CN1184507A - 来自曲霉的内切β－1,4－葡聚糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡聚糖酶。另外公开了编码这种酶的核苷酸序列和控制这种酶表达的启动子。

Description

来自曲霉的内切β-1，4-葡聚糖酶

本发明涉及一种酶，另外，本发明涉及编码这种酶的核苷酸序列。本发明也涉及一启动子，该启动子被用来控制编码所述酶的所述核苷酸序列的表达。

具体地说，本发明所述的酶是一种葡聚糖酶-即一种能降解β-1，4-糖苷键的酶。

已知希望在生物体-如丝状真菌(如黑色曲霉(Aspergillus Niger))或者甚至一种农作物的一些组织中指导所感兴趣的基因(“GOI”)的表达。产物蛋白质或者酶对于生物体本身可以是有用的。例如，可能希望产生有优化的氨基酸组成的作物蛋白产物，以提高作用的营养价值。例如，这种作物可以制成更有用的饲料。或者，可能希望分离产物蛋白质或酶，然后使用这种蛋白质或酶来制备，例如，食品组合物。从这一点来看，该产物蛋白质或酶可以食品组合物的一个成分，或者它可以被用来制备食品组合物，包括改变食品组合物的性质或外观。

甚至可能希望使用生物体，如一种丝状真菌或者一种农作物，为了相同的目的来表达非植物基因。

也可能希望使用一种生物体如一种丝状真菌或一种农作物，来表达哺乳动物基因。后者产物的例子包括干扰素、胰岛素、血因子和血纤蛋白溶酶原激活物。

也希望使用微生物，如丝状真菌，通过使用在该微生物中有活性的启动子，由GOI制备产品。

水果和蔬菜细胞壁大多由多糖组成，主要成分是果胶、纤维素和木糖葡聚糖(R.R.Selvendran和J.A.Rogbertson，IFR报告(IFRReport)，1989)。已经提出过多种细胞壁模型，努力加入强度和柔性基本性质(P.Albersheim，美国科学(Sci.Am.)，232，81-95，1975，P.Albersheim，植物生物化学(Plant Biochem.)第三版(Bonner和Varner)，Ac.Pross，1976；T.Hayashi植物生理及植物分子生物学年度综述(Ann.Rev.Plant Physiol & Plant Mol Biol，40，139-168，1989)。

植物细胞壁的组成复杂而多样。发现多糖主要以长链纤维素(植物细胞壁的主要结构成分)，半纤维素(含有多种β-木聚糖链，例如木葡聚糖(xyloglucans))和果胶物质(由半乳糖醛聚糖(galacturonan)和鼠李糖半乳糖醛聚糖(thamnogalacturonan)；阿拉伯聚糖和半乳聚糖及阿拉伯半乳聚糖组成)的形式。

具体地说葡聚糖专一性地由葡萄糖亚基组成。葡聚糖典型的例子是淀粉和纤维素。

降解葡聚糖的酶总称为葡聚糖酶。一种典型的葡聚糖是β-1，4-内切葡聚糖酶。

β-1，4-内切葡聚糖已经应用于多种工业。例如酿酒业，在近些年，作为酿酒过程中的副产物，大麦用于生产啤酒。当啤酒质地不好，或者大麦作为副产物被使用时，因为来自大麦的β-葡聚糖而产生麦芽汁中高粘度问题。就这一点来说，大麦含有大量非常高分子量的混合的β-1，3/1，4-葡聚糖。溶解时这些葡聚糖产生高粘度溶液，这在一些应用中带来麻烦。例如，高粘度降低了麦芽汁的可过滤性，并带来不可接受的长过滤时间。为避免这些问题，传统上向麦芽汁中加入β-葡聚糖酶来避免这些问题-即葡聚糖带来的问题可以通过加入酶，特别是葡聚糖酶(其降解该聚合物)而避免。

有关这些问题的其它信息可以参见C.W.Bamforth博士写的综述，Grindsted手册，名为《葡聚糖酶GV》(“Glucanase GV”)(BrewersDigest，1982年6月，pp.22-28；和Brewers’Guardian，1985年9月，pp.21-26)，和T.Godfrey的文章(《工业酶学-酶在工业上的应用》(Industrial Enzymology The Application of Enzymes)，第4.5章，pp.221-259)。

在食品工业中，由于大麦价廉而被用来制造鸡饲料，但还是β-葡聚糖带来鸡消化不食问题。通过向食物中加入β-葡聚糖酶可以提高食物的可消化性。而且喂食含大麦食品的鸡的排泄物有粘性，使其不易去除而使产蛋肮脏。

WO 93/2019讨论了内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC no.3.2.1.4)。根据WO 93/2019，这些萄聚糖酶是一组水解酶，其催化纤维素，地衣淀粉，谷物β-D-葡聚糖和其它含纤维素部分的植物材料中1，4-β-D-糖苷键的内切水解。内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖基水解酶有时称作内切-β-1，4-葡聚糖酶。

WO 93/2019中的内切-β-1，4-葡聚糖酶具有最适pH为2.0至4.0，等电点是2.0至3.5，分子量在30,000和50,000之间，最适温度在30和70℃之间。

有关葡聚糖，特别是木糖基葡聚糖(xyloglucan)的进一步教诲可以参见WO 93/17101。根据WO 93/17101，木糖基葡聚糖是被α-1，6-木糖基侧链广泛取代的，其中一些是1，2-β-半乳糖基化的。其大量发现于双子叶的初生细胞壁中，但在一些种子中也有发现，它们在其中起各种各样的作用。初生细胞壁木糖基葡聚糖是岩藻糖基化物的。木糖基葡聚糖紧密地氢键键合于纤维素微纤维，需要浓碱或强的溶胀剂才能释放它。据认为木糖基葡聚糖在纤维素微纤维之间形成交联桥，这种纤维素/木糖基葡聚糖网络形成该细胞壁主要的负载/弹性网络。DCB突变悬浮培养细胞(细胞壁缺乏纤维素)将木糖基葡聚糖释放到它们的培养基中，说明木糖基葡聚糖一般当然与纤维素键联。

在IAA诱导生长中，初生细胞壁的水解已在压片胚轴无光生长的区段中得已证实(K.Waka bayashi等，植物生理学(Plant Physiol.，95，1070-1076，1991)。据认为壁木糖基葡聚糖内切水解与伴随细胞膨胀的壁松散有关(T.Hyashi，植物生理学和植物分子生物学年度综述(Ann.Rev.Plant Physiol&Plant Mol.Biol.)，40，139-168，1989)。木糖基葡聚糖的平均分子量也呈示出在蕃茄果实成熟过程中降低，而且这可能与伴随成熟过程中组织变软有关(D.J.Huber，J.Amer.Soc.Hort Sci.，108(3)，405-409，1983)。一些种子，例如Masturtium，含有最多30％重量的木糖基葡聚糖，储存在加厚的子叶细胞壁中，其作用是储存多糖，并在发芽期间快速解聚。

提高葡聚糖酶活性，例如优选使用重组DNA技术获得用于食物的有高浓度葡聚糖酶的植物，这一点是有用的。

本发明试图提供一种具有葡聚糖酶活性的酶；优选其中这种酶能例如仅在一种生物体，一般为一丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉的一些或特定细胞或组织中制得，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中制得。

本发明也试图提供一种编码这种酶的GOI，这种GOI能优选在一种生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，特定细胞或组织中表达，或者甚至是一种植物的一些或特定细胞或组织中表达。

此外，本发明试图提供一种能指导GOI表达的启动子，例如优选在某些特定细胞或组织，例如仅在一种生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中编码本发明酶的核苷酸序列。优选在曲霉属中使用这种启动子，其中由GOI编码的产物从宿主生物体分泌到周围基质中。

而且，本发明试图提供包含GOI和/或启动子的构建，载体，质粒，细胞，组织，器官和生物体，以及优选在特定细胞或组织中的表达方法，例如仅在一种生物体，一般是丝状真菌，优选在曲霉属，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中表达。

根据本发明的第一方面，提供一种从曲霉属得到的酶，其中该酶具有如下特征：MW是24235D±50D；pI值大约为4；葡聚糖酶活性；其中该葡聚糖酶活性是内切β-1，4-葡聚糖酶活性。

根据本发明的第二方面，提供具有如SEQ ID NO：1所示序列的酶，或者其变体，同系物或片段。

根据本发明的第三方面，提供由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列编码的酶。

根据本发明的第四方面，提供编码本发明所述酶的核苷酸序列。

根据本发明的第五方面，提供具有SEQ ID NO：2所示的序列的核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。

根据本发明的第六方面，提供具有SEQ ID NO：3所示序列的启动子，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。

根据本发明的第七方面，提供具有SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的终止子，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。

根据本发明的第八方面，提供具有SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的信号序列，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。

