CN101864405B

CN101864405B - 黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用

Info

Publication number: CN101864405B
Application number: CN200910155260A
Authority: CN
Inventors: 莫建初; 陈春润
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2029-12-10
Also published as: CN101864405A

Abstract

本发明提供了一种黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶，编码基因、载体及应用。所述黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶，含有与SEQ IDNo.3所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。进一步，所述的内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有与SEQ ID No.2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。本发明发现了一种编码黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该内切-β-1，4-葡聚糖酶，用于纤维素的降解，实验证明本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活达190U。本发明所提供的内切-β-1，4-葡聚糖酶及其编码基因可应用于纤维素的降解。

Description

黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用。

(二)背景技术

木质纤维素类物质是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质。据估计，全世界绿色植物每年光合作用产生的干物质达1730亿吨，所合能量为2×10²¹焦耳，相当于全世界每年消耗能量的10倍(李忠仁，生物能源的开发和利用，延边大学农学学报，2003，25(3)：225～227)。

纤维素的酶降解需要纤维素酶的参与，纤维素酶并不是一种简单的酶，而是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系统。一般来说，纤维素酶主要由三类组成：(1)内切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo--β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)，主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子链截短，产生大量带有非还原性末端的小分子纤维素和可溶性纤维寡聚糖；(2)外切-β-1，4-葡聚糖酶(Exo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.91)，主要作用于纤维素分子链的非还原末端，水解β-1，4糖苷键，产生纤维二糖；(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)，水解上述两种酶产生的纤维二糖和其他低聚糖，生成葡萄糖(Coughlin M P，Ljungdahl J G.Comparative biochemistry of fungal and bacterial cellulolyticenzyme systems.In Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation.New York Academic，1988，11-30；Goyal A，et al.Characteristics of fungalcellulases.Bioresource Technology，1991，36(1)：37-50；王兰芬.纤维素酶的作用机理及开发应用.酿酒科技，1997，6：16-17；严岩，张全福.纤维素酶的性质、应用及其环境意义.农业环境与发展，1997，1：17-20)。

随着全球人类的增长和多数国家的工业化发展，能源的消耗在急剧增加，能源危机日益严重，因此寻找新的石油替代品一直是众多科技工作者关注的问题。近年来，燃料乙醇作为石油能源的替代物，逐渐成为世界各国研究的热点。在美国，乙醇已被广泛应用在汽车燃料中取代部分石油，它们在石油燃料中加入部分乙醇，以减少石油的使用。这样既可以减少环境污染，又可以节省能源，减少成本。目前，美国等国家在混合燃料中所使用的大量乙醇都是由谷物发酵而产生的，这样成本较高，并且还会消耗掉大量的粮食。我国是一个农业大国，农林生产中所产生的生物质种类多，产量巨大，较常见的有枝桠材、稻壳、植物秸秆、玉米芯、锯末、碎木块、甘蔗渣、薪柴、禽畜粪便和城市垃圾等，是仅次于煤炭、石油和天然气的第四位能源。然而，每年用于工业过程或燃烧的木质纤维素仅占所产生木质纤维素的2％(李忠仁.生物能源的开发和利用.延边大学农学学报，2003，25(3)：225-227；王超，章超桦.酶解纤维素类物质生产燃料酒精的研究进展.纤维素科学与技术，2003，11(4)：52-59)。如果用高活性的木质纤维素酶将这些木质纤维素降解产生还原糖，再进一步发酵生产乙醇，这样既可以降低制造成本，还可以变废为宝，为燃料和能源工业服务。

自然界中，纤维素酶广泛存在于细菌、真菌、软体动物、原生动物、甲壳动物和一些昆虫如蟑螂、天牛、白蚁等的体内。其中，人们对细菌、真菌体内的纤维素酶研究得最多，而对昆虫体内的纤维素酶则研究得较少。目前有关昆虫体内纤维素酶的研究主要集中在天牛和白蚁的一些种类上。

