CN109825488A - 一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，PCR产物回收得到目的基因核苷酸序列Signal peptide‑Xylnase‑6×His，将目的基因克隆表达载体pET28a中，测序确认得到正确的重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌菌株；向样品中添加IPTG，样品诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达。本发明能够将木聚糖酶直接分泌到培养基中；相比于原来的大肠杆菌胞内和或者酵母分泌表达，既能保证高的木聚糖酶活性，同时更容易操作，更省时，且成本更低。

Description

一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。尤其涉及一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

目前制备木聚糖酶的方法主要有两类:一类大肠杆菌胞内表达，将目的基因克隆进大肠杆菌常用表达载体pET28a、pET26b中进行常规胞内表达，其需要复杂的细菌破碎和纯化方法的步骤，同时无法避免由于物理作用对木聚糖酶的活性低纯度低等问题，因此现有的研究成果均不建议在大肠杆菌中进行木聚糖酶的表达；另一类是毕赤酵母或酿酒酵母分泌表达，酵母细胞具有培养周期长，生长培养基复杂，生长环境十分严格等特点，一般的表达周期需要至少需要5天以上，此外毕赤酵母的生长pH一般需要严格控制在5.5-6.0左右，这将非常不利于碱性木聚糖酶在毕赤酵母中的表达。

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物细胞干重的15％-30％，是除纤维素之外自然界中最为丰富的多聚糖，也是自然界中最为重要的可再生资源之一。木聚糖的降解利用需要丰富的木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成，而其中木聚糖酶是其中最关键的水解酶。同时，木聚糖酶因为其优异的水解多聚糖为低聚糖的特性，使其在造纸、生物能源、食品、饲料工业等行业中具有广阔的应用前景。此外，工业中木聚糖酶大规模生物应用可以减少传统化学处理方法造成的环境污染。

为了扩大木聚糖酶在工业中的应用，其中一个关键因素是开发一种低成本，省时，高产的生产方法。

由于大肠杆菌易于操作，快速生长和培养成本极低的特性，若是能解决胞内表达产量低，木聚糖酶的活性低纯度低等问题，将会是理想的木聚糖酶异源表达宿主细胞。因而，开发木聚糖酶的分泌表达策略将有利于工业中木聚糖酶的大规模生物生产，其不需要细胞裂解步骤并避免了细胞裂解造成的复杂内源蛋白释放和活性降低的影响。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，木聚糖酶的异源表达通过毕赤酵母或酿酒酵母分泌表达，大肠杆菌胞内表达。酵母细胞具有培养周期长，生长培养基复杂，生长环境十分严格等特点，表达周期需要至少需要5天以上，；对于大肠杆菌胞内表达，需要复杂的细菌破碎和纯化方法的步骤，无法避免由于物理作用对木聚糖酶的活性低纯度低等问题。

(2)木聚糖酶需要维持正确的蛋白结构以维持较高的酶活活性，同时对于碱性木聚糖酶而言需要更高的pH条件来保证高活性蛋白酶的表达，因此需要在简单易操作的宿主中寻求更优化的表达条件。

(3)目前为止对于木聚糖酶生产还没有大肠杆菌分泌表达的更多报道，大肠杆菌周质空间的大量分子伴侣可在分泌途径中有效地协助分泌蛋白正确折叠，因而，因此对于建立一个新的表达系统，需要从其本身性质出发考虑选择，设法发掘到有效的信号肽帮助其在大肠杆菌中的分泌。

解决上述技术问题的难度和意义：

木聚糖酶在医药、食品、造纸、动物饲养等工业中均应用广泛，开发使用大肠杆菌等原核表达系统并进行大规模生产可以大幅度缩短实践应用中的生产时间以及减少生产成本，进而提高工作效率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法。

本发明是这样实现的，一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，所述在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法包括：

第一步，获取所需木聚糖酶基因，从多种信号肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1～SEQID NO：7合成得到不同的信号肽的序列SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：14；

第二步，通过融合PCR的方式将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子SEQ ID NO：15，PCR产物回收得到，核苷酸序列Signal peptide-Xylnase-6×His；

第三步，将第二步的核苷酸序列SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23Signalpeptide-Xylnase-6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28aSEQ ID NO：24中,测序确认得到正确的重组表达载体(该测序正确的表达载体对应于使用pET28a的通用引物T7/T7-TER测序后，得到SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23对应的正确表达框)；

