CN103993025A - 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，采用易错PCR突变文库中筛选方法产生的含两个突变位点的突变木聚糖酶基础上进行位点突变产生的；有效突变位点的确定，通过比较不含突变位点、含一个突变位点和含两个突变位点四种木聚糖酶的活性发现突变位点G200C为有效突变，由易错PCR文库中筛选出的含两个突变位点的木聚糖酶是由于G200C位点的组合效应引起，提高突变木聚糖酶的性能。突变基因与原基因相比，具有较强的耐热性、pH耐受性及酶比活。此木聚糖酶可以水解半纤维素生产低聚木糖。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程改造木聚糖酶基因技术，通过这种技术对木聚糖酶基因进行耐热性能改造，生产高耐热性的木聚糖酶。
背景介绍
我国是饲料生产大国，饲料的年产量居世界第二位。然而我国饲料资源并不丰富，随着人畜争粮矛盾的日益突出，我国能量饲料缺口逐渐增大。充分利用我国丰富的非常规饲料资源，提高现有饲料资源的消化利用率，将成为我国畜牧业长期、持续、健康发展的关键。
随着动物营养学的，越来越多的研究结果表明在动物日粮中添加木聚糖酶无论对单胃动物还是反刍动物，均可提高饲料的消化利用率及家畜的生产性能。目前，国外对木聚糖酶的研究已经逐渐成熟和产业化并在1992年就实现了酶制剂的工业化生产。
到目前为止，细菌、真菌和放线菌来源的木聚糖酶都得到了广泛而深入的关注和研究目前已发现原核生物和真核生物中共几十个属、几百个种的微生物可以产生木聚糖酶。不同来源的木聚糖酶其功能有着较大差异。细菌所产的木聚糖酶主要是大分子的酸性木聚糖酶和小分子的碱性木聚糖酶，而真菌所产的木聚糖酶主要是小分子的碱性木聚糖酶。对于饲用木聚糖酶而言，对其性质的主要要求是：在较广的pH环境中有较好的耐受性，以便适应动物胃肠道不同的pH环境。其次，在制粒过程中，还要能够适应短暂的高温制粒环境，因此对木聚糖酶的耐热性具有一定的要求。在饲用酶的应用过程中，稳定性是影响应用效果的重要因素。目前可以通过改进生产工艺使酶的稳定性得以提高，但主要技术指标——发酵酶活则主要取决于菌种生产性能和酶本身。目前普遍采用的包被技术不能从根本上改变酶的热稳定性，而基因工程和蛋白质工程的发展为改造木聚糖酶提供了新手段。
对木聚糖酶产生菌研究较多的是丝状真菌，如曲霉属和木霉属，其次是细菌中的芽孢杆菌属。基于结构和遗传信息，已知并定性的木聚糖酶均属于家族GH10或GH11，也有其他的类型属于GH5，GH7，GH8和GH43家族。目前木聚糖酶的生产主要依靠真菌发酵，细菌等微生物发酵生产，但所选用菌株的酶产量一般较低，或木聚糖酶耐热性能不够好，或在产木聚糖酶的同时也分泌纤维素酶，限制了工业应用可操作性，高活性、热稳定性强，适应高温高湿环境特性以便于饲料加工的木聚糖酶成为一直以来的研发热点。然而木聚糖酶作为一种生物蛋白，其固有缺点也是热稳定性差、易失活。为解决这一问题，也成了国内外科学家的科研热点。总体来讲，主要分为以下几个方向：采用筛选培养基从各种环境中筛选具有嗜热特性的能产生木聚糖酶的菌株；通过各种方法克隆及筛选嗜热特性的木聚糖酶基因；优化不同的载体系统与表达系统；蛋白质化学修饰，如功能集团的修饰、酶分子内或分子间交联、与大分子结合等及后处理工艺，如加入稳定剂、包被技术、液体后喷涂技术等；从根本上改变木聚糖酶的分子结构，如对木聚糖酶基因序列进行修饰如定点突变、随机突变、易错PCR、DNA改组、序列优化等。
随着基因工程、蛋白质工程及的广泛应用，人们对酶的热稳定性性研究越来越深入。如何提高木聚糖酶的热稳定性受到了广泛的关注，通过比较12个不同热稳定性的GH11家族木聚糖酶的晶体结构，提出了一些结构因素，比如更高的Thr∶Ser的比例，带电荷的氨基酸的数目，β片层上的氨基酸数目和α螺旋的稳定对于11家族木聚糖酶的稳定性有很大的影响。另外人们通过定点突变，例如增加二硫键，增加芳香类氨基酸的结合，增加蛋白质表面的带电氨基酸来增强木聚糖酶的热稳定性，另外定向进化技术也是获得热稳定性高的木聚糖酶的常用手段。但是我们可以看到这些影响酶热稳定性的结构因素和氨基酸位点大部分都是分布在蛋白质的表面。其实不只GH11家族的木聚糖酶，在其他的一些蛋白质中导致热稳定性提高的突变位点大部分都是发生在蛋白质的表面。这是因为在同一蛋白质家族中，不同热稳定性的蛋白质的内部疏水核心的序列和结构是非常保守的，热稳定性不高的蛋白质的疏水核心同 样堆积得非常有效，这导致在蛋白质内部疏水核心进行的突变常常导致热稳定性的降低。
