CN101659948A - 一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木聚糖酶及其编码基因与应用。该木聚糖酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，本发明的木聚糖酶在温度不高于60℃条件下处理30min几乎没有酶活损失，其最适反应温度为75℃，最适pH值为7.0；用本发明酶水解木聚糖的主要产物为木二糖和木三糖。本发明的木聚糖酶具有耐热特性，可广泛用于分解半纤维素中的木聚糖，生产功能性低聚糖，适合于对温度要求高的很多工业环境，具有在生产中推广应用的巨大潜力。

Description

一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

木聚糖酶可广泛应用于食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。例如，在酿造工业中，木聚糖酶可以分解原材料中的β-木聚糖，降低酿造过程中物料的粘度，促进有效物质的释放；在饲料工业中，木聚糖酶可以通过降解木聚糖，降低饲料用粮中的非淀粉多糖的量，促进营养物质的吸收利用。木聚糖酶中的内切木聚糖酶(1，4-β-D-xylanohydrolase：EC 3.2.1.8)，主要随机水解木聚糖主链上的β-1，4-木糖苷键，其特殊作用决定了它是木聚糖复杂酶解过程中的关键酶。

应用木聚糖酶的许多工业中，常需要高温条件，这就需要木聚糖酶具有良好的热稳定性，但是一般情况下酶在遇到高温时，其活性往往会降低甚至完全失去。工业所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，制约着木聚糖酶技术的发展和应用，因此，亟待需要一种耐热的木聚糖酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热的木聚糖酶及其编码基因。

本发明所提供的木聚糖酶，来源于嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由226个氨基酸组成，分子量约为24.599×10³kDa。

为了使(a)中的木聚糖酶便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR

Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)和(b)中的木聚糖酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。(b)中的木聚糖酶的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述木聚糖酶的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因可为如下1)、2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述木聚糖酶的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述木聚糖酶的DNA分子。

上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明的木聚糖酶最适反应温度为75℃，在温度不高于60℃条件下处理30min几乎没有酶活损失，80℃时保温30min后还能残留60％的活力；其最适pH值为7.0；用本发明酶水解木聚糖的主要产物为木二糖和木三糖。本发明的木聚糖酶具有耐热特性，可广泛用于分解半纤维素中的木聚糖，生产功能性低聚糖，适合于对温度要求高的很多工业环境，具有在生产中推广应用的巨大潜力。

附图说明

图1为本发明的耐热木聚糖酶基因PCR和回收产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明的耐热木聚糖酶的纯化过程图。

图3为本发明的耐热木聚糖酶的最适pH。

图4为本发明的耐热木聚糖酶的最适温度。

图5为本发明的耐热木聚糖酶水解榉木木聚糖的水解产物TLC图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的方法。

实施例1、木聚糖酶的编码基因xynA的分离

以嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18(中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)(Yang，SQ，Yan，QJ，Jiang，ZQ，Li，LT，Tian，HM，Wang，YZ.High-level of xylanase production by the thermophilicPaecilomyces thermophila J18 on wheat straw in solid-state fermentation.Bioresour Technol，2006；97：1794-1800)(中国农业大学)的cDNA序列为模板，用如下引物进行PCR扩增：PT-XynA-NcoI-FWD(正向)：5’-CCATGGTGATCGGTATTACCTCC-3’(含有NcoI酶切位点)，PT-XynA-HindIII-His-REV(反向)：5’-AAGCTTGCCGACGTCAGCGACGGTGAT-3’(含有HindIII酶切位点)。PCR扩增反应混合物为：水，14.8μl；10×Ex Taq buffer，2μl；2.5mmol/L dNTP，1μl；100pmol/L PT-XynA-NcoI-FWD，0.5μl；100pmol/LPT-XynA-HindIII-His-REV，0.5μl；模板，1μl；Taq酶，0.2μl；反应混合物总体积为20μl。PCR扩增反应的条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，65℃ 30s和72℃ 1min，30个循环后72℃延伸10min，然后冷却至4℃。

