CN1188510A - 新的β-木糖苷酶和编码该酶的核苷酸序列以及该酶的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核苷酸序列或者是这种核苷酸序列的一部分,所说的核苷酸序列编码具有β－木糖苷酶活性并与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列显示出至少30%的氨基酸等同性的肽,或者在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交,所说的核苷酸序列的一部分具有编码SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的至少15个核苷酸。本发明也提供了具有β－木糖苷酶活性并与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列显示出至少30%的氨基酸等同性的肽,或者这种肽的一部分(其具有SEQ ID NO.1所示的至少8个氨基酸)。SEQ ID NO.1来自黑曲霉。

Description

新的β-木糖苷酶和编码该酶的核苷酸序列以及该酶的用途

本发明涉及新的具有β-木糖苷酶活性的肽、编码这种肽的核苷酸序列和这种类β-木糖苷酶肽的用途。

背景

β-木糖苷酶(1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶；EC 3.2.1.37)是一种木聚糖裂解酶。木聚糖是植物细胞壁的一种主要成分，仅次于纤维素。它们大量存在于大多数陆生植物中，特别是农业副产品(如稻草、小麦糠、玉米穗轴、棉花种子等等)中。木聚糖是一种由β-1，4键连接的木糖聚合物组成，并含有阿拉伯呋喃糖、葡萄糖醛酸、甲基葡萄糖醛酸和乙酰侧链基团的复杂聚合物。内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)随机切割木聚糖骨架中的β-1，4-键，产生寡糖、木乙糖和木糖。β-木糖苷酶切割由内切木聚糖酶活性而形成的木糖寡聚物的非还原末端的末端木糖单元。α-葡萄糖醛酸酶切割木糖单元骨架的葡萄糖醛酸侧链基团，而α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)切割木聚糖骨架上的阿拉伯糖单元，乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)除去乙酰侧链基团。

β-木糖苷酶在将单糖或乙醇连接到木糖单元或从木糖单元中切割下来的葡基转移反应中也是有效的。β-木糖苷酶在木聚糖水解中是限制速率的酶(Dekker 1983，Poutanen和Puls 1988)。

β-木糖苷酶的水解反应和葡基转移反应在降解和利用农业废物中具有重要经济价值，例如在木糖、木糖寡聚物和木糖醇的产生过程中(这些物质在食品、蜜饯和药物中作为增甜剂，特别是作为糖替代品是有用的)。并且，此酶或其产物可以用作面包改进剂并可用于啤酒酿制工业中。

已经从各种来源(包括细菌和真菌)中分离了β-木糖苷酶。例如，Rodionova等(1983)已报道了从黑曲霉纯化β-木糖苷酶；据报道以凝胶过滤进行测定其分子量为253,000，以SDS电泳测定其分子量为122,000，此肽的等电点为pH4.9。

Kormelink等(1993)从泡盛曲霉中分离了三种内切木聚糖酶和一种β-木糖苷酶；β-木糖苷酶的分子量为110,000，最适pH值为6.5，最适温度为70℃。

Garcia-Campayo和Wood(1993)已经报道了瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的β-D-木糖苷酶，这种蛋白质的表观分子量为150,000(通过凝胶过滤测定)，最适pH6.4，最适温度为37℃。Utt等(1991)报道了编码反刍细菌溶纤维丁酸弧菌的β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的xylB的序列。

已有的β-木糖苷酶的活性模式不是总能适应于工业需要。特别是经常需要此酶具有高的木糖苷酶特异性，而对其它底物(如葡糖苷和半乳糖苷)具有低的特异性。尤其是真菌β-木糖苷酶在它们的活性水平和特异性模式方面具有很大的优势。

为了从所需要的产酶生物体提供具有所需要的酶活性模式的类β-木糖苷酶，应该知道β-木糖苷酶的序列信息。然而，到目前为止，还没有有关真菌β-木糖苷酶序列信息的报道。

发明描述

已经发现了一种新的β-木糖苷酶，并确定了它的氨基酸序列以及编码它的核苷酸序列。本文称此蛋白质为xylD，而称此编码基因为xlnD。新的β-木糖苷酶的一级结构似乎与已知的β-木糖苷酶类酶不同。另外，它的活性模式与已知的β-木糖苷酶类酶不同，它的β-木糖苷酶活性比Rodionova等(见上文)报道的β-木糖苷酶活性高大约2倍。

因此，本发明涉及一种核苷酸序列或者本发明涉及这种核苷酸序列的一部分，所说的核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性并与SEQID NO.1所示的氨基酸序列显示出至少30％的氨基酸等同性的肽，或者在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交，所说的核苷酸序列的一部分具有编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的至少15个，优选的是至少21个，更优选的是至少24个并且更优选至少30个核苷酸。本文的氨基酸同源性的意思是指氨基酸在一级结构上的等同性。氨基酸相似性通常高于所给定的等同性数值。

在本文中，异源杂交条件如下：在6×SSC(1000毫升20×SSC溶液含有：175.3g NaCl，107.1g柠檬酸钠-5H₂0，pH7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸钠，5×Denhardt溶液(500ml 100×Denhardt溶液包含：10g Ficoll-400、10g聚乙烯吡咯烷酮、10g牛血清清蛋白(PentaxFraction V))和20μg/ml变性鲱精DNA中于56℃杂交18-24小时，接着在5×SSC、0.1％SDS中于56℃洗涤两次，每次30分钟，然后在2×SSC、0.1％SDS中于56℃洗涤两次，每次30分钟。

本发明的核苷酸序列编码实质上具有β-木糖苷酶活性的肽，即这种肽以β-木糖苷酶活性作为其主要酶活性，因此可以用于产生β-木糖苷酶或它的突变体。所说的编码序列可以包含用于改变表达产物的结构和/或活性的突变(插入、缺失或两者都有)。作为这样一种活性表达产物应该优选地保持以上限定的最小等同性和/或杂交特征。这样的核苷酸也可以相当于β-木糖苷酶调节序列或信号序列。为此，核苷酸序列实质上含有β-木糖苷酶的编码序列或调节序列。在另一方面，此核苷酸序列可以用作检测β-木糖苷酶编码序列的引物或探针。为此，这种序列包含至少15个，多达例如60个SEQ ID NO.1序列的连续的核苷酸。

本发明也涉及一种具有β-木糖苷酶活性并与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列显示出至少30％氨基酸同源性的分离的肽，所说的肽不具有β-葡糖苷酶和/或不具有β-半乳糖苷酶活性；基本上不具有β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性的意思是这些活性不到β-木糖苷酶活性的2％，特别是不到1％。与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列显示出至少40％，优选的是至少60％，最优选的是至少75％的氨基酸等同性的肽构成本发明的优选的实施方案。含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的一系列至少8个邻接的氨基酸的肽也是本发明的一部分。可以通过翻译以上所述的核苷酸序列产生这些肽。优选地，所说的肽具有至少10个，最优选的是至少12个SEQ ID NO.1中所示的邻接的一系列氨基酸。

本发明的肽尤其来源于真菌，特别是丝状真菌，如曲霉属的菌株(尤其是黑曲霉、黑曲霉tubigensis变种、黑曲霉awamori变种、黑曲霉kawachii变种、米曲霉、聚多曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、赭曲霉、土曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、黄曲霉、海枣曲霉、构巢曲霉、臭曲霉和炭黑曲霉)、木霉属(尤其是Trichoderma reesei、绿色木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma harzianum、Trichodermakongingii、Trichoderma pseudokongii)的菌株、青霉属(瓦克青霉、嗜松青霉、微紫青霉、桔青霉、胶囊青霉、草酸青霉、疣孢青霉、产黄青霉)的菌株、腐质霉属(Humicola thermophilium＝Scytalidiumthermophilium)的菌株和镰孢属(尖镰孢、腐皮镰孢)的菌株。

并且，本发明也涉及抗以上所述的肽产生的抗体，这种抗体用于例如纯化β-木糖苷酶和检测β-木糖苷酶的存在。使用技术人员熟知的杂交瘤技术用以上所述的肽免疫接种产生这种抗体。

本发明也要求了在同源或异源启动子控制下的含有以上所述的核苷酸序列的表达载体和质粒。

此外，本发明也涉及使用这些序列通过不同的宿主细胞在其自身调节序列或者异源调节序列控制下产生β-木糖苷酶或使用β-木糖苷酶启动子序列产生其它肽的用途。表达载体和宿主细胞可以含有编码xylD序列(改变的或没有改变的SEQ ID NO.1)和其它基因的多个拷贝。

宿主生物体可以是同源的生产菌株或另外的异源宿主。合适的宿主生物体包括真菌、细菌和植物。宿主生物体的例子是曲霉属物种、木霉属物种、芽孢杆菌属物种、克鲁维属物种、酵母属物种和镰孢属物种。特别优选的是曲霉属、黑曲霉tubigensis变种、黑曲霉awamori变种、米曲霉、日本曲霉、炭黑曲霉、棘孢曲霉、Trichoderma reesei、绿色木霉、Trichoderma harzianum、尖镰孢、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母和啤酒糖酵母。宿主生物体优选地是食物级的生物体。

自身调控区和异源调节区的例子包括真菌的组成型和/或者诱导型启动子，例如丙酮酸酯激酶启动子(pkiA)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)启动子。强酵母启动子的例子是乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油酯激酶和磷酸丙糖异构酶启动子。细菌启动子的例子是α-淀粉酶、spo2和细胞外蛋白质酶基因的启动子。

本发明还涉及SEQ ID NO.1的5’非编码区中含有的调节序列(1-854个核苷酸或它的一部分)在表达同源或异源基因上的用途，所述基因例如木聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、氧化还原酶(己糖氧化酶)、α-葡糖苷酸酶、脂酶、酯酶、阿魏酸酯酶、蛋白酶或人类白细胞介素-6、牛(原)凝乳酶、人类乳铁蛋白质、真菌肌醇六磷酸酶基因。xlnD的信号序列和合适的终止子(如xlnD或trpC)也可以用于这种结构中。

本发明还涉及使用上述的核苷酸序列以一种方法破坏宿主生物体的β-木糖苷酶基因。为达到此目的，将含有能导致β-木糖苷酶基因失去功能的突变的核苷酸序列引入宿主细胞。这种突变可以是缺失一个或多个核苷酸、插入一个或多个核苷酸或者是它们的组合。