白蚁是一类以木质纤维素为主要食源的古老生物，在地球物理循环和能量流动中起着十分重要的作用。在长期的进化过程中，白蚁为了适应纤维素类食物的消化，体内形成了非常高效的降解纤维素的纤维素酶系统。近几十年的研究结果表明，白蚁体内的纤维素酶主要由内切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组成，在一定条件下，这两种酶也具有外切-β-1，4-葡聚糖酶活性。在澳白蚁科、草白蚁科、木白蚁科、鼻白蚁科和齿白蚁科白蚁体内，纤维素的消化由白蚁自身分泌的纤维素酶和体内共生生物分泌的纤维素酶协同完成；在白蚁科白蚁体内，纤维素的消化则主要依赖头部唾液腺或中肠上皮细胞分泌的内源性纤维素酶(Martin M M.The evolution ofcellulose digestion in insects.Philosophical Transactions of the Royal Societyof London B：Biological Sciences.1991，333(1267)：281-288；李珺，等.低等白蚁肠道内原生动物的分布及其进化学意义.白蚁科技，1999，16(2)：1-7；Nakashima K，Watanabe H，Saitoh H et al.Dual cellulose-digesting system ofthe wood-feeding termite，Coptotermes formosanus Shiraki.InsectBiochemistry and Molecular Biology，2002，32：777-784)。

在当前利用纤维素酶降解纤维素的生产工艺中，最困扰人们的是如何提高纤维素酶的酶解效率和降低纤维素酶的生产成本(王景林.纤维素酶固定化的研究进展.生命科学.1997，9(3)：116-118，135)。从自然界中寻找高活性的纤维素酶和利用分子生物学技术改造纤维素酶基因，进而开发活性高、热稳定性好、底物范围广、耐酒精能力强的纤维素酶生物工程菌，是解决这一问题的有效途径。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用。

本发明采用的技术方案是：

一种内切-β-1，4-葡聚糖酶，含有与SEQ ID No.3所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的肽蛋白同源性在95％以上的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，均属于本发明保护范围之列。具体的改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

或者，所述的内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有与SEQ ID No.2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。

在本发明中，术语“内切-β-1，4-葡聚糖酶”、“黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶”或“酶OfEG”都可互换使用，该术语包括含有信号肽的多肽以及不含信号肽的成熟的内切-β-1，4-葡聚糖酶。

在本发明中，术语“内切-β-1，4-葡聚糖酶”指具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID No.2的全长序列(第1-448位)或成熟序列(第17-448位，即SEQ ID No.3)的多肽。该术语还包括具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID No.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括内切-β-1，4-葡聚糖酶的活性片段和衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与内切-β-1，4-葡聚糖酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含内切-β-1，4-葡聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了内切-β-1，4-葡聚糖酶的可溶性片段。通常，该片段具有内切-β-1，4-葡聚糖酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，最佳地约70个连续氨基酸。

发明还提供内切-β-1，4-葡聚糖酶或多肽的类似物，这些类似物与天然内切-β-1，4-葡聚糖酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明所述内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No.2中第1～448位或第17～448位(即SEQ ID No.3)氨基酸残基序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

优选的，所述的内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。或者将SEQ ID No.2氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽。

优选的，所述的内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。将SEQ ID No.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽。

本发明还涉及一种编码所述内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因。该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：

(a)具有SEQ ID No.1中第1～1726位的核苷酸序列；

(b)具有SEQ ID No.1中第152～1498位(即SEQ ID NO.4)的核苷酸序列；

(c)具有SEQ ID No.1中第200～1498位(即SEQ ID NO.5)的核苷酸序列

(d)编码具有SEQ ID No.2中第1～448位或第17～448位(即SEQ IDNO.3)氨基酸残基序列的多核苷酸；

(e)在高严谨条件下可与SEQ ID No.1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

由于核苷酸序列的特殊性，任何前述多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。

在本发明中，术语“编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸”指编码具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中第152～1498位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.1序列的编码框第152～1498位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.1中第152～1498位核苷酸序列同源性低至约70％。简并序列也能编码出SEQ ID No.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.1中从核苷酸第152～1498位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.1中从核苷酸第152～1498位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与内切-β-1，4-葡聚糖酶相同功能的蛋白的SEQ ID No.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。