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外下照射，切下目标DNA片段，然后采用QIAquick Gel Extration Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，再进行电泳检测。结果如图1所示(M为DNA分子Marker DL2000，1为木聚糖酶基因的PCR扩增产物，2为用试剂盒回收的基因片段)，结果表明，木聚糖酶基因的PCR扩增产物的长度大小为700bp左右；用试剂盒回收的该基因片段，条带单一且浓度适当，可以用于接下来的连接实验。

采用拓扑TA克隆将上述纯化得到的基因片段克隆到pMD-18T载体上，转化，用菌落PCR和提取质粒双酶切方法筛选带有重组子的菌落。用pMD-18T质粒载体上的标准引物序列作为测序引物，测插入基因的DNA序列。结果表明，插入的上述纯化得到的木聚糖酶基因(xynA)的全长为681bp(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，编码226个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)，编码的蛋白(xynA)的分子量约为24.599×10³kDa。将含有序列表中序列1所示木聚糖酶基因的阳性重组质粒命名为pMD-18T/xynA。

将核苷酸序列如序列表中序列1所示的基因序列在Genbank中进行比对，比对结果表明，本发明木聚糖酶基因与来源于Thermomyces lanuginosus的木聚糖酶(No.U35436)编码基因序列同源性最高(91％)，与其余来源的木聚糖酶编码基因的同源性低于75％。

在设计上述引物对PT-XynA-NcoI-FWD/PT-XynA-HindIII-His-REV时，引物上引入了能插入pET-28a(+)质粒的NcoI-HindIII酶切位点；在设计PT-XynA-NcoI-FWD正向引物时，考虑到在表达载体中C-末端带有6×His标签，在5’端由引物导入一个密码子突变，即ATGA*TG…→ATGG*TG…，这样翻译后从NcoI酶切位点第二个氨基酸由M变为V；根据引物设计的这一突变确保了目的基因克隆于开放阅读框内，同时具有ATG起始密码子和6×His标签，而不会发生开放阅读框漂移。

实施例2、木聚糖酶xynA的表达及性质检测

在本实施例中所使用的表达载体为pET-28a(+)(Novagen公司)，靶基因克隆于pET-28a(+)载体上，使其表达置于T7噬菌体强启动子转录及翻译信号控制之下。由于大肠杆菌胞内蛋白多，设计使xynA基因的3′末端带有6×His标签，这样表达出的目标蛋白质带有6×His tag，利用6×His tag与Ni-NTA的亲和性，可将表达出的重组蛋白进行亲和层析提纯，这样可方便快速地纯化表达的酶。

一、木聚糖酶基因xynA的亚克隆

将上述pMD-18T/xynA质粒，用一对限制性内切酶NcoI和HindIII酶切，电泳，在紫外下照射，迅速切下目标DNA，然后采用QIAquick Gel Extration Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段；用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切pET-28a(+)载体(Novagen公司)，将酶切回收的DNA片段和pET-28a(+)载体混合，并加入T4DNA Ligase(TaKaRa)，在16℃下连接4h，然后用热激法转入感受态细胞E.coliBL21(Novagen公司)，将100μl菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜，将生长出的单菌落标号，采用菌落PCR法筛选带重组质粒的菌落。提取阳性菌落的重组质粒，进行双酶切电泳和DNA序列测定。测序结果表明，测定的重组xynA基因序列由722对碱基组成(其核苷酸序列如序列表中序列3所示)[该序列是在序列表中序列1所示序列的基础上有以下变化：在起始位置加上两个碱基CC，后面接上ATG(起始密码子)，再接GTG，中间与序列表中序列1的相同，终止密码子前加入AAGCTT(HindIII酶切位点)，以及GCGGCCGCACTCGAG(pET-28载体上的序列)和六个组氨酸CACCACCACCACCACCAC)]，编码239个氨基酸(序列表中序列4所示)(起始位置由于加入NcoI酶切位点，第二个氨基酸由M变为V，终止密码子前加入的氨基酸为KLAAALEHHHHHH)，计算分子量约为26kDa。