第四步，将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购买于美国英杰公司(Carlsbad,CA,USA))；

第五步，分别挑取转化成功的单克隆表达菌株(为上述大肠杆菌BL21(DE3)菌株转化了表达载体的重组菌株。)接种于2ml LB培养基中过夜培养，12-14h；

第六步，分别将过夜培养的菌液接种于含有50ml LB培养基的培养瓶中，培养；

第七步，向样品中添加IPTG，样品诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达；

第八步，诱导完成的样品，离心，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。

进一步，第二步中，融合PCR为通过20bp的同源臂将片段A和片段B连接形成一个AB片段的酶链式聚合反应；

第四步中，转化为将DNA导入有机体使得该DNA作为染色体外的元件复制。

进一步，第六步中，将过夜培养的菌液以1:100的比列接种于含有50ml LB培养基的培养瓶中，37度培养至OD600＝0.6-0.8；

第七步中，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG，将样品置于18℃诱导培养20h。

第八步中，诱导完成的样品在17000rmp,4℃条件下离心10min，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。

进一步，第八步中，收集得到的木聚糖酶粗酶液直接用于使用SDS-PAGE检测，浓度和活性分析，同时直接使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到纯蛋白。

进一步，第三步中，碱性木聚糖酶XynHB大肠杆菌分泌表达载体的构建包括：

1)碱性木聚糖酶XynHB来源于枯草芽孢杆菌HBP8，并且去除自身N端的27个氨基酸信号肽的成熟形式；

2)通过在木聚糖酶成熟XynHB中N端融合可促进蛋白质进行胞外分泌的信号肽；

3)信号肽包括表征良好的来源于Sec途径的信号肽OmpA、PelB、PhoA、Lpp,Tat途径的信号肽TorA、Fdog,以及来源于Sec-Tat途径的的信号肽FhuD；

4)根据大肠杆菌密码子偏好表得到分别对应于各个信号肽的基因序列，同时在信号肽C末端添加和XynHB同源的20bp用于融合PCR；

5)片段Signal peptide-Xylnase-6×His的制备；

6)用NcoI和XhoI对载体pET28a和连接产物进行双酶切，酶切反应于37℃下进行6h，切胶回收目的片段，用DNA纯化试剂盒回收经NcoI和XhoI线性化的载体和目的片段；

7)根据各片段的回收情况确定连接体系，用T4DNA连接酶在16℃过夜连接；

8)将10ul的连接产物转化到克隆宿主XL-Gold中，次日对单菌落进行菌落PCR验证，正确的转化子提质粒酶切，并测序验证重组表达载体构建成功。

进一步，步骤5)片段Signal peptide-Xylnase-6×His的制备，具体包括：

融合PCR反应体系(100μL):Pfu 4μL，模板A+B＝20～30ng(根据两个片段的实际浓度，以摩尔币为1:1计算片段Signal peptide和XynHB的添加量)，上下游引物各3μL，KODbuffer 10ul,dNTP 4μL,灭菌的ddH2O定溶至100μL；

PCR扩增条件:95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min；

PCR后跑0.8％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收连接产物。

进一步，步骤7)根据各片段的回收情况确定连接体系，用T4DNA连接酶在16℃过夜连接；

连接体系(20μL):T4DNA ligase 0.2μL，T4DNA ligase buffer 2ul,载体+片段＝120ng，灭菌的ddH2O定溶至20μL。根据两个片段的实际浓度，以摩尔币载体：片段＝1:3计算载体和片段的添加量。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供一种可以在大肠杆菌中有效地进行木聚糖酶分泌表达的方法，大肠杆菌分泌系统的利用能有效的降低木聚糖酶的生产成本，缩短木聚糖酶纯化的时间，并且维持木聚糖酶的高活性。本发明将有利于木聚糖酶在科研和工业领域的进一步发展。

本发明利用信号肽在大肠杆菌中初次建立了木聚糖酶分泌表达系统，大肠杆菌易于培养，培养基组成简单，更有利于木聚糖酶的大规模工业应用。

目前为止有大量表征良好的信号肽原始序列或者突变体库，可参考所表达木聚酶基因的性质和来源进行选择多种途径的信号肽，以此获得最佳效果。

本发明将目的蛋白直接分泌到培养基中，相比于胞内和周质表达，不需要破碎细胞，回收与纯化更能容易操作。另外，培养基中空间足够大，利于重组蛋白的过量表达。分泌表达的木聚糖酶产量大，纯度高，大肠杆菌胞内杂蛋白含量少，可浓缩进行纯化，并保持酶的高活性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法流程图。