由于G／11木聚糖酶结构较小，所以对这个家族的酶学性质研究也较多。1995年，根据T.reeseii两个木聚糖酶晶体结构的差异，推测同活性位点在空间位置上较近的氨基酸对于酶最适pH值有影响，从而造成了这两个酶最适pH值的不同。1998年，对A.kawachii木聚糖酶C进行定点突变将Asp100替换为Asn，使酶的催化反应从最适pH2显著提高到5；但是酶催化活性下降到野生型酶的15％，同时发现在酶表面有大量酸性氨基酸存在。2000年，研究者又将B.circulans木聚糖酶A的Asn100突变为Asp，从而将其最适pH值5.7向下移到4.6。实验证实在T.reesei木聚糖酶II“Ser／Thr”表面引入Arg，这个突变将催化反应pH向碱性方向偏移了0.5-1.0个单位。在酶的热稳定性方面，1993年，运用随机突变方法提高了B.pumilus木聚糖酶A的热稳定性，并且分离出4个突变酶。由分析结果可以看出这些热稳定性突变发生在木聚糖酶序列氮端，同时结果表明Gly突变为Asp或Ser从而可能形成了氢键。1996年对于A.niger木聚糖酶A的结构分析，发现二硫键存在于Cys92和Cys111之间，从而将“弦”同蛋白结构中大的β-折叠片连接起来。1998年，通过对嗜热性Thermomyces lanuginoseus G／11木聚糖酶A三维结构的分析，认为它的热稳定性是由于二硫键存在于Cys100和Cys154之间；同时在整个蛋白中显示出带电荷氨基酸密度有增加现象。对于嗜热性蛋白质结构的研究，发现其螺旋区域的结构要比温性蛋白的螺旋区域更加稳定。2000年，在T.fusca嗜热性木聚糖酶和S.lividans嗜温性木聚糖酶基因之间，采用随机基因重组方法产生了嵌合酶。嵌合酶最适温度比嗜温性野生型木聚糖酶高出20℃，同时保留了野生型木聚糖酶较高催化活性。这个结果显示蛋白质氮端在酶热稳定性方面有重要作用。根据对嗜热／嗜温性木聚糖酶三维结构的对比分析结果及差异性比较，发现了嗜热性木聚糖酶所含有的热稳定性结构：Y11-Y16芳香族相互作用。通过对中温菌的木聚糖酶基因定向突变，将11位苏氨酸突变为酪氨酸，于16位酪氨酸形成芳香族相互作用，提高了这个木聚糖酶的嗜热性和热稳定性，结果突变酶的最适温度由原来的60℃提高到70℃，57℃时酶的热稳定性比原来提高了6倍。
Claire Dumon采用Gene site saturation mutagenesis方法对突变氨基酸序列活性进行测定显示，有活性的突变，主要集中在N端附近，但N端的保守型不强。
目前使蛋白质热稳定性提高的方法主要是对蛋白质表面表面的氨基酸进行替换，特别是蛋白质的环和和转角处。但是以蛋白质的疏水核心为出发点，改变蛋白质内部的核心氨基酸，同样可以提高酶的热稳定性以及比活性。
通过对原始序列FJ593504.1分析发现，其含有GH11水解酶家族的保守部位。如：109-111位的YGW，118-120位的EYY，158—160位的PSI，168-173位的QYWSVR(在氨基酸序列中用阴影表示)，主要是芳香族氨基酸，其中大部分芳香族氨基酸是底物的结合位点。
发明内容
以gb|FJ593504.1|为原始序列，通过输入www.swissmodel.expasy.org网站预测其三维结构，运用swiss-pdbviewer显示结构并进行分析。在http:／／ca.expasy.org／网站上找到该木聚糖酶的活性位点：第118位谷氨酸E为亲核中心，第210位谷氨酸E，为质子供体。通过易错PCR方法，产生了一种酶耐热性和酶比活行均强于原始木聚糖酶的蛋白，通过测序结果发现，突变位点不是木聚糖酶的活性中心。
一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，采用易错PCR突变文库中筛选方法产生的含两个突变位点的突变木聚糖酶基础上进行位点突变产生的；有效突变位点的确定，通过比较不含突变位点、含一个突变位点和含两个突变位点四种木聚糖酶的活性发现突变位点G200C为有效突变，由易错PCR文库中筛选出的含两个突变位点的木聚糖酶是由于G200C位点的组合效应引起，提高突变木聚糖酶的性能。突变基因与原基因相比，具有较强的耐热性、pH耐受性及酶比活。此木聚糖酶可以水解半纤维素生产低聚木糖。