根据本发明的第九方面，提供通过使用一种启动子表达GOI的方法，其中所述启动子是本发明启动子。

根据本发明的第十方面，提供本发明酶降解葡聚糖的应用。

根据本发明的第十一方面，提供用于表达能降解阿拉伯糖基木聚糖的酶，或者用于控制其表达，或用于控制另一GOI表达的质粒NCIMB40703，或从中获得的核苷酸序列。

根据本发明的第十二方面，提供具有SEQ ID NO：15所示序列的信号序列，或其变体，同系物或片段。

根据本发明的第十三方面，是提供具有降解β-1，4-葡糖苷键能力的葡聚糖酶，其具有与抗具有SEQ ID NO：1所示序列的纯化的葡聚糖酶的抗体的免疫反应性。

根据本发明的第十四方面，提供一种可由葡萄糖诱导的启动子。

根据本发明的第十五方面，是提供葡萄糖诱导启动子的应用。

本发明的其它方面包括由本发明前述方面构成的构建物，载体，质粒，细胞，组织，器官和转基因生物体。

本发明的其它方面包括表达或使表达或转化任一核苷酸序列，构建物，质粒，载体，细胞，组织，器官或生物体，以及其产物的方法。

本发明的另外方面包括使用所述启动子在培养基如肉汤或者在转基因生物体中表达GOI。

本发明的再一方面包括用所述酶制备或处理食物，包括动物饲料。

在下文中，本发明酶有时称作Egla酶，其编码序列有时称作Egla基因。另外，本发明启动子有时称作Egla启动子。

优选所述酶由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或者与其互补的序列编码。

优选所述核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示序列，或是其变体，同系物或其片段。

优选所述核苷酸序列与启动子操作连接。

优选所述启动子是具有SEQ ID NO：3所示序列，或是其变体，同系物或片段，或者是与其互补的序列的启动子。

优选本发明启动子与GOI操作连接。

优选所述GOI包含本发明核苷酸序列。

在一个优选的实施方案中，转基因生物体是一种真菌，例如所述生物体可以是一种酵母，其可能用于例如造酒工业。

优选的转基因生物体是丝状真菌，更优选曲霉属。

在另一个优选的实施方案中，转基因生物体是一种植物。

在另一个优选的实施方案中，转基因生物体是一种酵母，从这点上来说，酵母已经被广泛用作异源基因表达的载体。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)有很长历史的工业应用，包括用于异源基因表达。啤酒糖酵母中异源基因的表达参见Goodey等(1987，酵母生物技术(Yeast Biotechnology)，D R Berry等编著，pp.401-429，Allen和Unwin，伦敦)和King等(1989，酵母的分子和细胞生物学(Molecular and Cell Biology of Yeasts)，E F Walton和G T Yarronton编著，pp.107-133，Blackic，Glasgow)。

啤酒糖酵母很适合异源基因表达有几个原因。首先，其对人是非病原性的，不能产生某些内毒素。其次，其有安全使用的长久历史，几个世纪以来用于多种目的的商业应用。这使得广泛被公众接受。第三，大量商业应用和研究使已有很多有关基因和生理学以及啤酒糖酵母大量发酵性质的认识。

另一个优点是酵母能翻译后修饰蛋白质，从而具有将异源基因产物糖基化和/或分泌到生长基质中的能力。异源基因在啤酒糖酵母中表达和基因产物分泌的原理的综合性文章参见E.Hinchcliffe.E Kenny(1993，“酵母作为异源基因表达的载体”(Yeast as a vehicle forthe expression of heterologous genes)，《酵母》(Yeasts)，Vol.5，Anthony H.Rose和J Stuart Harrison，编著，第二版，科学出版社)。

已经在酵母中表达的酶的糖基化作用提高酶的热稳定性。根据本发明葡聚糖酶的提高的热稳定性使这种酶适于用于酿酒工业和用于动物食品如鸡饲料的制造中。

已经酵母分泌很少几种蛋白质在培养基中，这使酵母成为异源基因表达的富有吸引力的宿主，因为分泌的基因产物可容易地回收和纯化。

可以得到几种类型酵母载体，包括整合型载体，其需要与宿主基因组重组以维持，和自主复制质粒载体。

为了制备转基因糖酵母，通过将一种GOI(例如淀粉酶或SEQ IDNO：2)插入到为在酵母中表达而设计的构建物中而制备表达构建物，已经研究出用于异源表达的几种类型构建物。这些构建物包含与GOI融合的在酵母中有活性的启动子，通常使用酵母源启动子，如GAL1启动子。GOI可以与一个信号序列融合，该信号序列指导GOI编码的蛋白质的分泌。通常使用酵母源的信号序列，例如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的终止子终止表达体系。

已经报道过几种异源基因在酵母中表达。这些基因产物可以被糖基化，这对于要用于期望热耐受性的具体应用中的一些酶是有好处的。如果GOI没有与信号序列融合，则蛋白质可以胞内储存，或者如果GOI与信号序列融合，则蛋白质可以胞外分泌。

已经研究出转化酵母的几种转化方案。

例如，根据本发明的转基因糖酵母可以根据Hinnen等(1978，美国国家科学院科研论文集，75，1929)，Beggs，JD(1978，《自然》，伦敦，275，104)；和Ito，H等(1983，《细菌学》(J.Bacteriology)153，163-168)的教导而制备。

转化的酵母细胞用各种选择标记物来选择。用于转化作用的标记物是一些营养缺陷型标记，例如LEU2，HIS4和TRP1，和显性抗生素抗性标记，如氨基糖苷抗生素标记，例如G418。

本发明各方面高度优选的实施方案不包括任何一种天然环境中的天然酶，天然启动子，或天然核苷酸序列。

优选的是任何一种质粒，载体，如表达载体或转化载体，细胞，组织，器官，生物体或转基因生物体中，启动子与至少一种GOI结合存在。

优选所述启动子和GOI被稳定地插入到转基因生物体的基因组中。

优选转基因生物体是丝状真菌，优选曲霉属，更优选是黑色曲霉。或者转基因生物可以是酵母。转基因生物体甚至可以是一种植物，如单子叶或双子叶植物。

最为优选的实施方案是一种自曲霉得到的酶，其中该酶具有下述特征，MW为24235D±50D；pI值大约为4；葡聚糖酶活性，其中葡聚糖酶活性是内切β-1，4-葡聚糖酶活性；其中所述酶具有SEQ IDNO：1所示序列，或是其变体，同系物或片段。

另一最为优选的实施方案是自曲霉得到的一种酶，其中该酶具有如下特征：Mw为24235D±50D；pI值大约为4；葡聚糖酶活性；其中葡聚糖酶活性是内切β-1，4-葡聚糖酶活性；其中所述酶由SEQ IDNO：2所示核苷酸序列或其变体，同系物或片段编码，或由与其互补的序列编码。

本发明的优点在于，它提供了一种制备葡聚糖酶的方法，以及编码这种酶的核苷酸序列。另外，本发明提供了能控制那个或另外的核苷酸序列表达的启动子。

本发明的其它优点是这种酶能用来制备含谷物，如大麦、玉米、稻的有用的饲料。

因此，本发明提供一种具有葡聚糖酶活性的酶，其中该酶可以在一些或特定细胞或组织中制得，例如只在生物体，一般为丝状真菌，优选曲霉属，例如黑色曲霉的特定细胞或组织中制备，该酶甚至可以在一种植物中制备。

本发明也提供编码所述酶的GOI，该GOI可以优选在特定细胞或组织中表达，如在生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉的某些或特定细胞或组织中表达。该GOI甚至可以在一种植物中表达。

另外，本发明提供一种能指导GOI表达的启动子，如编码本发明酶的核苷酸序列，优选在某些特定细胞或组织中表达，例如只在生物体，一般为丝状真菌，优选曲霉属，例如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中表达，优选在曲霉中使用所述启动子，其中GOI编码的产物从宿主生物体分泌到周围基质中。甚至可以裁制启动子(如果需要的话)以在植物中表达GOI。

本发明也提供了包含所述GOI和/或启动子的构建物，载体，质粒，细胞，组织，器官和生物体，表达GOI的方法，优选在特定细胞或组织中表达，例如，只在生物体一般为丝状真菌，优选在曲霉属中，或者甚至是植物的特定细胞或组织中表达。

与酶有关系的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或条件是所得氨基酸序列具有葡聚糖降解活性，优选至少具有序列表(SEQ.I.D.No.1或12)所示酶的相同活性，具体地说，术语“同系物”包括有关结构和/或功能的同源性，条件是所得酶具有葡聚糖降解活性。关于序列同源性，优选与序列表所示SEQ.I.D.No.1至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更为优选的是与序列表中所示SEQI.D.No.1至少95％，更优选至少98％同源性。

与编码所述酶的核苷酸序列有关系的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)核酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列编码具有葡聚糖降解活性的酶，优选至少具有序列表(SEQ.I.D.No.2或12)所示酶的相同活性，具体地讲，术语“同系物”包括关于结构和/或功能的同源性，条件是所得核苷酸序列编码具有葡聚糖降解活性的酶。有关序列的同源性，优选与序列表中所示的SEQ.I.D.No.2至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更为优选的是与序列表中所示SEQ.I.D.No.2至少95％更优选至少98％同源性。

与启动子相关的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)核酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列在表达系统-例如根据本发明转化的细胞或者转基因生物体中具有作为启动子而起作用的能力。具体地讲，术语“同系物”包括与结构和/或功能有关的同源性，条件是所得核苷酸序列具有作为启动子而起作用的能力。关于序列同源性，优选与序列表所示SEQ.I.D.No.3至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更为优选的是与序列表所示SEQ.I.D.No.3至少95％，更优选至少98％同源性。

与终止子或信号核苷酸序列有关的术语“变体”，“同系物”或“片段”包括一个(或几个)核酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列在表达系统-例如根据本发明转化的细胞或转基因生物体中分别具有作为终止子而起作用或者编码具有作为信号序列而起作用的能力的氨基酸序列的能力。具体地说，术语“同系物”包括有关结构和/或功能的同源性，条件是所得核苷酸序列具有各作为或编码终止子或信号序列的能力。关于序列同源性，优选与序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分别地)至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更优选的是与序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分别地)至少95％，更优选至少98％同源性。

