CN101724615B

CN101724615B - β-木糖苷酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101724615B
Application number: CN2010100336353A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 贾会勇; 滕超; 周鹏; 闫巧娟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-01-07
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-01-07
Also published as: CN101724615A

Abstract

本发明公开了一种β-木糖苷酶及其编码基因与应用。该β-木糖苷酶是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-木糖苷酶活性的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入大肠杆菌后构成的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。实验证明：该重组大肠杆菌所产β-木糖苷酶主要为胞外酶(胞外酶占总酶活的98％左右)，发酵进行到48h时发酵液酶量达到最大值103.9U/mL。由于此重组木糖苷酶绝大部分为胞外蛋白，因此纯化简单，回收率达61.5％。本发明提供的β-木糖苷酶可水解玉米芯汽爆液，反应条件温和、对环境友好。

Description

β-木糖苷酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及β-木糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

木聚糖为植物半纤维素的最主要的组分，是一种含量丰富的可利用自然资源，它是由β-1，4糖苷键连接β-吡喃型木糖单元而构成主链的异质多糖，其完全降解的终产物为重要的工业原料——木糖。整个水解过程需要包括木聚糖酶和木糖苷酶等木聚糖酶系的协同作用。β-木糖苷酶(β-1，4-D-xylan xylanohydrolase；EC.3.2.1.37)主要以外切方式作用于木二糖或低聚木糖的非还原端木糖苷键并释放出木糖，因此在整个协同水解过程中可以降低木聚糖的水解产物从而可以较大程度的解除产物对木聚糖酶的抑制，是木聚糖水解过程中的限速酶。虽然β-木糖苷酶在一些高等植物中也有发现，但微生物(包括真菌、细菌等)发酵仍然是β-木糖苷酶的主要来源。然而利用天然微生物发酵产β-木糖苷酶的酶活性及产量普遍较低，因此利用分子生物技术获得产β-木糖苷酶工程菌株，是实现β-木糖苷酶的大量获得及生产成本有效控制的捷径。微生物β-木糖苷酶领域具有广泛的应用价值。

国际上报道产β-木糖苷酶的真菌有黑曲霉(Aspergillus niger)、炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)等。国内关于β-木糖苷酶的报道较少，目前有海枣曲霉(Aspergillusphoenicis)、草菇(Volvariella volvacea)和嗜热拟青霉(Paecilomycesthermophila)等。目前，国内已有少量关于天然微生物菌株产木糖苷酶或基因重组大肠杆菌产胞内木糖苷酶的研究报道，但关于利用基因重组大肠杆菌生产胞外木糖苷酶，及利用重组木糖苷酶单糖化天然纤维质材料中半纤维素的研究，还未见报道。2007年，薛业敏等(热稳定性α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的纯化，食品与发酵工业，2003(09)：22-26.)利用工程菌发酵生产重组木糖苷酶，同时研究了水解玉米芯木聚糖生产木糖的工艺条件。2008年，江正强等(嗜热拟青霉木糖苷酶的性质及其与木聚糖酶的协同作用，食品与发酵工业，2008(07)：12-16.)研究了利用嗜热拟青霉J18发酵所产的木聚糖酶及木糖苷酶对木聚糖的协同水解作用。另外，关于构建工程菌生产木糖苷酶最新的专利报道。如王磊等人报道了嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)木糖苷酶XynB1(专利号为第200810153078.1号、申请日期2008.11.14)及XynB2和编码该酶的基因与应用(专利号为第200810153079.6号、申请日期2008.11.14)，但得到的重组酶均为胞内酶。虽然国内外已有关于工程菌产木糖苷酶的报道，但先前研究中普遍存在着木糖苷酶表达量小及其纯化步骤繁琐的问题。本专利涉及的利用工程菌高表达胞外木糖苷酶，同时利用其酶解玉米芯汽爆液制备木糖的研究尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-木糖苷酶。

本发明所提供的的β-木糖苷酶，名称为xylA，来源于嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-木糖苷酶活性的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的XylA便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述2)中的XylA可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的XylA的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-1017位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述2)的蛋白具体可以是在所述1)的蛋白质的C-端带上6个His标签的蛋白。