本发明还包括内切-β-1，4-葡聚糖酶多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内内切-β-1，4-葡聚糖酶的表达。

优选的，所述基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

或者，所述基因具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

本发明还涉及一种含有所述基因的重组载体。以及利用所述重组载体转化、转导或转染得到的宿主细胞。

本发明中，编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体还包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pcDNA3.1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选pET载体系列以及其它原核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞、COS细胞等。

本发明还涉及所述的基因在制备内切-β-1，4-葡聚糖酶中的应用。具体方法包含：(a)在适合表达该内切-β-1，4-葡聚糖酶的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出该内切-β-1，4-葡聚糖酶。

本发明发现了一种编码黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该内切-β-1，4-葡聚糖酶，用于纤维素的降解，实验证明本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活达190U。本发明所提供的内切-β-1，4-葡聚糖酶及其编码基因可应用于纤维素的降解。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶基因(OfEG)的克隆

1.基因克隆

于冰浴条件下解剖黑翅土白蚁(取自浙江杭州)的唾液腺，并将获得的腺体迅速至于Trizol(Invitrogen)溶液中，迅速抽提其总RNA，并以oligo(dT)18为引物反转录生成cDNA。以反转录的cDNA为模板，用一对特异性引物(Primer 1：5’-aggaaggattccgcccttaacga-3’，Primer2：5’-ccgtcacccaatgcgt aatcga-3’)进行PCR扩增，将扩增到的片段进行T载体(Promega)克隆，并对其进行序列测定(Invitrogen)。

根据测序得到的结果设计特异性引物(Primer 3：5’-tgtcgacccctcttattccaacga-3’，Primer 4：5’-gtagtaactgttggcgtcggtga-3’)，分别用于扩增编码OfEG全长cDNA的3’及5’端。以总RNA为模板，利用3’及5’RACE试剂盒(Takara-Clontech)，参照试剂盒说明书，分别扩增该基因的3’端及5’端序列。分别对扩增到的片段进行T载体(Promega)克隆，并对其进行序列测定(Invitrogen)。将测序获得的序列用软件进行序列拼接，最终获得全长cDNA。

2.序列比对

利用DNAStar软件对编码OfEG的全长cDNA序列进行相关分析，发现该序列长1726bp(SEQ ID No.1)，GC含量为50.0％。其中开放阅读框(open reading frame，ORF)为1347bp(SEQ ID NO.4)，编码448个推导氨基酸残基(SEQ ID NO.2)。

利用SignalP 3.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对其推导氨基酸序列的信号肽序列进行预测分析，发现前16个氨基酸残基为信号肽序列。利用http://au.expasy.org/网站的在线工具预测该基因编码的蛋白质分子量为48.9KDa，等电点为5.25。使用在线SMART工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质的功能结构域，发现该蛋白含有一个典型的Glyco hydro 9结构域。

将该基因的ORF阅读框所包含的cDNA序列于NCBI数据库中进行BLASTn比对分析，结果显示其与多种昆虫的内切β-1，4-葡聚糖酶基因高度同源。

实施例2：黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶基因(OfEG)在大肠杆菌中的表达

将得到的黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶(OfEG)的基因编码区(SEQID NO.4)，经Sac I和Hind III双酶切后，连接入同样酶切的大肠杆菌表达质粒pET-28a(Novagen)中，转化大肠杆菌DH5α，经测序鉴定正确后得到表达质粒pET-28a-OfEG。将质粒转化至大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，并对其进行诱导表达。