与信号氨基酸序列有关的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)氨基酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得序列在表达系统-例如根据本发明的转化细胞或者转基因生物体中具有作为信号序列而起作用的能力。具体地说，术语“同系物”包括有关结构和/或功能的同源性，条件是所得核苷酸序列分别具有作为或编码一个信号的能力。关于序列同源性，优选于序列表所示SEQ.I.D.No.15至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更优选的是与序列表所示SEQ.I.D.No.15至少95％，更优选至少98％同源性。

上述术语是序列等位变异的同义词。

术语“互补”指本发明也包括能分别与编码序列或启动子序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

与本发明有关的术语“核苷酸”包括基因组DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。优选其指DNA，更优选指用于本发明编码序列的cDNA，因为基因组编码序列具有两个内含子，去除之，将使其在细菌中表达成为可能。

术语“构建物”-其与术语如“缀合物”，“弹夹”和“杂种”是同义词-包括与启动子直接或间接相连的GOI。一个间接连接的例子是有一合适的间隔基团，例如一内含子序列，例如ShI内含子或ADH内含子，在启动子和GOI之间起中介作用。对于包括直接或间接连接的与本发明有关的术语“融合”也是一样。在每种情况下最为优选的是这些术语不包括编码酶的基因正常地与野生型基因启动子相联的，且两者都在其自然环境下的情况的天然组合。最为优选的实施方案是与一种或所述启动子操作连接所述或一种GOI。

所述构建物甚至可以包含或表达一标记物，该标记物使选择已被转移到例如丝状真菌，优选曲霉属，例如黑色曲霉，或者植物，优选谷类，例如玉米，稻，大麦等中选择所要的基因构建物成为可能。存在可以使用的多种标记物，例如那些编码甘露糖-6-磷酸异构酶的标记物(尤其是用于植物)或者提供抗生素抗性的那些标记物-例如G418抗性，潮霉素，博来霉素，卡那霉素和庆大霉素抗性。

术语“载体”包括表达载体和转化载体。

术语“表达载体”指能体内或体外表达的构建物。

术语“转化载体”指能从一个物种转移到另一个物种的构建物-例如从大肠杆菌(E.coli)质粒转移到丝状真菌，优选曲霉属。其也可以是能从E.coli质粒转移到土壤杆菌转移到一种植物的构建物。

术语“组织”包括组织本身和器官。

与本发明有关的术语“生物体”包括可能包含本发明启动子和/或编码本发明酶的核苷酸序列和/或从其中得到的产物的任何生物体，其中所述启动子能使表达GOI和/或其中本发明核苷酸序列当在生物体中存在时能被表达。

优选生物体是丝状真菌，优选曲霉属，更优选黑色曲霉。

与本发明有关的术语“转基因生物体”包括包含本发明启动子和/或编码本发明酶的核苷酸序列和/或从其中得到的产物的任何生物体，其中在生物体内所述启动子能使GOI表达和/或其中本发明核苷酸序列在能被表达。优选启动子和/或核苷酸序列被插入到生物体的基因组中。优选的转基因生物是丝状真菌，更优选曲霉属，更优选黑色曲霉。

因此，本发明转基因生物体包括包含有任一本发明启动子，编码本发明酶的核苷酸序列，本发明构建物，本发明载体，本发明质粒，本发明细胞，本发明组织或其产物，或者包含它们的组合的一种生物体。例如，转基因生物体可以包含本发明启动子控制下的GOI，优选外源核苷酸序列。转基因生物体也可以包含启动子控制下的编码本发明酶的核苷酸序列，所述启动子可以是本发明启动子。

在高度优选的实施方案中，转基因生物体不包含本发明启动子和编码本发明酶的核苷酸序列的组合，其中所述启动子和核苷酸序列两者对于该生物体是天然的，且处于它们的天然环境。因此在高度优选的实施方案中，本发明不包括处于其也处于其天然环境下的天然启动子的控制之下时处于其天然环境的根据本发明的天然的核苷酸编码序列。另外，在高度优选的实施方案中，本发明不包括处于其天然环境和由也处于自然环境的、其处于也处于其天然环境下的天然启动子的控制下的天然核苷酸编码序列表达的据本发明的天然的酶。

术语“启动子”是本领域通常的意义，例如-Jacob-Mond基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。

一方面，本发明启动子能表达GOI，其可以是编码本发明酶的核苷酸序列。

另一方面，根据本发明的核苷酸序列处于使核苷酸序列表达的启动子控制之下。从这一点上来说，启动子不一定要是与本发明启动子相同的启动子。从这方面来说，启动子可以是一种细胞或组织特异性启动子。例如，如果生物体是一种植物，则启动子可以是在茎，苗，根和叶组织的一种或几种中影响核苷酸序列表达的启动子。

例如，本发明核苷酸序列的启动子可以是α-Amy 1启动子(另外也称作Amy 1启动子，Amy 637启动子或α-Amy 637启动子)，参见1994年10月21日申请的共同未决的UK专利申请No.9421292.5。所述启动子包含图1所示的序列。

或者本发明核苷酸序列的启动子可以是α-Amy 3启动子(另外也称为Amy 3启动子，Amy 351启动子或α-Amy 351启动子)，参见1994子包含图2所示序列。年10月21日申请的审而未决的UK专利申请No9421286.7。所述启动子包含图2所示序列。

优选启动子是本发明启动子。

除上述核苷酸序列外，启动子，特别是本发明启动子可以另外包括确保或增加在合适宿主中表达的性质。例如所述性质可以是保守区，如Pribnow Box或TATA匣。所述启动子也可以包含影响(例如保持，增强，提高)GOI表达水平的其它序列。例如合适的其它序列包括Sh1-内含子或ADH内含子。其它序列包括可诱导元件-例如温度，化合物，光或应激反应可诱导元件。也可以存在增强转录或翻译的合适的元件。后者元件的一个例子是TMV 5′信号序列，参见Sleat基因217[1987]，217-225；和Dawson植物分子生物学(Dawson Plant Mol，Biol)23[1993]97)。

另外，本发明也涉及启动子和/或编码蛋白质或酶的核苷酸序列和/或元件的组合。例如，本发明涉及与可能是根据本发明的一个核苷酸序列的GOI操作连接的根据本发明的启动子的组合，和另外一个启动子，如与相同或不同GOI操作连接的一种组织特异性启动子的组合。

本发明也涉及用启动子来表达编码根据本发明酶的核苷酸序列用途，其中启动子的一部分是失活的，但其中该启动子仍能起启动子的作用。启动子的部分失活在某些情况下是有好处的。

具体地说，对于早些时候提到的Amy 351启动子，能够失活启动子的一部分，从而部分失活的启动子以更专一的方式如只在一种特定组织类型或器官中表达GOI。

术语“失活的”指部分失活，意义在于启动子的表达模式被修饰，但其中部分失活的启动子仍起启动子作用。但是，如上所述，修饰过的启动子能在至少一种(但不是全部)原启动子的特定组织中表达GOI。一种这样的启动子是如上所述的Amy 351启动子。

部分失活的例子包括改变启动子序列的折叠模式，或者改变其与核苷酸序列部分组合，这样，核苷酸序列的一部分不被例如RNA聚合酶识别。另一优选的部分失活启动子的方法是将其截短成其片段。另一种方法是使该序列的至少一部分突变，从而RNA聚合酶不能组合这一部分或另一部分。

另一种修饰作用是突变调节蛋白质的结合位点，例如已知来自丝状真菌的施加碳分解产物的阻遏作用CreA蛋白质，从而解除天然启动子的分解代谢产物的阻遏作用。

术语“GOI”参照本发明是指所感兴趣的任何基因。GOI可以是对于所研究生物体(例如丝状真菌，优选曲霉属，或一种植物)是外来的或本身的任何核苷酸。GOI典型的例子包括修饰代谢和分解代谢过程中的蛋白质和酶的编码基因。GOI可以编码引入或提高病原抗性的一种试剂。GOI还可以是修饰相关组织中存在的天然转录本的表达的反义构建物。GOI还可以编码丝状真菌，优选曲霉属的非天然蛋白质，或者编码对动物或人有好处的一种化合物。

例如，GOI可以编码药学活性蛋白质或酶，例如，治疗化合物胰岛素，干扰素，人血清白蛋白，人生长因子和凝血因子之任何一种。从这点上来说，转化的细胞或生物体可以制备可接受量的所期化合物，而这种化合物容易自该细胞或生物体得到。GOI也可以是给予一种食品或作物营养价值的一种蛋白质。典型的例子包括能抑制抗营养因子生成的植物蛋白和具有更加期望的氨基酸组成(例如比非转基因植物有更高的赖氨酸含量)的植物蛋白。GOI还可以编码可以用于食品加工的酶，例如凝乳酶，奇异果甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是任何一种有害毒素的编码基因，可以是一反义转录本，如对于马铃薯蛋白(patatin)或α-淀粉酶，ADP-葡糖焦磷酸酶(例如参见EP-A-0455316)的反义转录本，一种蛋白水解酶反义或葡聚糖酶的反义转录本。

GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，这是我们于1994年7月4日申请的共同未决UK专利申请9413439.2的主题，序列在图3中给出。GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，这是我们于1994年10月21日申请的共同未决UK专利申请9421290.9的主题，序列在图4中给出。GOI可以是编码ADP-葡糖焦磷酸酶的核苷酸序列，这是我们于1994年4月7日申请的审而未决PCT专利申请PCT/EP94/01082的主题，其序列在图5和图6中给出。GOI可以是编码α-葡聚糖水解酶的任何核苷酸序列，这在我们于1994年10月15日申请的审而未决PCT专利申请PCT/EP94/03397中有说明，其序列在图7-10中给出。