将获得的含有上述722bp核苷酸序列的阳性重组质粒命名为pET28a/xynA，将含有pET28a/xynA的菌命名为BL21-xynA。

将得到的含有239个氨基酸残基的氨基酸序列，与已知木聚糖酶蛋白质氨基酸进行同源比对，结果表明，该序列与来源于Thermomyces lanuginosus的XynA(No.AAB94633)同源性最高，达到93％，与来源于Paecilomyces variotii的木聚糖酶(No.P81536)同源性次之，为88％，与其它木聚糖酶的同源性小于73％。通过以上基因序列及其编码的蛋白质序列的同源比较，得出来源于嗜热拟青霉J18的XynA蛋白属于F/11族木聚糖酶，并且只含有一个单一功能区。

二、木聚糖酶的表达

(一)酶的表达：

取100μl含有重组质粒pET28a/xynA的大肠杆菌BL21-xynA，于100ml LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃振荡培养12-16h；再以10％的接种量转接到100ml LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，30℃振荡培养，当培养液OD_600nm达到0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导培养10-20h后，离心收集细胞，再用超声波破碎仪破碎细菌细胞，离心收集上清即为粗酶液。

(二)酶的纯化：

1、Ni-NTA纯化

用平衡缓冲液(50mmol/L，pH 8.0，磷酸缓冲液，0.3mol/L NaCl，20mmol/L咪唑)平衡Ni-NTA(1×5cm)；将上述粗酶液以0.1ml/min的速度过平衡好的Ni柱，上样结束后封柱子1h；用相同缓冲液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质；接着用45mmol/L咪唑洗至基线，有少量目标蛋白被洗下来，但从电泳图观察以杂蛋白为主，未收集；用45mmol/L的咪唑溶液为起始液，以175mmol/L的咪唑溶液为终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱速度为1ml/min，咪唑的浓度变化速度为1.3mmol/L/min，收集梯度洗脱的各管样品；待洗脱峰趋于平缓后用0.5mol/L的咪唑溶液洗脱吸附的杂质，最后用平衡缓冲液平衡柱料。

对上述收集的每管样品分别进行电泳，由于已知目标蛋白的理论分子量，通过与低分子量标准蛋白的比较，即判断目标蛋白在哪些管中存在，保留电泳图上含有目标蛋白的纯度类似的各管。

重复三次上述亲和纯化，将每次保存的各管样品超滤到0.8ml。

2、Sephadex G50过滤

将上述步骤1得到的各管0.8ml样品分别进行如下实验。

用50mmol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液平衡Sephadex G50，将步骤1中的0.8ml样品上样于柱中，用50mmol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液，以0.1ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱下来的液体。为确定蛋白含量，测定洗脱下来的溶液的OD₂₈₀值(蛋白质分子中色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm，蛋白质OD₂₈₀值与其浓度成正比，故可测定蛋白质的含量)，并将峰值附近各管电泳，通过电泳确定纯的目标蛋白在哪些管中。

将粗酶液、Ni-NTA层析得到的酶液、经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液，分别进行电泳，电泳结果如图2所示(M为低分子量标准蛋白；1为粗酶液；2为过Ni-NTA层析得到的酶液；3为经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液)。结果表明，得到的蛋白与预期蛋白的分子量相符(26kDa)。将得到的蛋白的N端测15个氨基酸(Edman化学降解)，C端也测15个氨基酸(串联质谱法)，结果表明，测得的序列正确，证明得到的蛋白正确。

