CN112626000A - 一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法，涉及生物技术领域，其保藏编号是：CGMCC No.21519，菌株的筛选方法，包括下列步骤：S1：将10 g新鲜鸡粪加入到装有100mlLB培养基的三角瓶中，得到富集液；S2：将富集液与NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到驯化培养液，2d后将驯化培养液与NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到二代驯化培养液，重复以上操作4次，得到富集驯化液；S3：将富集驯化液与无菌水按照重量份数比1:9加入三角瓶中混合，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养，得到纯化细菌；S4：将纯化细菌接种于LB液体培养基上，制成纯化细菌菌液；S5：通过测定结果筛选出菌株。本发明菌株有效去除氨气和硫化氢。

Description

一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法。
背景技术
随着畜禽养殖业集约化、产业化的发展，畜禽养殖过程中产生了大量废弃物。我国每年产生的养殖废弃物可达38亿吨，综合利用率不到60%，不仅严重污染环境，而且在一定程度上危害到人畜健康。在畜禽废弃物资源化利用中，堆肥是最有效的处理方法，却面临着异味气体带来的一系列污染和健康安全问题。畜禽养殖业所产生的异味气体成分较为复杂，一般分为：氨和挥发性胺类、挥发性低级脂肪酸类、挥发性含硫化合物、酚类和吲哚类。这些异味气体被人体吸入后会刺激黏膜，引起咳嗽等健康问题，而高浓度的异味气体会导致呼吸困难，甚至引起癌症和中枢神经系统的损害。
堆肥除臭的方法很多，其中微生物除臭法是目前治理臭气的一种简单有效的方法。微生物除臭法是指在堆肥中添加外源除臭菌剂，利用微生物在代谢过程中可利用某些臭气成分，或可抑制臭气成分的产生等特点，从而达到除臭的目的。目前，对于除臭菌的筛选已有大量研究，但是一种除臭菌株一般只对一种异味气体具有较高的去除效率，难以同时去除多种成分的异味气体。因此，进一步筛选能够去除多种成分异味气体的菌株具有重要的实际意义。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，而提供一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法，有效去除氨气和硫化氢。
本发明通过下述技术方案实现：一种有效去氨气和硫化氢的菌株，该菌株已于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号是：CGMCC No.21519，其生物学分类命名为：波氏杆菌 Bordetella sp.。
有效去氨气和硫化氢的菌株的筛选方法，包括下列步骤：
S1：将10 g新鲜鸡粪加入到装有100mlLB培养基的三角瓶中，然后将三角瓶放置到温度为30℃，转速为150 rpm的震荡培养箱中富集培养72h，得到富集液；
S2：将富集液与 NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，然后在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床中培养，得到驯化培养液，2d后将驯化培养液与NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到二代驯化培养液，重复以上操作4次，得到富集驯化液；
S3：将富集驯化液与无菌水按照重量份数比1:9加入三角瓶中混合，振荡20 min，静置1 min，用10倍稀释法，取10-5梯度的稀释液涂布于LB培养基，置于30℃恒温培养箱内培养，2d后采用平板划线法对菌落进一步纯化，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养，得到纯化细菌；
S4：将纯化细菌接种于LB液体培养基上，在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床上扩大培养2 d制成纯化细菌菌液；
S5：量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入10%纯化细菌菌液，测定纯化细菌菌液的除氨效果；量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1mlH2S标准液（1mg/ml），搅拌混匀后接入10%菌液，测定纯化细菌菌液的除硫化氢效果；通过测定结果筛选出有效去氨气和硫化氢的菌株。
进一步，所述NH3选择性培养基的制备方法，包括下列步骤：
A1：按重量份数计，将50份蔗糖、2份KH2PO4、0.5份MgSO4·7H2O 、0.1份FeSO4、5份1% ZnSO4、2份NaCl 、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
A2：将混合液灭菌后加入10ml氨水，最终得到NH3选择性培养基。
进一步，LB培养基的制备方法为：按重量份数计，将10份胰蛋白胨、5份酵母提取物、10份NaCl、1000份蒸馏水混合得到LB培养基。
进一步，基础发酵培养基的制备方法为：按重量份数计，将20份葡萄糖、0.5份酵母膏、2份KH2PO4、2份K2HPO4、0.2份MgSO4·7H2O、0.5份NaCl、0.5份尿素、1000份蒸馏水混合得到基础发酵培养基。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明有效去氨气和硫化氢的菌株不仅可以有效去除氨气，而且对硫化氢也有较好的去除效果，可以用于堆肥中氨气和硫化氢的去除。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为菌株对氨气的去除效果图；
图2为菌株对硫化氢的去除效果图；
图3为菌株系统发育树；
图4为BH11菌落形态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例
在一个实施例中，一种有效去氨气和硫化氢的菌株，其保藏编号是：CGMCCNo.21519。
在一个实施例中，所述菌株的筛选方法，包括下列步骤：
S1：将10 g新鲜鸡粪加入到装有100mlLB培养基的三角瓶中，然后将三角瓶放置到温度为30℃，转速为150 rpm的震荡培养箱中富集培养72h，得到富集液；
S2：将富集液与 NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，然后在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床中培养，得到驯化培养液，2d后将驯化培养液与NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到二代驯化培养液，重复以上操作4次，得到富集驯化液；
