CN112831445A

CN112831445A - 一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌s4及其在低温高效降解蛋白方面的应用

Info

Publication number: CN112831445A
Application number: CN202110257808.8A
Authority: CN
Inventors: 喻婵; 敖悦; 李俊红; 阮林森
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN112831445B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4及其在低温高效降解蛋白方面的应用。本发明提供的菌株枯草芽孢杆菌S4(Bacillus subtilisstrain S4)可以高效降解蛋白，其发酵上清和所分泌的蛋白酶粗提液具有低温降解蛋白质的活性，还涉及到该枯草芽孢杆菌在促进昆虫水虻转化降解畜禽有机废弃物中的重要作用。

Description

一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4及其在低温高效降解蛋白方面的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4及其在低温高效降解蛋白方面的应用。

背景技术

随着社会进步和人民生活水平的提高，国民的食物结构产生了巨大变化，居民对肉蛋奶等畜禽产品消费量高速增长，致使我国畜禽养殖业逐步从分散型转向集约化、规模化。但是随着畜牧业的发展，大量产生的畜禽粪便未能得到有效、及时的处理，未经治理无序的排放已成为我国环境中最主要的污染源。在畜禽养殖过程中，特别是猪和禽类，由于对蛋白饲料的不充分利用，使得饲料里50％-70％的氮元素，以尿氮和粪氮的方式排出体外。未经过处理的粪尿中，小部分的氮以氨气的形式挥发到空气中，使得大气中的氮含量增加，严重时会导致酸雨，对人、畜和农作物都会造成危害；另一部分的氮元素被氧化为硝酸盐，造成土壤和水的污染。畜禽粪便里的有机物质在厌氧的情况下，将会被微生物降解为对人体有毒害性的气体，例如：氨气、甲烷、硫化氢等；畜禽粪便污染空气，使得空气的质量严重下降，主要是由于酰胺、吲哚、硫化氢、氨类、胺类等恶臭有害气体所引起的，这些气体是畜禽粪便在厌氧的情况下被微生物降解产生的。与此同时畜禽粪便的污染物中含有寄生虫产的卵，也有一些蚊蝇、病原微生物以及致病菌等在其中生长，这些有害的病菌和寄宿虫卵不经过任何处理，会通过各种途径传播威胁人类健康。

亮斑扁角水虻幼虫在自然界经常会以动物粪便或尸体和腐烂的有机物为食，可处理餐厨垃圾、畜禽粪便等有机废弃物。采用亮斑扁角水虻处理畜禽粪便，可在两周左右达到减量除臭的效果，干物质减少率可达一半以上，使得畜禽排泄物堆积量减少，杀灭其中的病原微生物，实现资源化再利用。在这个转化过程中，其肠道微生物起着至关重要的作用，能够协同水虻对有机废物进行转化降解。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4及其在低温高效降解蛋白方面的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明提供的枯草芽孢杆菌S4分离自水虻肠道，具备高效降解蛋白质的能力，并且其发酵液及粗提蛋白酶在低温(4℃)下依然具有较高降解活性；同时，对水虻转化畜禽有机废弃物中蛋白质有促进作用，是一种具有良好应用前景的菌株。

本发明是这样实现的，一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis strain)S4，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020834。保藏日期2020年12月3日，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还提供了一种蛋白酶制剂，包括从上述的枯草芽孢杆菌S4的发酵上清中提取的蛋白酶液。

本发明还提供了一种蛋白质降解发酵液，包括上述的枯草芽孢杆菌S4的发酵上清。

本发明还提供了如上述的昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4，或蛋白酶制剂或蛋白质降解发酵液在牛奶和或蛋白质降解中的应用。

进一步地，所述应用包括在低温降解蛋白质中的应用。

进一步地，所述低温在4℃及以上。

进一步地，所述所述蛋白质包括酪蛋白。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过对有机废物降解机制的研究，从水虻肠道中分离出枯草芽孢杆菌S4(Bacillus subtilis strain S4)，具备高效降解蛋白质的能力，并且其发酵液及粗提蛋白酶在低温(4℃)下依然具有较高降解活性，同时，菌株能够协助水虻将畜禽有机废弃物中的蛋白质高效降解并吸收。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌S4在酪素培养基中的蛋白质降解情况；

图2是枯草芽孢杆菌S4在酪素培养基中降解蛋白质产生氨基酸情况；

图3是枯草芽孢杆菌S4发酵液上清在低温(4℃)下对2％牛奶的分解作用(左边为对照组，右边为实验组)；

图4是枯草芽孢杆菌S4粗提蛋白酶在低温下对2％牛奶的高效降解作用(左边为对照组，右边为实验组)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4及其在低温高效降解蛋白方面的应用。具体如下实施例所示。

实施例1枯草芽孢杆菌S4的分离

先对水虻体表进行无菌处理，在无菌操作台中取出水虻整个肠道，加入无菌水充分研磨，梯度稀释后涂布到脱脂奶粉培养基(脱脂奶粉20g，琼脂4g，蒸馏水定容到200mL)，37℃培养24h，挑取有水解圈的单菌落连续划线多次，得到目标菌株Bacillus subtilisstrain S4，本发明中简称为枯草芽孢杆菌S4。

