CN101659948B - 一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents
一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种木聚糖酶及其编码基因与应用。该木聚糖酶是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。实验证明,本发明的木聚糖酶在温度不高于60℃条件下处理30min几乎没有酶活损失,其最适反应温度为75℃,最适pH值为7.0;用本发明酶水解木聚糖的主要产物为木二糖和木三糖。本发明的木聚糖酶具有耐热特性,可广泛用于分解半纤维素中的木聚糖,生产功能性低聚糖,适合于对温度要求高的很多工业环境,具有在生产中推广应用的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术
木聚糖酶可广泛应用于食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。例如,在酿造工业中,木聚糖酶可以分解原材料中的β-木聚糖,降低酿造过程中物料的粘度,促进有效物质的释放;在饲料工业中,木聚糖酶可以通过降解木聚糖,降低饲料用粮中的非淀粉多糖的量,促进营养物质的吸收利用。木聚糖酶中的内切木聚糖酶(1,4-β-D-xylanohydrolase:EC3.2.1.8),主要随机水解木聚糖主链上的β-1,4-木糖苷键,其特殊作用决定了它是木聚糖复杂酶解过程中的关键酶。
应用木聚糖酶的许多工业中,常需要高温条件,这就需要木聚糖酶具有良好的热稳定性,但是一般情况下酶在遇到高温时,其活性往往会降低甚至完全失去。工业所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾,制约着木聚糖酶技术的发展和应用,因此,亟待需要一种耐热的木聚糖酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐热的木聚糖酶及其编码基因。
本发明所提供的木聚糖酶,来源于嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18,是如下(a)或(b)的蛋白质:
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。
其中,序列表中的序列2由226个氨基酸组成,分子量约为24.599×103kDa。
为了使(a)中的木聚糖酶便于纯化,可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 | 残基 | 序列 |
Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
FLAG | 8 | DYKDDDDK |
Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(a)和(b)中的木聚糖酶可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。(b)中的木聚糖酶的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述木聚糖酶的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述编码基因可为如下1)、2)或3)的基因:
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述木聚糖酶的DNA分子;
3)与1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述木聚糖酶的DNA分子。
上述严格条件是,在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。
实验证明,本发明的木聚糖酶最适反应温度为75℃,在温度不高于60℃条件下处理30min几乎没有酶活损失,80℃时保温30min后还能残留60%的活力;其最适pH值为7.0;用本发明酶水解木聚糖的主要产物为木二糖和木三糖。本发明的木聚糖酶具有耐热特性,可广泛用于分解半纤维素中的木聚糖,生产功能性低聚糖,适合于对温度要求高的很多工业环境,具有在生产中推广应用的巨大潜力。
附图说明
图1为本发明的耐热木聚糖酶基因PCR和回收产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明的耐热木聚糖酶的纯化过程图。
图3为本发明的耐热木聚糖酶的最适pH。
图4为本发明的耐热木聚糖酶的最适温度。
图5为本发明的耐热木聚糖酶水解榉木木聚糖的水解产物TLC图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的方法。
实施例1、木聚糖酶的编码基因xynA的分离
以嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18(中国科学院微生物研究所菌种保藏中心,保藏号为AS3.6885)(Yang,SQ,Yan,QJ,Jiang,ZQ,Li,LT,Tian,HM,Wang,YZ.High-level of xylanase production by the thermophilicPaecilomyces thermophila J18 on wheat straw in sol id-state fermentation.Bioresour Technol,2006;97:1794-1800)(中国农业大学)的cDNA序列为模板,用如下引物进行PCR扩增:PT-XynA-NcoI-FWD(正向):5’-CCATGGTGATCGGTATTACCTCC-3’(含有NcoI酶切位点),PT-XynA-HindII-His-REV(反向):5’-AAGCTTGCCGACGTCAGCGACGGTGAT-3’(含有HindIII酶切位点)。