S3：将富集驯化液与无菌水按照重量份数比1:9加入三角瓶中混合，振荡20 min，静置1 min，用10倍稀释法，取10-5梯度的稀释液涂布于LB培养基，置于30℃恒温培养箱内培养，2d后采用平板划线法对菌落进一步纯化，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养，得到纯化细菌；
S4：将纯化细菌接种于LB液体培养基上，在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床上扩大培养2 d制成纯化细菌菌液；
S5：量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入10%纯化细菌菌液，测定纯化细菌菌液的除氨效果；量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1mlH2S标准液（1mg/ml），搅拌混匀后接入10%菌液，测定纯化细菌菌液的除硫化氢效果；通过测定结果筛选出有效去氨气和硫化氢的菌株。
在一个实施例中，所述NH3选择性培养基的制备方法，包括下列步骤：
A1：按重量份数计，将50份蔗糖、2份KH2PO4、0.5份MgSO4·7H2O 、0.1份FeSO4、5份1% ZnSO4、2份NaCl 、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
A2：将混合液灭菌后加入10ml氨水，最终得到NH3选择性培养基。
在一个实施例中，LB培养基的制备方法为：按重量份数计，将10份胰蛋白胨、5份酵母提取物、10份NaCl、1000份蒸馏水混合得到LB培养基。
在一个实施例中，基础发酵培养基的制备方法为：按重量份数计，将20份葡萄糖、0.5份酵母膏、2份KH2PO4、2份K2HPO4、0.2份MgSO4·7H2O、0.5份NaCl、0.5份尿素、1000份蒸馏水混合得到基础发酵培养基。
实验例
1、菌株的选取
1）除氨菌的筛选
将实施例中所述纯化细菌一共15株，编号BH1-BH15，然后分别接种于LB液体培养基上，在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床上扩大培养2 d制成纯化细菌菌液；量取100ml基础发酵培养基置于15个广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入15种10%纯化细菌菌液；在广口瓶内放置含5ml2%硼酸的小烧杯，用保鲜膜封住瓶口后于培养箱内30℃静置培养，2d后取出小烧杯用硫酸滴定法测定NH3含量测定完更换含5ml 2%硼酸的小烧杯，广口瓶中加1mL氨水继续培养，每2d测定一次，共测定4次。
如图1所示，除氨菌复筛结果显示菌株BH2、BH5、BH9、BH11、BH12和BH15对NH3去除率相对较高，分别为48.82%、49.44%、45.75%、48.33%、50.96%和51.82%，均高于45%。
2）硫化氢去除效果实验
将上述编号BH1-BH15的15株菌株，分别接种于LB液体培养基上，在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床上扩大培养2 d制成纯化细菌菌液；量取100ml基础发酵培养基置于15个广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入15种10%纯化细菌菌液；在广口瓶内放置含5ml碱性锌氨络盐的小烧杯，用保鲜膜封住瓶口后于培养箱内30℃静置培养，2d后取出取出小烧杯用亚甲基蓝分光光度法测定H2S含量。
如图2所示，将初筛获得的15株除氨菌进行硫化氢去除效果的验证，结果发现菌株BH11、BH13和BH14有去除硫化氢的能力，去除率分别为36.69%、33.68%和32.04%，而其它菌株对硫化氢无去除效果。
综上所述，菌株BH11不仅可以有效去除氨气，而且对硫化氢也有较好的去除效果，可以用于堆肥中氨气和硫化氢的去除。
2、菌株的鉴定
2.1 DNA的提取
2.11 试剂盒组成
使用TIANamp 细菌基因组提取试剂盒进行细菌DNA的提取，试剂盒具体组成为：缓冲液GA(Buffer GA)、缓冲液GB(Buffer GB)、缓冲液GD(Buffer GD)、漂洗液PW(BufferPW)、洗脱缓冲液TE(Buffer TE)、Proteinase K、吸附柱CB3(Spin Columns CB3)、收集管（2ml）(Collection Tubes 2 ml)。
2.22 细菌基因组DNA的提取
1）取细菌培养液1-5 ml，10000 rpm离心1 min，尽量吸净上清，向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
2）向管中加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。
3）加入220 μl缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4）加220 μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
6）向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7）向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。
8）重复操作步骤7）。
9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.2 PCR扩增
运用通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)，1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。
PCR反应体系：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE001
2.3 测序及比对结果
PCR上海派森诺生物科技股份有限公司测序获得的BH11序列如序列表所示，在NCBI数据库中进行BLAST比对后发现，BH11与Bordetella sp.基因序列同源性达到99.93%，可以确定其为波氏菌属。其系统发育树如图3所示。
3、菌株的培养与形态特征
LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，氯化钠(NaCl) 10g，蒸馏水1 L，pH 7.4。
摇床培养条件：转速为150rpm，温度为35℃。
形态特征：BH11菌落接种于LB培养基上，然后放置在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床，35℃条件下培养2天，如图4所示，菌落直径为2mm，菌落表面光滑湿润，乳白色半透明，菌体呈球状，表现光滑、凸起，呈珍珠光泽而透明，边缘整齐但边界模糊，革兰氏染色阴性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 一种有效去氨气和硫化氢的菌株及其筛选方法
<130> YB216212
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1409
<212> DNA
<213> 波氏杆菌(Bordetella sp.)