图2是本发明实施例提供的纯化收集的木聚糖酶样品首先使用SDS-PAGE进行分析图。

图中：图2A是本发明实施例提供的XynHB的培养上清液用0.5mM IPTG诱导20小时的胶图。图2B是本发明实施例提供的XynHB的40ml培养上清液Ni柱纯化后的胶图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，木聚糖酶的异源表达通过毕赤酵母或酿酒酵母分泌表达，大肠杆菌胞内表达。酵母细胞具有培养周期长，生长培养基复杂，生长环境十分严格等特点，表达周期需要至少需要5天以上，毕赤酵母的生长pH一般需要严格控制在5.5-6.0，将非常不利于碱性木聚糖酶在毕赤酵母中的表达；对于大肠杆菌胞内表达，需要复杂的细菌破碎和纯化方法的步骤，无法避免由于物理作用对木聚糖酶的活性低纯度低等问题。

为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法包括：

S101,获取所需木聚糖酶基因，从一种或多种信号肽的氨基酸序列出发合成得到不同的信号肽的基因序列，本发明使用的信号肽氨基酸序列表格1中所示。

S102,通过融合PCR的方式将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签(His taq)的密码子，PCR产物回收得到，核苷酸序列Signal peptide-Xylnase-6×His；所述“融合PCR”是通过20bp左右的同源臂将片段A和片段B连接形成一个AB片段的酶链式聚合反应。

S103,将步骤S102确定的核苷酸序列Signal peptide-Xylnase-6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,测序确认得到正确的重组表达载体。

S104,将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。所述“转化”“转化”是指将DNA导入有机体使得该DNA作为染色体外的元件是可复制。

S105,分别挑取转化成功的单克隆表达菌株接种于2ml LB培养基中过夜培养，约12-14h。

S106,分别将过夜培养的菌液以1:100的比列接种于含有50ml LB培养基的培养瓶中，37度培养至OD600＝0.6-0.8。所述体积为小量体积，如若需要将样品进一步扩大，以1:100的比列接种于更大的体系中即可。

S107,向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG，将样品置于18℃诱导培养20h。诱导表达完成后，信号肽可引导木聚糖酶直接分泌到培养基中，不需要破壁，实现了木聚糖酶的高效分泌表达。

S108,诱导完成的样品在17000rmp,4℃条件下离心10min，收集上清即得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。

步骤S108中收集得到的木聚糖酶粗酶液可直接可用于使用SDS-PAGE检测，浓度和活性分析，同时直接使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到纯蛋白。

步骤S102中，密码子基因序列为SEQ ID NO：15。

步骤S103中，将步骤S102中的核苷酸序列为SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：23Signalpeptide-Xylnase-6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28aSEQ ID NO：24中,测序确认得到正确的重组表达载体(该测序正确的表达载体对应于使用pET28a的通用引物T7/T7-TER测序后，得到SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：23对应的正确表达框)。

步骤S104中，大肠杆菌BL21(DE3)菌株购买于美国英杰公司(Carlsbad,CA,USA)。

步骤S105中，分单克隆表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株转化了表达载体的重组菌株。

在本发明的具体实施中，所述分泌表达策略是通过在木聚糖酶的氨基末端融合不同的分泌信号肽。

所述信号肽“信号肽”是一种来源于可分泌蛋白的前体蛋白形式中的可切除的氨基酸信号序列。蛋白转运穿过细胞膜，即“分泌”，一般具有一约15至30个氨基酸长度的富含疏水氨基酸的N-末端序列。有时，在穿过细胞膜的过程中，大多数的该信号序列被信号肽酶酶切。信号肽的实际效果根据木聚糖酶来源、诱导条件的不同有差异。

所述信号肽包括表征良好的来源于Sec途径的OpmA、PelB、PhoA、Lpp,Tat途径的TorA、Fdog以及来源于Sec-Tat双途径信号肽FhuD。

所述信号肽氨基酸序列如表所示

所用表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1:碱性木聚糖酶XynHB大肠杆菌分泌表达载体的构建：

1)在本发明的具体实施中，碱性木聚糖酶XynHB来源于枯草芽孢杆菌HBP8，并且已去除自身N端的27个氨基酸信号肽的成熟形式。(NCBI：AY954630.1)。

