1）将丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌各以接种量5% v/v接种到活化培养基中，37 ℃、120rpm活化60 h，每隔12 h调节pH至5.5；
活化培养基配方为：1 g/L NaCl，0.75 g/L K2HPO4，0.75 g/L KH2PO4，3 g/L 酵母粉，0.5 g/L MgCl2•6H2O，0.3 g/L NH4Cl，0.015 g/L CaCl2•2H2O，1.5 g/L FeCl2·4H2O，0.3g/L KCl，葡萄糖60 g/L，溶剂为水，调节pH至5.5；
（2）将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌各以接种量5 % v/v接种到发酵培养基中，37℃、66 rpm发酵168 h，每隔12 h调节pH至5.5；
发酵培养基配方为：1 g/L NaCl，0.75 g/L K2HPO4，0.75 g/L KH2PO4，3 g/L 酵母粉，0.5 g/L MgCl2·6H2O, 0.3 g/L NH4Cl, 0.3 g/L KCl, 0.015 g/L CaCl2·2H2O，1.5 g/LFeCl2·4H2O，溶剂为水，pH 5.5，通氮气10～20 min，121℃灭菌15 min；
（3）在过程（2）培养期间，在24 h时分别加入5 g/L诺维信435脂肪酶，同时分别加入不同萃取剂（生物柴油、十二烷、十六烷、油醇），萃取剂：培养基=1:2；共4组，每组3个平行；
生物柴油、十二烷、十六烷、油醇作为常用的萃取剂，它们都有高丁酸丁酯分配系数和较低的丁醇和丁酸分配系数并且对细胞毒性较小。因此他们可以作为理想的萃取剂，用于原位萃取丁酸丁酯。培养过程中，每24 h测定发酵液中的产物产量以及底物消耗量，结果显示在以十二烷为萃取剂时，丁酸丁酯的产量最高，达到7.37 g/L，见图1。
实施例2 不同pH对最终丁酸丁酯产量的影响
方法同实施例1，不同的是萃取剂固定为十二烷，将发酵过程的pH分别控制在5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，共5组，每组3个平行；
丙酮丁醇梭菌的最适pH为5.5，酪丁酸梭菌的pH为6.0，因此为了实现丁酸和丁醇同步高效合成，提高丁酸丁酯合成的效率，需探究在何种pH条件下，丁酸丁酯的产量最高。培养过程中，每24 h测定发酵液中的产物产量以及底物消耗量，结果显示当pH为6.0时，丁酸丁酯的产量达到最高，为9.12 g/L。
实施例3 丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种时间对最终丁酸丁酯产量的影响
方法同实施例1，不同的是萃取剂固定为十二烷，发酵过程的pH控制在6.0，对丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的接种时间进行优化，分别在丙酮丁醇梭菌接种后的第-1天、第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天接入酪丁酸梭菌，在共8组实验，每组3个平行。
丁酸和丁醇的比例是影响生物发酵法合成丁酸丁酯浓度和收率的一个限速步骤；根据酶促反应动力方程式，丁酸与丁醇的反应摩尔比是1:1。因此，在发酵过程中如何实现丁酸和丁醇的同步合成并维持一定的丁酸/丁醇比例，是实现生物发酵法高效合成丁酸丁酯的关键因素之一。而本发明中两菌对于底物的利用和生长存在显著差异，调配两菌混菌时间，使其都能发挥最大优势，可大大提高丁酸丁酯的产量。
培养过程中，每24 h测定发酵液中的产物产量以及底物消耗量，结果显示，当在丙酮丁醇梭菌生长一天后接种酪丁酸梭菌，丁酸丁酯产量最高，为11.51 g/L，收率为0.21 g/g，见图2。由于脂肪酶的催化酯化是双向反应，因此在144 h时丁酸丁酯产量达到峰值，发酵应停止。
实施例4 丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例对最终丁酸丁酯产量的影响
方法同实施例1，不同的是萃取剂固定为十二烷，发酵过程的pH控制在6.0，对丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的接种比例进行优化，分别为0:5，1:4，2:3，2.5:2.5，3:2，4:1，5:0，共7组实验，每组3个平行；
培养过程中，每24 h测定发酵液中的产物产量以及底物消耗量，当丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的比例为1:4时，丁酸丁酯的产量最高，为16.77 g/L，收率为0.30 g/g，如图3。同样的，由于脂肪酶的催化酯化是双向反应，因此在144 h时丁酸丁酯产量达到峰值，发酵应停止。
与现有技术相比，此发明完全消除了对前体物（丁醇、丁酸）的依赖，极大程度上降低了生物法生产丁酸丁酯的成本，可实现丁酸丁酯的绿色经济合成。且目前底物葡萄糖仅为60 g/L，后期通过葡萄糖补加，可进一步大大提高丁酸丁酯产量。
Claims (10)
1.一种用微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将活化的丙酮丁醇梭菌与活化的酪丁酸梭菌接种到发酵培养基中进行发酵；
2）发酵24h后，加入脂肪酶与萃取剂，所述脂肪酶加入量为0-10 g/L，萃取剂：发酵液=1:2-1；
3）继续发酵，发酵温度35-39 ℃，发酵时间为60-168 h，萃取剂可以原位萃取中发酵液中产生的丁酸丁酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1~1:4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为诺维信435脂肪酶或者固定化南极假丝酵母B脂肪酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂为生物柴油、油醇、十二烷或者十六烷。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），菌株号为ATCC 824；所述酪丁酸梭菌分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum），菌株号为ATCC 25755。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：0.5-2.0 g/LNaCl， 0.5-2.0 g/L K2HPO4，0.5-2.0 g/L KH2PO4，1.0-5.0 g/L 酵母粉，0.2-1.0 g/LMgCl2·6H2O，0.1-0.6 g/L NH4Cl，0.01-0.05 g/L CaCl2·2H2O，0.5-2.0 g/L FeCl2·4H2O，0.1-0.5 g/L KCl，葡萄糖30-90 g/L，溶剂为水，调节pH至6.0-6.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化的丙酮丁醇梭菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%；所述活化的酪丁酸梭菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程pH调控在4.0-8.0。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1时，在丙酮丁醇梭菌生长一天后再接种酪丁酸梭菌。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，若丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌同时接种时，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的最优接种比例为1:4。
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