SDS-PAGE方法：按照Laemmli方法，如文献(Laemmli UK.Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature，1970，277：680-685)中所述进行。分离胶12.5％，浓缩胶4.5％，考马斯亮蓝染色显示蛋白带，低分子量标准蛋白与样品在同一条件下电泳。

(三)酶活的测定

1、酶活测定方法：

参照文献(Bailey，MJ，Biely，P，Poutanen，K.Interlaboratory testingof methods for assay of xylanase activity.J Biotechnol 1992；23：257-70.)中所述的方法。

具体步骤如下：向0.9ml含有桦木木聚糖的、pH值为6.5、50mmol/L的MOPS缓冲液(桦木木聚糖在缓冲液中的终浓度为1g/100ml)中，加入0.1ml步骤(一)得到的粗酶液(或0.1ml步骤(二)Ni-NTA层析得到的酶液，或0.1ml步骤(二)Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液)，50℃反应10min，采用DNS法(Miller，GL.Use of dinitro-salicylic acid reagent for determination of reducing sugars.Anal Chem 1959，31：426-428.)测定产生的还原糖量，同时以D-木糖作标准。

酶活力单位(U)定义为：上述反应条件下，每分钟产生1μmol相当于D-木糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。

2、蛋白含量的测定方法：采用Lowry法，如文献(Lowry et al.Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem，1951，193：265-275)中所述，以牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。

按照如上方法检测粗酶液、Ni-NTA层析得到的酶液、经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液中酶蛋白的量、酶比活，计算回收率和纯化倍数。

其中，回收率＝各步骤总酶活/粗酶总酶活，纯化倍数＝各步骤比活/粗酶比活。

实验设3次重复，结果取平均数。结果如表2所示。

表2、耐高温木聚糖酶A的纯化表

不同步骤的酶液	总体积(ml)	酶液中酶活(U/ml)	总蛋白(mg)	总酶活(U)	比酶活(U/mg)	回收率(％)	纯化倍数
								粗酶液	48	173.2	566.2	8315.5	14.7	100	1
Ni-NTA层析得到的酶液	4	1147.3	11.1	4589.4	413.5	55.2	28.1
								SephadexG50层析得到的酶液	2.5	1440.5	5.1	3601.2	706.1	43.3	48.0

^a蛋白含量以Lowry法测定，以BSA为标准。

^b酶活在50℃条件下测定，底物为1g/100ml桦木木聚糖，缓冲液为50mmol/LpH 6.5MOPS。

三、木聚糖酶的酶学性质

将上述经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶蛋白分别进行下列性质检测。

(一)最适反应pH值的测定

将上述经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶蛋白，分别置于下述不同缓冲体系中，在50℃条件下，测定其活力。测酶活的方法除了所用的缓冲体系不同外，其余均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。

选择的pH值范围及体系如下(50mmol/L)：柠檬酸-柠檬酸三钠pH 2.5-4.5；乙酸-乙酸钠pH 4-5.5；MOPS(3-吗啉丙磺酸)pH6-8；Tris-HCl pH 7-9；CHES(2-环己胺基乙磺酸)pH 8-10；CAPS(3-(环己胺)-1-丙磺酸)pH 9-11。

通过比较这些缓冲体系下纯酶活力差异，得出酶反应的最适pH值。

实验设3次重复，结果如图3所示(其中，“◆”为柠檬酸-柠檬酸三钠，“■”为乙酸-乙酸钠，“▲”为MOPS，“×”为Tris-HCl，“口”为CHES，“+”为CAPS)。相对酶活的定义为：不同pH下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为7.0(Tris-HCl)、50℃条件下，反应10min的酶活记作100％。结果表明，本发明酶的最适pH值为7.0(图3)。

(二)最适反应温度的测定

测定在pH值为7.0、不同温度下(即30，40，50，60，70，75，80，85，90和100℃)酶的活力，比较得到酶的最适反应温度。其中，除了温度不同、pH值不同，其余测酶活的方法均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。