2)在本发明的具体实施中，所述分泌表达策略是通过在木聚糖酶成熟XynHB中N端融合可促进蛋白质进行胞外分泌的信号肽。

3)所述信号肽包括表征良好的来源于Sec途径的信号肽OmpA、PelB、PhoA、Lpp,Tat途径的信号肽TorA、Fdog,以及来源于Sec-Tat途径的的信号肽FhuD。所述信号肽氨基酸序列如下表所示

4)根据大肠杆菌密码子偏好表得到分别对应于各个信号肽的基因序列，同时在信号肽C末端添加和XynHB同源的20bp用于融合PCR，在上海生物工程有限公司进行基因合成：每个信号肽完整的基因序列如下所示，其中小写字母表示与XynHB进行融合PCR的同源臂：

OmpA:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQ ID NO：8

PelB:

ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQ ID NO：9

PhoA:

ATGAAACAATCAACCATTGCACTGGCACTTTTACCCCTGCTTTTCACTCCGGTGACTAAGGCCGGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQ ID NO：10

Lpp:ATGAAAGCGACAAAGTTGGTTCTGGGCGCGGTAATCTTAGGATCAACGCTTCTGGCAGGAGGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQ ID NO：11

TorA:ATGAATAACAACGACCTTTTTCAGGCGAGTAGACGCCGGTTTTTAGCGCAGTTGGGTGGCCTGACCGTGGCCGGAATGTTAGGTCCTAGCTTGTTGACGCCCCGGCGGGCCACCGCCGCTCAGGCTGCGACCGATGCGGGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQ ID NO：12

Fdog:ATGCAGGTCAGCAGACGGCAGTTTTTCAAGATATGCGCTGGGGGTATGGCAGGAACAACGGCGGCTGCGCTGGGATTCGCTCCGTCGGTTGCACTTGCCGAAACTCGCCAATACAAACTTGGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQ ID NO：13

FhuD:

ATGTCAGGTTTGCCCCTTATATCGCGGCGTCGTTTACTGACCGCGATGGCATTATCCCCCTTGCTGTGGCAAATGAATACGGCCCATGCAGCAGCTATAGACCCAAAC GGATCCgcggaaacgatttatgataa SEQID NO：14。

5)片段Signal peptide-Xylnase-6×His的制备：

融合PCR反应体系(100μL):Pfu 4μL，模板A+B＝20～30ng(根据两个片段的实际浓度，以摩尔币为1:1计算片段Signal peptide和XynHB的添加量)，上下游引物各3μL(上下游引物待反应进行至7-8个循环时才添加到体系中)，KOD buffer 10ul,dNTP 4μL,灭菌的ddH2O定溶至100μL。

PCR扩增条件:95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min；

PCR后跑0.8％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收连接产物。

6)用NcoI和XhoI对载体pET28a和连接产物进行双酶切，酶切反应于37℃下进行6h，切胶回收目的片段，用DNA纯化试剂盒回收经NcoI和XhoI线性化的载体和目的片段。

7)根据各片段的回收情况确定连接体系，用T4DNA连接酶在16℃过夜连接。

连接体系(20μL):T4DNA ligase 0.2μL，T4DNA ligase buffer 2ul,载体+片段＝120ng，灭菌的ddH2O定溶至20μL。根据两个片段的实际浓度，以摩尔币载体：片段＝1:3计算载体和片段的添加量；

8)将10ul的连接产物转化到克隆宿主XL-Gold中，次日对单菌落进行菌落PCR验证，正确的转化子提质粒酶切，并测序验证重组表达载体构建成功。

实施例2

碱性木聚糖酶XynHB大肠杆菌中的分泌表达：

1)将构建成功的XynHB表达载体分别转化于大肠杆菌BL21(DE3)菌株，涂布于kana抗性平板中过夜培养至单克隆长出。

2)从平板上挑取单克隆转接于3ml LB(含有50ug/ml卡那霉素)中，置于37℃、200rpm摇床过夜培养12-14h。

3)以1％的接种量转接进50mlLB(含有50ug/ml卡那霉素)中，37℃继续培养至O D。6 0 0为0.5-0.6时加入终浓度为0.5mM IPTG,置于18℃摇床诱导20h。