<400> 2
tgcagtcgaa cggcagcacg agagagcttg ctctcttggt ggcgagtggc ggacgggtga 60
gtaatatatc ggaacgtgcc cagtagcggg ggataactac tcgaaagagt ggctaatacc 120
gcatacgccc tacgggggaa aggaggggat cttcggacct ttcactattg gagcggccga 180
tatcggatta gctagttggt ggggtaaagg cctaccaagg cgacgatccg tagctggttt 240
gagaggacga ccagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 300
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gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggat gatgtggatt 900
aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccta cgcttgacat gtctggaatc ctgaagagat 960
ttaggagtgc ccgcaaggga accggaacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtcactagt tgctacgcaa 1080
gagcactcta gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1140
tcatggccct tatgtgtagg gcttcacacg tcatacaatg gtcgggacag agggtcgcca 1200
acccgcgagg gggagctaat ctcataaacc cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260
cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag aatgccgcgg tgaatacgtt 1320
cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac catggaagtg ggtttcacca gaagtagtta 1380
gcctaaccgc aaggagggcg ataccacgg 1409

Claims (5)

1.一种有效去氨气和硫化氢的菌株，其保藏编号是：CGMCC No.21519。
2.根据权利要求1所述菌株的筛选方法，其特征在于，包括下列步骤：
S1：将10 g新鲜鸡粪加入到装有100mlLB培养基的三角瓶中，然后将三角瓶放置到温度为30℃，转速为150 rpm的震荡培养箱中富集培养72h，得到富集液；
S2：将富集液与 NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，然后在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床中培养，得到驯化培养液，2d后将驯化培养液与NH3选择性培养基按照重量份数比1:10混合，得到二代驯化培养液，重复以上操作4次，得到富集驯化液；
S3：将富集驯化液与无菌水按照重量份数比1:9加入三角瓶中混合，振荡20 min，静置1min，用10倍稀释法，取10-5梯度的稀释液涂布于LB培养基，置于30℃恒温培养箱内培养，2d后采用平板划线法对菌落进一步纯化，将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养，得到纯化细菌；
S4：将纯化细菌接种于LB液体培养基上，在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床上扩大培养2 d制成纯化细菌菌液；
S5：量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1ml氨水，搅拌混匀后接入10%纯化细菌菌液，测定纯化细菌菌液的除氨效果；量取100ml基础发酵培养基置于广口瓶中，灭菌后加入1mlH2S标准液（1mg/ml），搅拌混匀后接入10%菌液，测定纯化细菌菌液的除硫化氢效果；通过测定结果筛选出有效去氨气和硫化氢的菌株。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述NH3选择性培养基的制备方法，包括下列步骤：
A1：按重量份数计，将50份蔗糖、2份KH2PO4 、0.5份MgSO4·7H2O 、0.1份FeSO4 、5份1% ZnSO4、2份NaCl 、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
A2：将混合液灭菌后加入10ml氨水，最终得到NH3选择性培养基。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，LB培养基的制备方法为：按重量份数计，将10份胰蛋白胨、5份酵母提取物、10份NaCl、1000份蒸馏水混合得到LB培养基。
5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，基础发酵培养基的制备方法为：按重量份数计，将20份葡萄糖、0.5份酵母膏、2份KH2PO4、2份K2HPO4、0.2份MgSO4·7H2O、0.5份NaCl、0.5份尿素、1000份蒸馏水混合得到基础发酵培养基。
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