上述蛋白的编码基因(XylA基因)也属于本发明的保护范围。

该编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的白5′末端第1-1017位；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1的自5′末端第1-1014位；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由1017个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1017位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的XylA蛋白。

通过在GenBank数据库中比对分析，该β-木糖苷酶基因(序列1所示的基因)与土曲霉(Aspergillus terreus)木糖苷酶基因(GenBank登录号：XM 001210179)核酸序列相似性最高为70％，其编码氨基酸序列相似性为76％，属于GH43家族。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述XylA基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述XylA基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在pET-30(+)的NdeI和NotI酶切位点间插入上述基因得到的重组表达载体。

所述重组菌是将上述的重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述XylA蛋白的方法。

本发明所提供的方法，是将上述的重组菌发酵培养，得到蛋白。

所述发酵培养的条件是：培养温度是33℃，培养时间是48h。

上述蛋白在水解玉米芯汽爆液生产木糖中的应用也属于本发明的保护范围之内。

实验证明：本发明提供的转基因大肠杆菌所产β-木糖苷酶主要为胞外酶(胞外酶占总酶活的98％左右)，发酵进行到48h时发酵液酶量达到最大值103.9U/mL。由于此重组木糖苷酶绝大部分为胞外蛋白，因此纯化过程简单，回收率高达到61.5％。本发明提供的β-木糖苷酶可以水解玉米芯汽爆液，水解反应条件温和、对环境友好。

附图说明

图1为本发明的β-木糖苷酶基因xylA保守区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，M为DL2000marker；1为简并引物PCR扩增。

图2为本发明的β-木糖苷酶基因xylA全长CDS序列PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，M为DL2000marker；1为β-木糖苷酶基因全长CDS扩增。

图3为重组大肠杆菌发酵产胞外木糖苷酶的产酶曲线。

图4为液体发酵产木糖苷酶SDS-PAGE，M低分子量标准蛋白，1-8分别代表发酵时间，4、8、12、24、36、48、72及96h的产胞外β-木糖苷酶的情况。

图5为重组木糖苷酶的纯化过程SDS-PAGE，M：低分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：Ni-IDA亲和层析部分。

图6为利用重组木糖苷酶单糖化蒸汽爆破液TLC图，M：木糖及木寡糖标准品；C：玉米芯汽爆液(酶解前)；15min、30min、1h、2h为不同酶解时间的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

本发明所依赖的遗传资源是嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18保藏号为CGMCC 6885的原始来源是：于2004年9月中国农业大学江正强采自新疆天山地区土杨，直接来源与原始来源相同。

嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18：中国农业大学，非专利文献是：江正强等.嗜热拟青霉木糖苷酶的性质及其与木聚糖酶的协同作用，食品与发酵工业，2008(07)：12-16。

实施例1、β-木糖苷酶基因的发现

1、β-木糖苷酶基因组保守区片断PCR扩增

根据GeneBank数据库中丝状真菌β-木糖苷酶的氨基酸序列，利用在线软件Block Maker(http://blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/make blocks.html)搜索保守区。根据木糖苷酶的保守氨基酸序列，利用在线设计软件CODHOP(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html))设计简并引物xylDF和xylDR(见表2)，以嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18的基因组DNA为模板，利用表2中的简并引物xylDF和xylDR进行PCR扩增，PCR扩增条件如下：95℃5min；95℃30s，65-55℃(每个循环降1℃)45min，72℃1min，10个循环；95℃30s，55℃45min，72℃1min，20个循环；72℃，1min。PCR扩增的保守区片段(结果见图1)经凝胶回收后连接至pMD-18T载体，转化E.coli JM109，将PCR鉴定呈阳性的转化子送交测序。

表2.β-木糖苷酶基因xylA克隆引物

(注：以上简并引物xylDF和xylDR中，N＝A/T/C/G；Y＝C/T。)