4)诱导完成的样品在高速冷冻离心机中，以17000rmp,4℃条件下离心15min，收集上清即得到分泌于培养基中的木聚糖粗酶样品。

5)木聚糖酶的纯化与鉴定:

i)离心收集的木聚糖酶样品首先使用SDS-PAGE进行分析，结果如图2A所示，目的条带大小为22Kda，其中Sec途径的信号肽PelB,OmpA,以及Sec-Tat途径的信号肽FhuD对碱性木聚糖酶XynHB有促进效果，灰度分析得到信号肽PelB的分泌效果最好，粗酶液浓度达到0.11mg/ml，OmpA和FhuD的粗酶液浓度分别为0.02mg/ml和0.032mg/ml.

ii)使用木聚糖为底物测定50ml粗酶液样品中，最高总酶活能达到1685.4±105.5。

iii)将剩余的40ml木聚糖酶样品分10次上样到用平衡缓冲液(50mM

Tris-HCl，200mM NaCl和40mM咪唑，pH8.0)预平衡的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱中，每次上样后用相同的缓冲液进行洗涤，用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，200mM NaCl和200mM咪唑，pH8.0)洗脱XynHB，然后使用离心过滤装置浓缩成钟体积1ml,至储存缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0)。使用考马斯亮蓝G-250和使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的比色法用于测量培养上清液或纯化样品中XynHB的浓度。

iv)纯化收集的木聚糖酶样品首先使用SDS-PAGE进行分析，结果如图2A所示，得到单一目的条带，大小为22KDa，其中信号肽PelB具有最好的分泌效果，信号肽FhuD效果次之。使用粗酶液进行了活性测定，结果如下表所示。

分泌上清中木聚糖酶的浓度及活性

图2B本发明实施例提供的XynHB的40ml培养上清液Ni柱纯化后的胶图。

v)活性分析表明在菌株BL21(DE3)中，纯化后的信号肽PelB和FhuD的酶活分别达到585.3±9.8U和351.1±23.9U,其中FhuD的比酶活高达1729.4±117.5(U/mg)。如图2XynHB的培养上清液用0.5mM IPTG诱导20小时。泳道M，蛋白质Marker；NC阴性对照，对应于仅用pET28a质粒转化的菌株；第1-7道，XynHB分别用信号肽PelB，OmpA，Lpp，PhoA TorA，Fdog和Fhud表达的粗酶液。B)来自40mL细胞培养基的纯化的XynHB。泳道1-3相对应于不含信号肽纯化的Xyl或相应的用信号肽PelB，OmpA和FhuD表达的粗酶液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gly

20

<210> 5

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala

1 5 10 15

Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu

20 25 30

Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala Gln Ala Ala Thr Asp Ala

35 40 45

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gln Val Ser Arg Arg Gln Phe Phe Lys Ile Cys Ala Gly Gly Met

1 5 10 15

Ala Gly Thr Thr Ala Ala Ala Leu Gly Phe Ala Pro Ser Val Ala Leu

20 25 30

Ala Glu Thr Arg Gln Tyr Lys Leu

35 40

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ser Gly Leu Pro Leu Ile Ser Arg Arg Arg Leu Leu Thr Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Ser Pro Leu Leu Trp Gln Met Asn Thr Ala His Ala Ala Ala

20 25 30

Ile Asp Pro Asn

35

<210> 8

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gccggatccg cggaaacgat ttatgataa 89

<210> 9

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccggat ccgcggaaac gatttatgat aa 92

<210> 10

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaaacaat caaccattgc actggcactt ttacccctgc ttttcactcc ggtgactaag 60

gccggatccg cggaaacgat ttatgataa 89

<210> 11

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgaaagcga caaagttggt tctgggcgcg gtaatcttag gatcaacgct tctggcagga 60

ggatccgcgg aaacgattta tgataa 86

<210> 12

<211> 164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaataaca acgacctttt tcaggcgagt agacgccggt ttttagcgca gttgggtggc 60

ctgaccgtgg ccggaatgtt aggtcctagc ttgttgacgc cccggcgggc caccgccgct 120

caggctgcga ccgatgcggg atccgcggaa acgatttatg ataa 164

<210> 13

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcaggtca gcagacggca gtttttcaag atatgcgctg ggggtatggc aggaacaacg 60

gcggctgcgc tgggattcgc tccgtcggtt gcacttgccg aaactcgcca atacaaactt 120

ggatccgcgg aaacgattta tgataa 146

<210> 14

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtcaggtt tgccccttat atcgcggcgt cgtttactga ccgcgatggc attatccccc 60