有利的是宿主细胞(不论是改变了以产生或过量产生β-木糖苷酶或者不产生其β-木糖苷酶的宿主细胞)表达或者过量表达其它的相关蛋白质，所说的蛋白质包括酶，特别是其它的木聚糖裂解酶(如内切木聚糖酶)和/或其它的酶(例如淀粉酶、葡聚糖酶、氧化还原酶(如己糖氧化酶)、α-葡糖苷酸酶、脂酶、酯酶、阿魏酸酯酶和/或蛋白酶。相应的基因可以是在同源控制区或存在于上述的核苷酸序列中的β-木糖苷酶基因的控制区的控制下。

由本发明的重组宿主细胞表达的一种特异性的蛋白质是命名为xylR的木聚糖裂解途径的激活调节物。这种调节物的靶基因包含xlnA、xlnB、xlnC(所有三种内切木聚糖酶编码基因)、xlnD和axeA。因此，本发明的含有xlnR(即能够表达xylR或其活性等同物)的宿主细胞，在这些细胞包含活性xlnD基因时是β-木糖苷酶的有效的产生者；或者在xlnD基因已经失去功能的情况下，是其它木聚糖裂解酶(包括内切木糖苷酶，但不包括β-木糖苷酶)的有效的产生者。在SEQ ID NO.2中示出了xlnR基因的核苷酸序列。

本发明也包括所说的肽的酶活性在面包生面团和其它的烘烤产品中所包含的底物的葡糖基转移反应中的用途，结果产生改进的面包特性。这种用途包括以有关面包酶促改进剂的公知的方式用作面包改进剂。

由本发明的序列编码的β-木糖苷酶在用于从树木、植物废物、废纸浆产生木糖和木糖寡聚物方面也是有利的，所说的木糖和寡聚物适于用作增甜剂。也可以将它们还原成木糖醇(也是有效的主要增甜剂)。

本发明的其中的β-木糖苷酶基因已被破坏的宿主细胞可以用于，例如，生产例如加入到动物饲料中的酶和酶制剂。很多动物(包括家禽和猪)不能代谢木糖(Schutte，1991)。肠壁吸收的木糖占据泌尿系统，这样木糖的吸收对这些动物是不利的。并且，已知木糖的大量摄入导致白内障、腹泻和食欲不振。另一方面，可以将木糖和木糖寡聚物发酵成非常有用的短链脂肪酸。因此，饲料中的半纤维素酶应产生木糖寡聚物并且不产生木糖单体，这样此酶应具有内切木聚糖酶活性，不具有β-木糖苷酶活性或其水平降低。这样，本发明也涉及包含失去功能的β-木糖苷酶基因但能够有效地产生内切木聚糖酶及任选的其它的尤其是木聚糖裂解酶的宿主细胞(如真菌、细菌、酵母和植物)在产生不含β-木糖苷酶的酶制剂方面的用途。本发明也包括所说的不具有α-木糖苷酶活性的木聚糖裂解酶。

由SEQ ID NO.1的核苷酸序列编码的β-木糖苷酶与Rodionova等(1993)报道的黑曲霉的β-木糖苷酶有很大不同，表A列出了它们的不同。

                    表A

        本发明的β-木糖苷酶(X-I和X-II)与

按照Rodionova等(1983)的β-木糖苷酶的活性及抑制作用的比较

       底物                 本发明    本发明      β-xyl

     活性(U/m)              的X-I     的X-II    (Rodionova)对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷      60.2       60.9        35.2对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷    0.2        0.3         7.9对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷    0.0        0.0         0.6对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷  2.8        3.4         5.8抑制作用Ki(mM木糖)              9.8        13.2        2.9

表A概括了本发明的两种β-木糖苷酶X-I和X-II(可能只在糖基化模式上不同，氨基酸序列没有差异)及Rodionova等报道的β-木糖苷酶的特异性模式及木糖对它们的抑制作用。表B列出了这些β-木糖苷酶的氨基酸组成。

                       表B

         按照SEQ ID NO.1的β-木糖苷酶与按照Rodionova等报道的β-木糖苷酶的氨基酸组成的比较氨基酸          数目       摩尔百分比     摩尔百分比(％)

                          (％)         (Rodionova)Ala            86            11.1            8.2Arg            27            3.5             2.1Asn+Asp          95            12.2            5.6Cys            7             0.9             1.1Gln+Glu          74            9.5             12.4Gly            63            8.0             11.3His            13            1.7             1.4Ile            39            5.0             4.8Leu            69            8.9             8.8Lys            24            3.1             2.9Met            6             0.8             3.3Phe            24            3.1             2.9Pro            39            5.0             8.6Ser            53            6.8             8.7Thr            58            7.5             7.0Trp            15            2.0             2.6Tyr            41            5.3             3.4Val            45            5.8             6.1

实施例1：黑曲霉β-木糖苷酶的纯化

在添加了1.5％粗制的小麦阿拉伯木聚糖，10mM L-精氨酸，10μM烟酰胺的曲霉属基本培养基(MM)(每升包含6.0g NaNO₃，1.5g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄.7H₂O，0.5g KCl，指定的碳源，pH6.0和1毫升Vishniac溶液(Vishniac，W.和Santer，M.，1957，每升包含10g EDTA，4.4gZnSO₄.7H₂O，10g MnCl₂.4H₂O，0.32g CoCl₂.6H₂O，0.32g CuSO₄.5H₂O，0.22g(NH₄)₆ Mo₇O₂₄.4H₂O，1.47g CaCl₂.2H₂O，1.0g FeSO₄.7H₂O，pH4.0))中培养如在1996年6月24日申请的共同未决PCT申请(以及在EP 95201707.7和EP 95202346.3)中所述构建的突变株黑曲霉NW147，其是菌株NW205∷130#2(cspA1，pyrA6，nicA1，argBI3，∷pIM130)的去阻遏衍生突变菌株。以1×10⁶个孢子/升接种此培养基，30℃下菌丝体在250rpm的有轨New Brunswick摇床中生长96小时。在使用Bchner漏斗和温和抽吸的Myracloth(尼龙纱布)中过滤菌丝体后，收集培养物滤液。在培养物滤液由加入2倍体积的Millipore水稀释后，用0.1M NaOH将培养物滤液的pH调至6.0。

在50mM醋酸钠(pH5.0)中平衡DEAE-交联葡聚糖A-50，并将其加入到培养物滤液中。4℃下振荡30-60分钟后，使DEAE-交联葡聚糖与培养物滤液一起通过带有玻璃滤器夹具的漏斗，并将DEAE-交联葡聚糖A-50转移到一个柱中。首先以50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)洗脱此柱，然后以50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)+0.5M NaCl洗脱。合并含有β-木糖苷酶活性的组分(通过使用生色底物4-甲基伞形花内酯基-β-D-木糖苷(检测β-木糖苷酶和内切木聚糖酶)(Sigma#M7008)检测)，通过在Millipore水中透析进行脱盐，然后在20mM哌嗪-HCl缓冲液(pH5.0)中透析。透析后，将样品加入到DEAE-琼脂糖凝胶快流柱中，此柱先以3倍体积的20mM哌嗪-HCl缓冲液(pH5.0)洗脱，然后以溶解在20mM哌嗪-HCl缓冲液(pH5.0)中的0.5M NaCl的线性梯度洗脱。通过在280nm下UV吸收的连续测定来检测洗脱下来的蛋白质(图1)。收集10毫升组分，用来在对硝基-苯基-β-D-吡喃木糖苷(PNP-X)(Sigma# N2132)上测定β-木糖苷酶活性。在组分11-27中发现β-木糖苷酶，合并这些组分，接下来将其在20mM哌嗪-HCl缓冲液(pH6.0)中透析(图2)。将5毫升透析的样品加入到Mono Q HR5/5柱(Pharmacia)上，使用59毫升溶解在20mM哌嗪-HCl缓冲液(pH6.0)中的1M NaCl的线性梯度洗脱蛋白质。通过在280nm下UV吸收的连续测定来检测洗脱下来的蛋白质(图3)。发现2个含有β-木糖苷酶活性的峰；β-木糖苷酶I以0.19M NaCl洗脱下来，而峰II以0.29M NaCl洗脱下来。这两个峰组分的SDS-PAGE表明相当于这两个峰的组分每一个都包含单一的蛋白质带，两种蛋白质具有相同的表观分子量110kDa。如Rodionova等(1983)的描述测定这两种β-木糖苷酶I和II对人工底物PNP-X的比活性，分别为60.2和60.9U/mg蛋白质。此外，测定了它们对PNP-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma# N7006)的活性，分别为0.2和0.3U/mg；对PNP-β-D-吡喃半乳糖苷(Sigma# N1252)的活性为0.0和0.0U/mg；β-木糖苷酶I和II对PNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma# N3641)的活性分别是2.8和3.4U/mg。

实施例2：cDNA表达文库的构建

在含有2％小麦阿拉伯木聚糖的MM培养基上将黑曲霉NW147培养69小时和81小时，之后通过过滤收获菌丝体，并且用无菌盐水洗涤，随后在液氮中冷冻菌丝体，其后使用Microdismembrator(Braun)将菌丝体粉碎。按照Sambrook等(1989)所描述的硫氰酸胍/CsCl方案(只是使用CsCl梯度将RNA离心两次)从菌丝体粉末中分离出总RNA。通过寡(dT)纤维素层析(Aviv和Leder，1972，Sambrook等，1989)(但要作如下变动：从各种溶液中除去SDS，并且向上样缓冲液中补充9％(v/v)的二甲基亚砜)从5μg的总RNA中分离出Poly A⁺mRNA。

从7μg的Poly A⁺mRNA合成cDNA，并且使用ZAP^TM-cDNA合成试剂盒(Stratagene)按照厂商的说明将cDNA连接到噬菌体λ上。将cDNA连接到Uni-ZAP XR载体臂上后使用Packagene^TM提取物(Promega)按照厂商的说明包装噬菌体DNA。将120μg cDNA连接到1.2g的载体臂上，随后包装反应混合物产生由3.5×10⁴个重组噬菌体构成的初级文库。使用大肠杆菌XLl-Blue MRF(Stratagene)扩增初级文库，滴定并在4℃下保存文库。

实施例3：β-木糖苷酶抗体的制备

用1mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析各250μg的β-木糖苷酶I和β-木糖苷酶II并且冷冻干燥。在100μg的无菌PBS(0.136M NaCl、2.7mMKCl、8mM Na₂HPO₄、1.75mM KH₂PO₄、pH7.4)中悬浮蛋白质。将100μl的弗氏完全佐剂加入到蛋白质混合物中，并且涡旋30分钟以获得稳定的乳剂。将这两种蛋白质的混合物皮下注射到小鼠体内。四周后将溶解在100μl无菌PBS中的25μg的β-木糖苷酶(向其中加入100μl弗氏不完全佐剂)注射到小鼠体内。第7周从小鼠体内取血并且进行血清检验。第13周进行第二次25μg的加强免疫，接着第14周取血。间隔6周进行加强免疫，然后取血，这个过程可以进行几次。