在一个优选的实施方案中，GOI是编码根据本发明酶的核苷酸序列。

如上所述，一种优选的宿主生物是曲霉属，如黑色曲霉。本发明转基因曲霉可以根据下列文献的说明而制得：Rambosek，J，和Leach，J1987(丝状真菌中的重组DNA：改进和探索，CRC生物技术评论综述(Recombinant DNA in filamentous Fungi：Progress and Bospects CRCCrit.Rev Biotechnol.)6：357-393)，Davis R.W.1994(MartinelliS.D.，Kinghorn J.R.(编著)《曲霉：50年工业微生物进展》(Aspergillus：50 years on Progress in industrial microbiology)，vol 29，Elsevier Amsterdam 1994，第525-560，“曲霉中异源基因表达和蛋白质分泌(Heterologous gene expression and protein secretion inAspergillus))，Ballance，D.J.1991(Leong，S.A.Berka R，M.(编著)《分子工业真菌学，丝状真菌的系统和应用》(Molecular IndustrialMycology，Systems and Application for Filamentous Fungi.)Marcel DekkerInc NewYork 1991.pp1-29，“丝状真菌的转化系统和真菌基因结构的总结”(Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview ofFungal Gene Structure)，和Turner G.1994(Martinelli S D.，Kinghorn J.R.(编著)《曲霉：50年工业微生物进展》，vol 29，Elsevier Amster-dam 1994，pp641-666，“基因操作的载体”(Vectors for genetic manipulation))，而且，下面的说明总结了产生根据本发明的转基因曲霉的那些说明。

在近乎一个世纪里，工业上已广泛使用丝状真菌来生产有机化合物和酶。传统的日本Koji和大豆发酵已使用了曲霉属几百年。在本世纪已使用黑色曲霉生产有机酸，特别是柠檬酸，和生产各种用于工业的酶。

丝状真菌被广泛用于工业有两个主要原因。首先，丝状真菌可以产生大量胞外产物，例如酶和有机化合物，例如抗生素或有机酸。其次，丝状真菌可以在便宜的底物上生长，例如谷类，糠，甜菜肉质部分等。相同原因使丝状真菌成为根据本发明的异源表达的令人感兴趣的生物体。

为了制得转基因曲霉，通过将GOI(例如一种淀粉酶或SEQ.I.D.No.2)插入到为在丝状真菌中表达而设计的构建物而制备表达构建物。

已经研究出几种类型用于异源表达的构建物。这些构建物包含根据本发明的在真菌中有活性的启动子(或者如果GOI编码根据本发明的酶而需要的另一启动子)。除本发明外的启动子的例子包括用于高度表达胞外酶的真菌启动子，例如，葡糖淀粉酶启动子或α-淀粉酶启动子。该GOI可以与指导该GOI编码的蛋白质分泌的信号序列(例如本发明信号序列或另一个合适的序列)融合。通常使用真菌源信号序列，例如本发明的信号序列。在真菌中有活性的终止子终止表达体系，例如本发明的终止子。

已经研究出另外一种类型的真菌中的表达系统，其中GOI与编码稳定蛋白质的真菌基因的较小或较大部分融合。这可以稳定GOI编码的蛋白。在这样的体系中，被特异蛋白水解酶识别的一个切割位点可以被插入到真菌蛋白和GOI编码的蛋白之间，这样，产生的融合蛋白可以在该位点被特异蛋白水解酶切割，从而释放GOI编码的蛋白质(“POI”)。作为例子，可以插入至少在一些曲霉中发现的象肽酶一样的KEX-2识别的位点。这样的融合导致体内切割，从而保护POI并产生POI，而不产生较大融合蛋白。

已经报道过在曲霉中异源表达编码细菌，真菌，脊椎动物和植物蛋白质的几种基因。如果GOI不与信号序列融合，则蛋白质可以胞内沉积。蛋白质将在细胞质中蓄集，而且通常不被糖基化，这对于一些细菌蛋白是有益的。如果GOI装配有一信号序列，则蛋白质将在胞外蓄集。

就产生稳定性和宿主菌株修饰作用而言，当一些异源蛋白分泌到真菌培养液中时，它们不是非常稳定的，大多数真菌产生降解异源蛋白的几种胞外蛋白水解酶。为了避免这一问题，已经使用了具有降低的蛋白水解酶产量的一些特殊的真菌菌株作为异源生产的宿主。

为转化丝状真菌，对于很多丝状真菌已经研究出一些转化方案(Ballance 1991，上文)。其中很多方案的基础是制备原生质体并用PEG和C_a ²⁺离子将DNA插入到原生质体内。然后转化的原生质体再生，并用各种选择性标记物选择转化的真菌。用于转化作用的标记物是一些营养缺陷型标记物，例如argB，trpC，niaD，和pyrG，抗生素抗性标记物，如benomyl抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。一种很常用的转化标记物是构巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因，高拷贝数的该基因用丙烯酰胺作为唯一氮源使真菌生长。

尽管EP-B-0470145和CA-A-2006454中没有公开本发明所述的酶，编码该酶的核苷酸序列和本发明的启动子，但这两篇文献对这些类型的技术提供了一些有用的背景注释，可以应用到制备本发明转基因植物。一些这样的背景说明包括在下面的注释中。

基因工程改变的植物的构建的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，从而获得插入物质的稳定保持。插入遗传信息有几种技术，两个主要的原理是直接引入遗传信息和使用载体系统引入遗传信息。

一般性技术的综述可以参见Potrykus(植物生理和植物分子生物学年度综述(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol)[1991]42：205-225)和Christou(农业-食品-工业(Agro-Food-Industry)Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)的文章。

因此，一方面，本发明涉及一种载体系统，其携有本发明启动子或核苷酸序列或构建物，而且能将该启动子或核苷酸序列或构建物插入到一生物体，例如一种植物，的基因组中。

所述载体系统可以包含一个载体，但也可以包含两个载体。在有两个载体的情况下，通常认为该载体系统是二元载体系统(binary vectorsystem)。二元载体系统进一步详细描述于Gynheung An等(1980)，二元载体，植物分子生物学手册A3，1-19(Binary Vectors，PlantMolecular Biology Manual A3，1-19)。

用一种给定的启动子或核苷酸序列或构建物转化植物细胞的一种被广泛应用的系统的基础是使用来自根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒或来自发根病土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒，An等，(1986)，植物生理(Plant Physiol)81，301-305，和Butcher D.N.等，(1980)，植物病理学家的组织培养方法(Tissue.Culture Methods for Plant Pathologists，编著：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。

已经构建出适用于构建上述植物或植物细胞构建物的几种不同的Ti和Ri质粒。一个非限制性的这样的Ti质粒的例子是pGV3850。

本发明的启动子，或核苷酸序列或构建物应该优选插入到T-DNA或相邻T-DNA序列的末端序列之间的Ti质粒中，从而避免这些皮紧邻T-DNA边界的序列破碎，因为这些区中的至少一个显示出对于将修饰的T-DNA插入植物基因组是必需的。

从上面的解释应该理解，如果所述生物体是一种植物，则本发明载体系统优选是包含感染植物所必需的序列(例如Vir区)和T-DNA序列的边界部分之至少一个的载体系统，其中所述边界部分位于与遗传构建物同的载体上。

而且，所述载体系统优选是根癌土壤杆菌Ti-质粒或发根病土壤杆菌Ri-质粒或者其衍生物，因为这些质粒是公知的，而且广泛应用于转基因植物构建。存在很多载体系统，它们以这些质粒或其衍生物为基础。

在转基因植物构建中，本发明启动子或核苷酸序列或构建物可以首先构建在一种微生物中，在该微生物中载体可以复制，而且其容易操作，一种有用的微生物的例子是E.coli，但也可以使用具有上述性质的其它微生物。当在E.coli中构建了如上定义的载体系统中的载体后，如果需要，将其转移到合适的土壤杆菌菌株中，例如转移到根癌土壤杆菌中。因此，优选将载有本发明启动子或核苷酸序列或构建的Ti-质粒转移到合适的土壤杆菌菌株，如A.tumefaciens(根癌土壤杆菌)中，从而得到载有本发明启动子，核苷酸序列或构建的土壤杆菌细胞，其中DNA接着被转移到要修饰的植物细胞中。

在CA-A-2006454中报道了可以获得包含E.coli复制系统和使选择转化细胞成为可能的标记物的大量克隆载体。这些载体包含例如pBR 322，pUC系列，M13mp系列，pA CYC 184等。用这种方法，本发明核苷酸或构建或启动子可以被插入到载体中合适的限制性位点。包含的质粒用于在E.coli中转化。E.coli细胞在合适的营养培养基中培养后收获，并裂解。然后回收质粒。通常使用的分析方法是序列测定分析，限制性酶切分析，电泳，还有生物化学和分子生物学方法。每步操作后，使用的DNA序列可以限制性酶切并与下一个DNA序列连接。每一序列可以在相同或不同质粒中克隆。在植物中本发明所期望启动子或构建物或核苷酸序列的每一插入方法之后，可能需要存在和/或插入另一些DNA序列。如果例如为了转化而使用了植物细胞中的Ti-或Ri-质粒，则该Ti-和Ri-质粒T-DNA的至少右边界，而常常是右边界和左边界(作为插入基因的侧翼区)可以被连接。为转化植物细胞而使用T-DNA已经被深入研究，而且在EP-A-120516中有描述；Hoekema，于：The Binary Plant Vector System offset drukkerij KantersB.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等，植物科学评论(Crit Rev，Plant Sci.)，4：1-46；和An等，EMBO J(1985)4：277284。