将含有pET-28a-OfEG的表达菌株接种于LB培养液中，37℃培养过夜，按1∶100接种到大体积LB液体培养基中，37℃培养至OD值0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃诱导4小时。将诱导培养物离心收集菌体，用20mM Tris-HCl pH8.0 50mM NaCl 0.5mM EDTA洗菌体两遍，重悬于20mM Tris-HCl pH8.0 50mM NaCl 0.5mM EDTA 0.5mM PMSF0.5mg/ml溶菌酶中，超声处理裂解细胞，取上清测酶活，没有活性。实施例3：黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶基因(OfEG)在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹夜蛾细胞株)中的表达

将得到的黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶(OfEG)的基因编码区(SEQID NO.4)，经Not I和Hind III双酶切后，连接入同样酶切的Tn细胞表达载体pBacFastHTa(Invitrogen)中，转化大肠杆菌DH5α，经测序鉴定正确后得到表达质粒pBacFastHTa-OfEG。将质粒转化至大肠杆菌DH10Bac中，筛选阳性克隆，抽提质粒。

重组质粒在Lipofectin(GiBco Life)介导下转染Tn细胞，转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2～3周的TC-100连续传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，取上清测酶活，酶活大小为190U。

实施例4：黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活测定

内切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活测定采用Somogyi-Nelson微量法(Somogyi M，A reagent for the copper-iodometric determination of verysmall amounts of sugar.Journal of Biological Chemistry，1937，117(2)：771-776；Somogyi M，A new reagent for the determination of sugars.Journal of Biological Chemistry，1945，160(1)：61-68；Somogyi M，Notes onsugar determination.Journal of Biological Chemistry，1952，195(1)：19-23；Nelson N，A photometric adaptation of the Somogyi method for thedetermination of glucose.Journal of Biological Chemistry，1951，193(1)：375-380)，具体操作如下：

1.试剂配制

Somogyi I：将288g无水硫酸钠溶于1L煮沸的蒸馏水中，然后再依次加入24g酒石酸钾钠晶体，48g碳酸钠，32g碳酸氢钠，溶解后用蒸馏水稀释至1.6L，27℃保存。

Somogyi II：将72g无水硫酸钠溶于300ml煮沸的蒸馏水中，然后再加入8g硫酸铜，用煮沸的蒸馏水稀释至400ml，在27℃保存。

Nelson Reagent：将100g钼酸铵溶解在1.8L蒸馏水中，然后加入84ml浓硫酸，再加入100ml砷酸钠溶液(12g砷酸钠溶解在100ml蒸馏水中)，然后溶液保存在棕色瓶中并在37℃下储存24～48h，最后保存在室温下。

2.葡萄糖标准曲线的制作

在8支试管中分别装入200μg/ml标准葡萄糖0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml。再依次加入蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6ml，配成每毫升含0、20、40、60、80、100、120、140μg的葡萄糖溶液。每试管中加入铜试剂2ml(Somogyi I 1.6ml，Somogyi II 40ml)，混匀后沸水浴中加热15min，立即冷却，再加入2ml砷钼酸试剂(NelsonReagent)，振荡两分钟后用分光光度计在520nm下测定吸光值。以葡萄糖含量(μg/ml)为横坐标，520nm下吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.酶活测定

以1％(w/v)的羧甲基纤维素(溶剂为0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液pH5.6)为底物。取950μl底物与50μl酶液充分混合，在37℃下水浴30min，水解产生的还原糖采用Somogyi-Nelson微量法进行测定。最后在520nm下测定吸光值。一个酶活力单位定义为每分钟每克蛋白质所产生还原糖的微摩尔数，表示为U。

经测定，本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活达190U。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用