2、β-木糖苷酶基因全长cDNA扩增

将PCR扩增得到的保守片段测序结果在GenBank数据库中进行分别进行blastn和blastx比对分析。比对发现该片段为β-木糖苷酶基因的保守片段。根据blastx比对结果根据外显子序列分别设计5′和3′RACE引物(见表2)，GSP(gene specialprimer)和NGSP(nested gene special primer)分别为RACE反应第一轮和第二轮(巢式)PCR引物。取木聚糖诱导培养3天的嗜热拟青霉(Paecilomycesthermophila)J18菌丝体，液氮研磨，利用Trizol(Invitrogen)法提取总RNA，反转录后分别进行5′和3′RACE反应，PCR扩增得到5′和3′端侧翼片段。RACE过程参照BD SMART^TMRACE cDNA Ampl ificat ion Kit User Manual进行。分别将5′和3′RACE得到的侧翼片段凝胶回收，连接pMD-18T载体，转化E.coli JM109，PCR鉴定后送交测序。根据5′和3′RACE测序结果，拼接得到β-木糖苷酶基因xylA全长cDNA序列。

xylA的编码序列如序列表中序列1所示，开放阅读框为序列1的自5’端第1-1017位，编码由338个氨基酸(SEQ ID NO.2)组成的蛋白质。

实施例2、β-木糖苷酶的高效表达

一、重组菌的获得

1、β-木糖苷酶基因的获得

根据序列表中序列1所示的基因设计两端引物xylF和xylR(见表2)，以嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18的cDNA为模板，利用两端引物xylF和xylR进行PCR扩增，扩增产物的凝胶电泳结果见图2。

将PCR扩增产物经凝胶试剂盒回收后连接pMD-18T载体，热激法转化大肠杆菌JM109，将阳性重组质粒命名为pMD18T-xyl。然后送往测序。

经测序，该扩增产物具有序列表中序列1的自5’端第1-1014位的核苷酸，并没有扩出终止密码子(序列1的自5’端第1015-1017位)，这样在下一步中，扩增产物插入pET-30a(+)的NdeI和NotI酶切位点后，可以使得表达出的蛋白C-端带上6×His Tag，方便了重组蛋白的纯化。

2、重组表达载体的构建

利用NdeI和NotI双酶切步骤1中的质粒pMD18T-xyl后，回收目的基因片段，与经同样双酶切的表达载体pET-30a(+)(Novagen公司)相连，连接产物转化大肠杆菌JM109，提取质粒酶切鉴定阳性重组子，将构建正确的重组质粒命名为pET30a-xyl。

3、构建重组菌

将步骤2获得的pET30a-xyl利用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)，用步骤2中的提取质粒酶切鉴定阳性重组子，将含有pET30a-xyl重组子的表达菌株命名为BL21-xyl。

二、重组菌的发酵

1、发酵步骤

液体发酵培养基(LB培养基)：胰蛋白胨(1％)，酵母提取物(0.5％)，NaCl(1％)，调pH至7.0，121℃灭菌20min，使用前加入60或100μg/mL卡那霉素。

种子培养方法：将甘油保藏管存放的菌种以1％接种量转接到100mL LB培养基(含60μg/mL卡纳霉素)中，37℃的恒温摇床中震荡培养14h，转速为200rpm。

培养方法：取2mL种子培养液以1∶100比例接种于装有LB培养基(含100μg/mL卡纳霉素)的摇瓶中，37℃进行培养。进入对数期中后期(0.8-1.0)，加入乳糖诱导剂诱导(终浓度为2％)，而后改变培养温度至33℃培养48h后4℃12000rpm离心20min，收集上清液和沉淀。

2、对步骤1得到的上清液和沉淀分别进行酶活和蛋白含量的测定

重组木糖苷酶酶活测定参照Lacke的方法：200μL 50mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲溶液配制的5mM底物(pNPX)(Sigma公司，美国)，50℃预热3min，然后加入50μL适当稀释的酶液，50℃反应10min后，加入750μL，2mol/LNa₂CO₃溶液终止反应，冷却后测定吸光值A410，以pNP作标准计算酶活力。酶活力的单位定义为：在上述条件下，每分钟生成1μmol pNP所需要的酶量。