用土壤杆菌直接感染植物组织是一项简单的技术，已经被广泛应用，且在Butcher D.N.等(1980)的《植物病理学家的组织培养方法》，编著：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中有描述。该技术的进一步说明参见Potrykus(植物生理植物分子生物学年度综述)(Annu RevPlant Mol Biol)[1991]42：205-225)和Chnstou(农业-食品-工业，Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)。用这项技术，可以在植物的某些部分或组织，即在植物的叶，根，茎，或其它部位的一部分上感染植物。

一般对于用携有所述启动子和/或所述GOI的土壤杆菌直接感染植物组织，要将要被感染的植物切出刀口，例如用剃刀切割植物，或者用针将植物刺孔，或者用砂纸磨擦植物。然后用土壤杆菌接种伤口，之后，接种后的植物或植物部分在合适的培养基上生长，使其生长成成熟植物。

当植物细胞被构建后，这些细胞可以根据公知的组织培养方法生长和保持，例如在补加有必需生长因素例如氨基酸，植物激素，维生素等之合适的培养基质中培养细胞。转化的细胞再生成基因工程修饰的植物可以用植物自细胞或组织培养物再生的公知方法进行，例如通过用抗生素选择转化的枝，和通过在含有合适营养成分，植物激素等的培养基上传代培养枝而进行。

对于植物转化的进一步说明参见EP-A-0449375。

总之，本发明提供了一种葡聚糖酶和编码这种酶的核苷酸序列，另外，提供了能控制那个，或另一个核苷酸序列表达的启动子。另外其包括对于相同核苷酸序列表达的终止子和信号序列。

下面的样品根据布达佩斯条约保藏在认可的保藏单位The NationalCollections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)，在不列颠和北爱尔兰联合王国，苏格兰，Aberdeen MacharDrive 23号，AB2 1RY，1995年1月16日：

包含质粒pEGLA-3的E.coli{即E.coli DH5α-pEGLA-3}保藏号是NCIMB 40704。

现在通过实施例的方式说明本发明。

下面的实施例参考附图进行，其中；

图1-10是早期专利申请的启动子和GOI序列，对于本发明的各方面是有用的；

图11是质粒pEGLA-3的质粒图；

图12是一些启动子缺失的纲要图解；

图13是pGPAMY质粒图

图14是图解；

图15是pGP-GssAMY-Hyg质粒图；

图16是图解；

图17是蛋白质印迹。

下面的叙述讨论特别是重组DNA技术的应用。重组DNA技术的一般性说明可以参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.Maniatis T(编著)《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning A laboratory manual.)第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press.New York1989。β-葡聚糖酶的纯化

黑色曲霉3M43在含有麦糠甜菜肉质部分的培养基中生长。发酵肉汤从肉汤经过滤的固体部分制备，浓缩的发酵肉汤装载到用20mMTris，HCl pH 7.5平衡过的25×100mm Q-SEPHAROSE(Pharmacia)高效柱上，线性梯度是0-500mM NaCl，收集洗脱液级分。β-葡聚糖酶在大约100mM NaCl处洗脱出来。

合并含有葡聚糖酶的级分，用50×200mm G-25 SEPHAROSESuperfine(Pharmacia)脱盐。用蒸馏水洗脱柱子。脱盐后用High-Trap旋转柱浓缩酶。

接着将浓缩的脱盐的级分在50×600mm SUPERDEX 50柱上进行凝胶过滤。装载样品，用0.2M磷酸盐缓冲pH 7.0加0.2M NaCl洗脱柱子，收集洗脱液级分。合并含葡聚糖酶的级分并脱盐，并且如上所述浓缩。

合并的级分装载到用50mM含有1.5M(NH₄)₂SO₃的磷酸盐缓冲液pH6.0平衡过的16×100mm Phenylsepharose高效柱(Pharmacia)上，使用(NH₄)₂SO₃浓度自1.5-0M变化的梯度，并分部收集洗脱液。合并含有葡聚糖酶的级分。使用Phast系统凝胶(Pharmacia)通过SDS-PAGE评价β-1，4-葡聚糖酶的纯度。表征

通过使用激光解吸技术的质谱测定纯化的葡聚糖酶的分子量，发现葡聚糖酶的Mw是24235D±50D。

使用广谱pI试剂盒(Pharmacia)测定pI值。葡聚糖酶的pI值大约为4。

SDS-PAGE分析后，处理PAS试剂显示出葡聚糖酶是未经糖基化的。根据I.Van Seuningen和M.Davril(1992)《电泳》(Elecrophoresis)13，pp.97-99的方法进行PAS染色。β-葡聚糖酶的氨基酸序列测定

用Stone & Williams 1993说明的方法的改良方法，用来自Boehringer Mannheim Lys-C序列测定级内切蛋白酶消化所述的酶(Stone，K.L.和Williams，K.R(1993)“蛋白质的酶消化和HPLC肽分离”，Matsudaira P.(编著)，《用于微量测序的蛋白质和肽纯化的实验指南》，第二版，科学出版社，San Diego，1993，pp.45-73(Enzymatic  digestion of Protein and HPLC PeptideIsolation、In：Matsudaira P.(Editor).A.Practical Guide toProtein and Pepnde Purification for Microsequencing)。

冷冻干燥的β-葡聚糖酶(0.4mg)溶解于50μl之8M尿素，0.4MNH₄HCO₃，pH 8.4中。上面充满N₂后加入5μl 45mM DTT，蛋白质在50℃ N₂下变性并还原15分钟。冷却至RT后，加入5μl 100mM碘代乙酰胺以使半胱氨酸衍生物化15分钟，条件是RT，黑暗，N₂。接着加入90μl水和5μg内切蛋白酶Lys-C的50μl 50mM Tricine和10mM EDTA，pH 8.0的溶液，消化作用在37℃ N₂下进行24小时。所得肽在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10gm；The SeparationsGroup；California)上用反相HPLC分离，使用溶剂A：0.1％TFA水溶液，溶剂B：0.1％TFA乙腈溶液。在使用脉冲液体循环于AppliedBiosystems 476A测序仪上测定序列之前，用相同的溶剂体系将选择的肽再在Develosil C18柱(0.46×10cm；3gm)上进行色谱。发现下面的肽序列：SEQ  I.D.No.4SEQ  I.D.No.5SEQ  I.D.No.6SEQ  I.D.No.7SEQ  I.D.No.8基因片段PCR克隆的分离

用Applied  Biosystem DNA合成仪392型合成PCR引物。在这一方面，从发现的肽序列中的两个，即来自Seq I.D.No.4的WEVWYGT和来自Seq I.D.No.7的WTWSGG合成PCR引物。自WEVWYGT(反向的)衍生的引物在Seq I.D.No.9中给出，自WTWSGG衍生的引物在Seq I.D.No.10中给出-见下文：SEQ I.D.No.10TGG ACN TGG WSN GGN GG17mer 256混合物SEQ I.D.No.9CTN CCR TAC CAN ACY TCC CA20mer 64混合物

PCR扩增是用100pmol每一种引物在100μl反应液中用Amplitaq II试剂盒(Perkin Elmor)进行。程序是：步骤          温度          时间1             94℃          2min2             94℃          1min3             55℃          2min4             72℃          2min5             72℃          5min6             5℃           SOAK步骤2-4重复40个循环。PCR反应在PERKIN ELMER DNA Thermal循环仪上进行。

根据厂商说明(Novagen)，将350bp的扩增的片段分离并克隆到pT7-Blue T-载体上。分离片段并测序。发现的序列显示其确实是葡聚糖酶基因的一部分。分离黑色曲霉(A.niger)基因组DNA

lg的冷冻的A.niger菌丝体有研钵中在液氮中研磨。氮气蒸发后，研磨的菌丝体用含有1ml 20％十二烷基硫酸钠的提取缓冲液(100mMTris，HCl，pH 8.0，0.50mM EDTA，500mM NaCl，10mM β-巯基乙醇)15ml提取。在65℃培养10分钟后加入5ml 5M KAc，pH 5.0，混合后将混合物接着在冰上培养20分钟。然后，将混合物离心20分钟，上清液与0.6体积异丙醇混合以沉淀出提取的DNA。进一步离心15分钟后，将DNA沉淀溶解于0.7ml TE(10mM Tris，HCl，pH 8.0，1mM EDTA)，并用75μl 3M NaAc，pH 8.0和500gl异丙醇沉淀。

离心后，沉淀物用70％ETOH冲洗并真空下干燥。DNA溶解于200gl TE并在-20℃下贮存。库的构建

用Tsp 509I部分消化20μg基因组DNA，给出与EcoRI末端相容末端。消化的DNA在1％琼脂糖凝胶上分离并纯化4-10kb片段。使用λZAPII EcoRI/CIAP试剂盒(购自Stratagene)根据厂商说明构建库。根据厂商说明2μl接头(总计5μl)与来自Stratagene的Gigapack Gold II填充提取物一起包装。该库包含650,000个独立的克隆。库的筛选

在NZY平板(每升5g NaCl，2mg MgSO₄·7H₂O，5g酵母提取液，10g酪蛋白水解产物，15g琼脂)上平板接种2×50,000pfu，并在Hybond N薄膜(Amersham)上进行噬斑取出。重复进行噬斑取出和杂交。薄膜用购自pharmacia的Ready-to-go标记盒与用³²p dCTP(Amersham)标记的PCR克隆杂交。只有当在两薄膜上都检测到杂交时看作阳克隆。本发明核苷酸序列用ALF-激光荧光测序仪(Pharmacia)测序。该序列包括所有发现的氨基酸序列，证明该分离的基因确实编码β-1，4-内切葡聚糖酶。序列信息SEQ I.D.No 12代表启动子序列，酶编码序列，终止子序列和信号序列，和本发明酶的氨基酸序列。分析酶活性