37℃下将收集到的血清培养30分钟，接着在4℃保存16小时。用Sorvall高速离心机以5000rpm离心后，收集血清并在-20℃保存。

实施例4：用β-木糖苷酶II的抗体

对黑曲霉NW147的cDNA文库进行免疫筛选

为了筛选如实施例3描述的方法构建的用于表达β-木糖苷酶的黑曲霉NW147 cDNA文库，使用大肠杆菌BB4(Stratagene)作为接种细菌，按照Maniatis等(1982，pp.64)描述的方法将cDNA克隆以5×10³pfu/平板接种在含有0.7％琼脂糖的NZYCM的优质琼脂糖的NZYCM(1.5％琼脂)平板(平板直径为85mm)上。主要按照Young和Davies(1983)描述的方法对所获得的cDNA表达文库进行筛选，简而言之，使用大肠杆菌BB细胞作为宿主在0.7％优质琼脂糖中将5000pfu扩增的原液接种在NZYCM培养基上。将平板在37℃培养5小时，其后用预先浸泡在10mM IPTG中然后风干的硝化纤维滤膜覆盖此平板。然后将平板在37℃下另外培养6小时。将平板冷却到4℃，在将滤膜除去之前标记其在平板的位置。将滤膜在0.5M NaCl，0.05％Tween 20(Biorad)，20mM Tris/HCl，pH7.5中温育15分钟，同时轻微振荡，重复一次以上操作。用手(带上手套)轻微振荡以除去细菌碎片，通过用抗β-木糖苷酶II抗血清检测滤膜，其后用碱性磷酸酶缀合物按照在Biorad操作指南中相应的Western杂交部分描述的方法进行检测来鉴定表达含有一部分β-木糖苷酶蛋白质的融合蛋白质的噬菌体。在两个实验中筛选5×10³和5×10⁴pfu扩增文库的β-木糖苷酶cDNA的表达；发现4个阳性克隆。使用巴氏吸管从平板中挑取每个阳性噬菌斑，并且在含有20μl氯仿的SM缓冲液中按照Maniatis等(1982)描述的方法从琼脂填料中洗脱噬菌斑。使用影印滤膜通过重复上述方法从含有分离的噬菌体的50-100噬菌斑的平板上纯化获得的噬菌体。

实施例5：表达β-木糖苷酶的cDNA克隆的分析

按照厂商的说明，用丝状辅助噬菌体ExAssist^TM(其包含在Stratagene的ZAP^TM-cDNA合成试剂盒中)通过超感染将表达β-木糖苷酶的cDNA克隆转移到Bluescript噬菌粒中。

接下来如Sambrook等(1989)的描述分离噬菌粒DNA。使用限制酶EcoRI和XhoI对4个cDNA克隆分离的DNA进行限制性分析37℃下将所说的DNA在包含下列溶液的反应混合物中消化2小时：2μl(≈1μg)DNA溶液；2μl合适的10×反应缓冲液(LifeTechnologies)；每种限制性内切酶10U(Life Technologies)；无菌蒸馏水定容至20μl。加入4μl DNA上样缓冲液后，将此样品加入到0.7％TAE-琼脂糖凝胶上。通过在80V下电泳分离所说的DNA片段。限制性分析表明cDNA克隆已经插入了不同大小的片段，分别为1.4，1.5，2.4和2.5kb。使用Pharmacia T7 DNA聚合酶测序试剂盒通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等，1977)确定每一个cDNA的部分核苷酸序列。获得的序列表明这些cDNA的4个片段相当于同一基因。

实施例6：筛选黑曲霉基因组文库的

编码β-木糖苷酶的xlnD基因并分离此基因

为了筛选如Harmsen等(1990)的描述构建的黑曲霉N100基因组文库的xlnD基因，使用大肠杆菌LE392作为接种细菌以3×10³pfu/平板如Maniatis等(1982)的描述接种在5个直径为85mm的NZYCM(1.5％琼脂)平板上的含有0.7％琼脂糖的NZYCM优质琼脂糖上。平板在37℃下过夜培养后，如Maniatis等(1982)的描述将平板转移到HybondN⁺滤膜(Amersham)上，每个平板重复两次。滤膜在3×SSC中浸湿后，室温下将此滤膜在3×SSC中洗涤60分钟。使用如Sambrook等(1989)描述的方法制备的³²P标记的cDNA克隆#4的2.5kb EcoRI/XhoI片段按照下列方法(Sambrook等，1989)进行杂交：68℃下在6×SSC(1000毫升20×SSC含有：175.3g NaCl，107.1g柠檬酸钠.5.5H₂O，pH7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸钠，5×Denhardt溶液(500毫升100×Denhardt溶液含有：10g Ficoll-400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清清蛋白(Pentax组分V))，20μg/ml变性鲱精DNA中预杂交3-5小时；68℃下在相同的含有变性的标记探针的缓冲液中杂交15-18小时，然后68℃下在2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次。用Saran包装膜覆盖此膜，并在-70℃下使用Konica X-射线胶片和带有常规增感屏的X-Omatic盒进行过夜放射自显影。

此筛选得到了大约50个阳性噬菌体，纯化了其中的10个。使用巴氏吸管从此平板上挑取每一个阳性噬斑，并如Maniatis等(1982)的描述在含有20μl三氯甲烷的1ml SM缓冲液中将所说的噬斑从琼脂填料中洗脱下来。使用影印滤膜通过重复上述的方法从包含50-100个分离噬菌体之噬斑的平板上纯化得到的噬菌体。

纯化后，通过在NZYCM培养基上接种5×10³个噬菌体来繁殖这些噬菌体。37℃下过夜培养后，得到铺满的平板，通过加入5毫升SM缓冲液并将平板在4℃下间歇摇动贮存2小时来从平板中洗脱这些噬菌体。使用吸管收集上清液后，通过4℃下以4,000×g离心10分钟从此溶液中除去细菌。向上清液中加入0.3％三氯甲烷，并确定pfu数值。这些噬菌体原液含有大约10⁹pfu/ml。

经Southern分析方法分析如Sambrook等(1989)描述的方法分离的4个选中的噬菌体G15-G18的DNA。37℃下在含有下列溶液的反应混合物中将DNA消化5小时：5μl(≈1μg)DNA溶液；2μl合适的10×反应缓冲液(Life Technologies)；限制性内切酶10U(LifeTechnologies)；无菌蒸馏水定容至20μl。65℃下将样品保温10分钟，在加入到溶解在1×TAE缓冲液中的0.6％琼脂糖凝胶中之前，在冰上快速冷却。在25V下通过电泳15-18小时分离这些DNA片段。

在电泳后，通过碱性真空印迹法(VacuGene XL，Pharmacia LKB)如VacuGene XL操作说明(pp.25-26)的描述将所说的DNA变性并转移到尼龙膜(Hpbond N，Amserham)上，接下来使用标记的cDNA克隆#4的2.5kb EcoRI/XhoI片段进行预杂交和杂交，杂交条件如上所述。在-70℃下通过使用增感屏在Kodak XAR-5 X-射线胶片上曝光18小时获得杂交图式。在所有的4个克隆中，发现了来源于同一个基因组区的片段，并构建了这些片段的限制图谱(图4)。

以限制图谱为基础，筛选3.6kb PstI片段用于亚克隆。将100ngpEMBL19 PstI消化的片段与250ng 3.8kb PstI片段混合，并向混合物中加入4μl 5×连接缓冲液(组成：500mM Tris-HCl，pH7.6；100mMMgCl₂；10mM ATP；10mM二硫苏糖醇；25％PEG-6000)和1μl(1.2U/μl)T₄ DNA连接酶(Life Technologies)，混合物的最终体积为20μl。14℃下保温16小时后，用无菌水将混合物稀释到100μl。用10μl稀释的混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(如Sambrook等(1989)的描述进行制备)。得到的6个克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(每1000毫升的LB培养基含有：10g胰酶化蛋白胨(BBL)，5g酵母抽提物(BBL)，10g NaCl，0.5mM Tris-HCl pH7.5)中过夜生长。通过如Maniatis等(1982)描述的碱裂解法从培养物中分离质粒DNA，在限制性分析中使用此质粒筛选含有所需要的质粒pIM200的克隆。在真菌菌种保藏中心，Baam，NL以保藏号CBS 677.96保藏含有质粒pIM200的菌株。从生长在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中的500毫升包含pIM200的大肠杆菌DH5α培养物中大规模分离质粒DNA(Maniatis等，1982)。通过CsCl离心，乙醇沉淀纯化质粒，并溶解在400μl TE中。所得的产量大约为500μg。此质粒用于构建详细的限制性图谱(图5)。

实施例7：使用质粒pIM200转化黑曲霉

以1×10⁶个孢子/ml在250ml由MM组成的培养基(添加了2％葡萄糖，0.5％酵母抽提物，0.2％酪蛋白氨基酸(不含维生素)，2mM亮氨酸，10μM烟酰胺，10mM尿苷)中接种NW155菌株(cspAl，argBl3，pyrA6，nicA1，leuA1，prtF28)(来源于NW228，Van den Hombergh等，1995)的孢子，30℃下在250rpm有轨New Brunswick摇床中培养菌丝体16-18小时。使用Bchner漏斗和温和抽吸在Myracloth(尼龙纱布)上收集菌丝体，并且用SP6(SP6：0.8％NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH6.0)洗涤几次。将150ml的Novozyme 234溶解在已加入1g菌丝体(湿重)的20ml SMC(SMC：1.33M山梨醇，50mM CaCl₂，20mMEMS缓冲液，pH5.8)中，并且小心地悬浮。30℃下用温和振荡器培养悬浮液1-2小时，每隔30分钟将菌丝体小心地悬浮，取样后用血细胞测定仪计数原生质体以检测原生质体的形成。当存在足够的原生质体(大于1×10⁸)时，小心地悬浮并通过无菌玻璃棉管塞过滤除去菌丝体碎片。使用台式离心机在4℃以3000rpm离心10分钟收集菌丝体，除去上清液，将沉淀物小心地悬浮在5ml STC(STC：1.33M山梨醇，50mM CaCl₂，10mM Tris/HCl，pH7.2)中。洗涤步骤重复两次，最后将原生质体以1×10⁸/ml密度悬浮在STC中。

