CN106086068B - 一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法 - Google Patents

一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106086068B
CN106086068B CN201610397567.6A CN201610397567A CN106086068B CN 106086068 B CN106086068 B CN 106086068B CN 201610397567 A CN201610397567 A CN 201610397567A CN 106086068 B CN106086068 B CN 106086068B
Authority
CN
China
Prior art keywords
carrier
seq
polycistron
gene
infu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610397567.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106086068A (zh
Inventor
吴珍芳
张献伟
孙悦
钟翠丽
李国玲
李紫聪
蔡更元
石俊松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Winson Food Group Ltd By Share Ltd
South China Agricultural University
Original Assignee
Winson Food Group Ltd By Share Ltd
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Winson Food Group Ltd By Share Ltd, South China Agricultural University filed Critical Winson Food Group Ltd By Share Ltd
Priority to CN201610397567.6A priority Critical patent/CN106086068B/zh
Publication of CN106086068A publication Critical patent/CN106086068A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106086068B publication Critical patent/CN106086068B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02002—Pectate lyase (4.2.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种多顺反子、唾液腺特异性表达该多顺反子的载体及其构建方法，所述多基因共表达的多顺反子具有如SEQ ID No:1所示的碱基序列，所述唾液腺特异性表达多顺反子的载体具有如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，其是以多顺反子真核表达载体pCD‑PXAT和pPB‑mPSP‑neoGFP载体为原料构建得到的。本发明构建的多顺反子能共表达纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶与植酸酶，囊括了常规饲料中NSP酶的所有主要成员和植酸酶，这些酶都能较好的兼容动物胃肠消化道pH环境，具有较好的胃蛋白和胰蛋白酶耐受性，且始终保持较高的活性，克服了传统饲料用酶制剂在加工，生产使用中缺陷和问题，由于是动物自身分泌，几乎不存在成本问题。

Description

一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种可在猪细胞共表达纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶酶、果胶酶及植酸酶的多顺反子及其构建方法和应用，以及唾液腺特异性表达该多顺反子的载体及其构建方法。
背景技术
非淀粉多糖(NSP)是饲料中主要的抗营养因子，非淀粉多糖由纤维素、非纤维多糖(半纤维素性聚合体)和果胶聚糖三大类物质组成，其中纤维素构成细胞壁的“三明治”框架结构，而以木聚糖和β-葡聚糖为主的半纤维素和果胶等基质多糖是细胞壁纤维素框架内的主要成分，起填充和连接作用(Choct,1997)，细胞内的营养物被牢固地包埋在细胞壁夹层及其内部，是阻碍动物对饲料营养充分利用的主要原因。部分可溶性NSP溶解后形成粘性食糜，影响营养物质向肠道扩散，造成有害菌的滋生。
植酸(IP6)是常规植物性饲料中磷的主要贮存形式，约占饲料总磷的44％～92％(Marounek et al.,2011；Selle,2003；方热军等，2006)，由于单胃动物胃和小肠缺失植酸酶，常规饲料总磷的生物利用率仅14％～30％(NRC,1998)，动物生产中常依赖人工添加的矿物磷来满足动物对磷的需求，而植酸磷被大肠微生物降解成无机磷后，随粪排出，造成环境污染。
非淀粉多糖酶是能降解日粮中的纤维素、β-葡聚糖、果胶和木聚糖等非淀粉多糖的一系列酶类，主要包括：纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶等。非淀粉多糖酶在提高饲料消化率，改善肠道健康，提高动物生产性能，扩大饲料资源开发方面具有重要意义。
植酸酶是生产中应用最广泛的一类酶，植酸酶可分解动物饲料中的植酸磷，用于代替部分磷酸氢钙，由于饲料中植物源磷被吸收，动物粪便中磷的排放量可减少20％～40％，减少了集约化畜牧场粪磷对环境的污染。