附图说明
图1木聚糖酶的热稳定性
图2酶的pH稳定性
图3xynA／G200C木聚糖酶的表达与纯化(其中1为marker，2,3,4分别为粗酶液，对照，纯化产物)
具体实施方式
实施例1活性克隆子的筛选
设计引物，为了在pet28a+载体中表达，将NcoI酶切位点所产生的粘性末端的atg作为起始氨基酸，为避免引入移码突变，根据大肠杆菌表达密码子偏好性，在粘性末端的g后添加tg，将第二个氨基酸突变为缬氨酸，从第三个氨基酸开始不变，同时为方便后期产物的纯化，加入6×his标签。以pET28a／xynA为模板进行易错PCR扩增。引物的上下游分别添加NcoI和XhoI酶切位点，用下划线表示，序列如下所示：
1-F：ccatggtgatcggtattacctcctttgctctc／1-R：ctcgagttaatgatgatgatgatgatggccgacgtcagcgacg
PCR扩增反应体系如下：
易错PCR反应体系50μL如下：
1×TaqDNA聚合酶缓冲液、0.2mmol／LdATP和dGTP、1mmol／LdCTP和dTTP、3-7mmol／LmmolMg2+、0.15～0.3mmol／LMn2+、1pmol／L上下游引物、模板DNA。其中，Mg2+和Mn2+的浓度被调整，可以得到不同突变频率的文库。
反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃1min和72℃1min，30个循环后72℃延伸10min，然后冷却至4℃。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，大小与预期一致。在紫外下观察目的片段大小与预期相符，切下目标DNA片段，康为世纪试剂盒进行凝胶回收。
上述易错PCR产物经胶回收纯化后，经NcoI和XhoI双酶切，与同样双酶切的载体pET28a相连接，转入Top10感受态细胞，提取质粒，将质粒分别引入大肠杆菌BL21(DE3)。菌落接种到每孔含50μLLB+Amp液体培养基的96孔板中进行初筛；37℃摇床培养18h,加入50μL底物1％木聚糖溶液，50℃反应0.5h，加入50μLDNS终止反应，充分混合，置沸水浴中煮沸5rnin，用冷水将其冷却至室温。进行比色。有活性的克隆子将呈现亮砖红色。
筛选出有活性且颜色较深的克隆子，于37℃试管培养10h，进行酶活测定。将活性最高的克隆子送往北京诺赛测序。
经过测序结果与原序列进行序列比对发现，在活性克隆子存在以下两个突变：Q56R，G200C，将该克隆子命名为pET。为了进一步探讨两个突变位点中活性位点，本研究进一步设计两对引物，获得以下两种蛋白序列：
| 序列名称 | 引物对 |
| xynA Q56R | 2-F／2-R |
| xynA G200C | 3-F／3-R |
对活性克隆子质粒进行双酶切，酶切体系如下：
37℃水浴锅中反应2h。
琼脂糖电泳检测，出现700bp和5.4k的片段，回收小片段，与pMD18-T vector相连，连接体系如下：
将测序正确的克隆，将其命名为pMD18-T-xynQ56R／G200C，以其为模板，分别以2-F， 2-R，3-F，3-R为引物对，进行扩增，扩增体系与上一致。其中第二对引物用于在原始木聚糖酶蛋白序列Q56R，第三对引物用于原始木聚糖酶蛋白序列G200C。引物序列如下：
2-F-5′GAACGTTAACGGTGACCACTACTACCA3′
2-R：5′AGTGGTCACCGTTAACGTTCAAACC
3-F：5′GGTGGAGCCCAGGCCACGTACACC3′
3-R：5′ACGTGGCCTGGGCTCCACCGTCAC3′
以2-F／2-R为引物扩增的产物分别命名为xynA／Q56R和xynA／G200C扩增产物采用无酶克隆的方式直接转化DH10β感受态细胞，氨苄抗性平板筛选，随机挑取平板上长出的克隆，抽提克隆质粒以T载体通用引物测序，将阳性质粒分别命名为pMD18-T-xynA／Q56R和pMD18-T-xynA／G200C。
以1-F和1-R为引物，以pET28a／xynA为模板进行常规PCR扩增，扩增xynA基因。扩增反应体系如下：
PCR扩增反应体系如下：
酶切质粒pMD18-T-xynA／Q56R，pMD18-T-xynA／G200C和pET28a(+)以及扩增的xynA基因。酶切体系如下：
37℃水浴锅中反应2h。