通过以下步骤进行转化：将20μg的pIM200 DNA和含有黑曲霉pyrA基因的5μg pGW635(溶解在10-20μl的TE中)与5μl的PEG缓冲液(PEG缓冲液：25％PEG-6000，50mM CaCl₂，10mM Tris/HCl，pH7.2)一起加入到200μl的原生质体悬浮液中，然后使用移液管上下移动多次慢慢地将上述液体混合，并在室温下温育20分钟。此后，加入2μl的PEG缓冲液，将溶液慢慢混合并在室温下温育5分钟，接下来加入4ml的STC并在涡旋混合器中慢慢混合。然后将1ml的悬浮液加入到4ml含有0.95M蔗糖渗透稳定的优质琼脂中，然后倒入渗透稳定的平板中。另外使用pGW635转化黑曲霉作为对照。

实施例8：转化体的分析

通过将在实施例7中获得的pIM200转化体接种在含有1％燕麦二粒小麦木聚糖和1mM 4-甲基伞形花内酯基-β-木糖苷的MM培养基上来分析其表型。检验了26个转化体，其中5个显示出增加了的荧光。将这些转化体和转化体PYR⁺(作为参考)一起培养在含有1％燕麦二粒小麦木聚糖的MM上，培养20、27和42小时。此后测量β-木糖苷酶对PNP-X的活性。结果列于表C中。

在全部5个选择的转化体中都发现了β-木糖苷酶活性水平的增加，最高水平比野生活性多30多倍。使用如实施例3中的描述制备的抗β-木糖苷酶的抗体通过Western印迹和使用Bio-Rad免疫印迹GAR-AP测定试剂盒按照供应商的说明证实了这些结果。

                     表C

在下述保温时间后的黑曲霉转化体的β-木糖苷酶活性

              (mU/ml培养物滤液)

                 20hr          27hr      42hrpGW635                15            16        17XlsA1                 82            86        51XlsA4                 90           112        78XlsA8                211           239       384XlsA9                 63           110        74XlsA12                96           295       527

实施例9：xlnD基因的一级结构

9.1：黑曲霉xlnD基因的序列分析

通过在pEMBL18/19中亚克隆这些片段和使用特异性的寡核苷酸作为测序反应中的引物测定黑曲霉xlnD基因、它的启动子/调节区、基因的结构部分和终止区的序列。

为分析核苷酸序列，分离出限制性片段，然后将其克隆到pEMBL18/19 DNA载体中，并用适当的限制酶消化。通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等，1977)使用Pharmacia T7 DNA聚合酶测序试剂盒测定核苷酸序列。使用PC/GENE程序(Intelligenetics)进行计算机分析。在SEQ ID NO.1中给出了测定的序列。

9.2 xlnD基因的描述

包含xlnD结构基因的序列(SEQ ID NO：1)的前端是一个854个核苷酸长的上游区。在787-794位发现推定的TATA框。xlnD基因的结构部分从855到3266位，并且不含有内含子，这一点已由cDNA片段测序和pIM200基因组片段测序证实。

xlnD基因编码一种804个氨基酸的蛋白质。N-末端氨基酸序列的前端是一个26个氨基酸长的疏水区序列，其可能相当于信号序列。成熟的β-木糖苷酶蛋白质的长度为778个氨基酸，并且具有84,727Da的推导分子量。

实施例10：筛选塔宾曲霉基因组文库的编码β-木糖苷酶的xlnD基因

为了筛选如De Graaff等(1994)所述的方法构建的塔宾曲霉基因组文库的塔宾曲霉相应的基因，如实施例6所描述的方法，以3×10³pfu/平板在5个直径为85mm的NZYCM(1.5％琼脂)平板的含有0.7％琼脂糖的NZYCM优质琼脂糖上接种。平板在37℃下过夜培养后，如Maniatis等(1982)的描述将平板转移到HybondN⁺滤膜(Amersham)上，每个平板重复两次。滤膜在3×SSC中浸湿后，室温下将此滤膜在3×SSC中洗涤60分钟。使用如Sambrook等(1989)描述的方法制备的³²P标记的pIM200的3.6kb pstI片段按照下列方法(Sambrook等，1989)进行杂交：65℃下在6×SSC，0.1％SDS，0.05％焦磷酸钠，5×Denhardt溶液(参见实施例6)，20μg/ml变性鲱精DNA中预杂交3-5小时；65℃下在相同的含有变性的标记探针的缓冲液中杂交15-18小时，然后65℃下在2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次。用Saran包装膜覆盖此膜，并在-70℃下使用Konica X-射线胶片和带有常规增感屏的X-Omatic盒进行过夜放射自显影。

此筛选得到了大约10个全部纯化了的阳性噬菌体。使用巴氏吸管从此平板上挑取每一个阳性噬斑，并如Maniatis等(1982)的描述在含有20μl三氯甲烷的1ml SM缓冲液中将所说的噬斑从琼脂填料中洗脱下来。使用影印滤膜通过重复上述的方法从包含50-100个分离噬菌体之噬斑的平板上纯化得到的噬菌体。

纯化后，通过在NZYCM培养基上接种5×10³个噬菌体来繁殖这些噬菌体。37℃下过夜培养后，得到铺满的平板，通过加入5毫升SM缓冲液并将平板在4℃下间歇摇动贮存2小时从平板中洗脱这些噬菌体。使用吸管收集上清液后，通过4℃下以4,000×g离心10分钟从此溶液中除去细菌。向上清液中加入0.3％三氯甲烷，并确定pfu数值。这些噬菌体原液含有大约10⁹pfu/ml。

实施例11：黑曲霉xlnD基因的破坏

11.1：破坏(disruption)质粒pIM203和pIM204的构建

通过经PCR产生xlnD基因的内部片段来构建此基因的破坏质粒pIM203和plM204。使用衍生于xlnD序列(SEQ ID NO：1)的寡核苷酸产生所说的片段。xylos001是从1157至1176的位置上产生的，xylos004是从3147至3164位置上产生的。通过包含10μl 10×反应缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.01％明胶)，4种脱氧核苷三磷酸各16μl 1.25mM，1ng质粒pIM200 DNA，每种寡核苷酸各1μg(定容到100μl)的PCR产生此片段。混合反应混合物，并加入1μlTAQ聚合酶(5U/μl)(Life Technologies)。通过在92℃下温育3分钟使此DNA变性，接下来进行25个循环(92℃，1分钟；52℃，1.5分钟；72℃，1.5分钟)。25个循环后，将混合物在72℃下温育5分钟。经琼脂糖电泳的反应产物分析显示出一个大约2000bp的片段，基于此基因的序列，此片段的大小在预料之内。将所得的片段亚克隆到载体pGEM-T(Promega)中，形成质粒pIM202。在EcoRV/PstI消化的pIM202载体中通过连接pILJ16的SmaI/PstI片段(Johnstone等，1985)(包含构巢曲霉的argB基因(Upshall等，1986))构建质粒pIM203。在SpeI/NsiI消化的pIM202载体中通过连接pIM130(EP 95202346.3)的NsiI/XbaI片段(包含在塔宾曲霉xlnA启动子UAS控制之下的pyrA基因)构建质粒pIM204。

11.2：黑曲霉xlnD基因的破坏

如实施例11.1中所述的包含xlnD内部片段和argB基因(pIM203)或pyrA基因(pIM201)的质粒作为在转化中的选择标记用于破坏黑曲霉xlnD基因。为此，如实施例7中所述，分别利用选择精氨酸或尿苷原养型的质粒pIM203和pIM204转化黑曲霉N902(argB15、cspA1、fwnA1、metB10、pyrA5)。如实施例8所述在1％木聚糖平板上筛选得到的转化体对甲基伞形花内酯基-β-木糖苷的活性。在这两组转化体中筛选了20个转化体。生长24小时后，在这些转化体中每一组的MUX活性水平都有明显减少。选择的转化体的Southern分析表明pIM203转化体在同源的xlnD位点有多拷贝的整合。pIM204转化体在xlnD位点发生单一同源整合。如实施例8中所述的，分析这些转化体的PMP-X的活性表明β-木糖苷酶降低至少100倍。

11.3：xlnD基因的过量表达和失活对黑曲霉木聚糖裂解系统表达的作用

为了确定xlnD表达对木聚糖裂解系统(spectrum)表达的作用效应，将黑曲霉N902、两个在N902中的xlnD多拷贝转化体、xlnD基因破坏菌株在液体培养基上培养。在1％果糖上预培养18小时后，转移到2％燕麦二粒小麦木聚糖或3％D-木糖作为碳源的培养基上培养。在培养物滤液中按照PNP-X活性测定方法确定β-木糖苷酶活性。在这两种碳源中，对于pIM200转化体能够发现明显的过量表达，而对于两种(pIM203和pIM204)失活转化体几乎没有PNP-X活性。xlnD基因破坏转化体表明最初内切木聚糖酶表达水平降低，然而在16小时后其活性最终增加，结果相对于黑曲霉野生型其活性增加，因此，所形成的木聚糖制剂中不含β-木糖苷酶。

接下来使用Dionex系统和脉冲Amperometric检测通过HPLC分析方法分析培养物滤液。为此，收获后立即煮沸1ml培养物滤液，以便失活木聚糖裂解酶，然后将样品离心10分钟(14,000rpm，4℃，Eppendorf离心机)。将得到的上清液用bidest稀释5倍，使用DionexCarbofac 100柱通过HPLC分析20μl上清液。分析结果表明在野生型和过量表达的转化体中仅在最初阶段能够在培养物滤液中检测到木糖寡聚物的存在。在破坏突变体中，在培养物滤液中积累木乙糖，而很少积累木丙糖，所以得到木寡聚物尤其是木乙糖和木丙糖的源。

实施例12：黑曲霉xlnD基因在构巢曲霉中的表达

使用黑曲霉pyrA基因(位于质粒pGW635中)作为选择标记和质粒pIM200作为共转化质粒，通过共转化构巢曲霉G191(Balance和Turner，1985)将质粒pIM200引入到构巢曲霉中。如实施例7的描述制备原生质体，并使用1.2M山梨醇作为渗透稳定剂、1μg pGW635和25μg的pIM200进行转化。然后使用实施例8描述的平板测定方法筛选获得的PYR⁺的xylD表达。

从此筛选中，选择5个转化体确定β-木糖苷酶的活性。37℃下将构巢曲霉野生型菌株和选择的转化体在含有2％的Birchwood木聚糖(Roth)或3％D-木糖作为诱导碳源的基本培养基上培养26小时。除去菌丝体后，确定培养物滤液中相对于PNP-X的β-木糖苷酶活性。表D概括了所得的结果。结果表明xylD能够在构巢曲霉中使用天然表达信号表达。

                     表D构巢曲霉菌株    对2％木聚糖的活性    对3％D-木糖的活性

                  (mU/ml)             (mU/ml)WG096(Wt)               16                   0G191∷200-5            725                  48G191∷200-7             96                  11G191∷200-9            249                  40G191∷200-13           520                  33G191∷200-15          1525                 210