但NSP酶和植酸酶在发酵生产和使用中存在诸多缺点：1.饲料工业中植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等酶的生产都是通过微生物发酵生产而来的，所用的菌种主要有毕赤酵母、木霉、青霉、大肠杆菌、芽孢杆菌等，由于菌种的生产菌较稳定，往往一种高产菌株只能生产一种酶，生产上述所有的酶需要多条发酵生产线才能完成，增加了酶制剂的生产成本；2.NSP酶在选择底物时有着高度的专一性，每一种酶只针对一种底物，所以在生产中，饲料配方频繁更换，为降低饲料成本，需要针对饲料中NSP的特点探索研究不同NSP酶组合，给生产造成不便。3.NSP酶的本质是蛋白质，使用过程中易受到光照、湿度、微生物、贮存时间和饲料粉碎、预混、制粒等因素影响，给酶制剂的效果产生很大的不确定性，实际添加效果不理想；4.由于原核表达系统或低等生物表达系统和高等动物表达系统细胞结构的差异，其各自的蛋白分泌信号引导肽迥异，低等生物来源的蛋白质在高等动物细胞内表达和分泌存在系统障碍；5.由于低等生物和高等生物对密码子使用存在一定偏好性，低等生物蛋白在高等生物细胞内表达效率较低，需要进行猪源化基因改造；6.用于不同生物蛋白翻译后修饰系统差异，微生物源的各种NSP酶和植酸酶直接用于动物细胞表达系统，存在较大的表达失败风险，必须要经过动物细胞表达验证；7.多基因共表达技术涉及基因多，重组后各基因受到连接肽和其他序列干扰较大，需要大量序列优化和重组试验探索其最佳组合，重复序列对基因遗传稳定性存在一定威胁；8.由于NSP酶和植酸酶涉及到基因和酶种类较多，传统单基因转基因技术工作量大，转基因遗传复杂，很难聚合和应用。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种可在猪细胞内高效表达的纤维素酶-木聚糖酶-葡聚糖酶-果胶酶-植酸酶的多顺反子，其该多顺反子的制备方法，该顺反子的应用，以及唾液腺特异性表达该多顺反子的载体及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种多基因共表达的多顺反子，所述多顺反子具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
一种多基因共表达的多顺反子，所述多顺反子具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述多基因共表达的多顺反子在细胞生物反应器、转基因动物制备或者组合酶制剂开发等方面的应用。
本发明还提供了一种多基因共表达的多顺反子真核表达载体，所述真核表达载体包括上述多基因共表达的多顺反子。
本发明还提供了上述多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)、对果胶酶基因Pg7fn进行猪密码子偏好优化，再与bovine腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，中间添加6×his标签，获得序列号为SEQ ID No:4的重组果胶酶基因Bpsp-6His-Pg7fn；对木聚糖酶基因Aspxyn进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID No:5的重组木聚糖酶基因Ppsp1-AspXyn；对植酸酶基因EsAPPA进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQID No:6的重组植酸酶基因Ppsp2-EsAPPA；对纤维素酶基因TeEGI进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID No:7的重组纤维素酶基因Ppsp3-TeEGI；
(2)、分别以重组果胶酶基因Bpsp-6His-Pg7fn为模板，SEQ ID No:14及SEQ IDNo:15作为引物；以重组木聚糖酶基因Ppsp1-AspXyn为模板，SEQ ID No:16及SEQ ID No:17作为引物；以重组植酸酶基因Ppsp2-EsAPPA为模板，SEQ ID No:18及SEQ ID No:19作为引物；以重组纤维素酶基因Ppsp3-TeEGI为模板，SEQ ID No:20及SEQ ID No:21作为引物；进行PCR扩增，获得具有E2A、P2A和T2A末端的目的基因infu-Pg7fn、infu-AspXyn、infu-EsAPPA和infu-TeEGI；
(3)、利用EcoRⅠ和NotⅠ酶切pcDNA3.1载体获得线性化载体pcDNA3.1载体，再与步骤(2)获得的目的基因infu-Pg7fn、infu-AspXyn、infu-EsAPPA和infu-TeEGI进行重组反应，获得多顺反子真核表达载体pCD-PXAT，多顺反子真核表达载体pCD-PXAT包括多基因共表达的多顺反子，其核苷酸序列为SEQ ID No:1，氨基酸序列为SEQ ID No:2。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增体系为：总体积为50μL：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，上下游引物(10μmol/L)各1.5μL，模板DNA 1μL，加双蒸水补至50μL。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增程序为：98℃预变性10s，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，35个循环，72℃后延伸2min。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述重组反应的反应体系为：2uL5×In-FusionHD Enzyme Premix、1uL线性化载体pcDNA3.1、1～1.5uL infu-Pg7fn、1～1.5uL infu-AspXyn、1～1.5uL infu-EsAPPA和1～1.5uL infu-TeEGI、加dH2O至10uL。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述重组反应的反应条件为：50℃，15min。
本发明还提供了一种唾液腺特异性表达多顺反子的载体，所述载体具有如SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述唾液腺特异性表达多顺反子的载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)、以上述pCD-PXAT为模板，SEQ ID No:24和SEQ ID No:25为引物，进行PCR反应，得到扩增产物infu-PXAT；