蛋白含量的测定参照Lowry等的方法进行测定，以牛血清白蛋白作为标准。

结果如图3所示，本转基因大肠杆菌所产木糖苷酶主要为胞外酶(胞外酶占总酶活的98％左右)，发酵进行到48h时发酵液酶量达到最大值103.9U/mL。图4是上清液(胞外)中重组木糖苷酶凝胶电泳图，随着发酵时间的延长，重组木糖苷酶的产量变大与图3的结论相应。

三、蛋白纯化回收

根据表达出的重组木糖苷酶含有His标签，利用Ni-IDA进行亲和层析纯化。

具体纯化步骤：磷酸缓冲溶液(pH8.0，50mM，含20mM咪唑)，1mL/min平衡层析柱后，以流量0.3mL/min直接将发酵得到的粗酶液(发酵上清液)上样。然后继续使用磷酸缓冲溶液(pH8.0，50mM，含20mM咪唑)1mL/min将未吸附蛋白洗脱干净。

磷酸缓冲溶液(pH8.0，50mM，含50mM咪唑)洗脱杂蛋白至OD₂₈₀＜0.005，后用磷酸缓冲溶液(pH8.0，50mM，含150mM咪唑)收集目标蛋白。纯化表及纯化过程图分别如表3及图5所示。

表3.重组β-木糖苷酶纯化表

结果显示：由于此重组木糖苷酶绝大部分为胞外蛋白，因此较其它研究中木糖苷酶纯化过程简单，回收率高达到61.5％。

实施例3、β-木糖苷酶的应用

1、玉米芯汽爆液的制备

称取100g玉米芯(含木聚糖32.4％)，加入蒸馏水800mL，室温浸泡12h后加入高压罐中，加盖密封，加热待反应温度达到165℃时开始计时，保温30min后立即打开球型阀，释放物料(汽爆液)到收集罐中。待所收集的物料(汽爆液)温度降至60-70℃时抽滤，滤液冷却至室温后，薄层色谱法(TLC)测定结果如图6所示，HPLC测定其木寡糖比例(结果如表4)。用1MNaOH溶液将汽爆液pH调节至7.0，4℃冰箱冷藏备用。

表4.木糖苷酶酶解对玉米芯汽爆液中木糖及木寡糖比例的影响

注：-为未测检测出。

2、水解制备木糖

将步骤1中备用的汽爆液预热至50℃后，按照0.05U/mL添加实施例2纯化过的重组木糖苷酶水解1h。然后TLC测定结果如图6所示，HPLC检测结果如表4，水解产物主要以木糖为主，水解液中木糖比例达90％以上。

上述步骤1和步骤2的检测条件均为：色谱柱：键合氨基柱Carbohydrate(nova-pak250×4.6mm，4μm)；流动相：乙晴∶水(75∶25；V/V)；柱温：40℃；示差检测器温度：40℃；流速：1.0mL/min；进样量20μL。

序列表

<110>中国农业大学

<120>β-木糖苷酶及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>1017

<212>DNA

<213>嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)