实施例13：筛选丝状真菌的xlnD基因

为了分析是否能够使用xlnD基因的2.5bp PstI/NsiI片段作为探针，通过异源杂交从其它真菌中分离xlnD的对等部分，从下列菌株中分离DNA：黑曲霉N902(argB15，cspA1，fwnA1，metB10，pyrA5)、塔宾曲霉NW184(cspA1，fwnA1，pyrA22)、FGSC 187的构巢曲霉WG096(pabaA1，yA2)、CBS 101.43的棘孢曲霉NW240(pyrA3)、CBS 115.80的棘孢曲霉NW217(fwnA1，cspA1，pyrA4，lysA1)、CBS115.52的臭曲霉(awamori)NW183(cspA1，fwnA1，pyrA13，lysA1)和Trichoderma reesei QM9414。用BamHI或XhoI消化1-2μgDNA，接下来通过Southern分析方法进行分析。所用的杂交条件是：56℃下在6×SSC(1000毫升20×SSC含有：175.3g NaCl，107.1g柠檬酸钠.5.5H₂O，pH7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸钠，5×Denhardt溶液(参见实施例6)，20μg/ml变性鲱精DNA中杂交18-24小时，然后在56℃下5×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟；56℃下在2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。杂交后用Saran包装膜覆盖此膜，并在-70℃下使用Konica X-射线胶片和带有常规增感屏的X-Omatic盒进行过夜放射自显影。

结果，在所有分析的真菌中现杂交片段，在黑曲霉、塔宾曲霉、棘孢曲霉、日本曲霉和臭曲霉发现非常强烈的杂交信号，而在构巢曲霉和Trichoderma reesei中发现较强的杂交信号。

实施例14 xlnR基因的剂量对黑曲霉木聚糖裂解系统表达的作用

如实施例11的描述使用19μg的包含xlnR的质粒pIM230和2μg包含构巢曲霉argB基因(Johnstone等，1985)的质粒pIM650在共转化实验中将含有编码β-木糖苷酶的多拷贝(大约6个)的黑曲霉xlnD基因的菌株N902∷200-18转化成精氨酸原养型。在含有1％燕麦二粒小麦木聚糖的MM平板中筛选获得的增加了内切木聚糖酶表达的转化体。选择4个晕轮形成最快最大的菌落确定xlnR拷贝数。为此，分离这些转化体和受体菌株的DNA，并将系列稀释液点到Hybond N膜上。使用跨越xlnR基因的编码序列的标记的4.5kb SmaI/Xbal片段，从杂交后获得的信号计算拷贝数。基于与受体菌株比较，确定N902∷200-18-R14中的xlnR拷贝数为8，而N902∷200-18-R16中的拷贝数为32。对于这两种转化体，在菌株在液体培养基中生长后，通过Northern分析方法分析增加基因xlnR的剂量的效应。在1％果糖上预培养18小时后，在转移到2％燕麦二粒小麦木聚糖作为碳源的转移实验中进行此项分析。在转移后8和24小时取样(菌丝样品)，使用TriZol(Life Technologies)按照厂商的说明从中分离总RNA，并经Northern印迹分析方法进行分析(Sambrook等，1989)。在这些转化体中，木聚糖酶B的表达水平相对于受体菌株明显增加，这一点是在杂交后通过使用标记的黑曲霉xlnB的1kb EcoRI/XhoI片段确定的(Kinoshita等，1995)。

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                 序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

         (A)姓名：Agricultural University Wageningen

         (B)街道：Costerweg 50

         (C)城市：Wageningen

         (E)国家：荷兰

         (F)邮码：6701 BH

(ii)发明名称：新的β-木糖苷酶和编码该酶的核苷酸序列以及该

              酶的用途

(iii)序列数：2

(iv)计算机可读形式：

         (A)介质类型：软盘

         (B)计算机：IBM PC兼容机

         (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

         (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：

(A)长度：4108个碱基对

(B)类型：核酸

(C)类型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：否(vi)最初来源：

(A)生物体：黑曲霉(CBS 120.49)

(B)菌株：NW147(ix)特征：

(A)名称/关键：TATA_信号

(B)位置：787..794(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：855..3266

(D)其它信息：/EC_号＝3.2.1.37

     /产物＝“1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶”

     /基因＝＂xlnD＂

     /标准名称＝＂β-木糖苷酶＂(ix)特征：

(A)名称/关键：信号肽

(B)位置：855..932(ix)特征：

(A)名称/关键：成熟肽

(B)位置：933..3266(ix)特征：

(A)名称/关键：polyA_位点

(B)位置：3383(ix)特征：

(A)名称/关键：polyA_位点

(B)位置：3404(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CTGCAGGCCA TGTATCCTGC GAAGATGGGT GAGTGGAAGA AAATCGTCAA GATTGAGGCG      60GAGATGGCGA GGGCCGCGAT GAAGAAGGGT GGCTGGGCAC CGGAGAAGCC AGCCACCGCC     120ACGGCGGCGC AGATGAGTAT ACCGTATGCG GTGGCGTTGC AGGTTCTGGA TGGGGAGATT     180GTGCCGGGGC AGTTTGCGCC GGGCATGTTG AATCGGGAGG AGTTATGGGA TGTGATTAGG     240CTGGTGGAAT GTCGGGAGGC CAAGGAGCTG GATAATACGT GGGCGCAGAG GGTCAAGATC     300ACGTTTGAGG ATGGGGAGGT GGTGGAGAAG TTGTTGAAGG CTCCGAAGGG AGTCCATCCT     360GGGGTGACGA ATGAGGAGGT GTTGCAGAAG TGGCGGGCTG TGACGAAGGG GGTAATTTCG     420GAAGAGAGGC AGAAGAAGAT CGAGGAGATT GTGTTGAATT TGGAAGAGGT GGAGGATGTG     480GCTGGTGTTT TGGGCGAGTT GTTGAGGGAA GAGACGGTGA ATGTGCTGCA GTAGACGGTT     540ACCCCATTTG GACGGGGATG GCTTCATATT TCCCAAGCGA TGTCACGCCA TAGAAAGGGC     600ACATTTACCC GGTGCCTGAG CGAAACTCTA CTTCGAAGAC AATGCCAATG TTTAACTATC     660TTGTTTTAAT TGCTAAATGC AAACATTCCA GGTTCTTCCT AATGCCGGCT AAATCATTCA     720GGCTAAACCC CCGCGATGAA GTCAATCGGT CATTCTCCGG CGCATCTCCG CATCTCCGCA     780AACCGCTATA AAATCTACCC CAGATTCAGT CCCCGGCCAC CTTTCTATCC CCCCCCCCAC     840AGACTGGCTC AACC ATG GCG CAC TCA ATG TCT CGT CCC GTG GCT GCC ACT       890

            Met Ala His Ser Met Ser Arg Pro Val Ala Ala Thr

            -26 -25                 -20                 -15GCC GCT GCT CTG CTG GCT CTG GCT CTT CCT CAA GCT CTT GCC CAG GCC       938Ala Ala Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu Pro Gln Ala Leu Ala Gln Ala

            -10                  -5                   1AAC ACC AGC TAC GTC GAC TAC AAC ATC GAA GCC AAC CCG GAC TTG TAT       986Asn Thr Ser Tyr Val Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Asn Pro Asp Leu Tyr

      5                  10                  15CCT TTG TGC ATA GAA ACC ATC CCA CTG AGC TTC CCC GAC TGC CAG AAT      1034Pro Leu Cys Ile Glu Thr Ile Pro Leu Ser Phe Pro Asp Cys Gln Asn

 20                  25                  30GGT CCC CTG CGC AGC CAT CTC ATC TGT GAT GAA ACA GCC ACC CCC TAT      1082Gly Pro Leu Arg Ser His Leu Ile Cys Asp Glu Thr Ala Thr Pro Tyr35                  40                  45                  50GAC CGA GCA GCA TCG CTC ATC TCG CTC TTC ACC CTG GAC GAG CTG ATC      1130Asp Arg Ala Ala Ser Leu Ile Ser Leu Phe Thr Leu Asp Glu Leu Ile

             55                  60                  65GCC AAC ACC GGC AAC ACC GGC CTC GGT GTC TCC CGA CTG GGC CTC CCT      1178Ala Asn Thr Gly Asn Thr Gly Leu Gly Val Ser Arg Leu Gly Leu Pro

         70                  75                  80GCA TAC CAA GTA TGG AGT GAA GCT CTT CAC GGC CTC GAC CGT GCC AAT      1226Ala Tyr Gln Val Trp Ser Glu Ala Leu His Gly Leu Asp Arg Ala Asn

     85                  90                  95TTC AGC GAC TCA GGA GCC TAC AAT TGG GCC ACC TCA TTC CCC CAG CCC      1274Phe Ser Asp Ser Gly Ala Tyr Asn Trp Ala Thr Ser Phe Pro Gln Pro

100                 105                 110ATC CTG ACC ACC GCG GCC CTC AAC CGC ACC CTC ATC CAC CAA ATC GCC      1322Ile Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ile His Gln Ile Ala115                 120                 125                 130TCC ATC ATC TCT ACC CAA GGC CGC GCC TTC AAC AAC GCC GGC CGC TAC      1370Ser Ile Ile Ser Thr Gln Gly Arg Ala Phe Asn Asn Ala Gly Arg Tyr

            135                 140                 145GGC CTC GAC GTC TAC GCC CCC AAC ATC AAC ACC TTC CGC CAC CCC GTC      1418Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Ile Asn Thr Phe Arg His Pro Val

        150                 155                 160TGG GGT CGC GGA CAA GAA ACC CCA GGA GAG GAC GTC TCT CTC GCC GCC      1466Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu Asp Val Ser Leu Ala Ala

    165                 170                 175GTC TAC GCC TAC GAA TAC ATC ACC GGC ATC CAG GGT CCC GAC CCA GAA      1514Val Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly Ile Gln Gly Pro Asp Pro Glu

180                 185                 190TCA AAC CTC AAA CTC GCC GCC ACG GCC AAG CAC TAC GCC GGC TAT GAC      1562Ser Asn Leu Lys Leu Ala Ala Thr Ala Lys His Tyr Ala Gly Tyr Asp195                 200                 205                 210ATC GAG AAC TGG CAC AAC CAC TCC CGC CTG GGC AAC GAC ATG AAC ATC      1610Ile Glu Asn Trp His Asn His Ser Arg Leu Gly Asn Asp Met Asn Ile