琼脂糖电泳检测，xynA／Q56R和xynA／G200C质粒出现的酶切片段片段大小为700bp和2.9kbp，pET28a(+)酶切后的片段大小为5.4k，与预期大小一致。
实施例2原核表达载体构建
将pET28a(+)双酶切后大片段分别与700bp的小片段相连，连接体系如下：
16℃过夜连接。转化Top10感受态细胞，转化程序相同涂布于卡那抗性的平板上。随机挑取平板上的克隆，抽提质粒，酶切鉴定结果显示，片段大小与预期一致。载体构建正确，含四种基因的载体分别命名为：pET-xynA、pET-xynA／Q56R、pET-xynA／G200C。
实施例3木聚糖酶的表达
一酶的表达与纯化
将四种质粒分别转化E.coli BL21-CodonPlus(DE3)感受态细胞，涂布于卡那抗性的平板，37℃倒置过夜培养。
挑取单克隆，接种于5mL液体卡那抗性(50μg／ml)的LB培养基中，过夜培养，再以2％的接种量转接到50ml卡那抗性(50μg／ml)的LB培养基中，30℃振荡培养，当培养液OD600nm达到0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol／L，诱导培养10-20h后，离心收集细胞。再用超声波破碎仪破碎细菌细胞，离心收集上清即为粗酶液。
二测定粗酶液的酶活特性
(1)酶活测定方法：
取出10支干净的具塞试管，将其分别编号为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。按从0到0.1mg／mL的浓度梯度加入木糖溶液2mL，加入DNS溶液3mL，充分混合，置沸水浴中煮沸5rnin，用冷水将其冷却至室温。在540nm下以0号管为参比，测定其它试管溶液的吸光值。以木糖量x(mg)对吸光值Y作图，得出木糖量与吸光值关联的标准曲线。1个国际酶活力单位：在60℃和pH6.5条件下，每分钟水解木聚糖产生1μmol还原糖所需酶量。在此分析中，还原糖以木糖为标准。原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。
蛋白定量采用BSA蛋白定量法。首先以牛血清蛋白为标准，制备标准曲线，按照以下表格配置不同BSA浓度的标准曲线。
每个点三个重复，测定吸光值，制备吸光值与BSA蛋白浓度的标准曲线。将待测样品进行梯度稀释，每个点三个重复，每个孔加入200μLR-250，在1h以内以空白管为对照，酶标仪595nm下比色，被测样品的OD595值在0.1-0.05之间。如果OD595值太大，将样品再进行稀释比色。
根据吸光值和标准曲线，计算样品的蛋白浓度。
| 粗酶液名称 | 粗酶液体积(mL) | 酶活(U／mL) | 总酶活 | 总蛋白 | 比酶活 |
| xynA | 46.3 | 174.3 | 8070.09 | 552.75 | 14.6 |
| xynA／Q56R | 46.8 | 110.6 | 5176.08 | 424.27 | 12.2 |
| xynA／G200C | 46.2 | 280.5 | 12959.1 | 689.31 | 18.8 |
| xynA／Q56R-G200C | 46 | 220.1 | 10124.6 | 632.39 | 15.01 |
(2)最适作用温度及温度稳定性将木聚糖酶
分别在不同温度条件与底物反应下，检测粗酶液的活力。结果表明，木聚糖酶xynA的最适反应温度为65℃，木聚糖酶xynA／Q56R的最适反应温度为50℃，木聚糖酶xynA／G200C的最适反应温度为80℃，木聚糖酶xynA／Q56R-G200C的最适反应温度为70℃；将三种粗酶液在不同的温度条件下，保温30min，检测剩余木聚糖酶的活力，未经处理酶活力定为100。结果如图1所示，木聚糖酶xynA／M354和xynA／M630酶在50℃以下保温处理后，活力损失不到10％，而60℃保温30min，活力丧失近60％，含有一种突变的酶的温度稳定性较差。木聚糖酶xynA／M354-M630在50℃以下保温处理后，活力损失不到10％，而60℃保温30min，活力丧失30％，经过两个位点突变后，酶的温度稳定性有所提高。
(3)最适作用pH值及pH稳定性