根据厂商说明使用Azurine-交联的大麦β-葡聚糖压片(tablet)(商品名：Glucazyme压片，Megazyme，Australia提供)对纯化的蛋白质测定其内切β-1，4-葡聚糖酶活性。

该纯化的酶对该底物有高度活性。一般情况下该酶比活是每分钟每毫克蛋白质给出2250毫摩尔葡萄糖。诱导EglA基因：诱导碳源的鉴定

下表给出几种高和低分子量葡聚糖酶启动子的诱导物的特性。该分析使用与E.coli β-葡糖醛酸酶基因融合的本发明全长葡聚糖酶启动子。

不同碳源的诱导强度通过测定细胞内水解对-硝基苯酚葡糖醛的GUS特异活性而定量测定。碳源(1％)                     GUS活性(单位/mg)-24小时木糖                                   12.91木糖醇                                 10.62阿拉伯糖                               8.50阿拉伯糖醇                             14.40葡萄糖                                 20.25纤维素二糖                             19.44木糖-寡聚物70                          11.80吡喃葡萄糖苷                           19.70甲基-吡喃木糖苷                        12.60木糖基葡聚糖                           13.90果胶                                   9.7阿拉伯半乳聚糖                         30.20阿拉伯糖醇+葡萄糖                      29.50

出人意料的是，一般是潜在的分解代谢阻抑物的葡萄糖诱导葡聚糖酶启动子。

因此，本发明也涉及葡萄糖诱导的启动子。

另外，本发明涉及使用葡萄糖诱导启动子。

本发明的这些方面不同于WO 94/04673公开的内容，WO 94/04673公开了葡萄糖存在时有活性的一种真菌启动子。从这点上来说，本发明启动子不只是在葡萄糖存在下有活性，而且也被葡萄糖诱导。

葡萄糖可诱导的葡聚糖酶启动子优点之一是该启动子能用来表达GOI，从而被用来制备包含葡萄糖的环境中的POI(例如一种异源POI)。这是重要的，因为葡萄糖是生物量蓄集的优选的碳源之一。另外，希望含葡萄糖的基质产生较低量蛋白水解酶，从而得到更好的POI产率。另外，在脱阻抑的宿主菌株中使用脱阻抑启动子将会提高反应基质例如发酵反应培养基的速度和效率。另外，在发酵期间使用混合的碳源将使启动子有效诱导，例如在低水平葡萄糖和廉价碳源(例如甜菜肉质部分)时诱导。启动子缺失对调节葡聚糖酶基因表达的影响。

进行一系列缺失研究，见图12。在这些研究中，图12所示的不同启动子缺失构建物与GUS基因融合。定性分析报道基因的活性。结果表明没有一例缺失破坏葡聚糖酶启动子的可诱导性。这些结果表明存在转录激活和转录起始的多处位点。使用包含葡聚糖酶启动子(GP)和葡聚糖酶信号序列(Gss)的黑色曲霉的转化子产生异源蛋白。黑色曲霉的转化

黑色曲霉(A.niger)的转化方案以下述文献的公开为基础：Buxton，F.P.，Gwynne D.I.，Davis，R.W.1985(“用构巢曲霉的argB基因转化黑色曲霉”(Transformation of Aspergillus niger using the arg Bgene of Aspergillus nidulans)，《基因》(Gene)，37：207-214)，Daboussi，M.J.，Dieballi，A.，Gerlinger，C.，Blaiseau，P.L，Cassan，M.，Lebrun，M.H.，Parisot，D，Brygoo，Y.1989(“使用构巢曲霉的硝酸盐还原酶基因转化几种有丝真菌”(Transformation ofseven species of filamentous fungi nsing the nitrate Neductose gene ofAspergillus nidulans)，Curr.Genet.15：453-456)和Punt，P.J.，van den Hondel，C.A.M.J.J.1992(“以潮霉素B和腐草霉素抗性标记物为基础转化有丝真菌”(Transformation of filamentous fungi based onhygromycin B and Phlemycin resistance markers)，《酶学方法》(Meth、Enzym.)216：447-457)。

关于原生质体的纯化，在5-10ml水中从孢子新形成的N 400(CBS 120.49，Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn)(生长了7天)的-PDA(马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar)-fromDifco Lab.Detroit)板上冲洗下孢子。用该孢子悬浮液接种盛有200mlPDC(马铃薯葡萄糖肉汤，Difco 0549-17-9，Difco Lab、Detroit)的震荡瓶，并在30℃下震荡(250rpm)16-20小时。

使用Miracloth纸收获菌丝体，并将3-4g湿的菌丝体转移到盛有含75Mg裂解酶(Sigma L-2265)和4500个单位溶细胞酶(Sigma L-8012)的10ml STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris HCl pH7.5，50Mm CaCl₂)的无菌陪替氏皿中。菌60μm目过滤器过滤降解的菌丝体。在一甩平式转头中以2000rpm的速度离心10分钟收获原生质体。弃去上清液，并将沉积物溶解于8ml1.5M MgSO₄中后，以3000rpm离心10分钟。

用移液管将含有原生质体的上层条带转移到另一试管中，并加入2ml0.6M KCl。在顶部小心加入5ml 30％蔗糖，试管以3000rpm离心15分钟。

处于界面带的原生质体转移到新的试管中并用1vol.STC稀释。溶液以3000rpm离心10分钟。沉积物用STC冲洗两次，最后溶解于1ml STC中。计数原生质体，并在转化前还要浓缩。

关于转化，将100μl原生质体溶液(10⁶-10⁷原生质体)与含有5-10μgDNA的10μl DNA溶液混合，并在室温下温育25分钟。然后以200μl，200μl和800μl分批小心加入60％PEG-4000。该混合物在室温下温育20分钟。向混合物中加入3ml STC，并小心混合。该混合物以3000rpm离心10分钟。

去除上清液，并将原生质体增溶于残留的上清液中，加入3-5ml顶层琼脂糖，并将原生质体快速涂布于选择板上。葡聚糖酶启动子和异源基因表达

图13给出在这些研究中使用的表达载体pGPAmy。该表达载体包含与Thermomyces Lanuginosusue前体形式的α-淀粉酶基因融合的葡聚糖酶启动子。使用木聚糖A终止子终止自该启动子的转录。该构建物用于共转化实验，以潮霉素抗性基因为选择性标记。

在甜菜肉质部分和小麦糠上生长，用包含表达载体pGPAmy的四种不同的转化物产生α-淀粉酶见图14。生长48小时后，在培养基中首次测定α-淀粉酶活性。在3天和4天后发现酶活性峰。葡聚糖酶信号序列和异源蛋白质的生产

在这些研究中使用表达载体pGPGssArnyHyg。

载体pGPGssAmyHyg在图15中给出。该载体包括与葡聚糖酶信号肽(标记为ss)翻译融合的成熟α-淀粉酶基因。另外，该载体包含本发明启动子(标记为EGl.A)和木聚糖酶A终止子。因此自该载体的转录是在葡聚糖酶启动子的控制下，并由木聚糖酶A终止子终止。

该构建物特别用来试验异源蛋白分泌中信号肽的效能。

图16显示出当在甜菜肉质部分/小麦糠中生长时通过利用菌株6M179中的构建诱导α-淀粉酶的结果。这些结果表明该酶活性定域在培养基中，并在生长48小时后首次测定。在第4天发现酶活性蓄集。蛋白质印迹

图17给出SDS-PAGE分离的并印迹到膜上的三个不同转化物的上清液的蛋白质的Western印迹。具有T.Lanuginosusα-淀粉酶15个氨基酸残基的一种合成肽识别来自转化物培养上清液Western印迹上的一条单一谱带。产生抗体

通过给兔注射纯化的酶，并根据N Harboe和A Ingild(“免疫，分离免疫球蛋白，估算抗体滴度”(Immunization，Isolation ofImmunoglobulins，Estimation of Antibody Titre)，《定量免疫电泳，方法和应用手册》(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Methods and Applications)N H Axelsen等编著，UniversitetsforlagetOslo，l973)和TG Cooper(“生物化学工具”(The Tools ofBiochemistry)，John Wiley & Sons，New York，1977)描述的方法从抗血清中分离免疫球蛋白来产生抗本发明酶的抗体。总结

尽管已知黑色曲霉产生能降解葡聚糖的几种酶，但本发明提供了一种新的有创造性的β-1，4-内切葡聚糖酶，以及编码该酶的序列，其终止序列，其信号序列，和这些序列的启动子。本发明一个重要的优点在于这种酶能高量生产。另外，本发明启动子和调节序列(例如信号序列和终止子)可以用来表达或者可以用于生物体中GOI的表达，例如在黑色曲霉中表达。

本发明酶用作饲料添加剂是有益处的。另外由于其具有高纤维转换能力，所以其可用于酿酒业。此外，当使用这种酶时基本上没有加工问题，特别是用非淀粉类多糖加工时。另外，这种酶有效降解β-葡聚糖，因此其可以有利地用于酿酒业以降低粘度并且也改善啤酒的可过滤性。这一点是重要的，因为啤酒中大分子量葡聚糖和类似物引起过滤困难，而且给出残渣，凝胶和混浊。

本发明信号序列对于POI，例如一种异源POI是有用的，从而改善POI的质和量。

本发明的其它变化在本发明范围内对于本发领域技术人员来说是显而易见的。序列信息酶序列SEQ  ID  NO：1Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser1               5                  10                  15Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Gln Cys

         20                  25                  30Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys

     35                  40                  45Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ser

 50                  55                  60Gly Leu Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro65                  70                  75                  80Thr Ser Val Thr Trp Ser Gln Asp Asp Thr Asn Val Gln Ala Asp Val