            215                 220                 225ACC CAG CAA GAC CTC TCC GAA TAC TAC ACG CCC CAA TTC CAC GTC GCC       1658Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr Thr Pro Gln Phe His Val Ala

        230                 235                 240GCC CGC GAC GCC AAA GTC GAG AGT GTC ATG TGC GCC TAG AAC GCC GTC       1706Ala Arg Asp Ala Lys Val Gln Ser Val Met Cys Ala Tyr Asn Ala Val

    245                 250                 255AAC GGC GTC CCT GCC TGC GCC GAC TCC TAC TTC CTC CAG ACC CTC CrC       1754Asn Gly Val Pro Ala Cys Ala Asp Ser Tyr Phe Leu Gln Thr Leu Leu

260                 265                 270CGC GAC ACC TTC GGA TIT GTC GAC CAC GGA TAC GTC TCC AGC GAC TGC       1802Arg Asp Thr Phe Gly Phe Val Asp His Gly Tyr Val Ser Ser Asp Cys275                 280                 285                 290GAT GCC GCC TAT AAC ATC TAC AAC CCC CAC GGC TAT GCC TCC TCC CAG       1850Asp Ala Ala Tyr Asn Ile Tyr Asn Pro His Gly Tyr Ala Ser Ser Gln

            295                 500                 305GCT GCC GCT GCC GCT GAG GCC ATC CTC GCC GGC ACC GAC ATC GAC TGC       1898Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ile Leu Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys

        310                 315                 320GGT ACC ACC TAC CAA TGG CAC CTG AAC GAG TCC ATC GCT GCG GGA GAT       1946Gly Thr Thr Tyr Gln Trp His Leu Asn Glu Ser Ile Ala Ala Gly Asp

    325                 330                 335CTC TCT CGC GAT GAT ATT GAG CAG GGT GTG ATT CGT CTC TAC ACG ACC       1994Leu Ser Arg Asp Asp Ile Glu Gln Gly Val Ile Arg Leu Tyr Thr Thr

340                 345                 350CTC GTG CAG GCC GGA TAC TTC GAC TCC AAC ACC ACA AAG GCG AAC AAC       2042Leu Val Gln Ala Gly Tyr Phe Asp Ser Asn Thr Thr Lys Ala Asn Asn355                 360                 365                 370CCC TAC CGC GAC CTC TCC TGG TCC GAC GTC CTT GAG ACG GAC GCA TGG       2090Pro Tyr Arg Asp Leu Ser Trp Ser Asp Val Leu Glu Thr Asp Ala Trp

            375                 380                 385AAC ATC TCC TAC CAA GCC GCG ACG CAG GGC ATT GTC CTT CTC AAG AAC       2138Asn Ile Ser Tyr Gln Ala Ala Thr Gln Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn

        390                 395                 400TCC AAC AAC GTC CTC CCC CTC ACC GAG AAA GCT TAC CCA CCA TCC AAC       2186Ser Asn Asn Val Leu Pro Leu Thr Glu Lys Ala Tyr Pro Pro Ser Asn

    405                 410                 415ACC ACC GTC GCC CTC ATC GGT CCC TGG CCC AAC GCC ACC ACC CAA CTC       2234Thr Thr Val Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Leu

420                 425                 430CTG GGC AAC TAC TAC GGC AAC GCT CCC TAC ATG ATC AGC CCC CGC GCC       2282Leu Gly Asn Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Tyr Met Ile Ser Pro Arg Ala435                 440                 445                 450GCC TTC GAA GAA GCC GGA TAC AAA GTC AAC TTC GCC GAG GGC ACC GGT       2330Ala Phe Glu Glu Ala Gly Tyr Lys Val Asn Phe Ala Glu Gly Thr Gly

            455                 460                 465ATC TCC TCC ACA AGC ACC TCG GGC TTC GCT GCC GCC TTA TCC GCC GCA       2378Ile Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gly Phe Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala

        470                 475                 480CAA TCC GCC GAC GTG ATA ATC TAC GCC GGT GGT ATC GAC AAT ACC CTT       2426Gln Ser Ala Asp Val Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ile Asp Asn Thr Leu

    485                 490                 495GAA GCG GAG GCA CTG GAT CGA GAG ACT ATC GCG TGG CCG GGT AAC CAA       2474Glu Ala Glu Ala Leu Asp Arg Glu Ser Ile Ala Trp Pro Gly Asn Gln

500                 505                 510CTG GAC TTG ATC CAG AAG CTC GCC TCG GCG GCC GGA AAG AAG CCG CTC       2522Leu Asp Leu Ile Gln Lys Leu Ala Ser Ala Ala Gly Lys Lys Pro Leu515                 520                 525                 530ATC GTC CTC CAA ATG GGC GGC GGA CAG GTC GAT TCC TCT TCG CTC AAG       2570Ile Val Leu Gln Met Gly Gly Gly Gln Val Asp Ser Ser Ser Leu Lys

            535                 540                 545AAC AAC ACC AAT GTT TCT GCA CTT CTC TGG GGC GGA TAC CCC GGC CAA       2618Asn Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Leu Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln

        550                 555                 560TCT GGC GGC TTC GCT TTG CGG GAT ATC ATC ACG GGG AAG AAG AAC CCC       2666Ser Gly Gly Phe Ala Leu Arg Asp Ile Ile Thr Gly Lys Lys Asn Pro

    565                 570                 575GCG GGT AGA CTA GTC ACG ACG CAG TAC CCT GCC AGC TAC GCG GAG GAG       2714Ala Gly Arg Leu Val Thr Thr Gln Tyr Pro Ala Ser Tyr Ala Glu Glu

580                 585                 590TTC CCG GCG ACA GAT ATG AAC CTT CGT CCT GAG GGT GAT AAC CCT GGT       2762Phe Pro Ala Thr Asp Met Asn Leu Arg Pro Glu Gly Asp Asn Pro Gly595                 600                 605                 610CAG ACG TAT AAA TGG TAC ACC GGC GAA GCC GTG TAC GAG TTC GGC CAC       2810Gln Thr Tyr Lys Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Val Tyr Glu Phe Gly His

            615                 620                 625GGG TTA TTC TAC ACG ACC TTC GCC GAA TCC TCC AGC AAT ACC ACT ACA       2858Gly Leu Phe Tyr Thr Thr Phe Ala Glu Ser Ser Ser Asn Thr Thr Thr

        630                 635                 640AAG GAA GTT AAG CTC AAC ATC CAG GAC ATT CTT TCC CAG ACA CAC GAA       2906Lys Glu Val Lys Leu Asn Ile Gln Asp Ile Leu Ser Gln Thr His Glu

    645                 650                 655GAC CTG GCG TCG ATT ACC CAG CTC CCT GTG CT  AAC TTC ACC GCC AAT       2954Asp Leu Ala Ser Ile Thr Gln Leu Pro Val Leu Asn Phe Thr Ala Asn

660                 665                 670ATC AGG AAC ACT GGA AAG CTG GAA TCG GAT TAC ACC GCT ATG GTA TTC       3002Ile Arg Asn Thr Gly Lys Leu Glu Ser Asp Tyr Thr Ala Met Val Phe675                 680                 685                 690GCC AAT ACC TCT GAT GCC GGG CCG GCG CCG TAT CCC AAG AAG TGG CTG       3050Ala Asn Thr Ser Asp Ala Gly Pro Ala Pro Tyr Pro Lys Lys Trp Leu

            695                 700                 705GTC GGG TGG GAT CGG CTT GGG GAG GTG AAG GTC GGG GAG ACG AGG GAG       3098Val Gly Trp Asp Arg Leu Gly Glu Val Lys Val Gly Glu Thr Arg Glu

        710                 715                 720TTG AGG GTC CCC GTT GAG GTG GGG AGC TTT GCG AGG GTG AAT GAG GAT       3146Leu Arg Val Pro Val Glu Val Gly Ser Phe Ala Arg Val Asn Glu Asp

    725                 730                 735GGC GAT TGG GTG GTG TTT CCG GGA ACG TTT GAG TTG GCG TTG AAT TTG       3194Gly Asp Trp Val Val Phe Pro Gly Thr Phe Glu Leu Ala Leu Asn Leu

740                 745                 750GAG AGG AAG GTT CGG GTG AAG GTT GTT CTT GAG GGT GAG GAG GAA GTC       3242Glu Arg Lys Val Arg Val Lys Val Val Leu Glu Gly Glu Glu Glu Val755                 760                 765                 770GTG CTG AAG TGG CCG GGG AAG GAG TAGAAAATAC TATTCTGTTG ATGGCTCTAG      3296Val Leu Lys Trp Pro Gly Lys Glu

            775GGGATGAGAG TCAGCCTATT ACTGGATATG CATAGTGGTG ATACGATGTA TATAGCTCTA     3356TGAAGTAATT AGTTCAAGTG GGAATACCCC TTTCACACAT ATAGTATGCT GTTATTCCGA     3416AATAGGGATC ATTTCTGATT AATAGTAGCG GTAGCGATGG TCACACACGA CTTAATGTTC     3476CCCATTGTAC CGGAAGTAAC AATTCCAGTG ACCTCTTAGA AGAAAGACAG CAAGAAAAAG     3536TAAGAAAGGG AAATTGATCA AAAAATAAGG CCATCTACAG CCTATTCACA TTTAGCCGGA     3596TCTGCAATAC AGCTACAGAA ATAAAGTTTC TTAGGCTGCT TGCTAGCATA GCTCCTACTA     3656TACTAAACCA ACACAATGGG ACAATACCCC AATTAACCAG CCCTCACTCA ACACAAGTGA     3716ATCCTACCGA CAACATGCAT AAACCACTGC TTCCCCACCC AGCACCCTTC TTCACGATCA     3776GATCACGGAG AATTACCAAC TACTCTTCGC ATAAAACGTA AACAACGGCC TCGGGCCAGG     3836ATCCGTCCGA CTCAAAAGCA ACAAATCCCT CGTTCGCATA CTAGCCACAT GAACCTGTTG     3896CTCCGAGACC TCCTCAACTG GGTCTTCAAA TGCCCAGAAG ACGCTTTCTT CTCGATATCC     3956ATCGGATACT CGCTGGCCGC TTAGACATAT GAACGATGAG TCTCGTCTGC CAAAGGAAAC     4016AACCGTGTTC CCGAATCCAG TGTCAAAGTC GTAGGTCTGG AATTTGAAAA GTGTTCGGGC     4076GTTTCCTTGG AGGGTCGGGA GTGCGACTGC AG                                   4108(2)SEQ IDNO：2信息：(i)序列特征：

(A)长度：4173个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：否(vi)最初来源：

(A)生物体：黑曲霉

(B)菌株：CRS 120.49

(C)个体分离物：N400(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：连接(948..1173，1238..3495，3550..3690)