(2)、利用AscI酶切pPB-mPSP-neoGFP载体，得到线性化的pPB-mPSP-neoGFP载体，将上述扩增产物infu-PXAT克隆到pPB-mPSP-neoGFP的AscⅠ酶切片段上，构建得到pPB-mPSP-PXAT-neoGFP，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述PCR的反应体系为：反应体系总体积为50μL：PrimeSTAR Max Premix(2)25μL，上下游引物(10μmol/L)各1.5μL，模板DNA 1μL，加双蒸水补至50μL在其中一些实施例中，步骤(1)中所述PCR的反应程序为：98℃预变性10s，98℃变性10s，68℃退火和延伸4min，33个循环。
在其中一些实施例中，步骤(2)中的反应体系为：2uL5×In-Fusion HD EnzymePremix、1uL线性化载体pPB-mPSP-neoGFP、1～3uL infu-PXAT、4～6uL dH2O。
在其中一些实施例中，步骤(2)中的反应条件为：50℃，15min。
本发明选择微生物源高活性的酸性的纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等酶基因候选基因，预测其原信号肽序列，用OptimumGeneTM基因设计软件进行密码子猪源化改造，为避免同源信号肽序列一致性太高，增加同源重组丢失的风险，本发明分别选用猪、牛、鼠等多种来源的腮腺蛋白分泌信号肽序列，与猪源化蛋白酶序列重组，通过信号肽更新和序列优化，保证基因在猪腮腺细胞正常胞外分泌，筛选到适合在动物细胞表达分泌的纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等酶基因，这些基因汇聚了细菌，真菌和昆虫源的高效表达基因，再预先设计单个酶基因组合后的携带的全部表达序列，预先验证其表达活性，模拟多顺反子表达，利用In-fusion载体构建技术，一次性重组获得多基因重组多顺反子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)、本发明选择T2A(Thosea asigna virus)、E2A(Equine rhinitis A virus)、P2A(porcine teschovirus)(Donnelly et al,2001)等不同来源linker与furin蛋白酶识别氨基酸(-Arg-Lys/Arg-Arg↓)灵活组合，保证多顺反子翻译后各基因独立性，减少冗余序列对蛋白酶高级结构形成干扰；
(2)、本发明构建的多顺反子能共表达纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶与植酸酶，该顺反子共表达的蛋白酶囊括常规饲料中NSP酶的所有主要成员和植酸酶，若用于转基因动物的开发，将大大拓宽饲料资源的选择和开发，提高饲料利用率，减少污染排放；
(3)、本发明构建的多顺反子共表达的这些酶都能较好的兼容动物胃肠消化道pH环境，具有较好的胃蛋白和胰蛋白酶耐受性，这些酶主要在动物消化道细胞中表达，在动物胃、小肠、大肠等整个消化道都能发挥作用，且始终保持较高的活性，克服了传统饲料用酶制剂在加工，生产使用中缺陷和问题，由于是动物自身分泌，几乎不存在成本问题；
(4)、本发明多顺反子的构建思路不但可以用于节粮环保型转基因动物的制备和培育，也可以用于多功能组合酶制剂的开发和应用。
附图说明
图1为实施例1中纤维素酶基因真核表达酶活测定结果，其中，图A-C测定底物为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，图A’-C’测定底物为:β-葡聚糖，测定温度为39.5℃，A和A’测定pH分别为3.5(Cel5B)、4.8(EgII)、6.0(AG-Egasel)；
图2为实施例1中猪细胞表达Ppsp3-TeEGI纤维素酶的酶学特性，其中，A:最适pH测定；B:pH耐受性；C耐胃蛋白试验；D:耐胰蛋白酶试验；
图3为实施例1中猪细胞表达Rpsp-EgII纤维素酶的酶学特性，其中，A:最适pH测定；B:pH耐受性(2h)；C耐胃蛋白试验(2h)；D:耐胰蛋白酶试验(2h)；
图4为实施例1中三种果胶酶酶的活力测定，其中，图A、B测定底物分别为多聚半乳糖醛酸、55％-70％酯化果胶，测定温度为39.5℃，测定pH为4.5；
图5为本发明实施例1中PG7fn基因在PK15细胞中表达果胶酶的酶学性质；其中，A:最适pH测定；B:pH耐受性(2h)；C耐胃蛋白试验(2h)；D:耐胰蛋白酶试验(2h)；
图6为本发明实施例1中三种木聚糖酶的酶学性质比较分析，其中，A:最适pH测定；B:pH耐受性(2h)；C/D，E/F和H/I分别为Ppsp1-AspXyn/Xynl11/PenXyl耐胃蛋白试验(2h)和耐胰蛋白酶试验(2h)；图A、C、E分别为Axp-Xyn、XylII、PenXyl基因真核表达木聚糖酶猪胃蛋白酶耐受性测定结果；图B、D、F分别为Axp-Xyn、XylII、PenXyl基因真核表达木聚糖酶猪胰蛋白酶耐受性测定结果；测定温度为39.5℃；
图7为本发明实施例1中pH对CAPPA和EsAPPA影响；其中，A：磷标准曲线；B：CAPPA最适pH(mean±S.D.)；C：CAPPA的pH稳定性(mean±S.D.)；D：EsAPPA最适pH(mean±S.D.)；
图8为本发明实施例1中CAPPA和EsAPPA的胃蛋白和胰蛋白耐受能力(mean±S.D.,P<0.05)，其中，A：加胃蛋白处理；(-)：未经胃蛋白或者胰蛋白酶处理；B：‘trypsin+’和‘EDTA+’；加胰蛋白酶或EDTA处理；‘trypsin-’和‘EDTA-’；未经胰蛋白酶或EDTA处理；
图9为本发明实施例1中Xyn-EgII双顺反子重组优化的结果；
图10为本发明实施例1中pCD-EsAPPA-T2A和EsAPPA在PK15细胞中表达植酸酶的活性测定；
图11为本发明实施例1的pCD-TeEGI-T2A和TeEGI在PK15细胞中表达植酸酶的活性测定；
图12为本发明实施例1构建的PXAT多顺反子示意图；
图13为本发明实施例1中多顺反子PXAT使用信号肽的序列优化设计；