PCR扩增反应混合物为:水,14.8μl;10×Ex Taq buffer,2μl;2.5mmol/L dNTP,1μl;100pmol/L PT-XynA-NcoI-FWD,0.5μl;100pmol/LPT-XynA-HindIII-His-REV,0.5μl;模板,1μl;Taq酶,0.2μl;反应混合物总体积为20μl。PCR扩增反应的条件为:94℃5min;94℃30s,65℃30s和72℃ 1min,30个循环后72℃延伸10min,然后冷却至4℃。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外下照射,切下目标DNA片段,然后采用QIAquick Gel Extration Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,再进行电泳检测。结果如图1所示(M为DNA分子Marker DL2000,1为木聚糖酶基因的PCR扩增产物,2为用试剂盒回收的基因片段),结果表明,木聚糖酶基因的PCR扩增产物的长度大小为700bp左右;用试剂盒回收的该基因片段,条带单一且浓度适当,可以用于接下来的连接实验。
采用拓扑TA克隆将上述纯化得到的基因片段克隆到pMD-18T载体上,转化,用菌落PCR和提取质粒双酶切方法筛选带有重组子的菌落。用pMD-18T质粒载体上的标准引物序列作为测序引物,测插入基因的DNA序列。结果表明,插入的上述纯化得到的木聚糖酶基因(xynA)的全长为681bp(其核苷酸序列如序列表中序列1所示),编码226个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列2所示),编码的蛋白(xynA)的分子量约为24.599×103kDa。将含有序列表中序列1所示木聚糖酶基因的阳性重组质粒命名为pMD-18T/xynA。
将核苷酸序列如序列表中序列1所示的基因序列在Genbank中进行比对,比对结果表明,本发明木聚糖酶基因与来源于Thermomyces lanuginosus的木聚糖酶(No.U35436)编码基因序列同源性最高(91%),与其余来源的木聚糖酶编码基因的同源性低于75%。
在设计上述引物对PT-XynA-NcoI-FWD/PT-XynA-HindIII-His-REV时,引物上引入了能插入pET-28a(+)质粒的NcoI-HindIII酶切位点;在设计PT-XynA-NcoI-FWD正向引物时,考虑到在表达载体中C-末端带有6×His标签,在5’端由引物导入一个密码子突变,即ATGA*TG…→ATGG*TG…,这样翻译后从NcoI酶切位点第二个氨基酸由M变为V;根据引物设计的这一突变确保了目的基因克隆于开放阅读框内,同时具有ATG起始密码子和6×His标签,而不会发生开放阅读框漂移。
实施例2、木聚糖酶xynA的表达及性质检测
在本实施例中所使用的表达载体为pET-28a(+)(Novagen公司),靶基因克隆于pET-28a(+)载体上,使其表达置于T7噬菌体强启动子转录及翻译信号控制之下。由于大肠杆菌胞内蛋白多,设计使xynA基因的3′末端带有6×His标签,这样表达出的目标蛋白质带有6×His tag,利用6×His tag与Ni-NTA的亲和性,可将表达出的重组蛋白进行亲和层析提纯,这样可方便快速地纯化表达的酶。
一、木聚糖酶基因xynA的亚克隆
将上述pMD-18T/xynA质粒,用一对限制性内切酶NcoI和HindIII酶切,电泳,在紫外下照射,迅速切下目标DNA,然后采用QIAquick Gel Extration Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段;用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切pET-28a(+)载体(Novagen公司),将酶切回收的DNA片段和pET-28a(+)载体混合,并加入T4DNA Ligase(TaKaRa),在16℃下连接4h,然后用热激法转入感受态细胞E.coliBL21(Novagen公司),将100μl菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上,37℃培养过夜,将生长出的单菌落标号,采用菌落PCR法筛选带重组质粒的菌落。提取阳性菌落的重组质粒,进行双酶切电泳和DNA序列测定。测序结果表明,测定的重组xynA基因序列由722对碱基组成(其核苷酸序列如序列表中序列3所示)[该序列是在序列表中序列1所示序列的基础上有以下变化:在起始位置加上两个碱基CC,后面接上ATG(起始密码子),再接GTG,中间与序列表中序列1的相同,终止密码子前加入AAGCTT(HindIII酶切位点),以及GCGGCCGCACTCGAG(pET-28载体上的序列)和六个组氨酸CACCACCACCACCACCAC)],编码239个氨基酸(序列表中序列4所示)(起始位置由于加入NcoI酶切位点,第二个氨基酸由M变为V,终止密码子前加入的氨基酸为KLAAALEHHHHHH),计算分子量约为26kDa。
将获得的含有上述722bp核苷酸序列的阳性重组质粒命名为pET28a/xynA,将含有pET28a/xynA的菌命名为BL21-xynA。
将得到的含有239个氨基酸残基的氨基酸序列,与已知木聚糖酶蛋白质氨基酸进行同源比对,结果表明,该序列与来源于Thermomyces lanuginosus的XynA(No.AAB94633)同源性最高,达到93%,与来源于Paecilomyces variotii的木聚糖酶(No.P81536)同源性次之,为88%,与其它木聚糖酶的同源性小于73%。通过以上基因序列及其编码的蛋白质序列的同源比较,得出来源于嗜热拟青霉J18的XynA蛋白属于F/11族木聚糖酶,并且只含有一个单一功能区。
二、木聚糖酶的表达
(一)酶的表达:
取100μl含有重组质粒pET28a/xynA的大肠杆菌BL21-xynA,于100ml LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中,37℃振荡培养12-16h;再以10%的接种量转接到100ml LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中,30℃振荡培养,当培养液OD600nm达到0.5-0.6时,加入IPTG至终浓度1mmol/L,诱导培养10-20h后,离心收集细胞,再用超声波破碎仪破碎细菌细胞,离心收集上清即为粗酶液。
(二)酶的纯化:
1、Ni-NTA纯化
用平衡缓冲液(50mmol/L,pH8.0,磷酸缓冲液,0.3mol/L NaCl,20mmol/L咪唑)平衡Ni-NTA(1×5cm);将上述粗酶液以0.1ml/min的速度过平衡好的Ni柱,上样结束后封柱子1h;用相同缓冲液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质;接着用45mmol/L咪唑洗至基线,有少量目标蛋白被洗下来,但从电泳图观察以杂蛋白为主,未收集;用45mmol/L的咪唑溶液为起始液,以175mmol/L的咪唑溶液为终止液,进行线性梯度洗脱,洗脱速度为1ml/min,咪唑的浓度变化速度为1.3mmol/L/min,收集梯度洗脱的各管样品;待洗脱峰趋于平缓后用0.5mol/L的咪唑溶液洗脱吸附的杂质,最后用平衡缓冲液平衡柱料。
对上述收集的每管样品分别进行电泳,由于已知目标蛋白的理论分子量,通过与低分子量标准蛋白的比较,即判断目标蛋白在哪些管中存在,保留电泳图上含有目标蛋白的纯度类似的各管。
重复三次上述亲和纯化,将每次保存的各管样品超滤到0.8ml。
2、Sephadex G50过滤
将上述步骤1得到的各管0.8ml样品分别进行如下实验。
用50mmol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液平衡Sephadex G50,将步骤1中的0.8ml样品上样于柱中,用50mmol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液,以0.1ml/min的流速进行洗脱,收集洗脱下来的液体。为确定蛋白含量,测定洗脱下来的溶液的OD280值(蛋白质分子中色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm,蛋白质OD280值与其浓度成正比,故可测定蛋白质的含量),并将峰值附近各管电泳,通过电泳确定纯的目标蛋白在哪些管中。
将粗酶液、Ni-NTA层析得到的酶液、经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液,分别进行电泳,电泳结果如图2所示(M为低分子量标准蛋白;1为粗酶液;2为过Ni-NTA层析得到的酶液;3为经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液)。结果表明,得到的蛋白与预期蛋白的分子量相符(26kDa)。将得到的蛋白的N端测15个氨基酸(Edman化学降解),C端也测15个氨基酸(串联质谱法),结果表明,测得的序列正确,证明得到的蛋白正确。
SDS-PAGE方法:按照Laemmli方法,如文献(Laemmli UK.Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature,1970,277:680-685)中所述进行。分离胶12.5%,浓缩胶4.5%,考马斯亮蓝染色显示蛋白带,低分子量标准蛋白与样品在同一条件下电泳。
(三)酶活的测定
1、酶活测定方法:
参照文献(Bailey,MJ,Biely,P,Poutanen,K.Interlaboratory testingof methods for assay of xylanase activity.J Biotechnol 1992;23:257-70.)中所述的方法。
具体步骤如下:向0.9ml含有桦木木聚糖的、pH值为6.5、50mmol/L的MOPS缓冲液(桦木木聚糖在缓冲液中的终浓度为1g/100ml)中,加入0.1ml步骤(一)得到的粗酶液(或0.1ml步骤(二)Ni-NTA层析得到的酶液,或0.1ml步骤(二)Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液),50℃反应10min,采用DNS法(Miller,GL.Use of dinitro-salicylic acid reagent for determination of reducing sugars.Anal Chem 1959,31:426-428.)测定产生的还原糖量,同时以D-木糖作标准。
酶活力单位(U)定义为:上述反应条件下,每分钟产生1μmol相当于D-木糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。
2、蛋白含量的测定方法:采用Lowry法,如文献(Lowry et al.Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265-275)中所述,以牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。
按照如上方法检测粗酶液、Ni-NTA层析得到的酶液、经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶液中酶蛋白的量、酶比活,计算回收率和纯化倍数。
其中,回收率=各步骤总酶活/粗酶总酶活,纯化倍数=各步骤比活/粗酶比活。
实验设3次重复,结果取平均数。结果如表2所示。
表2、耐高温木聚糖酶A的纯化表
不同步骤的酶液 | 总体积(ml) | 酶液中酶活(U/ml) | 总蛋白(mg) | 总酶活(U) | 比酶活(U/mg) | 回收率(%) | 纯化倍数 |