<130>

<160>9

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1726

<212>DNA

<213>formosan white termite

<400>1

acattccact tcagaagacg tcagtttgac attatttccc ttgttgtgca gctgaacacg 60

tagcagcagc agcttctctg taattactta taaatacgga gcgacggtcc tgcccaaata 120

atttctcggt cagcaaccac taccaaccac catgagggtc ttcgtttgcc ttctgtctgc 180

gcttgcgctt tgccaaggtg cttatgacta caagacagta ctgaggaatt cactgctgtt 240

ctacgaggct cagcgatctg gaaagttgcc cgctgatcag aaggtcacgt ggaggaagga 300

ttccgccctt aacgacaagg gacagaacgg agaggacctg acagggggat actatgacgc 360

tggtgattat gtgaaattcg gcttcccaat ggcgtccaca gctaccgtcc tggcatgggg 420

cctggtggac tatgcagcgg gctacacctc agcaggcgct ctggatgacg gtcgtaaagc 480

tgttaaatgg gccacggact acttcctcaa ggcgcacaca gccccaacag aattatacgg 540

acaagtggga aagggagatt tggaccactc ctactggggt cgtccagaag acatgacgat 600

gtcgagacct gcgttcaaga tcgacgcgtc aaatccaggg tcggatctgg ccggcgagac 660

ggccgccgcc ctcgctgcag cttccattgt gttcaaggct gtcgacccct cttattccaa 720

cgatctgctc acacacgcca agcagctttt cgacttcgcc aacaattatc gcggcaaata 780

cagtgactcc atcaccgacg ccaacagtta ctacacgtcc tatgactaca gggatgagtt 840

agtatgggca gccgcttggc tctacagggc aaccaacgac atcacctacc tcaacaccgc 900

tgaatcgcta cataatcaat tcggcctaca agactggaac ggtggtttta gctgggatgc 960

taaagtctcc ggtgtacagc ttctactggc caagctcacc aacaagcagc agtacaagga 1020

cgcgataaaa ggttacgtgg attacttaat taacgctcag cagaagacac caaaaggtct 1080

ccttttcatc gacgtgtggg gttccctgcg acatgcttca aatgcggctt ttgttatcct 1140

acaggcagca gacctcggta taagtgctgt tagttatcga cagtttgcca agaagcagat 1200

cgattacgca ttgggtgacg gtggtcgcag cttggtcgta ggatttggca ataacccacc 1260

tacacaccct caccacgctt ccagttcgtg tcccgacgcg ccggccgtat gtgactggag 1320

tacatacagc agcccggatc caaatttcca cgtgctcacc ggagctttgg tgggcggtcc 1380

ggatgtgaac gacaactacg tggacgatcg caatgattac gtccaaaacg tagtagcctg 1440

cgattacaac gcaggcttcc aatcagctgt ctccgctctc gtaacgttgg gctattaaac 1500

tcacagagca gtcactctgt ccgcctgctt tgcgtgtgta caaaataata tgaaaatgta 1560

aaattgtcct gaatagtgaa aataatgtat ttaattgcaa ttacgtccgt tgaatttgta 1620

gaagacgtta agtactacat cgggggctga agttggggat gttggtaaaa ggagacaaat 1680

aaaggaattc gtcctctgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1726

<210>2

<211>448

<212>PRT

<213>formosan white termite

<400>2

Met Arg Val Phe Val Cys Leu Leu Ser Ala Leu Ala Leu Cys Gln Gly

1 5 10 15

Ala Tyr Asp Tyr Lys Thr Val Leu Arg Asn Ser Leu Leu Phe Tyr Glu

20 25 30

Ala Gln Arg Ser Gly Lys Leu Pro Ala Asp Gln Lys Val Thr Trp Arg

35 40 45

Lys Asp Ser Ala Leu Asn Asp Lys Gly Gln Asn Gly Glu Asp Leu Thr

50 55 60

Gly Gly Tyr Tyr Asp Ala Gly Asp Tyr Val Lys Phe Gly Phe Pro Met

65 70 75 80

Ala Ser Thr Ala Thr Val Leu Ala Trp Gly Leu Val Asp Tyr Ala Ala

85 90 95

Gly Tyr Thr Ser Ala Gly Ala Leu Asp Asp Gly Arg Lys Ala Val Lys

100 105 110

Trp Ala Thr Asp Tyr Phe Leu Lys Ala His Thr Ala Pro Thr Glu Leu

115 120 125

Tyr Gly Gln Val Gly Lys Gly Asp Leu Asp His Ser Tyr Trp Gly Arg

130 135 140

Pro Glu Asp Met Thr Met Ser Arg Pro Ala Phe Lys Ile Asp Ala Ser

145 150 155 160

Asn Pro Gly Ser Asp Leu Ala Gly Glu Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala

165 170 175

Ala Ser Ile Val Phe Lys Ala Val Asp Pro Ser Tyr Ser Asn Asp Leu

180 185 190

Leu Thr His Ala Lys Gln Leu Phe Asp Phe Ala Asn Asn Tyr Arg Gly

195 200 205

Lys Tyr Ser Asp Ser Ile Thr Asp Ala Asn Ser Tyr Tyr Thr Ser Tyr

210 215 220

Asp Tyr Arg Asp Glu Leu Val Trp Ala Ala Ala Trp Leu Tyr Arg Ala

225 230 235 240

Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Leu Asn Thr Ala Glu Ser Leu His Asn Gln

245 250 255

Phe Gly Leu Gln Asp Trp Asn Gly Gly Phe Ser Trp Asp Ala Lys Val

260 265 270

Ser Gly Val Gln Leu Leu Leu Ala Lys Leu Thr Asn Lys Gln Gln Tyr

275 280 285

Lys Asp Ala Ile Lys Gly Tyr Val Asp Tyr Leu Ile Asn Ala Gln Gln

290 295 300

Lys Thr Pro Lys Gly Leu Leu Phe Ile Asp Val Trp Gly Ser Leu Arg

305 310 315 320

His Ala Ser Asn Ala Ala Phe Val Ile Leu Gln Ala Ala Asp Leu Gly

325 330 335

Ile Ser Ala Val Ser Tyr Arg Gln Phe Ala Lys Lys Gln Ile Asp Tyr

340 345 350

Ala Leu Gly Asp Gly Gly Arg Ser Leu Val Val Gly Phe Gly Asn Asn

355 360 365

Pro Pro Thr His Pro His His Ala Ser Ser Ser Cys Pro Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Val Cys Asp Trp Ser Thr Tyr Ser Ser Pro Asp Pro Asn Phe His

385 390 395 400

Val Leu Thr Gly Ala Leu Val Gly Gly Pro Asp Val Asn Asp Asn Tyr

405 410 415

Val Asp Asp Arg Asn Asp Tyr Val Gln Asn Val Val Ala Cys Asp Tyr

420 425 430

Asn Ala Gly Phe Gln Ser Ala Val Ser Ala Leu Val Thr Leu Gly Tyr

435 440 445

<210>3

<211>432

<212>PRT

<213>formosan white termite

<400>3

Ala Tyr Asp Tyr Lys Thr Val Leu Arg Asn Ser Leu Leu Phe Tyr Glu

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20 25 30

Lys Asp Ser Ala Leu Asn Asp Lys Gly Gln Asn Gly Glu Asp Leu Thr

35 40 45

Gly Gly Tyr Tyr Asp Ala Gly Asp Tyr Val Lys Phe Gly Phe Pro Met

50 55 60

Ala Ser Thr Ala Thr Val Leu Ala Trp Gly Leu Val Asp Tyr Ala Ala

65 70 75 80

Gly Tyr Thr Ser Ala Gly Ala Leu Asp Asp Gly Arg Lys Ala Val Lys

85 90 95

Trp Ala Thr Asp Tyr Phe Leu Lys Ala His Thr Ala Pro Thr Glu Leu

100 105 110

Tyr Gly Gln Val Gly Lys Gly Asp Leu Asp His Ser Tyr Trp Gly Arg

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Ala Ser Ile Val Phe Lys Ala Val Asp Pro Ser Tyr Ser Asn Asp Leu

165 170 175

Leu Thr His Ala Lys Gln Leu Phe Asp Phe Ala Asn Asn Tyr Arg Gly

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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420 425 430