图14为本发明实施例1中构建的pCD-PXAT多顺反子的酶切结果，其中，M：DL5000；1为pCD-PXAT质粒；2为对应质粒的双酶切结果。
图15为多顺反子PXAT的表达测定与表达量差异比较；其中，A为表达测定图，B为表达量差异比较图；mo-：单基因转染对照，Re：多顺反子转染；
图16为本发明实施例2构建的pPB-mPSP-PXAT-neoGFP载体的图谱；
图17为本发明实施例2构建的pPB-mPSP-PXAT-neoGF载体的酶切图，其中，M，DL15000；1,3为pPB-mPSP-PXAT-neoGF质粒；2，4为对应质粒的限制性酶切结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
实施例1 多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法
包括以下具体步骤：
1、候选基因密码子优化及其真核表达载体构建
1.1、候选基因选择
根据文献报道及候选基因报道活性和特征，本实施例筛选以下基因进行改造和动物细胞表达适应性验证。
候选纤维素酶基因：来源于天牛的Ag-egaseI基因(Lee et al,2004)和Bh-EgaseI基因(Mei et al,2016)、来源于丝状真菌的Cel5B基因(Kim et al,2012)、来源于梭状芽孢杆菌的Cel9基因(Zhang et al,2010)、来源于Trichoderma reesei(里氏木霉)的EgII基因(Akbarzadeh et al,2014)、来源于蟋蟀的TeEGI基因(Kim et al,2008)
候选木聚糖基因：来源于青霉菌的PenXyl基因(Liu et al,2010)、来源于黑曲霉的Xyl11基因(Guo et al,2013)和XynB(张茂等，2010)
候选果胶酶基因：来源于耐热真菌沙栖梭孢壳XZ7的Pg7fn基因(Tu et al,2014)、来源于毛壳菌的PG基因(Tu et al,2013)、来源于黑曲霉JL-15的PgaA(Liu et al,2014)
候选植酸酶基因：来源于Escherichia coli大肠杆菌的植酸酶基因APPA(GoLovanet al,1990)，Citrobacter freundii(Zhao et al.,2010)植酸酶CAPPA将这些酶基因经SignalP 4.1Server预测信号肽后，分别去掉其原有信号肽。
1.2、候选基因猪源化改造
纤维素酶基因：将上述文献报道的纤维素酶基因用OptimumGeneTM基因设计软件进行猪密码子偏好进行优化，并将其分别与猪密码子优化后的Rat，Pig等腮腺分泌蛋白信号肽(Rpsp,Ppsp3)进行重组，利用猪密码子偏好性和简并性，对原始猪Ppsp信号肽密码子进行适当调整后，命名为Ppsp3，获得Rpsp-Ag-EGaseI/Bh-EGaseI/Cel5B/Cel9/EgII和Ppsp3-TeEGI基因(图13)。
果胶酶基因：将上述文献报道的果胶酶基因用OptimumGeneTM软件进行猪密码子偏好进行优化后，将其与bovine腮腺分泌蛋白信号肽(Bpsp)进行重组，中间添加6Xhis标签，最后在氨基酸的C末端与E2A重组，即：获得Bpsp-6His-Pg7fn/PG/PgaA-E2A。
木聚糖酶：将上述文献报道的木聚糖酶基因用OptimumGeneTM软件进行猪密码子偏好优化后，将其与猪腮腺分泌蛋白信号肽(Ppsp1)原始序列进行重组，即：Ppsp1-PenXyl/Xyl11/Aspxyn，接着克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体(商业载体)中EcoRⅠ和XhoI位点。
植酸酶基因：将上述文献报道的植酸酶基因经过用OptimumGeneTM软件进行猪密码子偏好进行优化后，与猪密码子偏好优化后的Ppsp2信号肽重组，利用猪密码子偏好性和简并性，对原始猪Ppsp信号肽密码子进行适当调整后，命名为Ppsp2，即为：Ppsp2-EsAPPA/CAPPA(图13)。
接着将上述重组和修饰后的纤维素酶基因，果胶酶基因、木聚糖酶基因和植酸酶基因克隆到克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体中EcoRⅠ和XhoI位点(基因合成和表达载体构建委托上海金斯瑞公司完成)，接着按照转染试剂盒LipofectamineTM LTX+PLUSTMReagent(invitrogen)说明书瞬时转染猪肾pK15细胞系，48～72h收集细胞培养液作为粗酶液测定酶活，酶活测定方法和定义参考纤维素酶《NYT/912-2004》、葡聚糖酶《NYT/911-2004》、木聚糖酶《GBT/23874-2009》、植酸酶《GBT/18634-2009》，果胶酶测定方法参考张飞等(2004)《果胶酶果胶酶活力的测定方法研究》。
1.3、候选基因真核表达结果
1)、纤维素酶
纤维素酶基因猪细胞表达结果(图1)显示，仅有Rpsp-EgII，Rpsp-Bh-EGaseI和Ppsp-TeEGI在猪细胞表达的纤维素酶和葡聚糖酶有活性，其中Rpsp-EgII和Ppsp-TeEGI活性最高。
猪细胞表达的Ppsp-TeEGI和Rpsp-EgII酶学测定结果(图2和图3)显示，二者都具有较宽pH范围和较强的pH耐受力，前者在pH>4有优势，后者在pH<4时有优势。二者对胰蛋白酶胃蛋白耐受性都比较强，说明二者都是理想的选择。
2)、果胶酶
三种猪源化的果胶酶在PK15细胞表达的酶活测定结果(图4)显示：3种来源的果胶酶仅有Bpsp-6His-Pg7fn和Bpsp-6His-PG具有活性，但Bpsp-6His-Pg7fn活性最高。Bpsp-6His-Pg7fn不但对低酯化的多聚半乳糖醛酸酶活性高，对55％-70％酯化果胶活性也比较理想，而PGI对55％-70％酯化果胶活性较差。酶学测定(图5)显示在pH3～6范围Bpsp-6His-Pg7fn都具有较高的活性，其pH耐受强，对胃蛋白酶(pH4.5)和胰蛋白酶(pH6.5)耐受力也比较理想。
Bpsp-6His-Pg7fn基因在表达前已经携带2A尾巴，表达结果显示2A并不影响该基因活性，表明该酶适合放在多顺反子的首位或中间部分。
3)、木聚糖酶活性