粗酶液 | 48 | 173.2 | 566.2 | 8315.5 | 14.7 | 100 | 1 |
Ni-NTA层析得到的酶液 | 4 | 1147.3 | 11.1 | 4589.4 | 413.5 | 55.2 | 28.1 |
SephadexG50层析得到的酶液 | 2.5 | 1440.5 | 5.1 | 3601.2 | 706.1 | 43.3 | 48.0 |
a蛋白含量以Lowry法测定,以BSA为标准。
b酶活在50℃条件下测定,底物为1g/100ml桦木木聚糖,缓冲液为50mmol/LpH 6.5 MOPS。
三、木聚糖酶的酶学性质
将上述经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶蛋白分别进行下列性质检测。
(一)最适反应pH值的测定
将上述经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶蛋白,分别置于下述不同缓冲体系中,在50℃条件下,测定其活力。测酶活的方法除了所用的缓冲体系不同外,其余均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。
选择的pH值范围及体系如下(50mmol/L):柠檬酸-柠檬酸三钠pH 2.5-4.5;乙酸-乙酸钠pH 4-5.5;MOPS(3-吗啉丙磺酸)pH 6-8;Tris-HCl pH 7-9;CHES(2-环己胺基乙磺酸)pH 8-10;CAPS(3-(环已胺)-1-丙磺酸)pH 9-11。
通过比较这些缓冲体系下纯酶活力差异,得出酶反应的最适pH值。
实验设3次重复,结果如图3所示(其中,“◆”为柠檬酸-柠檬酸三钠,“■”为乙酸-乙酸钠,“▲”为MOPS,“×”为Tris-HCl,“□”为CHES,“+”为CAPS)。相对酶活的定义为:不同pH下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为7.0(Tris-HCl)、50℃条件下,反应10min的酶活记作100%。结果表明,本发明酶的最适pH值为7.0(图3)。
(二)最适反应温度的测定
测定在pH值为7.0、不同温度下(即30,40,50,60,70,75,80,85,90和100℃)酶的活力,比较得到酶的最适反应温度。其中,除了温度不同、pH值不同,其余测酶活的方法均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。
实验设3次重复,结果如图4所示。相对酶活的定义为:不同温度下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为7.0(Tris-HCl)、75℃条件下,反应10min的酶活记作100%。结果表明,本发明酶的最适温度为75℃。
(三)pH值及温度稳定性
对酶在50℃的条件下对pH稳定性进行测定,表明,该酶在pH 6.5-10.5范围内能保持85%以上的酶活;
将经Sephadex G50凝胶过滤得到的酶蛋白在不同温度下保温30min;保温后,再于50℃、pH值为7.0(Tris-HCl)条件下测定残余酶活力,除了pH值不同,其余测酶活的方法均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。结果表明,该酶在温度不高于60℃条件下处理30min后几乎没有酶活损失,80℃时保温30min后残留60%的活力,因此,该酶具有良好的温度稳定性。
实施例3、木聚糖酶的应用
以含有榉木木聚糖或桦木木聚糖的、50mM、pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液做底物(其中,榉木或桦木木聚糖在溶液中的终浓度为2g/100ml),酶添加量为4U/ml底物溶液,于50℃水浴中保温12h,在不同时间(15min,30min,1h,2h,4h,6h,12h)取样进行TLC分析。
TLC条件:硅胶板(60F254,E.Merk,德国)在2:1:1的正丁醇-乙酸-水系统中展层2次后,在其表面均匀喷洒5%硫酸甲醇溶液,吹干在100℃显色。标准为木寡糖混合物。
TLC结果表明,该酶水解榉木木聚糖终产物以木二糖和木三糖为主(图5,A为木糖,B为木二糖,C为木三糖,D为木四糖,E为木五糖),水解桦木木聚糖也以木二糖和木三糖为主,因此该酶可用于水解半纤维素生产低聚木糖。
序列表
<160>4
<210>1
<211>681
<212>DNA
<213>拟青霉属 嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)
<400>1
<210>2
<211>226
<212>Pro
<213>拟青霉属 嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)
<400>2
<210>3
<211>722
<212>DNA
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>239
<212>Pro
<220>
<223>
<400>4
Claims (8)
1.一种木聚糖酶,是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述木聚糖酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。
6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。
8.权利要求1所述木聚糖酶在降解半纤维素中的应用。
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Date | Code | Title | Description |
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