<210>4

<211>1347

<212>DNA

<213>formosan white termite

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atgagggtct tcgtttgcct tctgtctgcg cttgcgcttt gccaaggtgc ttatgactac 60

aagacagtac tgaggaattc actgctgttc tacgaggctc agcgatctgg aaagttgccc 120

gctgatcaga aggtcacgtg gaggaaggat tccgccctta acgacaaggg acagaacgga 180

gaggacctga cagggggata ctatgacgct ggtgattatg tgaaattcgg cttcccaatg 240

gcgtccacag ctaccgtcct ggcatggggc ctggtggact atgcagcggg ctacacctca 300

gcaggcgctc tggatgacgg tcgtaaagct gttaaatggg ccacggacta cttcctcaag 360

gcgcacacag ccccaacaga attatacgga caagtgggaa agggagattt ggaccactcc 420

tactggggtc gtccagaaga catgacgatg tcgagacctg cgttcaagat cgacgcgtca 480

aatccagggt cggatctggc cggcgagacg gccgccgccc tcgctgcagc ttccattgtg 540

ttcaaggctg tcgacccctc ttattccaac gatctgctca cacacgccaa gcagcttttc 600

gacttcgcca acaattatcg cggcaaatac agtgactcca tcaccgacgc caacagttac 660

tacacgtcct atgactacag ggatgagtta gtatgggcag ccgcttggct ctacagggca 720

accaacgaca tcacctacct caacaccgct gaatcgctac ataatcaatt cggcctacaa 780

gactggaacg gtggttttag ctgggatgct aaagtctccg gtgtacagct tctactggcc 840

aagctcacca acaagcagca gtacaaggac gcgataaaag gttacgtgga ttacttaatt 900

aacgctcagc agaagacacc aaaaggtctc cttttcatcg acgtgtgggg ttccctgcga 960

catgcttcaa atgcggcttt tgttatccta caggcagcag acctcggtat aagtgctgtt 1020

agttatcgac agtttgccaa gaagcagatc gattacgcat tgggtgacgg tggtcgcagc 1080

ttggtcgtag gatttggcaa taacccacct acacaccctc accacgcttc cagttcgtgt 1140

cccgacgcgc cggccgtatg tgactggagt acatacagca gcccggatcc aaatttccac 1200

gtgctcaccg gagctttggt gggcggtccg gatgtgaacg acaactacgt ggacgatcgc 1260

aatgattacg tccaaaacgt agtagcctgc gattacaacg caggcttcca atcagctgtc 1320

tccgctctcg taacgttggg ctattaa 1347

<210>5

<211>1299

<212>DNA

<213>formosan white termite

<400>5

gcttatgact acaagacagt actgaggaat tcactgctgt tctacgaggc tcagcgatct 60

ggaaagttgc ccgctgatca gaaggtcacg tggaggaagg attccgccct taacgacaag 120

ggacagaacg gagaggacct gacaggggga tactatgacg ctggtgatta tgtgaaattc 180

ggcttcccaa tggcgtccac agctaccgtc ctggcatggg gcctggtgga ctatgcagcg 240

ggctacacct cagcaggcgc tctggatgac ggtcgtaaag ctgttaaatg ggccacggac 300

tacttcctca aggcgcacac agccccaaca gaattatacg gacaagtggg aaagggagat 360

ttggaccact cctactgggg tcgtccagaa gacatgacga tgtcgagacc tgcgttcaag 420

atcgacgcgt caaatccagg gtcggatctg gccggcgaga cggccgccgc cetcgctgca 480

gcttccattg tgttcaaggc tgtcgacccc tcttattcca acgatctgct cacacacgcc 540

aagcagcttt tcgacttcgc caacaattat cgcggcaaat acagtgactc catcaccgac 600

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<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

aggaaggatt ccgcccttaa cga 23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

ccgtcaccca atgcgtaatc ga 22

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

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<400>8

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<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

gtagtaactg ttggcgtcgg tga 23

Claims

1.一种内切-β-1，4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

3.权利要求2所述的基因在制备内切-β-1，4-葡聚糖酶中的应用。