ttgctgtggc aaatgaatac ggcccatgca gcagctatag acccaaacgg atccgcggaa 120

acgatttatg ataa 134

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catcatcatc atcatcac 18

<210> 16

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gccggatccg cggaaacgat ttatgataat agaataggca cacacagcgg atacgatttt 120

gaattatgga aggattacgg aaatacctcg atgacactca ataacggcgg ggcatttagt 180

gcaagctgga acaatatcgg aaatgcctta tttcgaaaag gaaagaagtt tgattccact 240

aaaactcatc atcaacttgg caacatctcc atcaactaca acgcagcctt taacccgggc 300

gggaattcct atttatgtgt ctatggctgg acacaatctc cattagctga atactacatt 360

gttgagtcat ggggcacata tcgtccaaca gggacgtata aaggatcatt ttatgccgat 420

ggaggcacat atgacatata tgaaacgctc cgtgtcaatc agccttctat cattggagac 480

gctaccttca aacaatattg gagtgtacgt caaacaaaac gcacaagcgg aactgtctct 540

gtcagtgagc attttaaaaa atgggaaagc ttaggcatgc caatgggaaa aatgtatgaa 600

acagcattaa ctgtagaagg ctaccgaagc aacggaagtg cgaatgtcat gacgaatcag 660

ctgatgattc gacatcatca tcatcatcac taa 693

<210> 17

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccggat ccgcggaaac gatttatgat aatagaatag gcacacacag cggatacgat 120

tttgaattat ggaaggatta cggaaatacc tcgatgacac tcaataacgg cggggcattt 180

agtgcaagct ggaacaatat cggaaatgcc ttatttcgaa aaggaaagaa gtttgattcc 240

actaaaactc atcatcaact tggcaacatc tccatcaact acaacgcagc ctttaacccg 300

ggcgggaatt cctatttatg tgtctatggc tggacacaat ctccattagc tgaatactac 360

attgttgagt catggggcac atatcgtcca acagggacgt ataaaggatc attttatgcc 420

gatggaggca catatgacat atatgaaacg ctccgtgtca atcagccttc tatcattgga 480

gacgctacct tcaaacaata ttggagtgta cgtcaaacaa aacgcacaag cggaactgtc 540

tctgtcagtg agcattttaa aaaatgggaa agcttaggca tgccaatggg aaaaatgtat 600

gaaacagcat taactgtaga aggctaccga agcaacggaa gtgcgaatgt catgacgaat 660

cagctgatga ttcgacatca tcatcatcat cactaa 696

<210> 18

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgaaacaat caaccattgc actggcactt ttacccctgc ttttcactcc ggtgactaag 60

gccggatccg cggaaacgat ttatgataat agaataggca cacacagcgg atacgatttt 120

gaattatgga aggattacgg aaatacctcg atgacactca ataacggcgg ggcatttagt 180

gcaagctgga acaatatcgg aaatgcctta tttcgaaaag gaaagaagtt tgattccact 240

aaaactcatc atcaacttgg caacatctcc atcaactaca acgcagcctt taacccgggc 300

gggaattcct atttatgtgt ctatggctgg acacaatctc cattagctga atactacatt 360

gttgagtcat ggggcacata tcgtccaaca gggacgtata aaggatcatt ttatgccgat 420

ggaggcacat atgacatata tgaaacgctc cgtgtcaatc agccttctat cattggagac 480

gctaccttca aacaatattg gagtgtacgt caaacaaaac gcacaagcgg aactgtctct 540

gtcagtgagc attttaaaaa atgggaaagc ttaggcatgc caatgggaaa aatgtatgaa 600

acagcattaa ctgtagaagg ctaccgaagc aacggaagtg cgaatgtcat gacgaatcag 660

ctgatgattc gacatcatca tcatcatcac taa 693

<210> 19

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgaaagcga caaagttggt tctgggcgcg gtaatcttag gatcaacgct tctggcagga 60