菌株在LB培养基上菌落为乳白色，扁平，表面粗糙。利用细菌16S rDNA通用引物27F:5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ˊ，SEQ ID NO.2和1492R:5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ，SEQ ID NO.3对枯草芽孢杆菌S4进行PCR扩增，测序后获得1450bp的片段，在GenBank的登录号为(GenBank:MW271030.1)。其序列见SEQ ID NO.1所示。

实施例2枯草芽孢杆菌S4在酪素培养基中对酪蛋白的高效降解及氨基酸产生

1.试验方法

1)菌株Bacillus subtilis strain S4的富集培养：用接种环挑取目标菌株S4，接种于20mL LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容到1L)中，37℃220rpm振荡培养12h，备用。

2)高效降解蛋白质能力：配置酪素液体培养基(见表1)，接种适量的富集菌液，37℃，220rpm条件下摇瓶发酵。取样时间设置为6、12、24、36、48、72h，三天6个点，摇瓶体积为200mL，每次取样2mL用于测OD值和留样做液相色谱及蛋白胶检测，每组3个平行。加入到含有200mL酪素液体培养基的500mL锥形瓶中，通过SDS-PAGE检测其中酪蛋白的降解情况，同时分析其氨基酸产生情况。

表1.酪素培养基配方

组分	培养要求(％)	母液浓度(％)	各成分的取量(ml/200ml)
				KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.036	3.6	2
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.05	5	2
				ZnCl<sub>2</sub>	0.0014	0.14	2
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.107	10.7	2
				NaCl	0.016	1.6	2
CaCl<sub>2</sub>	0.0002	0.02	2
				FeSO<sub>4</sub>	0.0002	0.02	2
酪素	0.4	4	20

2.试验结果

枯草芽孢杆菌S4对酪蛋白有很好的降解效果，在摇瓶6h就已经出现降解现象，24h时基本已经降解完全(见图1)；同时产生的氨基酸有Val，Glu，Ile，Phe，Leu，Tyr，Lys，Gly，Ala以及Met，Leu的增加量远高于其他氨基酸(见图2)。

实施例3枯草芽孢杆菌S4的LB发酵液上清在低温下对2％牛奶的高效降解作用

1.试验方法

1)枯草芽孢杆菌S4发酵上清的制备：用接种环挑取目标菌株S4，接种于20mL LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养12h，备用。

2)发酵上清在低温下高效降解蛋白质能力：将菌液在4℃，12000rpm条件下离心1min，收集发酵上清。取0.1mL发酵上清，加入到0.9mL无菌的2％牛奶溶液中，4℃下静置，每隔4h拍照记录。

2.试验结果

枯草芽孢杆菌S4的LB发酵上清在低温(4℃)下对2％的牛奶的降解效果显著，8h时，浑浊的牛奶已基本变澄清(见图3)。

实施例4枯草芽孢杆菌S4粗提蛋白酶在低温下对2％牛奶的高效降解作用

1.试验方法

1)枯草芽孢杆菌S4发酵上清的制备：用接种环挑取目标菌株S4，接种于100mL LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养12h，在4℃，12000rpm下离心1min，收集发酵上清。

2)枯草芽孢杆菌S4粗提蛋白酶液的制备：将收集好的上清倒入250mL的烧杯中，置于低温(4℃)环境中，加入硫酸铵固体，边加边搅拌，达到硫酸铵80％饱和度后，在4℃下静置4h。然后在15000rpm，4℃下离心10min；将离心后的上清去掉，再用500μL PBS把沉淀的蛋白溶解，得到浓缩后的蛋白液，即为粗提蛋白酶液。

3)粗提蛋白酶在低温下高效降解蛋白质能力：取0.1mL粗提蛋白酶液，加入到0.9mL无菌的2％牛奶溶液中，4℃下静置，观察降解情况。

2.试验结果

粗提蛋白酶在低温下具有高效的降解蛋白质能力，反应30min便可基本降解完全(见图4)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4及其在低温高效降解蛋白方面的应用

<130> JZWH2021227

<140> 2021102578088

<141> 2021-03-09

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1450

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 1

cccctaaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg 60

gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg 120

ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac ataaaaggtg gcttcggcta 180

ccacttacag atggacccgc gggcgccatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240

gcaacgatgg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300

cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360

caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420

agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540

agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600

cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660

aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720

cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840

agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900

gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960

gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020

gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080

ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140

ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200

ctaacatggg acggaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct 1260

gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc 1320

gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380

acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag ccgccgaagg 1440

tgacaggagg 1450

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020834。

2.一种蛋白酶制剂，其特征在于：包括从权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌S4的发酵上清中提取的蛋白酶液。

3.一种蛋白质降解发酵液，其特征在于，包括权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌S4的发酵上清。

4.如权利要求1中所述的昆虫水虻幼虫肠道来源的枯草芽孢杆菌S4，或权利要求2中所述的蛋白酶制剂或权利要求3中所述的蛋白质降解发酵液在牛奶和或蛋白质降解中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括在低温降解蛋白质中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述低温在4℃及以上。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述所述蛋白质包括酪蛋白。