Ppsp1-AspXyn/Xynl11/PenXyl三种微生物源木聚糖酶基因在pK15细胞表达结果(图6)显示，三者都在pH 5.0时酶活力最高，分别为：1.88U/mL、1.65U/mL、0.72U/mL。Ppsp1-AspXyn在pH2.0-6.0范围变化最稳当，该基因对胃蛋白和胰蛋白耐受能力也明显好于其它两个木聚糖酶基因Xynl11/PenXyl。
4)、植酸酶基因
猪细胞表达的Ppsp2-EsAPPA/CAPPA均具有较高的活性，最适pH和pH稳定性测定显示(图7)，CAPPA有两个最优pH峰，即pH 2.5和5.0；EsAPPA在pH1.5～5.0均保持较高的活性，优势明显。
耐受性测定结果(图8)显示：EsAPPA对胃蛋白酶耐受能力较强，胃蛋白处理前后，酶活几乎没变化，而CAppA剩余酶活只有52.2％。单独用胰蛋白酶处理CAppA和EsAPPA两个小时后，CAppA和EsAPPA剩余酶活分别为39.7％和98.2％。在EDTA存在情况下，胰蛋白酶处理CAppA和EsAPPA两个小时剩余酶活分别为13.7％和31.8％。对比结果显示猪源化的EsAPPA是本发明实施例的理想选择。
1.4、可在猪细胞高效表达的候选基因重组优化
1)、木聚糖酶和纤维素酶优化重组试验
分别构建flagXyn-FE2A-flagEgII-FT2A、flagXyn-FE2A-EgII，flagXYN-FE2A-EgII-FT2A，flagXYN-FE2A-flagEgII并克隆到pCDNA3.1(+)EcoRⅠ和XhoⅠ位点(委托金斯瑞公司基因合成和克隆)。将上述重组的木聚糖酶基因-纤维素酶基因双顺反子与单基因Rpsp-EgII和Ppsp1-Asp-XynIII分别转染PK15细胞后，收集细胞培养基，分别测定其木聚糖酶及纤维素酶活性(CMCase)和葡聚糖酶活性，结果显示(图9)：flagXYN-furinE2A-EgII融合效果最好，与单基因载体相比，木聚糖酶活性为单基因asp-xyn表达活性的57.35％，β-葡聚糖酶活性为单基因的46.90％，其CMC的活性分别为纤维单基因的67.97％(由于基因大小与转染效率直线相关，双基因转染效率不及单基因的50％，直接影响酶活力)。该试验结果表明Ppsp1-AspXyn基因适合放置在首位和中间部位，并且不受其它序列干扰，而Rpsp-EgII基因较为敏感，无论2A，furin和flag-tag都直接影响其蛋白功能，表明其只能放于多顺反子的末位(放在末尾位置，其3末端不需要在与其他基因融合表达，独立性强)。
2)、植酸酶EsAPPA和TeEGI基因在多顺反子位置优化重组试验
为确定植酸酶EsAPPA和TeEGI基因在多顺反子中位置，设计引物在单基因PpspEsAPPA和Ppsp-TeEGI 3-末端添加furin-T2A序列及HindIII和NotI酶切位点，并克隆到pCDNA3.1(+)的HindIII和NotI酶切位点，引物序列见表1，分别转染PK15细胞，收集细胞培养基，测定植酸酶活性和纤维素酶活性。
表1 EsAPPA和TeEGI基因定点突变所用引物序列
测定结果(图10)显示：pCD-EsAPPA-T2A在PK15细胞中表达的植酸酶活力为1.00U/mL，较不添加2A序列的EsAPPA基因表达的植酸酶活性低0.08U/mL，差异不显著，表明在该基因3-末端添加furin-2A对其空间结构和酶活都没影响，表明EsAPPA可以放在多顺反子中间或两头位置。
但是TeEGI基因在添加2A后，其纤维素酶活性和葡聚糖酶活性都受到较大的影响(图11)，表明该基因3-末端添加furin-2A对其空间结构干扰较大，严重影响了其活力，该结果表明TeEGI基因只能放置在多顺反子末端位置。
2、多顺反子pCD-PXAT构建、表达及酶活检测
根据上述对单个基因或双基因初步重组试验结果可知，对候选基因Bpsp-6His-Pg7fn,Ppsp1-AspXyn,Ppsp2-EsAPPA,Ppsp3-TeEGI重组排列组合顺序有以下2种：Pg7fn-AspXyn-EsAPPA-TeEGI/EgII,Pg7fn-EsAPPA-AspXyn-TeEGI/EgII。本实施例选择前者进行验证，即构建BpspHisPg7-E2A-Ppsp1-AspXYN-P2A-Ppsp2-EsAPPA-furinT2A-Ppsp3-TeEGI(PXAT)，其示意图如图12所示，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
根据重组基因Bpsp-6His-Pg7fn(SEQ ID No:4),Ppsp1-AspXyn(SEQ ID No:5),Ppsp2-EsAPPA(SEQ ID No:6),Ppsp-TeEGI(SEQ ID No:7)序列，在基因上下游两侧依次设计infusion接头引物(表3)，接着以PCD-Bpsp-6His-Pg7fn/Ppsp1-AspXyn/Ppsp2-EsAPPA/Ppsp-TeEGI为模板进行扩增，扩增的目的基因末端(infu-Pg7fn/AspXyn/EsAPPA/TeEGI)及载体末端(pcDNA3.1)具有15bp同源序列，扩增程序：98℃预变性10s，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，35个循环，72℃后延伸2min。扩增产物经切胶回收纯化。
接着利用EcoRⅠ和NotⅠ酶切pcDNA3.1载体(商业化)，纯化回收后，利用In-FusionTMHD Cloning Kits试剂盒，将线性化载体pcDNA3.1载体与infu-Pg7fn/AspXyn/EsAPPA/TeEGI重组反应，反应条件：50℃，15min然后放于冰上。反应体系如下表2，接着经转化，涂板，挑菌，鉴定构建PXAT多顺反子真核表达载体，见图14。
表2 PAXT多顺反子构建infusion重组体系
项目 用量(uL)
5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2
Linearized Vector pcDNA3.1 1
infu-Pg7fn 1～1.5
Infu-Xyn 1～1.5
Infu-AppA 1～1.5
Infu-TeEGI 1～1.5
dH<sub>2</sub>O 1～3.0
表3 多顺反子构建及检测所用引物序列