(C)鉴定方法：通过实验

(D)其它信息：/功能＝＂木聚糖裂解基因的转录激活物＂

     /产物＝＂双核锌指DNA结合蛋白质＂

     /基因＝＂xlnR＂

     /标准名称＝＂XYL R＂(ix)特征：

(A)名称/关键：外显子

(B)位置：948..1173(ix)特征：

(A)名称/关键：内含子

(B)位置：1174..1237(ix)特征：

(A)名称/关键：外显子

(B)位置：1238..3495(ix)特征：

(A)名称/关键：内含子

(B)位置：3496..3549(ix)特征：

(A)名称/关键：外显子

(B)位置：3550..3690(xi)序列描述：SEQ ID NO：2CCCGGGCTTG GTTGGTCTCC GTCTGGCTTC CCCGCCTTTT TCCCCTGCAA TTCTGCATCC    60CCAATCCTTC TTTTTTCTTT GCCTCGCCAG GCTGTGTCTT TTTTCCCCCT CCCCCTCCTC     120CCTCGTCAGC TTCTCTTCGA CAGCATGCGT GAGGGTCTGC TACCAACTAC AATCCTTGTT     180CTCACTGTCT GATGGTCTGA CCCGACCGTG GTGTCTGTGG TGTGTGTGTG AGAGAGAAAG     240GAAAGCTAGT CAGTCCAGTC ACTCTTTCTC GTGGGTTCTT CACCTTCCCC GGACCTGCCC     300TCCGACACTA AAAAGCCACT TCCCCCCAAC TGGTTAGTTG CTGCTAGTCT CCTTAGTTCA     360TGGTCGGCCT TGTCGCTTCT CCGGCTGACA TTCTCCTCTT CTGCTGCCTT CTAGGTCCCT     420GTTTTTTAGT CCCTGTTTTA GTTGCCCCGC AGACTGAATC GGCAATGCCG TGGAGTTGAT     480CGTTCCGTGG TTTCCTTGCG ACCGCTCCTC TGCTTCATCA TCTTTTTCCT CCTGCCCTCC     540TGGTCTTGAA TCGCCTGGCC CTCGTCTAGG ATCTGTTGCG CCAGTGTCGC CTTAATCTCC     600TTTCCCGCTA GCGTAGTGCC CTTTCACGCT TGGGGCCTTA CGGCCCTTCC ATTCGCCAGC     660GGTCTGAATA CCTCACTTTC CCCCCCAACG ACCGGGGTCT TCATGACCCG CTGGGGTGAT     720TGTTCCGCCC GGTGAGGATG TCAACCCCCT CGATTCCTCA ATTCACCAGT CCTTTCTCTC     780CCTTCTCTTC CGGATCGCAC TCGACTGGCA TGGCGCCGTC TCAGACTGTC GGGTTGGATA     840CGCTCGCCGA GGGCTCGCAG TACGTCCTGG AACAATTGCA GCTGTCGCGA GACGCTGCGG     900GAACCGGTGC CGGCGATGGC GCGACCTCCA CTTCCTTGCG AAATTCC ATG TCG CAT       956

                                                Met Ser His

                                                  1ACG AAG GAT CAA CCA CCC TTT GAT AAT GAG AAG AAC CAG AGC ACT GGC      1004Thr Lys Asp Gln Pro Pro Phe Asp Asn Glu Lys Asn Gln Ser Thr Gly

  5                  10                  15TCG GGT TTT AGG GAC GCT CTG CAA AGA GAT CCC CTC GTG GAG GCT CGC      1052Ser Gly Phe Arg Asp Ala Leu Gln Arg Asp Pro Leu Val Glu Ala Arg20                  25                  30                  35TCT GCC GTC CGC AAA ACC TCG TCT TCA GCT CCG GTT CGC CGC CGA ATC      1100Ser Ala Val Arg Lys Thr Ser Ser Ser Ala Pro Val Arg Arg Arg Ile

             40                  45                  50AGC CGT GCG TGT GAC CAG TGT AAC CAA CTC CGA ACG AAA TGC GAC GGG      1148Ser Arg Ala Cys Asp Gln Cys Asn Gln Leu Arg Thr Lys Cys Asp Gly

         55                  60                  65CAG CAT CCG TGC GCT CAT TGC ATT  G GTAGGCTTCC GCTCTTTCTC             1193Gln His Pro Cys Ala His Cys Ile

     70                  75CGATGCCGGC GATGAGGCGG ACGCTTGACT GACCTGTTCT TAG  AA TTC GGA CTG      1248

                                            Glu Phe Gly LeuACC TGC GAG TAT GCG CGA GAA CGC AAG AAG CGT GGA AAA GCG TCG AAG      1296Thr Cys Glu Tyr Ala Arg Glu Arg Lys Lys Arg Gly Lys Ala Ser Lys80                  85                  90                  95AAG GAT CTG GCG GCG GCA GCT GCG GCG GCT ACC CAA GGG TGG AAT GGT      1344Lys Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gln Gly Ser Asn Gly

            100                 105                 110CAT TCC GGG CAG GCC AAC GCG TCG CTA ATG GGC GAG CGA ACG TCG GAA      1392His Ser Gly Gln Ala Asn Ala Ser Leu Met Gly Glu Arg Thr Ser Glu

        115                 120                 125GAC AGC CGG CCA GGA CAA GAC GTG AAC GGC ACA TAC GAC TCG GCT TTT      1440Asp Ser Arg Pro Gly Gln Asp Val Asn Gly Thr Tyr Asp Ser Ala Phe

    130                 135                 140GAG AGC CAC CAT CTT AGC TCG CAG CCA TCG CAT ATG CAG CAT GCA AGC      1488Glu Ser His His Leu Ser Ser Gln Pro Ser His Met Gln His Ala Ser

145                 150                 155ACT GCA GGG ATA TCC GGC CTG CAC GAG TCT CAG ACG GCA CCG TCG CAT      1536Thr Ala Gly Ile Ser Gly Leu His Glu Ser Gln Thr Ala Pro Ser His160                 165                 170                 175TCG CAA TCA TCG CTA GGA ACG ACT ATC GAT GCG ATG CAT TTG AAT CAT      1584Ser Gln Ser Ser Leu Gly Thr Thr Ile Asp Ala Met His Leu Asn His

            180                 185                 190TTC AAC ACG ATG AAC GAT TCC GCT CGC CCG GCA ATG TCC ATA TCC GAT      1632Phe Asn Thr Met Asn Asp Ser Gly Arg Pro Ala Met Ser Ile Ser Asp

        195                 200                 205CTG CGT TCG CTA CCC CCG TCC GTC TTA CCA CCG CAA GGA CTA AGC TCC      1680Leu Arg Ser Leu Pro Pro Ser Val Leu Pro Pro Gln Gly Leu Ser Ser

    210                 215                 220GGG TAC AAC GCG AGC GCC TTC GCT TTG GTG AAC CCG CAA GAG CCG GGC      1728Gly Tyr Asn Ala Ser Ala Phe Ala Leu Val Asn Pro Gln Glu Pro Gly

225                 230                 235TCA CCA GCT AAC CAG TTT CGC TTG GGA AGC TCA GCG GAA AAC CCA ACC      1776Ser Pro Ala Asn Gln Phe Arg Leu Gly Ser Ser Ala Glu Asn Pro Thr240                 245                 250                 255GCA CCG TTT CTT GGT CTC TCG CCT CCA GGA CAG TCG CCT GGA TGG CTC      1824Ala Pro Phe Leu Gly Leu Ser Pro Pro Gly Gln Ser Pro Gly Trp Leu

            260                 265                 270CCT CTT CCC TCG CCA TCT CCT GCC AAC TTT CCT TCT TTC AGC TTG CAT      1872Pro Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ala Asn Phe Pro Ser Phe Ser Leu His

        275                 280                 285CCG TTT TCC AGC ACT TTA CGA TAC CCT GTT TTG CAG CCG GTC CTG CCT      1920Pro Phe Ser Ser Thr Leu Arg Tyr Pro Val Leu Gln Pro Val Leu Pro

    290                 295                 300CAC ATC GCC TCC ATT ATT CCG CAG TCG CTA GCG TGT GAC CTT CTG GAT      1968His Ile Ala Ser Ile Ile Pro Gln Ser Leu Ala Cys Asp Leu Leu Asp

305                 310                 315GTT TAC TTC ACT AGT TCC TCT TCG TCC CAC CTG TCT CCC TTG TCC CCA      2016Val Tyr Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Ser Pro Leu Ser Pro320                 325                 330                 335TAC GTG GTG GGC TAC ATC TTC CGC AAG CAG TCT TTC CTT CAC CCG ACA      2064Tyr Val Val Gly Tyr Ile Phe Arg Lys Gln Ser Phe Leu His Pro Thr

            340                 345                 350AAA CCC CGA ATA TGC AGC CCC GGT CTC CTG GCG AGT ATG CTC TGG GTA      2112Lys Pro Arg Ile Cys Ser Pro Gly Leu Leu Ala Ser Met Leu Trp Val

        355                 360                 365GCC GCA CAA ACG AGT GAA GCT GCG TTT CTG ACA TCG CCG CCC TCG GCT      2160Ala Ala Gln Thr Ser Glu Ala Ala Phe Leu Thr Ser Pro Pro Ser Ala

    370                 375                 380CGG GGG CGT GTA TGC CAG AAA CTG CTA GAA CTG ACC ATT GGT TTG CTC      2208Arg Gly Arg Val Cys Gln Lys Leu Leu Glu Leu Thr Ile Gly Leu Leu

385                 390                 395CGA CCG TTG GTC CAT GGT CCT GCT ACC GGA GAA GCG TCG CCC AAC TAT      2256Arg Pro Leu Val His Gly Pro Ala Thr Gly Glu Ala Ser Pro Asn Tyr400                 405                 410                 415GCG GCG AAT ATG GTC ATC AAT GGC GTC GCT CTG GGC GGA TTT GGG GTC      2304Ala Ala Asn Met Val Ile Asn Gly Val Ala Leu Gly Gly Phe Gly Val

            420                 425                 430TCC ATG GAT CAG CTG GGC GCG CAA AGT AGC GCC ACC GGC GCC GTG GAT      2352Ser Met Asp Gln Leu Gly Ala Gln Ser Ser Ala Thr Gly Ala Val Asp

        435                 440                 445GAT GTA GCA ACT TAT GTG CAT CTT GCG ACA GTA GTA TCC GCC AGC GAG      2400Asp Val Ala Thr Tyr Val Hls Leu Ala Thr Val Val Ser Ala Ser Glu