实验设3次重复，结果如图4所示。相对酶活的定义为：不同温度下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为7.0(Tris-HCl)、75℃条件下，反应10min的酶活记作100％。结果表明，本发明酶的最适温度为75℃。

(三)pH值及温度稳定性

对酶在50℃的条件下对pH稳定性进行测定，表明，该酶在pH 6.5-10.5范围内能保持85％以上的酶活；

将经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶蛋白在不同温度下保温30min；保温后，再于50℃、pH值为7.0(Tris-HCl)条件下测定残余酶活力，除了pH值不同，其余测酶活的方法均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。结果表明，该酶在温度不高于60℃条件下处理30min后几乎没有酶活损失，80℃时保温30min后残留60％的活力，因此，该酶具有良好的温度稳定性。

实施例3、木聚糖酶的应用

以含有榉木木聚糖或桦木木聚糖的、50mM、pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液做底物(其中，榉木或桦木木聚糖在溶液中的终浓度为2g/100ml)，酶添加量为4U/ml底物溶液，于50℃水浴中保温12h，在不同时间(15min，30min，1h，2h，4h，6h，12h)取样进行TLC分析。

TLC条件：硅胶板(60F 254，E.Merk，德国)在2∶1∶1的正丁醇-乙酸-水系统中展层2次后，在其表面均匀喷洒5％硫酸甲醇溶液，吹干在100℃显色。标准为木寡糖混合物。

TLC结果表明，该酶水解榉木木聚糖终产物以木二糖和木三糖为主(图5，A为木糖，B为木二糖，C为木三糖，D为木四糖，E为木五糖)，水解桦木木聚糖也以木二糖和木三糖为主，因此该酶可用于水解半纤维素生产低聚木糖。

序列表

<160>4

<210>1

<211>681

<212>DNA

<213>拟青霉属嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)

<400>1

atgatgatcg gtattacctc ctttgctctc gcggcattgg ccgctactgg ggccctggcc    60

ttcccgacag ggaatactac ggagctcgaa aagcgacaga ccacccctaa ctcggaaggc    120

tggcacgatg gctattacta ctcctggtgg agtgacggtg gagcccaggc cacgtacacc    180

aacctggaag gcggcaccta cgagattagc tggggcgatg gcggtaacct cgtcggcgga    240

aagggttgga accctggact gaacgcaagg gccattcact ttgacggtgt ttaccagccc    300

aacggcaaca gttacctcgc ggtttacggt tggacccgca acccgctcgt cgagtactac    360

atcgttgaga acttcggcac ctacgatccc tcctcggatg ccaccgacct gggtaccgtg    420

gagtgcgacg gtagcaccta tcgactcggc aagagcactc gttacaacgc acctagcatc    480

gacggcatcc aaactttcga ccagtactgg tcggtccgcc agaacaagcg ctccagcggc    540

accgtccaga cgggctgcca cttcgacgcc tgggctcgcg ctggtttgaa cgttaacggt    600

gaccactact accagatcgt tgcgacggag ggctacttca gcagcggcta tgctcgcatc    660

accgtcgctg acgtcggcta  a                                             681

<210>2

<211>226

<212>Pro

<213>拟青霉属嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)

<400>2

Met Met Ile Gly Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr

1               5                   10                  15

Gly Ala Leu Ala Phe Pro Thr Gly Asn Thr Thr Glu Leu Glu Lys Arg

            20                  25                  30

Gln Thr Thr Pro Asn Ser Glu Gly Trp His Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ser

        35                  40                  45

Trp Trp Ser Asp Gly Gly Ala Gln Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Glu Gly