抽提无内毒素质粒瞬时转染PK15细胞，同时将单基因载体瞬时转染PK15细胞作为对照，48小时后，收集细胞培养基，测定相应酶活力，测定结果如图16所示。结果(图15A)显示，多顺反子在PK15细胞中成功共表达木聚糖酶、纤维素内切酶、β-葡聚糖酶、果胶酶，Q-PCR结果显示，PXAT每个基因都得到表达，但由于多顺反子质粒远远大于单个基因载体，其转染效率远远小于单个质粒的效率，这直接影响其mRNA的转录水平，结果见图15B。
实施例2 唾液腺特异表达PXAT载体构建
唾液腺特异表达载体pPB-mPSP-neoGFP为本单位专利保护载体(专利号：ZL201310343067.0)。
载体构建包括以下步骤：
首先设计infusion-F和infusion-R(见表4)，以pCD-PXAT为模板，利用Max DNA Polymerase进行PCR反应，反应程序：98℃预变性10s，98℃变性10s，68℃退火和延伸4min，33个循环，扩增产物infu-PXAT末端与线性化pPB-mPSP-neoGFP载体(AscI酶切)末端具有15bp同源序列；接着利用In-FusionTM HD Cloning Kits将infusion-PXAT克隆到pPB-mPSP-neoGFP的AscⅠ酶切片段上构建pPB-mPSP-PXAT-neoGFP，反应体系见表5，构建结果见图16，核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
表4 pPB-mPSP-PXAT-neoGFP构建及检测引物序列
表
5 pPB-mPSP-PXAT-neoGFP构建重组反应体系
项目 用量(uL)
5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2
Linearized Vector pPB-mPSP-neoGFP 1
infu-PXAT 1～3
dH<sub>2</sub>O 4～6
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多基因共表达的多顺反子，其特征在于，所述多顺反子为如SEQ ID No:1所示的碱基序列。
2.一种多基因共表达的多顺反子，其特征在于，所述多顺反子为如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
3.一种多基因共表达的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体包括权利要求1或2所述的多基因共表达的多顺反子。
4.权利要求3所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、对果胶酶基因Pg7fn进行猪密码子偏好优化，再与bovine腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，中间添加6×his标签，获得序列号为SEQ ID No:4的重组果胶酶基因Bpsp-6His-Pg7fn；对木聚糖酶基因AspXyn进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID No:5的重组木聚糖酶基因Ppsp1-AspXyn；对植酸酶基因EsAPPA进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID No:6的重组植酸酶基因Ppsp2-EsAPPA；对纤维素酶基因TeEGI进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID No:7的重组纤维素酶基因Ppsp3-TeEGI；
(2)、分别以重组果胶酶基因Bpsp-6His-Pg7fn为模板，SEQ ID No:14及SEQ ID No:15作为引物；以重组木聚糖酶基因Ppsp1-AspXyn为模板，SEQ ID No:16及SEQ ID No:17作为引物；以重组植酸酶基因Ppsp2-EsAPPA为模板，SEQ ID No:18及SEQ ID No:19作为引物；以重组纤维素酶基因Ppsp3-TeEGI为模板，SEQ ID No:20及SEQ ID No:21作为引物；进行PCR扩增，获得具有E2A、P2A和T2A末端的目的基因infu-pg7fn、infu-AspXyn、infu-EsAPPA和infu-TeEGI；
(3)、利用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切pcDNA3.1载体获得线性化载体pcDNA3.1载体，再与步骤(2)获得的目的基因infu-Pg7fn、infu-AspXyn、infu-EsAPPA和infu-TeEGI进行重组反应，获得多顺反子真核表达载体pCD-PXAT，所述多顺反子真核表达载体pCD-PXAT包括权利要求1或2所述的多基因共表达的多顺反子。
5.根据权利要求4所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增程序为：98℃预变性10s，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸45s，35个循环，72℃后延伸2min。
6.根据权利要求4所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述重组反应的反应体系为：2uL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix、1uL线性化载体pcDNA3.1、1～1.5uL infu-Pg7fn、1～1.5uL infu-AspXyn、1～1.5uL infu-EsAPPA和1～1.5uL infu-TeEGI、加dH2O至10uL。
7.根据权利要求4所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述重组反应的反应条件为：50℃，15min。
8.一种唾液腺特异性表达多顺反子的载体，其特征在于，所述载体具有如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。