ggatccgcgg aaacgattta tgataataga ataggcacac acagcggata cgattttgaa 120

ttatggaagg attacggaaa tacctcgatg acactcaata acggcggggc atttagtgca 180

agctggaaca atatcggaaa tgccttattt cgaaaaggaa agaagtttga ttccactaaa 240

actcatcatc aacttggcaa catctccatc aactacaacg cagcctttaa cccgggcggg 300

aattcctatt tatgtgtcta tggctggaca caatctccat tagctgaata ctacattgtt 360

gagtcatggg gcacatatcg tccaacaggg acgtataaag gatcatttta tgccgatgga 420

ggcacatatg acatatatga aacgctccgt gtcaatcagc cttctatcat tggagacgct 480

accttcaaac aatattggag tgtacgtcaa acaaaacgca caagcggaac tgtctctgtc 540

agtgagcatt ttaaaaaatg ggaaagctta ggcatgccaa tgggaaaaat gtatgaaaca 600

gcattaactg tagaaggcta ccgaagcaac ggaagtgcga atgtcatgac gaatcagctg 660

atgattcgac atcatcatca tcatcactaa 690

<210> 20

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgaataaca acgacctttt tcaggcgagt agacgccggt ttttagcgca gttgggtggc 60

ctgaccgtgg ccggaatgtt aggtcctagc ttgttgacgc cccggcgggc caccgccgct 120

caggctgcga ccgatgcggg atccgcggaa acgatttatg ataatagaat aggcacacac 180

agcggatacg attttgaatt atggaaggat tacggaaata cctcgatgac actcaataac 240

ggcggggcat ttagtgcaag ctggaacaat atcggaaatg ccttatttcg aaaaggaaag 300

aagtttgatt ccactaaaac tcatcatcaa cttggcaaca tctccatcaa ctacaacgca 360

gcctttaacc cgggcgggaa ttcctattta tgtgtctatg gctggacaca atctccatta 420

gctgaatact acattgttga gtcatggggc acatatcgtc caacagggac gtataaagga 480

tcattttatg ccgatggagg cacatatgac atatatgaaa cgctccgtgt caatcagcct 540

tctatcattg gagacgctac cttcaaacaa tattggagtg tacgtcaaac aaaacgcaca 600

agcggaactg tctctgtcag tgagcatttt aaaaaatggg aaagcttagg catgccaatg 660

ggaaaaatgt atgaaacagc attaactgta gaaggctacc gaagcaacgg aagtgcgaat 720

gtcatgacga atcagctgat gattcgacat catcatcatc atcactaa 768

<210> 21

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgcaggtca gcagacggca gtttttcaag atatgcgctg ggggtatggc aggaacaacg 60

gcggctgcgc tgggattcgc tccgtcggtt gcacttgccg aaactcgcca atacaaactt 120

ggatccgcgg aaacgattta tgataataga ataggcacac acagcggata cgattttgaa 180

ttatggaagg attacggaaa tacctcgatg acactcaata acggcggggc atttagtgca 240

agctggaaca atatcggaaa tgccttattt cgaaaaggaa agaagtttga ttccactaaa 300

actcatcatc aacttggcaa catctccatc aactacaacg cagcctttaa cccgggcggg 360

aattcctatt tatgtgtcta tggctggaca caatctccat tagctgaata ctacattgtt 420

gagtcatggg gcacatatcg tccaacaggg acgtataaag gatcatttta tgccgatgga 480

ggcacatatg acatatatga aacgctccgt gtcaatcagc cttctatcat tggagacgct 540

accttcaaac aatattggag tgtacgtcaa acaaaacgca caagcggaac tgtctctgtc 600

agtgagcatt ttaaaaaatg ggaaagctta ggcatgccaa tgggaaaaat gtatgaaaca 660

gcattaactg tagaaggcta ccgaagcaac ggaagtgcga atgtcatgac gaatcagctg 720

atgattcgac atcatcatca tcatcactaa 750

<210> 22

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgtcaggtt tgccccttat atcgcggcgt cgtttactga ccgcgatggc attatccccc 60

