CN105200024A - 脂肪酶calb突变体、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脂肪酶CALB突变体及其制备方法，本发明利用基因体外定向进化策略中易错PCR技术，对来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella？sp.)的野生型脂肪酶基因进行体外诱变，通过鉴别培养基进行筛选，获得高效生产脂肪酶的菌株。获得的脂肪酶CALB突变体表达活性高，是野生型脂肪酶催化活性的8.7倍，可用于脂类水解相关行业中。通过对含有编码所述CALB突变体的基因的工程菌进行大规模发酵，可实现脂肪酶CALB突变体的批量生产。

Description

脂肪酶CALB突变体、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种脂肪酶CALB突变体、其制备方法及应用。
背景技术
脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯+水→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶的另一重要特征是，它只作用于异相系统，即在油(或脂)—水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用，即使作用也极缓慢，因此也可说脂肪酶是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)—水界面上水解酯的酶。脂肪酶是最早研究的酶类之一，从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至今，微生物脂肪酶研究已有上百年的历史。
脂肪酶的微生物发酵法的应用前景优于提取法及化学合成法。目前，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的脂肪酶已制成结晶。来源于根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球菌、粘质色杆菌等的脂肪酶也得到高度提纯，并对它们的理化性质展开进一步研究。早在上世纪60年代，由假丝酵母、曲霉、根霉等微生物产生的脂肪酶相继在日本进入商品化生产。与此同时，我国也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中国科学院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candidalipolytica)AS2.1203，并于1969年制成酶制剂供应市场。近年来，随着非水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已远远超出了油—水界面上进行水解反应的范畴，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景十分广阔。尽管在产脂肪酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比逊色许多。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶CALB突变体、其制备方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明利用基因体外定向进化策略中易错PCR技术构建基因工程菌株获得高效生产脂肪酶的方法，其是通过在毕赤酵母中表达突变的脂肪酶基因，然后对表达的脂肪酶进行分离纯化，获得高纯度高活力的脂肪酶。
易错PCR技术具体如下：
(1)由产脂肪酶的克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)扩增CALB的编码基因calb；
(2)将calb基因连接在表达质粒pPICZαA上，酶切位点为EcoRI和XbaI，获得重组质粒pPICZαA-calb；
(3)采用易错PCR技术，以重组质粒pPICZαA-calb为模板，设计引物，扩增获得calb突变基因；
(4)将步骤(3)所得易错PCR产物及表达质粒pPICZαA用EcoRI和XbaI双酶切后连接，连接产物转入毕赤酵母X33感受态细胞，涂布于博来霉素抗性(Zec+)YPD平板上，即得构建好的重组calb基因突变库；
(5)将YPD平板上长出的菌落逐一对应转接至含甲醇的三丁酸甘油酯(Zec+)平板上，转板后将平板置于30℃恒温培养箱培养24h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有脂肪酶的空载体作为阳性对照和阴性对照。
本发明提供的脂肪酶CALB突变体，其为：1)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或2)SEQIDNo.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。
本发明还提供编码所述CALB突变体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
本发明还提供含有编码所述CALB突变体的基因的载体、宿主细胞和转基因工程菌。
本发明还提供含有编码所述CALB突变体的基因的毕赤酵母工程菌。
本发明还提供含有编码所述CALB突变体的基因的毕赤酵母X33。
本发明进一步提供所述CALB突变体的制备方法，将含有编码所述CALB突变体的基因的毕赤酵母X33接种于含博来霉素的BMGY培养基中，30℃振荡培养至OD600为8-10时，离心后收集菌体，将菌体转入诱导培养基BMMY中，30℃诱导表达20h，离心后收集上清；将上清加入到Ni2+-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NTA-1缓冲液洗涤介质以去除杂蛋白，最后用NTA-2缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的脂肪酶突变体。
其中，所述NTA-1缓冲液为含有80mmol/L咪唑的NTA-0缓冲液，NTA-2缓冲液为含有300mmol/L咪唑的NTA-0缓冲液。NTA-0缓冲液：20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl。
本发明还提供所述脂肪酶CALB突变体在洗涤剂加工领域中的应用。
本发明进一步提供含有所述脂肪酶CALB突变体的洗涤剂制品。
本发明利用基因体外定向进化策略中易错PCR技术，对来源于克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)的野生型脂肪酶基因进行体外诱变，通过鉴别培养基进行筛选，获得高效生产脂肪酶的菌株。获得的脂肪酶CALB突变体表达活性高，是野生型脂肪酶催化活性的8.7倍，可用于脂类水解相关行业中。通过对含有编码所述CALB突变体的基因的工程菌进行大规模发酵，可实现脂肪酶CALB突变体的批量生产。