             85                  90                  95Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Ala Asp His Ala Thr Ser Ser

        100                 105                 110Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Val Gln

    115                 120                 125Pro Ile Gly Lys Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp

130                 135                 140Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Thr Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys Thr145                 150                 155                 160Tyr Ser Phe Val Ala Gly Ser Pro Ile Asn Ser Trp Ser Gly Asp Ile

            165                 170                 175Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ser

        180                 185                 190Ser Gln His Leu Ile Thr Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly

    195                 200                 205Gly Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn  *

210                 215                 229酶编码序列SEQ  ID  NO：2CAG ACG ATG TGC TCT CAG TAT GAC AGT GCC TCG AGC CCC CCA TAC TCGGTG AAC CAG AAC CTC TGG GGC GAA TAC CAG GGC ACT GGC AGC CAG TGTGTC TAC GTC GAC AAG CTT AGC AGC AGT GGT GCC TCA TGG CAT ACC AAATGG ACC TGG AGT GGT GGC GAG GGA ACA GTG AAA AGC TAC TCT AAC TCCGGC CTT ACG TTT GAC AAG AAG CTA GTC AGC GAT GTG TCA AGC ATT CCCACC TCG GTG ACA TGG AGC CAG GAC GAC ACC AAT GTC CAA GCC GAT GTCTCA TAT GAT CTG TTC ACC GCG GCG AAT GCG GAT CAT GCC ACT TCC AGCGGT GAC TAT GAG CTT ATG ATT TGG CTT GCC CGC TAC GGC TCA GTC CAGCCT ATT GGC AAG CAG ATT GCC ACG GCC ACT GTG GGA GGC AAG TCC TGGGAG GTG TGG TAT GGT ACC AGC ACC CAG GCC GGT GCG GAG CAA AAG ACATAT AGC TTC GTG GCA GGA TCT CCT ATC AAC TCG TGG AGT GGG GAC ATTAAG GAC TTC TTC AAC TAT CTC ACC CAG AAC CAA GGC TTC CCG GCT AGCTCT CAG CAT TTG ATC ACT CTG CAA TTT GGA ACT GAG CCG TTC ACC GGTGGC CCG GCA ACC TTC ACG GTT GAC AAC TGG ACC GCT AGT GTC AAC启动子序列SEQ ID NO：3AATTGAAGCA TTTTGATAGG TTTAAGCCTA ATCAGGATAT TGGATGAGTC GAGTTGCAGA    60AGTTGAGGAC GGTGGGTGAA ATCGGGGGTT TGATAGGTAG GCAATGCAGG GCGGAACGGG    120AAGGGTCTAG ACAATTTCTT TCTTTTGGAC AGCTGGTGCG TTTCACTGAG ATTAATAGTA    180AGCAAACTAC TCGCTCGAAG TCGTAGATGT GCATAATGGA TAACTACAGC CAACCGAAAT    240CTCCGGGCAG AAGGCCTGGA GGCAGGAGGA AACGTGGATA AGAGAGTAAT GTTTGAGTAT    300AGATATGTAG GCAAGAAAGG ACTGGGAGGA AGGAAGTATC GCAAACAAGA CAAGTCACTG    360AATAGGAAAG AATGGGGCCA TCAGAGAAAT GAATCTAAAC GGTAACTGCA GATATTACAT    420GGAAGAAAAT ACTATGATCC CTAATTGATA TGGTTCCATG GCCCCTGGAG ACTTAAACCT    480CGTGGTATGA TAAACATATG AGTTACATTC TCGGTAAATC CAACATTACT CCCAAGCTCT    540GTTGATATTC TCCGATAATT CACCGATAAC CAACCAACCT ACTCCCGTCT AGATCCAATT    600GGTCTATATG CATAATGGAT ATCGTCAGCA CAGGCAGAAC CCTTTAATTT ATTTCTGGAG    660ATCCCGTTCT CCACAATGCT TGGTTGCCGA CTGCCACAGA CCATCGCTAA CTTGAAGCGG    720AAAGTGCTCC GATGAAGGGT CTCATTTTGA AACGGAGGAT TTACATGTCA ATGTTGCAGG    780CTGGCGTTGA TGATGGCGCA ACCTGCTATA GCTAGTTGGC TTACTTCGTC CTGGCTGCCG    840TATTGGACAC GGAAAGTCGG ACAATAATAG TGTTAACAGT AAGCGCCATT GATCAGAGTT    900GATGTATTTA AAGCTGCGTC GTCTGCTGCC CCCTCCGTGT TCGTGTCTTA TTCCAAACAT    960TCAACCTCTA TTCCTTTCGA AGTCCTTTAG ATCTGCCGTT CCTCTGCTTT ATTGCCCAAC    1020SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：17氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(vi)来源序列：

  (A)生物体：黑色曲霉

(xi)序列描述SEQ ID NO：4

Ser Trp Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Thr Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys

1               5                   10                  15SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述SEQ ID NO：5

Thr Tyr Ser Phe Val Ala GlV Ser Pro Ile

1               5                   10SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：35个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(xi)序列描述SEQ ID NO：6Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro Thr Ser Val Thr Xaa Ser1               5                   10                  15Gln Asp AsP Thr Asn Xaa Xaa Ala Ala Val Ser Tyr Xaa Leu Phe Thr

        20                  25                  30Ala Ala Asn

    35SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：11个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述SEQ ID NO：7

Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys

1               5                   10SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：11个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述SEQ ID NO：8

Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys

1               5                   10SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：20碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

  (A)说明：/desc＝“寡核苷酸”

(xi)序列描述SEQ ID NO：9

GTN  CCR  TAC  CAN  ACY  TCC  CA                      17SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：17碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

  (A)说明：/desc＝“寡核苷酸”

  (xi)序列描述SEQ ID NO：10

TGG  ACN  TGG  WSN  GGN  GG                            17SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：345碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链股：双链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

  (A)说明：/desc＝“PCR片段”

(xi)序列描述SEQ ID NO：11GTGGAGTGGT  GGCGAGGGAA  CAGTGAAAAG  CTACTCTAAC  TCGGSCCTTA  CGTTTGACAA    60GAAGCTAGTC  AGCGATGTGT  CAAGCATTCC  CACCTCGGTG  ACATGGAGCC  AGGACGACAC   120CAATGTCCAA  GCCGATGTCT  CATATGATCT  GTTCACCGCG  GCGAATGCGG  ATCATGCCAC   180TTCCAGCGGT  GACTATGAGC  TTATGATTTG  GTATGTGACG  TCGTGAACAA  GATAGATGGA   240GGAGGCTAAC  GTAACCAGGC  TTGCCCGCTA  CGGCTCAGTC  CAGCCTATTG  GCAAGCAGAT   300TGCCACGGCC  ACTGTGGGAG  GCAAGTCCTG  GGAGGTCTGG  TACGG    .               345SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：2360个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链股：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)来源：

  (A)生物体：黑色曲霉

  (B)菌株：3M43

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：join(1021..1427，1476..1708，1778..1857)

  (D)其它信息：/product＝“内切葡聚糖酶”/gene＝“eglA”

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：exon

  (B)位置：1021..1427

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：intron

  (B)位置：1428..1475

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：exon

  (B)位置：1476..1708

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：intron

  (B)位置：1709..1777(ix)特征：

(A)名称/关键词：exon

(B)位置：1778..1854(ix)特征：

(A)名称/关键词：sig_peptide

(B)位置：1021..1068(ix)特征：

(A)名称/关键词：mat_peptide

(B)位置：join(1069..1427，1476..1708，1777..1854)(xi)序列描述SEQ ID NO：12AATTGAAGCA TTTTGATAGG TTTAAGCCTA ATCAGGATAT TGGATGAGTC GAGTTGCAGA    60AGTTGAGGAC GGTGGGTGAA ATCGGGGGTT TGATAGGTAG GCAATGCAGG GCGGAACGGG    120AAGGGTCTAG ACAATTTCTT TCTTTTGGAC AGCTGGTGCG TTTCACTGAG ATTAATAGTA    180AGCAAACTAC TCGCTCGAAG TCGTAGATGT GCATAATGGA TAACTACAGC CAACCGAAAT    240CTCCGGGCAG AAGGCCTGGA GGCAGGAGGA AACGTGGATA AGAGAGTAAT GTTTGAGTAT    300AGATATGTAG GCAAGAAAGG ACTGGGAGGA AGGAAGTATC GCAAACAAGA CAAGTCACTG    360AATAGGAAAG AATGGGGCCA TCAGAGAAAT GAATCTAAAC GGTAACTGCA GATATTACAT    420GGAAGAAAAT ACTATGATCC CTAATTGATA TGGTTCCATG GCCCCTGGAG ACTTAAACCT    480CGTGGTATGA TAAACATATG AGTTACATTC TCGGTAAATC CAACATTACT CCCAAGCTCT    540GTTGATATTC TCCGATAATT CACCGATAAC CAACCAACCT ACTCCCGTCT AGATCCAATT    600GGTCTATATG CATAATGGAT ATCGTCAGCA CAGGCAGAAC CCTTTAATTT ATTTCTGGAG    660ATCCCGTTCT CCACAATGCT TGGTTGCCGA CTGCCACAGA CCATCGCTAA CTTGAAGCGG    720AAAGTGCTCC GATGAAGGGT CTCATTTTGA AACGGAGGAT TTACATGTCA ATGTTGCAGG    780CTGGCGTTGA TGATGGCGCA ACCTGCTATA GCTAGTTGGC TTACTTCGTC CTGGCTGCCG    840TATTGGACAC GGAAAGTCGG ACAATAATAG TGTTAACAGT AAGCGCCATT GATCAGAGTT    900GATGTATTTA AAGCTGCGTC GTCTGCTGCC CCCTCCGTGT TCGTGTCTTA TTCCAAACAT    960TCAACCTCTA TTCCTTTCGA AGTCCTTTAG ATCTGCCGTT CCTCTGCTTT ATTGCCCAAC   1020ATG AAG CTC TCC ATG ACA CTT TCC CTG TTT GCG GCC ACT GCC ATG GGC     1068Met Lys Leu Ser Met Thr Leu Ser Leu Phe Ala Ala Thr Ala Met Gly-16 -15                 -10                  -5CAG ACG ATG TGC TCT CAG TAT GAC AGT GCC TCG AGC CCC CCA TAC TCG     1116Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser1               5                  10                  15GTG AAC CAG AAC CTC TGG GGC GAA TAC CAG GGC ACT GGC AGC CAG TGT     1164Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Gln Cys