    50                  55                  60

Gly Thr Tyr Glu Ile Ser Trp Gly Asp Gly Gly Asn Leu Val Gly Gly

65                  70                  75                  80

Lys Gly Trp Asn Pro Gly Leu Asn Ala Arg Ala Ile His Phe Asp Gly

                85                  90                  95

Val Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr

            100                 105                 110

Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr

        115                 120                 125

Asp Pro Ser Ser Asp Ala Thr Asp Leu Gly Thr Val Glu Cys Asp Gly

    130                 135                 140

Ser Thr Tyr Arg Leu Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile

145                 150                 155                 160

Asp Gly Ile Gln Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asn Lys

                165                 170                 175

Arg Ser Ser Gly Thr Val Gln Thr Gly Cys His Phe Asp Ala Trp Ala

            180                 185                 190

Arg Ala Gly Leu Asn Val Asn Gly Asp His Tyr Tyr Gln Ile Val Ala

    195                 200                 205

Thr Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val Ala Asp

    210                 215                 220

Val Gly

225

<210>3

<211>722

<212>DNA

<220>

<223>

<400>3

ccatggtgat cggtattacc tcctttgctc tcgcggcatt ggccgctact ggggccctgg    60

ccttcccgac agggaatact acggagctcg aaaagcgaca gaccacccct aactcggaag    120

gctggcacga tggctattac tactcctggt ggagtgacgg tggagcccag gccacgtaca    180

ccaacctgga aggcggcacc tacgagatta gctggggcga tggcggtaac ctcgtcggcg    240

gaaagggttg gaaccctgga ctgaacgcaa gggccattca ctttgacggt gtttaccagc    300

ccaacggcaa cagttacctc gcggtttacg gttggacccg caacccgctc gtcgagtact    360

acatcgttga gaacttcggc acctacgatc cctcctcgga tgccaccgac ctgggtaccg    420

tggagtgcga cggtagcacc tatcgactcg gcaagagcac tcgttacaac gcacctagca    480

tcgacggcat ccaaactttc gaccagtact ggtcggtccg ccagaacaag cgctccagcg    540

gcaccgtcca gacgggctgc cacttcgacg cctgggctcg cgctggtttg aacgttaacg    600

gtgaccacta ctaccagatc gttgcgacgg agggctactt cagcagcggc tatgctcgca    660

tcaccgtcgc tgacgtcggc aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact    720

ga                                                                   722

<210>4

<211>239

<212>Pro

<220>

<223>

<400>4

Met Val Ile Gly Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr

1               5                   10                  15

Gly Ala Leu Ala Phe Pro Thr Gly Asn Thr Thr Glu Leu Glu Lys Arg

            20                  25                  30

Gln Thr Thr Pro Asn Ser Glu Gly Trp His Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ser

        35                  40                  45

Trp Trp Ser Asp Gly Gly Ala Gln Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Glu Gly

    50                  55                  60

Gly Thr Tyr Glu Ile Ser Trp Gly Asp Gly Gly Asn Leu Val Gly Gly

65                  70                  75                  80

Lys Gly Trp Asn Pro Gly Leu Asn Ala Arg Ala Ile His Phe Asp Gly

                85                  90                  95

Val Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr

            100                 105                 110

Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr

        115                 120                 125

Asp Pro Ser Ser Asp Ala Thr Asp Leu Gly Thr Val Glu Cys Asp Gly

    130                 135                 140

Ser Thr Tyr Arg Leu Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile

145                 150                 155                 160

Asp Gly Ile Gln Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asn Lys

                165                 170                 175

Arg Ser Ser Gly Thr Val Gln Thr Gly Cys His Phe Asp Ala Trp Ala

            180                 185                 190

Arg Ala Gly Leu Asn Val Asn Gly Asp His Tyr Tyr Gln Ile Val Ala

        195                 200                 205

Thr Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val Ala Asp

    210                 215                 220

Val Gly Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

225                 230                 235

Claims (8)

1、一种木聚糖酶，选自如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述木聚糖酶的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因选自如下1)、2)或3)：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述木聚糖酶的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述木聚糖酶的DNA分子。

4、含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5、含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6、含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

8、权利要求1所述木聚糖酶在降解半纤维素中的应用。

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