附图说明
图1为本发明实施例2中PCR扩增脂肪酶CALB突变体基因的电泳检测结果；其中，M为DNAMarker，1为目的基因。
图2为本发明实施例3中质粒pPICZαA-calb的酶切电泳图。
图3为本发明实施例4中CALB突变体的SDS-PAGE电泳检测图；其中，M为蛋白Marker，1为上清浓缩沉淀蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1构建脂肪酶CALB突变体文库
1、由产脂肪酶的克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)扩增CALB的编码基因calb；
2、将calb基因连接在表达质粒pPICZαA上，酶切位点为EcoRI和XbaI，获得重组质粒pPICZαA-calb；
3、采用易错PCR技术，以重组质粒pPICZαA-calb为模板，设计引物，扩增获得calb突变基因；
4、将步骤3所得易错PCR产物及表达质粒pPICZαA用EcoRI和XbaI双酶切后连接，连接产物转入毕赤酵母X33感受态细胞，涂布于博来霉素抗性(Zec+)YPD平板上，即得构建好的重组calb基因突变库；
5、将YPD平板上长出的菌落逐一对应转接至含甲醇的三丁酸甘油酯(Zec+)平板上，转板后将平板置于30℃恒温培养箱培养24h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有脂肪酶的空载体作为阳性对照和阴性对照，获得高效生产脂肪酶的菌株。
实施例2脂肪酶CALB突变体基因的获得
以1μg实施例1的高产脂肪酶的菌株基因组DNA为PCR反应模板，设计正向引物calb-F：5′-AAAAAGAATTCAACAAACACGTCGCTGCTATGCTGACGATGCTTATTA-3′，反向引物calb-R：5′-AAAAATCTAGAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCTTTGAGATTTTGGTCTAAAAAA-3′，其中斜体字母部分分别为酶切位点EcoRI和XbaI，为保证读码框正确，额外在正反向引物5′端各加了五个碱基。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为：94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。取3μLPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取100μLPCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。
实施例3表达载体pET-28b(+)-calb的构建
凝胶回收实施例2的PCR产物和pPICZαA载体分别用EcoRI和XbaI双酶切，并通过凝胶回收试剂盒回收，然后进行连接(16℃，16h)，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行酶切分析验证，结果如图2所示，并进行DNA测序鉴定，编码所述脂肪酶CALB突变体的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，CALB突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。构建的表达质粒被称为pPICZαA-calb。
实施例4calb在毕赤酵母X33感受态细胞中的表达及CALB突变体的纯化与鉴定
1、calb基因的表达
以测序验证的pPICZαA-calb表达质粒转化毕赤酵母X33感受态细胞；挑取阳性克隆，接种于含博来霉素的BMGY培养基中，30℃振荡培养至OD600约为8-10时，离心后菌体转入诱导培养基BMMY培养基中，30℃诱导表达20h，离心后收集上清。
2、脂肪酶CALB突变体的纯化与鉴定
NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后加NiSO4溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NTA-0缓冲液(20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl)洗柱。将上述收集得到的上清加入到Ni2+-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NTA-1缓冲液(即含80mmol/L咪唑的NTA-0缓冲液)洗涤介质以去除杂蛋白,最后用NTA-2缓冲液(即含300mmol/L咪唑的NTA-0缓冲液)洗脱带有6个组氨酸标签的脂肪酶，并进行SDS-PAGE分析(图3)。
实施例5脂肪酶CALB突变体的酶活检测
脂肪酶的酶活分析液为：终浓度10mM对硝基苯丁酯(1.76μl)作为底物，乙腈：乙醇：磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.0)为1:4:95(体积比)作为反应缓冲体系，加5μl酶液，总反应体系1ml，45℃反应一分钟，其中每分钟产生1μM对硝基苯酚定义为1U。最优的脂肪酶CALB突变体酶活为野生型酶活的8.7倍。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.脂肪酶CALB突变体，其特征在于，其为：1)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
2)SEQIDNo.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的毕赤酵母工程菌。
7.含有权利要求2或3所述基因的毕赤酵母X33。
8.权利要求1所述突变体的制备方法，其特征在于，将权利要求7所述的毕赤酵母接种于含博来霉素的BMGY培养基中，30℃振荡培养至OD600为8-10时，离心后收集菌体，将菌体转入诱导培养基BMMY中，30℃诱导表达20h，离心后收集上清；将上清加入到Ni2+-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NTA-1缓冲液洗涤介质以去除杂蛋白，最后用NTA-2缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的脂肪酶突变体；
其中，所述NTA-1缓冲液为含有80mmol/L咪唑的NTA-0缓冲液，NTA-2缓冲液为含有300mmol/L咪唑的NTA-0缓冲液。
9.权利要求1所述脂肪酶CALB突变体在洗涤剂加工领域中的应用。
10.含有权利要求1所述脂肪酶CALB突变体的洗涤剂制品。
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