配置pH值为3-10的PBS缓冲液，以HCl和NaOH调整PBS缓冲液的pH。以不同pH值缓冲液配制木聚糖底物，在50℃条件下检测粗酶液的木聚糖酶活力。结果表明木聚糖酶xynA及xynA／Q56R的最适pH为7.0，木聚糖酶xynA／G200C和木聚糖酶xynA／Q56R-G200C的最适pH为6.5，其中xynA／G200C的pH耐受性更广，在pH4-pH10.5范围内都具有50％以上的活力。如图2所示。
综合选择来看，xynA／Q56R性能相对于原始蛋白酶，性能下降；木聚糖酶xynA／G200C性能优于其他酶，而木聚糖酶xynA／Q56R-G200C性能优于原始基因，这很有可能是是由于G200C组合效应引起。综合评价，木聚糖酶xynA／G200C是效果最好的突变。
三粗酶液的纯化
采用美国全式金公司产品ProteinIsoNi-NTAResin进行纯化。用5-10倍柱体积的平衡缓冲 液(50mmol／L，pH8.0，磷酸缓冲液，0.3mol／L NaCl)平衡层析柱。对于结合能力强的His标签重组蛋白，或为了提高特异性结合，平衡液中可加入低浓度20mM咪唑。
将上述粗酶液以与平衡好的Ni柱混合，密封后，放置于旋转器中旋转混合，并将旋转器至于层析柜中，3h后取出，离心，分离上清与Ni珠；接着用50mmol／L、100mmol／L、150mmol／L、200mmol／L、300mmol／L的咪唑溶液对Ni珠进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液。对上述收集的每管样品分别进行SDS-PAGE电泳，判断目标蛋白的最佳咪唑洗脱浓度。收集各个咪唑浓度洗脱的蛋白样品，装入透析袋中，于pH8.0的1×PBS缓冲液中磁力搅拌器透析，每天换液3-4次，除去咪唑分子。测定纯化后蛋白酶的活力。结果如下：
实例4木聚糖酶的应用
分别以燕麦木聚糖和玉米芯为底物，加入粗酶液,50℃保温3h后，煮沸灭酶活后，进行薄层层析分析。展层剂(正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3)，显色剂(2％二苯胺丙酮∶2％苯胺丙酮∶85％磷酸=5∶5∶1)。将样品点至硅胶板上，自然干燥。将干燥好的硅胶板置于薄层层析缸中，下端浸于新配制的展层剂中，使展层剂由下而上扩展。展开2次后，自然干燥。均匀喷上显色剂，85℃烤5min，观察结果。
将粗酶液适当稀释，然后分别以燕麦木聚糖和玉米芯为底物，50℃保温3h后，煮沸灭酶活。用薄层层析对酶解产物进行分析，结果表明木聚糖酶水解燕麦木聚糖的产物以三糖、四糖和五糖为主；而水解玉米芯的产物主要是二糖、三糖和四糖，因此该酶可用于水解半纤维素生产低聚木糖。
Claims (5)
1.一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，其特征在于：采用易错PCR突变文库中筛选方法产生的含两个突变位点的突变木聚糖酶基因基础上进行位点突变产生的。
2.根据权利要求1所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，其特征在于有效突变位点的确定，通过比较不含突变位点、含一个突变位点和含两个突变位点四种木聚糖酶的活性发现突变位点G200C为有效突变，由易错PCR文库中筛选出的含两个突变位点的木聚糖酶是由于G200C位点的组合效应引起。
3.根据权利要求1所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，其特征在于所述的突变木聚糖酶基因与原基因相比，具有较强的耐热性、pH耐受性及酶比活。
4.根据权利要求2所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，其特征在于G200C的突变，正是由于这种突变，是突变木聚糖酶的性能有所提高。
5.根据权利要求1所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用，其特征在于此木聚糖酶可以水解半纤维素生产低聚木糖。
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|---|---|
| CN (1) | CN103993025A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105349511B (zh) * | 2015-12-16 | 2018-10-12 | 南京工业大学 | 木聚糖酶和编码该酶的基因及其在废纸脱墨中的应用 |