         20                  25                  30GTC TAC GTC GAC AAG CTT AGC AGC AGT GGT GCC TCA TGG CAT ACC AAA     1212Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys

     35                  40                  45TGG ACC TGG AGT GGT GGC GAG GGA ACA GTG AAA AGC TAC TCT AAC TCC     1260Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ser

 50                  55                  60GGC CTT ACG TTT GAC AAG AAG CTA GTC AGC GAT GTG TCA AGC ATT CCC     1308Gly Leu Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro65                  70                  75                  80ACC TCG GTG ACA TGG AGC CAG GAC GAC ACC AAT GTC CAA GCC GAT GTC     1356Thr Ser Val Thr Trp Ser Gln Asp Asp Thr Asn Val Gln Ala Asp Val

             85                 90                 95TCA TAT GAT CTG TTC ACC GCG GCG AAT GCG GAT CAT GCC ACT TCC AGC     1404Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Ala Asp His Ala Thr Ser Ser

        100                 105                 110GGT GAC TAT GAG CTT ATG ATT TG GTATGTGACG TCGTGAACAA                1447Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp

    115                 120GATAGATGGA GGAGGCTAAC GTAACCAG G CTT GCC CGC TAC GGC TCA GTC CAG    1500

                             Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Val Gln

                                             125CCT ATT GGC AAG CAG ATT GCC ACG GCC ACT GTG GGA GGC AAG TCC TGG     1548Pro Ile Gly Lys Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp

130                 135                 140GAG GTG TGG TAT GGT ACC AGC ACC CAG GCC GGT GCG GAG CAA AAG ACA     1596Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Thr Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys Thr145                 150                 155                 160TAT AGC TTC GTG GCA GGA TCT CCT ATC AAC TCG TGG AGT GGG GAC ATT     1644Tyr Ser Phe Val Ala Gly Ser Pro Ile Asn Ser Trp Ser Gly Asp Ile

            165                 170                 175AAG GAC TTC TTC AAC TAT CTC ACC CAG AAC CAA GGC TTC CCG GCT AGC     1692Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ser

        180                 185                 190TCT CAG CAT TTG ATC A GTGAGTTTTC CTAATTCTAC TAGCGAGCGC              1738Ser Gln His Leu Ile

    195CGGCAGTTGA AATTGGTCAC TAACAGAAGT GATGATTAG  CT CTG CAA TTT GGA          1791

                                       Thr Leu Gln Phe Gly

                                               200ACT GAG CCG TTC ACC GGT GGC CCG GCA ACC TTC ACG GTT GAC AAC TGG         1839Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp

    205                 210                 215ACC GCT AGT GTC AAC TAA AAGGCTTTAG GCGCGGCTGG GGTAAATAAC                1887Thr Ala Ser Val Asn  *

220AGCTTGTTTC  TTCGTTCTAG  AACGTCGGGC  GTGTAAGAGC  TAGAAATCCA  CCCACTCTGA  1947TTGGAAACAC  TCATTCAAGA  TCGGTACTCC  TCTTCAGCCG  AGAAAGGCAC  AGATAGTGTA  2007TCGAATCCAA  TCAAATCTAT  TTGGTGTTGC  TTAAATTCCG  AGCCAGTCCT  TTCCTTGAAA  2067GGTAATCCAC  CCGTAGCGAT  TGATCATTAA  CAGATCCGAG  TGGTGCTAGG  TTAAATTGCT  2127AACCCGATCC  CGCTCCAATT  AGCTAGCGCA  TCCGGCAGAT  TCAAACTTGA  CAGTGGGCCG  2187GGCATTACCT  GAACCTGTAG  AAGGAACAGA  CCCTTGTCTA  GAAATCTCTA  AATAGTATAA  2247GCCGAAACTT  GCCCCGGACG  TACCCTAAGC  TAAGATTGCT  CTTCGCATTC  CCAGGGGGGT  2307GAACTCTCTA  AAGAGGGAGC  ATCGCTTGCC  GATGTCTGGT  TCGGGGATCA  TGA         2360(2)SEQ ID NO：13的信息：终止子序列：AAGGCTTTAG  GCGCGGCTGG  GGTAAATAAC  AGCTTGTTTC  TTCGTTCTAG   50AACGTCGGGC  GTGTAAGAGC  TAGAAATCCA  CCCACTCTGA  TTGGAAACAC  100TCATTCAAGA  TCGGTACTCC  TCTTCAGCCG  AGAAAGGCAC  AGATAGTGTA  150TCGAATCCAA  TCAAATCTAT  TTGGTGTTGC  TTAAATTCCG  AGCCAGTCCT  200TTCCTTGAAA  GGTAATCCAC  CCGTAGCGAT  TGATCATTAA  CAGATCCGAG  250TGGTGCTAGG  TTAAATTGCT  AACCCGATCC  CGCTCCAATT  AGCTAGCGCA  300TCCGGCAGAT  TCAAACTTGA  CAGTGGGCCG  GGCATTACCT  GAACCTGTAG  350AAGGAACAGA  CCCTTGTCTA  GAAATCTCTA  AATAGTATAA  GCCGAAACTT  400GCCCCGGACG  TACCCTAAGC  TAAGATTGCT  CTTCGCATTC  CCAGGGGGGT  450GAACTCTCTA  AAGAGGGAGC  ATCGCTTGCC  GATGTCTGGT  TCGGGGATCA  500TGA                                                         5037(2)SEQ ID NO：14的信息：信号序列：

ATG AAG CTC TCC ATG ACA CTT TCC CTG TTT GCG GCC ACT GCC ATG GGC    48(2)SEQ ID NO：15的信息：信号序列

Met Lys Leu Ser Met Thr Leu Ser Leu Phe Ala Ala Thr Ala Met Gly    16

Claims (29)

1.一种从曲霉属获得的酶，其中该酶具有下面的特征：

a.MW是24235D±50D

b.pI大约是4

c.葡聚糖酶活性其中所述葡聚糖酶活性是内切β-1，4-葡聚糖酶活性。

2.一种具有SEQ.I.D.No.1所示序列，其变体，同系物或片段的酶。

3.一种由SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列或其变体，同系物或片段，或者与其互补的序列编码的酶。

4.编码权利要求1的酶的核苷酸序列。

5.编码权利要求2的酶的核苷酸序列。

6.具有SEQ.I.D.No.2所示序列，其变体，同系物或片段，或者其互补序列的核苷酸序列。

7.与一启动子操作连接的任一权利要求4至6的核苷酸序列。

8.权利要求7的核苷酸序列，其中启动子是具有如SEQ.ID.No.3所示序列或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的启动子。

9.具有SEQ.I.D.No.3所示序列或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的启动子。

10.与GOI操作连接的权利要求9的启动子。

11.权利要求10的启动子，其中启动子GOI操作连接，其中GOI包含任一项权利要求4-6的核苷酸序列。

12.具有SEQ.I.D.No.13所示核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的终止子。

13.具有SEQ.ID.No.14所示核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的信号序列。

14.包含或表达权利要求1至13之任一的本发明的构建物。

15.包含或表达权利要求1至14之任一的本发明的载体。

16.包含或表达权利要求1至15之任一的本发明的质粒。

17.包含或表达权利要求1至16之任一的本发明的转基因生物体。

18.权利要求17的转基因生物体，其中生物体是一种真菌。

19.权利要求17的转基因生物体，其中生物体是一种丝状真菌，优选曲霉属。

20.权利要求17的转基因生物体，其中生物体是一种植物。

21.权利要求17的转基因生物体，其中所述生物体是一种酵母。

22.制备权利要求1至3之任一的酶的方法，包括表达权利要求4至8之任一的核苷酸序列。

23.权利要求22的方法，其中所述酶具有SEQ.I.D.No.1所示序列，或者是其变体，同系物或片段，所述核苷酸片段具有SEQ I.D.No 2所示序列，或者是其变体，同系物或片段或者是其互补序列。

24.权利要求22或23的方法，其中通过用权利要求9的启动子控制(部分或全部)表达。

25.一种通过使用一启动子表达GOI的方法，其中启动子是权利要求9的启动子。

26.权利要求1至3之任一的酶或通过权利要求22至25之任一的方法制备的酶降解葡聚糖的用途。

27.质粒NCIMB 40704，或从中获得的核苷酸序列，其用来表达葡聚糖酶，或控制其表达，或控制另一GOI的表达。

28.一种具有降解β-1，4-葡糖苷键能力的葡聚糖酶，其与抗纯化的具有SEQ.I.D.No.1所示序列的葡聚糖酶抗体起免疫反应。

29.具有SEQ.I.D.No.15所示序列或其变体，同系物或其片段的信号序列。

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