9.权利要求8所述的唾液腺特异性表达多顺反子的载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、以权利要求4所述的多顺反子真核表达载体pCD-PXAT为模板，SEQ ID No:24和SEQID No:25为引物，进行PCR反应，得到扩增产物infu-PXAT；
(2)、利用AscI酶切pPB-mPSP-neoGFP载体，得到线性化的pPB-mPSP-neoGFP载体，将上述扩增产物infu-PXAT克隆到pPB-mPSP-neoGFP的Asc Ⅰ酶切片段上，构建得到pPB-mPSP-PXAT-neoGFP，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
10.根据权利要求9所述的唾液腺特异性表达多顺反子的载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR的反应程序为：98℃预变性10s，98℃变性10s，68℃退火和延伸4min，33个循环；步骤(2)中的反应体系为：2uL5×In-Fusion HD Enzyme Premix、1uL线性化载体pPB-mPSP-neoGFP、1～3uL infu-PXAT、4～6uL dH2O。
CN201610397567.6A 2016-06-06 2016-06-06 一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法 Active CN106086068B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610397567.6A CN106086068B (zh) 2016-06-06 2016-06-06 一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610397567.6A CN106086068B (zh) 2016-06-06 2016-06-06 一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106086068A CN106086068A (zh) 2016-11-09
CN106086068B true CN106086068B (zh) 2019-11-08

Family

ID=57227267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610397567.6A Active CN106086068B (zh) 2016-06-06 2016-06-06 一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106086068B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846337A (zh) * 2019-11-26 2020-02-28 温氏食品集团股份有限公司 一种多功能融合酶xabt基因及构建方法和应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108865914B (zh) * 2018-07-21 2021-08-27 湖北大学 一种可降解木质纤维素的重组酿酒酵母菌株及其应用
CN110846336B (zh) * 2019-11-26 2022-12-20 温氏食品集团股份有限公司 一种多功能融合酶xaet和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法
CN110846297B (zh) * 2019-11-26 2023-04-07 温氏食品集团股份有限公司 一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966188A (zh) * 2014-02-12 2014-08-06 华南农业大学 可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8809018B2 (en) * 2010-02-10 2014-08-19 Yfy Biopulp Technology Limited Modified nucleotide molecules of xylanase and application thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966188A (zh) * 2014-02-12 2014-08-06 华南农业大学 可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
唾液腺特异表达植酸酶转基因猪的制备及分析;孙悦等;《农业生物技术学报》;20160405;第24卷(第8期);1147-1155页 *
木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker 优化及其在猪肾pK15细胞中共表达;张献伟等;《中国农业科学》;20131231;第46卷(第22期);4774-4783页 *
非淀粉多糖酶基因筛选及其与植酸酶基因共表达载体构建;孙悦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20170315(第3期);D050-78 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846337A (zh) * 2019-11-26 2020-02-28 温氏食品集团股份有限公司 一种多功能融合酶xabt基因及构建方法和应用
CN110846337B (zh) * 2019-11-26 2023-02-28 温氏食品集团股份有限公司 一种多功能融合酶xabt基因及构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106086068A (zh) 2016-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chadha et al. Thermostable xylanases from thermophilic fungi and bacteria: current perspective