| CN105368804B (zh) * | 2015-12-16 | 2018-10-12 | 南京工业大学 | 一种耐高温耐强碱木聚糖酶及其在废纸脱墨中的应用 |
| CN109207498A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-01-15 | 上海市农业科学院 | 一种来自芽孢杆菌耐高温饲料用木聚糖酶的制备 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101392266A (zh) * | 2008-09-18 | 2009-03-25 | 复旦大学 | 一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法 |
| CN101659948A (zh) * | 2008-11-10 | 2010-03-03 | 中国农业大学 | 一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 |
| CN102994478A (zh) * | 2010-05-31 | 2013-03-27 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种1,4-β-D-木聚糖酶突变体 |
-
2013
- 2013-12-24 CN CN201310736967.1A patent/CN103993025A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101392266A (zh) * | 2008-09-18 | 2009-03-25 | 复旦大学 | 一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法 |
| CN101659948A (zh) * | 2008-11-10 | 2010-03-03 | 中国农业大学 | 一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 |
| CN102994478A (zh) * | 2010-05-31 | 2013-03-27 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种1,4-β-D-木聚糖酶突变体 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| STEPHENS DE ET AL: "Error-prone PCR of a fungal xylanase for improvement of its alkaline and thermal stability", 《FEMS》 * |
| ZHANG M ET AL: "Cloning and expression of a Paecilomyces thermophila xylanase gene in E.coli and characterization of the recombinant xylanase", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| 张雯 等: "易错PCR技术提高耐碱木聚糖酶基因xylBYG耐热性的研究", 《黑龙江畜牧兽医》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105349511B (zh) * | 2015-12-16 | 2018-10-12 | 南京工业大学 | 木聚糖酶和编码该酶的基因及其在废纸脱墨中的应用 |
| CN105368804B (zh) * | 2015-12-16 | 2018-10-12 | 南京工业大学 | 一种耐高温耐强碱木聚糖酶及其在废纸脱墨中的应用 |
| CN109207498A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-01-15 | 上海市农业科学院 | 一种来自芽孢杆菌耐高温饲料用木聚糖酶的制备 |
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