<400>1

atgtccaacc ctaaacctct ggtgacgcac atctacaccg ctgatcccag tgcgcatgtc 60

ttcaatgaaa gactttacat ctacccatcc catgaccgtg agacggacat cgctttcaat 120

gacaatggag atcagtatga catggtggat tatcatgtcc tgtcgctcga tgagttggat 180

ggtccagtga ccgaccatgg tgtcgccctt catgcagacg atgtgccgtg ggtgtcgaag 240

cagctgtggg cgccagacgc tgcctaccgc aatggcaagt actatctcta tttccctgct 300

cgtgataagg aaggcatctt ccgcatcggc gtggccgtca gtgatgaacc gcatggccca 360

ttcaagcccg agccagaacc aattccgggg agctacagca tcgatcccgc cgtgcttgtc 420

gatgaacccg acgcttcggg aaaacaaaaa gcatacatgt actttggagg gatctggggc 480

ggccagcttc agtgctgggt cgaggatcct acgaccaagc agcttgtgtt tgacagctcc 540

cgttccggac cgcaagaacc atcaggtccc ggcaagctgg cgttgggtcc tcgtgtggcc 600

gaattgaacg acgatatgct cacctttgct tcgccaccgc gggaaattca aatccttgac 660

cccgagacgc gtcagcccat tctcgcagat gaccatgatc gccgcttctt cgaagctgca 720

tggtgccata aatacaatgg caagtactac ttttcctact ctactggcga tacgcactac 780

atcgtgtacg cggtcggtga cagcccattt ggtccattta tctatcaggg acggatcctc 840

gagccggtgg tgggatggac aacacatcac tcgatcgctg agtataaagg acgatggtgg 900

cttttctacc atgactgtga acaatctggt ggggtcagtc atctcaggtc ggtgaagatg 960

agggagatta tctacgatga ggaggggaag attcgcttga aggaacctca acattga 1017

<210>2

<211>338

<212>PRT

<213>嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)

<400>2

Met Ser Asn Pro Lys Pro Leu Val Thr His Ile Tyr Thr Ala Asp Pro

1 5 10 15

Ser Ala His Val Phe Asn Glu Arg Leu Tyr Ile Tyr Pro Ser His Asp

20 25 30

Arg Glu Thr Asp Ile Ala Phe Asn Asp Asn Gly Asp Gln Tyr Asp Met

35 40 45

Val Asp Tyr His Val Leu Ser Leu Asp Glu Leu Asp Gly Pro Val Thr

50 55 60

Asp His Gly Val Ala Leu His Ala Asp Asp Val Pro Trp Val Ser Lys

65 70 75 80

Gln Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Arg Asn Gly Lys Tyr Tyr Leu

85 90 95

Tyr Phe Pro Ala Arg Asp Lys Glu Gly Ile Phe Arg Ile Gly Val Ala

100 105 110

Val Ser Asp Glu Pro His Gly Pro Phe Lys Pro Glu Pro Glu Pro Ile

115 120 125

Pro Gly Ser Tyr Ser Ile Asp Pro Ala Val Leu Val Asp Glu Pro Asp

130 135 140

Ala Ser Gly Lys Gln Lys Ala Tyr Met Tyr Phe Gly Gly Ile Trp Gly

145 150 155 160

Gly Gln Leu Gln Cys Trp Val Glu Asp Pro Thr Thr Lys Gln Leu Val

165 170 175

Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Pro Gln Glu Pro Ser Gly Pro Gly Lys

180 185 190

Leu Ala Leu Gly Pro Arg Val Ala Glu Leu Asn Asp Asp Met Leu Thr

195 200 205

Phe Ala Ser Pro Pro Arg Glu Ile Gln Ile Leu Asp Pro Glu Thr Arg

210 215 220

Gln Pro Ile Leu Ala Asp Asp His Asp Arg Arg Phe Phe Glu Ala Ala

225 230 235 240

Trp Cys His Lys Tyr Asn Gly Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Ser Thr Gly

245 250 255

Asp Thr His Tyr Ile Val Tyr Ala Val Gly Asp Ser Pro Phe Gly Pro

260 265 270

Phe Ile Tyr Gln Gly Arg Ile Leu Glu Pro Val Val Gly Trp Thr Thr

275 280 285

His His Ser Ile Ala Glu Tyr Lys Gly Arg Trp Trp Leu Phe Tyr His

290 295 300

Asp Cys Glu Gln Ser Gly Gly Val Ser His Leu Arg Ser Val Lys Met

305 310 315 320

Arg Glu Ile Ile Tyr Asp Glu Glu Gly Lys Ile Arg Leu Lys Glu Pro

325 330 335

Gln His

Claims

1.一种蛋白，其氨基酸序列是序列表中的序列2。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1017位；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1的自5′末端第1-1014位。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pET-30(+)的NdeI和NotI酶切位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。

9.一种生产权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求7或8所述的重组菌发酵培养，得到蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件是：培养温度是33℃，培养时间是48h。

11.权利要求1所述蛋白在水解玉米芯汽爆液生产木糖中的应用。