ttgctgtggc aaatgaatac ggcccatgca gcagctatag acccaaacgg atccgcggaa 120

acgatttatg ataatagaat aggcacacac agcggatacg attttgaatt atggaaggat 180

tacggaaata cctcgatgac actcaataac ggcggggcat ttagtgcaag ctggaacaat 240

atcggaaatg ccttatttcg aaaaggaaag aagtttgatt ccactaaaac tcatcatcaa 300

cttggcaaca tctccatcaa ctacaacgca gcctttaacc cgggcgggaa ttcctattta 360

tgtgtctatg gctggacaca atctccatta gctgaatact acattgttga gtcatggggc 420

acatatcgtc caacagggac gtataaagga tcattttatg ccgatggagg cacatatgac 480

atatatgaaa cgctccgtgt caatcagcct tctatcattg gagacgctac cttcaaacaa 540

tattggagtg tacgtcaaac aaaacgcaca agcggaactg tctctgtcag tgagcatttt 600

aaaaaatggg aaagcttagg catgccaatg ggaaaaatgt atgaaacagc attaactgta 660

gaaggctacc gaagcaacgg aagtgcgaat gtcatgacga atcagctgat gattcgacat 720

catcatcatc atcactaa 738

<210> 23

<211> 5369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360

caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420

ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480

gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540

gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600

ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660

caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720

tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780

agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840

ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900

ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960

gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020

taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080

cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140

cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200

tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260

tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860

acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040

ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100

tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160

gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220

tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280

cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340

catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400

gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460

catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520

tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580

taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640

atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700

gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760

aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020

ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080

tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140

gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800

gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369

Claims (7)

1.一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，所述在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法包括：

第一步，获取所需木聚糖酶基因，从多种信号肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：7合成得到不同的信号肽的核苷酸序列SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：14；

第二步，通过融合PCR的方式将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，PCR产物回收得到核苷酸序列Signalpeptide-Xylnase-6×His；

第三步，将第二步的核苷酸序列Signal peptide-Xylnase-6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,测序确认得到正确的重组表达载体；

第四步，将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21菌株；

第五步，分别挑取转化成功的单克隆表达菌株接种于2ml LB培养基中过夜培养，12-14h；

第六步，分别将过夜培养的菌液接种于含有50ml LB培养基的培养瓶中，培养；

第七步，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达；

第八步，诱导完成的样品，离心，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。

2.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第二步中，融合PCR为通过20bp的同源臂将片段A和片段B连接形成一个AB片段的酶链式聚合反应；

第四步中，转化为将DNA导入有机体使得该DNA作为染色体外的元件复制。

3.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第六步中，将过夜培养的菌液以1:100的比列接种于含有50ml LB培养基的培养瓶中，37度培养至OD600＝0.6-0.8；

第七步中，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG，将样品置于18℃诱导培养20h。

第八步中，诱导完成的样品在17000rmp,4℃条件下离心10min，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。

4.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第八步中，收集得到的木聚糖酶粗酶液直接用于使用SDS-PAGE检测，浓度和活性分析，同时直接使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到纯蛋白。

5.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第三步中，碱性木聚糖酶XynHB大肠杆菌分泌表达载体的构建包括：

1)碱性木聚糖酶XynHB来源于枯草芽孢杆菌HBP8，并且去除自身N端的27个氨基酸信号肽的成熟形式；

2)通过在木聚糖酶成熟XynHB中N端融合可促进蛋白质进行胞外分泌的信号肽；

3)信号肽包括表征良好的来源于Sec途径的信号肽OmpA、PelB、PhoA、Lpp,Tat途径的信号肽TorA、Fdog,以及来源于Sec-Tat途径的的信号肽FhuD；

4)根据大肠杆菌密码子偏好表得到分别对应于各个信号肽的基因序列，同时在信号肽C末端添加和XynHB同源的20bp用于融合PCR；

5)片段Signal peptide-Xylnase-6×His的制备；

6)用NcoI和XhoI对载体pET28a和连接产物进行双酶切，酶切反应于37℃下进行6h，切胶回收目的片段，用DNA纯化试剂盒回收经NcoI和XhoI线性化的载体和目的片段；

7)根据各片段的回收情况确定连接体系，用T4DNA连接酶在16℃过夜连接；

8)将10ul的连接产物转化到克隆宿主XL-Gold中，次日对单菌落进行菌落PCR验证，正确的转化子提质粒酶切，并测序验证重组表达载体构建成功。

6.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，步骤5)片段Signal peptide-Xylnase-6×His的制备，具体包括：

融合PCR反应体系:Pfu4μL，模板A+B＝20～30ng，上下游引物各3μL，KOD buffer 10ul,dNTP 4μL,灭菌的ddH2O定溶至100μL；

PCR扩增条件:95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min；

PCR后跑0.8％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收连接产物。

7.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，步骤7)根据各片段的回收情况确定连接体系，用T4DNA连接酶在16℃过夜连接；

连接体系:T4DNA ligase 0.2μL，T4DNA ligase buffer 2ul,载体+片段＝120ng，灭菌的ddH2O定溶至20μL。根据两个片段的实际浓度，以摩尔币载体：片段＝1:3计算载体和片段的添加量。