    450                 455                 460TAC AAG GCG GCC AGC ATG CGC TGG TGG ACT GCG GCC TGG TCT CTA GCG      2448Tyr Lys Ala Ala Ser Met Arg Trp Trp Thr Ala Ala Trp Ser Leu Ala

465                 470                 475CGT GAG CTG AAG CTA GGC CGT GAG CTG CCA CCC AAT GTT TCC CAC GCA      2496Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Glu Leu Pro Pro Asn Val Ser His Ala480                 485                 490                 495CGG CAA GAT GGA GAG CGA GAT GGG GAT GGC GAG GCG GAC AAA CGA CAT      2544Arg Gln Asp Gly Glu Arg Asp Gly Asp Gly Glu Ala Asp Lys Arg His

            500                 505                 510CCT CCG ACC CTC ATC ACG TCA CTG GGT CAT GGA TCG GGA AGC TCC GGC      2592Pro Pro Thr Leu Ile Thr Ser Leu Gly His Gly Ser Gly Ser Ser Gly

        515                 520                 525ATT AAT GTC ACC GAA GAG GAG CGT GAG GAG CGT CGA CGC CTA TGG TGG      2640Ile Asn Val Thr Glu Glu Glu Arg Glu Glu Arg Arg Arg Leu Trp Trp

    530                 535                 540GTC TTA TAT GCG ACC GAT CGG CAC CTG GCG CTG TGC TAG AAC CGG CCC      2688Leu Leu Tyr Ala Thr Asp Arg His Leu Ala Leu Cys Tyr Asn Arg Pro

545                 550                 555CrC ACG CTG CTG GAC AAG GAA TGT GCC GGG CTG CTG CAG CCG ATG AAC      2736Leu Thr Leu Leu Asp Lys Glu Cys Gly Gly Leu Leu Gln Pro Met Asn560                 565                 570                 575GAT GAT CTG TGG CAG GTC GGC GAG TTT GCA GCG GCT GCC TAG CGC GAG      2784Asp Asp Leu Trp Gln Val G1y Asp Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Arg Gln

            580                 585                 590GTC GGA CCG CCC GTC GAG TGT ACG GGT CAC AGC ATG TAT GGA TAC TTT      2832Val Gly Pro Pro Val Glu Cys Thr Gly His Ser Met Tyr Gly Tyr Phe

        595                 600                 605CTA CCG CTG ATG ACG ATT CTT GGA GGG ATC GTC GAT CTG CAC CAC GCT      2880Leu Pro Leu Met Thr Ile Leu Gly Gly Ile Val Asp Leu His His Ala

    610                 615                 620GAG AAT CAT CCG CGC TTT GGC CTG GCG TTC CGC AAT AGC CCG GAG TGG      2928Glu Asn His Pro Arg Phe Gly Leu Ala Phe Arg Asn Ser Pro Glu Trp

625                 630                 635GAG CGT CAG GTA CTG GAC GTT ACG CGG CAG CTG GAC ACA TAT GGG CGC      2976Glu Arg Gln Val Leu Asp Val Thr Arg Gln Leu Asp Thr Tyr Gly Arg640                 645                 650                 655AGC TTG AAG GAA TTC GAG GCC CGC TAC ACC AGC AAC TTG ACT CTG GGG      3024Ser Leu Lys Glu Phe Glu Ala Arg Tyr Thr Ser Asn Leu Thr Leu Gly

            660                 665                 670GCT ACG GAT AAC GAG CCT GTC GTC GAA GGT GCC CAC TTG GAT CAC ACG      3072Ala Thr Asp Asn Glu Pro Val Val Glu Gly Ala His Leu Asp His Thr

        675                 680                 685AGT CCT TCG GGG CGC TCC AGC AGC ACC GTG GGA TCG CGG GTG AGC GAG      3120Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ser Ser Thr Val Gly Ser Arg Val Ser Glu

    690                 695                 700TCC ATC GTC CAC ACG AGG ATG GTG GTC GCC TAC GGG ACG CAT ATC ATG      3168Ser Ile Val His Thr Arg Met Val Val Ala Tyr Gly Thr His Ile Met

705                 710                 715CAC GTC CTG CAT ATT TTG GTC GCG GGA AAA TGG GAG CCG GTG AAT CTG      3216His Val Leu His Ile Leu Leu Ala Gly Lys Trp Asp Pro Val Asn Leu720                 725                 730                 735TTG GAA GAT CAT GAT CTG TGG ATC TCC TCG GAG TCG TTT GTC TCG GCC      3264Leu Glu Asp His Asp Leu Trp Ile Ser Ser Glu Ser Phe Val Ser Ala

            740                 745                 750ATG AGC CAT GCG GTC GGT GCC GCA GAA GCA GCG GCA GAA ATC TTG GAG      3312Met Ser His Ala Val Gly Ala Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ile Leu Glu

        755                 760                 765TAC GAC CCG GAT CTC AGC TTC ATG CCG TTC TTC TTC GGG ATT TAC CTA      3360Tyr Asp Pro Asp Leu Ser Phe Met Pro Phe Phe Phe Gly Ile Tyr Leu

    770                 775                 780CTA CAG GGC AGT TTC TTG CTG CTA CTG GCG GCG GAC AAG TTG CAG GGC      3408Leu Gln Gly Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ala Asp Lys Leu Gln Gly

785                 790                 795GAT GCC AGT CCC AGT GTC GTG CGG GCA TGC GAG ACG ATC GTG CGG GCG      3456Asp Ala Ser Pro Ser Val Val Arg Ala Cys Glu Thr Ile Val Arg Ala800                 805                 810                 815CAT GAA GCG TGC GTC GTG ACC TTG AAC ACG GAG TAC CAG GTAGGTTTTC       3505His Glu Ala Cys Val Val Thr Leu Asn Thr Glu Tyr Gln

            820                 825TTGTTTCTCT CCCTAGCTTG GCAATAGTAG CTAACACAAT GTAG AGG ACA TTC CGC     3561

                                             Arg Thr Phe Arg

                                                 830AAG GTC ATG CGA TCG GCG CTG GCA CAG GTT CGA GGA CGC ATC CCA GAG      3609Lys Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Gln Val Arg Gly Arg Ile Pro Glu

    835                 840                 845GAC TTT GGG GAG CAG CAG CAG CGC CGA CGC GAA GTG CTT GCG CTA TAC      3657Asp Phe Gly Glu Gln Gln Gln Arg Arg Arg Glu Val Leu Ala Leu Tyr

850                 855                 860CGC TGG AGC GGC GAT GGC AGT GGG CTG GCA CTG TAGTTTTGCA GTAACACGGC    3710Arg Trp Ser Gly Asp Gly Ser Gly Leu Ala Leu865                 870                 875TGATGATGAG ATGCGATTTA TGGCGGTGCA TTGACCGGTC AATGGCTTCT TACATTCTGA    3770TTTGATACTA CTTTTGGATT CGCTATTTCA CTCCGGGCTT ATGCTGGCTT CATTGTCAAG    3830AGGGGTGGCA TGGCGAATGG AAATATGCTT ACTTCGTGTT GATACGGATT CGTACATATA    3890CTTTGGTGAT ATATGTGGAT ATTTGTGGCA TGTACACTAT GCGTGATCTT TGGACATGAT    3950ACTTTGATAC CAGGTCAATC TAATTGCGTT CTTTTCATTT GTTGCGCAAC AGCCGAGGTA    4010TGACGCCATG GCTGAGATAA GCTGCCGATA AGCATTCGCA TTCCATCCTC CATCGAAGCA    4070CCAAAATCTT CTTCATATAA CCAATCCATC AATTCAACAT TCGTAATGAC AATAGTATAA    4130TCCCCAAAAT GCCCTCCCTA TTACACTCCC TCCGCACTTC CCC                      4173

Claims (16)

1.一种核苷酸序列或者这种核苷酸序列的一部分，所说的核苷酸序列编码具有β-木糖苷酶活性并在一级结构上与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列显示出至少30％的氨基酸等同性的肽，或者在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交，所说的核苷酸序列的一部分具有编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的至少15个核苷酸。

2.按照权利要求1的核苷酸序列，其中所说的蛋白质与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列显示出至少40％，优选至少60％的氨基酸等同性。

3.按照前述任一项权利要求的核苷酸序列，这种核苷酸序列包含至少一个位于SEQ ID NO.1序列1-854之内的调节序列。

4.一种分离的肽，这种肽具有β-木糖苷酶活性并且基本上不具有β-葡萄糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性，并由权利要求1-3之任一项的核苷酸序列编码。

5.一种肽，这种肽包含一系列SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的至少8个邻接的氨基酸。

6.生产实质上具有β-木糖苷酶活性的肽的方法，这种方法包括以公知的翻译核苷酸序列的方法翻译按照权利要求1-3之任一项的核苷酸序列。

7.包含按照权利要求1-3之任一项的核苷酸序列的表达载体。

8.重组宿主细胞，这种宿主细胞除了包含其基因组核酸外，还包含权利要求1-3之任一项的核苷酸序列。

9.具有β-木糖苷酶基因的重组宿主细胞，其中所说的β-木糖苷酶基因已由权利要求1-3之任一项的核苷酸序列中的突变所破坏。

10.按照权利要求8或9的宿主细胞，这种宿主细胞能够表达淀粉酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、氧化还原酶、α-葡糖苷酸酶、脂酶、酯酶、阿魏酸酯酶或蛋白酶和/或木聚糖裂解调节物xylR。

11.按照权利要求8-10之任一项的宿主细胞，这种宿主细胞是食品级的。

12.按照权利要求11的宿主细胞，这种细胞选自曲霉属(特别是物种塔宾曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、日本曲霉、臭曲霉、炭黑曲霉或构巢曲霉)、木霉属和镰孢属。

13.权利要求8-11之任一项的宿主细胞的用途，该用途是用于经公知的从宿主细胞产生酶的方法生产木聚糖裂解酶制剂，特别是包含内切木聚糖酶的制剂，这种制剂基本上不具有β-木糖苷酶活性。

14.权利要求4或5的肽或者按照权利要求6的方法获得的肽的用途，该用途是用于以公知的方法生产木糖，包括向含有木糖前体的培养基中加入所说的肽。

15.权利要求4或5的肽或者按照权利要求6的方法获得的肽的用途，该用途是以有关面包改进酶的公知的方式用作面包改进剂。

16.可由权利要求13的用途获得的酶制剂，该酶制剂基本上含有所有木聚糖裂解活性，包括内切木聚糖酶活性、阿拉伯呋喃糖苷酶活性，但缺乏α-木糖苷酶活性。

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