CN106086068B (zh) 一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法
Fan et al. High-level expression of a xylanase gene from the thermophilic fungus Paecilomyces thermophila in Pichia pastoris
CN102143972A (zh) 白蚁纤维素酶在酵母中的异源表达
CA2785311C (en) Thermostable xylanase for the selective hydrolysis of pentose-containing polysaccharides
Sun et al. Direct cloning, expression of a thermostable xylanase gene from the metagenomic DNA of cow dung compost and enzymatic production of xylooligosaccharides from corncob
Lafond et al. Four GH11 xylanases from the xylanolytic fungus Talaromyces versatilis act differently on (arabino) xylans
CN105695439B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法
US9598700B2 (en) Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
US20170327809A1 (en) Polypeptides having xylanase activity with a high conversion rate of xylose - containing polysaccharides
Zhang et al. Cloning and expression of a Paecilomyces thermophila xylanase gene in E. coli and characterization of the recombinant xylanase
CN111094556B (zh) 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法
US7226772B2 (en) Recombinant xylanases derived from anaerobic fungi, and the relevant sequences, expression vectors and hosts
Tian et al. Molecular cloning and overexpression of an endo-β-1, 4-xylanase gene from Aspergillus niger in industrial Saccharomyces cerevisiae YS2 strain
AU2013344666B2 (en) Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
Han et al. Effect of VIB gene on cellulase production of Trichoderma orientalis EU7-22
Ali et al. Purification, characterization, gene cloning and sequencing of a new β-glucosidase from Aspergillus niger BE-2
CN103993025A (zh) 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用
Kalinina et al. Expression of the Xylanase Gene from Paenibacillus brasilensis X1 in Pichia pastoris and Characteristics of the Recombinant Enzyme
CN103966188B (zh) 可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用
KR101350955B1 (ko) 신규 엑소글루카나제 및 그의 용도
CN112779241B (zh) 一种宏基因组来源的木聚糖酶及其编码基因
WO2015118205A1 (es) Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables
CN116574162B (zh) 一种里氏木霉转录激活因子Xyr1突变体及其在提高纤维素酶及木聚糖酶产量中的应用
CN108841810B (zh) 一种多功能纤维素酶基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 527400 9 East Causeway North Road, Xinxing County new town, Yunfu, Guangdong

Applicant after: Winson food group Limited by Share Ltd

Applicant after: South China Agricultural University

Address before: 527400 9 East Causeway North Road, Xinxing County new town, Yunfu, Guangdong

Applicant before: Guangdong Wens Foodstuff Group Co., Ltd.

Applicant before: South China Agricultural University

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant