CN110923144A

CN110923144A - 一株高硒酸盐耐受细菌及筛选方法和应用

Info

Publication number: CN110923144A
Application number: CN201911000292.8A
Authority: CN
Inventors: 王行国; 倪雪晨; 雷佳; 田金宝; 周佳卉; 李亚东
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110923144B

Abstract

本发明提出了一种利用硒酸盐处理茶树内生草螺菌WT00F并结合强制进化方法获得高硒酸盐耐受新菌株的策略与高硒酸盐耐受新菌株发酵生产红色单质硒(Se⁰)的方法，通过硒酸盐处理和强制进化，将茶树内生草螺菌在200 mM硒酸盐培养基中反复多次转接培养,最终形成稳定的高硒酸盐耐受新菌株‑茶树草螺菌NTC00F，硒酸盐耐受可达800 mM。将茶树草螺菌NTC00F置于含400 mM硒酸盐的培养基中发酵，细菌通过还原硒酸盐并高效生成红色纳米单质硒，红色纳米单质硒的产率可达1000μg/ml，制备的纯净的红色纳米单质硒可用于医药、农业和食品加工等，技术操作简便、成本低廉，绿色环保无公害。

Description

一株高硒酸盐耐受细菌及筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及的是利用茶树内生草螺菌WT00F在高浓度硒酸盐(200 mM)条件下多次重复转接培养并获得高硒酸盐耐受细菌─茶树草螺菌NTC00F菌株，特别是一种应用高硒酸盐耐受茶树草螺菌NIC00F与高浓度硒酸盐(400 mM)共培养、发酵生产红色纳米单质硒的技术方法。

背景技术

硒是一种动植物必需的微量非金属元素。在自然界，硒常常以无机和有机形式存在。硒的有机形式通常存在动植物细胞内，如硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸以及硒蛋白；无机硒通常有4种价态: 硒酸盐（Se⁶⁺），亚硒酸盐（Se⁴⁺），硒化物（Se^2-）和单质硒（Se⁰），其中Se^2-常作为各种生物制造硒蛋白的原料且具有挥发性，而硒酸盐（Se⁶⁺）和亚硒酸盐（Se⁴⁺）是水溶性的，在环境中具有潜在的移动性和生物可利用性。虽然Se⁶⁺吸附能力较弱，但其潜在的活性和生物利用率比Se⁴⁺要高。在含氧环境中，Se⁶⁺和Se⁴⁺占有优势，但浓度偏高时对生物呈现较强的生物毒性。在还原环境中，Se⁰更趋于热力学稳定但水溶性较差，单质纳米硒具有高生物活性、低毒性和高光电导率。利用单质纳米硒特定的物理性质，人们已在光电、半导体、X 射线感测等方面应用。由于拥有高表面积和体积，单质纳米硒具有较强的吸附力和抗氧化功能，如抗羟自由基功效、抗DNA氧化作用以及抗微生物活性等。纳米单质硒体外清除羟基自由基的效率为无机硒的5倍、有机硒的2.5倍、其毒性仅为亚硒酸钠的1/7。因此，纳米单质硒在抗氧化、免疫调节、延缓衰老、抑制肿瘤、治疗微生物感染等方面具有广泛的应用潜力。同时也可以用作添加剂加于饲料、制备硒饲料饲养鱼类和禽畜以增强体质和抗病能力。

目前制备单质硒主要是通过物理化学方法，如使用水热/溶剂热合成法、微波法、脉冲激光烧蚀、气相沉积法、模板法和自组装等方法。物理化学方法虽然有效但存在环境污染和生产的单质硒易氧化而变成灰色硒等问题。由于物理化学方法的非环境友好问题，人们开始利用化学/生物质或微生物方法制备纳米单质硒，目前尚处在研究开发阶段。化学/生物质方法的缺点主要是生物质获取的成本高，不适宜规模化生产。利用微生物方法制备单质纳米硒虽然可行.但大多数微生物如大肠杆菌、罗尔斯通氏菌、深红红螺菌、荚膜红细菌、荧光假单胞菌、固氮红细菌等对硒酸钠或亚硒酸钠的耐受低。仅见一株固氮红细菌耐受高达125 mM亚硒酸钠且能将亚硒酸钠还原为红色纳米单质硒，高于此浓度细菌就无法生长。因此，开发新的微生物方法、制备纳米单质硒是当前广受关注的重要课题，也是实现环境友好、低成本、规摸化生产的有效途径。

茶树内生草螺菌WT00C和WT00F是本实验室从野外观赏茶树中分离的两株与茶树共生、专一性强的内生革兰氏阴性细菌，不含质粒和噬菌体，不产生抗生素类物质，无致病性。文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”和“草螺菌Herbaspirllum sp. WT00F 的生理生化性质和促生作用研究”（王婷等，微生物学报2014第4期、P424-432; 刘伟林等,湖北大学学报2017第3期、P291-298）详细叙述了茶树内生草螺菌的微生物学特性与茶树促生作用，但未涉及茶树内生草螺菌的红色单质纳米硒的合成与应用。近期我们发现茶树内生草螺菌拥有完整的硒代谢途径，具有强的硒酸盐还原能力并生成红色单质纳米硒。其机理是通过腺苷酰硫酸焦磷酸化酶将硒酸盐还原成亚硒酸盐后，再经过谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶将其还原为谷胱甘肽-硒醇并最终生成零价的红色纳米单质硒。实验研究也证明茶树内生草螺菌的确能利用硒酸盐还原途径合成红色纳米单质硒。两株茶树内生草螺菌不仅能在低硒酸盐浓度下还原硒酸盐而且能在高达200 mM硒酸盐中也能还原硒酸盐并生成红色纳米单质硒,但产率较低。依据此结果，我们曾经申请过一个国家发明专利《一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法（申请号： 201610285114.4）》。只是硒酸盐浓度越高，细菌的生长抑制期越长，即细菌生长周期耗时越久。例如,当硒酸盐浓度为75 mM时,茶树内生草螺菌生长抑制期大约为7 h. 而硒酸盐浓度为200 mM时,它的生长抑制期为12 h。直接利用两株茶树内生草螺菌在200 mM硒酸盐条件下发酵生产红色纳米单质硒则耗时36 h以上,而且产率较低。

红色纳米单质硒产率依赖硒酸盐浓度，即使用的硒酸盐浓度越高，红色纳米单质硒产率也越高。为了开发出一种能在高硒酸盐浓度条件下耗时短且高效生产红色纳米单质硒的菌株,我们用茶树内生草螺菌WI00F作为出发菌株,使用硒酸盐处理和强制进化(Forced evolution)的技术获得一株高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F。利用高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F在400 mM硒酸盐浓度条件下发酵30 h生产制备红色纳米单质硒,产率达1000 mg/L。利用茶树草螺菌NTC00F发酵生产红色纳米单质硒既缩短了发酵时间又极大地提高了红色纳米单质硒产率,实现了规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提出一种选育高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F并在含有高硒酸盐(400mM)的培养基中发酵生产红色纳米单质硒的技术方法。使用硒酸盐处理和强制进化的技术,在硒酸盐处理之后,多次在含200mM硒酸盐的培养基中重复转接茶树草螺菌WT00F,至到最后获得高硒酸盐耐受茶树内生草螺菌 NTC00F，该茶树草螺菌Herbaspirillum sp.NTC00F已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO.M2019679。

本发明是这样实现的，一种高硒酸盐耐受细菌发酵生产红色纳米单质硒的方法其步骤为：

1、高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F的选育

将本实验室保存的茶树内生草螺菌WT00F菌株接种至LB培养基(10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5g NaCl, 加水至1000 mL)中,37℃、200 rpm 培养12 h。离心收集细胞,悬浮在PBS(磷酸氢二钠1.44g, 磷酸二氢钾0.24g, 氯化钠8g, 氯化钾0.2g, pH7.4)中，然后使用三种方法处理。 (1) 化学诱变: 使用100-500μg/ml亚硝基胍(NTG) 35 ℃处理茶树内生草螺菌WT00F 2 h，然后用培养基稀释涂平板, 37℃培养过夜,最后在400 mM硒酸钠LB培养基(400 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5%NaCl, pH7.2) 中筛选。(2) 紫外线诱变: 使用15W紫外线杀菌灯(波长265 nM),在30 cm距离下照射茶树内生草螺菌WT00F(106/ml)15分钟 (细菌死亡率为75%)；取2 ml 照射菌液于30 ml液体LB培养基中37℃, 120rpm振荡培养，培养后的细菌按1:100比例接于400 mM的LB培养基中筛选。(3)硒酸钠处理: 使用200 mM硒酸钠室温处理茶树内生草螺菌WT00F 2 h, 培养后的细菌按1:100比例接于200mM硒酸钠的LB培养基中筛选。

前两种方式未获得能在400 mM硒酸钠中快速生长的细菌菌株,只有第三种方式处理获得了能在400 mM硒酸钠中生长的细菌。为了进一步改进细菌硒酸盐耐受性,取出250 μl第三种方式获取的细菌培养物并接种至25 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基(200 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5%NaCl, pH7.2), 37 ℃、200 rpm摇动培养24 h，再从中取出250 μl细菌培养物并接种至25 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基, 37℃、200 rpm摇动培养24 h；重复上述过程,一共重复转接培养6次，最后将细菌培养物涂布含200 mM硒酸钠的LB平板(200 mM硒酸钠、 1%胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、15 g琼脂,pH7.2), 37℃培养箱中倒置培养24 h，挑单菌落并接入5 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基,37℃、200 rpm摇动培养24 h，细菌培养物加甘油后置-80℃保存。

经此过程获得的菌株命名为茶树草螺菌NTC00F。与原来的茶树内生草螺菌WT00F相比,获得的细菌NTC00F不仅增大了2-3倍的细胞体积,细胞表面光滑,而且细菌的趋化性和细胞膜的分子转运功能都极大地降低。

只要将茶树草螺菌NTC00F维持在200 mM硒酸钠的LB培基中培养6轮，它就能保持它特有的性状,非常稳定。再继续培养,细菌会丧失硒酸盐耐受性。如经过8轮培养的细菌只能在≤200mM硒酸钠培养基中生长而不能在>200mM硒酸钠培养基中生长。很显然，6轮的强制进化效果最佳,过多或过少都不会达到细菌硒酸盐耐受性最强的状态。

2、茶树草螺菌NTC00F在不同硒酸盐浓度下的生长状况

取-80 °C保存的茶树草螺菌NTC00F，接种5mL含200 mM硒酸钠的LB培养基 (200 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl, pH7.2)，200 rpm摇动，37℃培养过夜。将活化后的菌液以1:100比例接入250ml含有0、50、100、200、400、800mM 硒酸钠的LB液体培养基中，37℃、200 rpm 摇动培养。在不同培养时间取样1 ml并在紫外/可见光分光光度仪上测定OD₆₀₀值，检测细菌的生长情况。每个点重复3次,求得平均数，最后汇制细菌的生长曲线，结果见图2A。使用原始菌株茶树内生草螺菌WT00F做相同的实验,结果仅见原始菌株只能在400 mM硒酸盐中生长, 硒酸盐超过400 mM后,细菌不能生长(见图1A)。与原始菌株相比,茶树草螺菌NTC00F对硒酸盐有更强的耐受性，能在高达800 mM硒酸钠生长(见图2A)。

3．茶树草螺菌NTC00F与硒酸盐共培养合成红色纳米单质硒

取-80℃保存的茶树草螺菌NTC00F，接种5mL含200 mM硒酸钠的LB培养基 (200 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5% NaCl, pH7.2)，200 rpm摇动，37℃培养过夜。将活化后的菌液以1:100比例接入200 ml含有0、50、100、200、400、800 mM硒酸钠的LB液体培养基中，37℃、200 rpm 摇动培养。肉眼观察细菌培养物的颜色变化。细菌培养物的颜色变红说明细菌已将硒酸钠还原并生成红色纳米单质硒。图2B可见, 茶树草螺菌NTC00F与硒酸盐共培养能有效合成红色纳米单质硒。使用原始菌株茶树内生草螺菌WT00F做相同的实验,原始菌株仅能在400 mM硒酸盐中生成红色纳米单质硒,超过400 mM则未见红色纳米单质硒生成(见图1B)。与原始菌株相比, 茶树草螺菌NTC00F能在高达800 mM硒酸钠中生长并合成红色纳米单质硒。

4、茶树草螺菌NTC00F发酵生产红色纳米单质硒

取-80℃保存的茶树草螺菌NTC00F，接种5mL含200 mM硒酸钠的LB培养基 (200 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5% NaCl, pH7.2)，200 rpm摇动，37℃培养过夜。将活化后的菌液以1:100比例接入50 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基（200 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠、200 mM硒酸钠 pH7.2），37℃、200 rpm 摇动培养至OD₆₀₀=0.8。然后在5L发酵罐（Biotech）中加入3 L 含400 mM硒酸钠的LB液体培养（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠、400 mM硒酸钠, pH7.2）。121℃灭菌30 min 。待培养基冷却后，按照1:100的接种量接入放大培养的菌液。在温度为37℃、转速200 rpm、pH7.0、通气量为1 v/v^.min条件下发酵，发酵时间为30 h。刚开始发酵培养时，发酵液呈橙黄色（见图3a）。发酵培养30 h后培养基颜色由橙黄色变成鲜红色(图3b)，说明发酵罐内的茶树草螺菌NTC00F已还原硒酸钠并生成了红色纳米单质硒。使用扫描电子显微镜观察,显示细菌表面巳聚集许多的白色球状物即红色纳米单质硒球，直径为10-200 nm(见图4A)。

5、红色纳米单质硒分离纯化

发酵完成后,收集菌液，将菌液转移至500 ml 离心瓶中，4℃、1000 r/min离心两次，每次10 min。每次收集上清部分并除去细菌沉淀。上清部分再在4 ℃、8000 r/min 离心30min 并收集沉淀物。用生理盐水离心洗涤(4℃、12,000 r/min、8 min) 沉淀物三次后，用生理盐水重悬沉淀物并混匀。在冰浴、功率为100 W的条件下超声波处理重悬液10 min，然后在4℃、12000 r/min 离心15 min并收集沉淀物。用含1%SDS的1.5 M Tris-HCl（PH 8.3）离心洗涤沉淀物两次，再用无菌水洗涤1次。离心条件为4℃、12,000 r/min、8 min。用无菌水重悬沉淀物后，按重悬液：正辛醇=2：1的比例加入正辛醇。充分混匀后，4℃、12000 r/min离心8 min并置于4℃ 24小时。小心移去全部液体后，沉在离心管底部纳米硒颗粒(SeNPs)分别用氯仿、乙醇和无菌水离心(4℃、12,000 r/min、8 min)洗涤各一次以除去蛋白杂质。最后使用真空冷冻干燥仪(LGJ-10, 北京松源华兴)干燥获得的纯净的红色纳米单质硒,称重后储存于4℃，按照上面描述的红色纳米单质硒制备方法即可获得纯净的红色纳米单质硒(见图4B)。经过三次发酵实验，获得的红色纳米单质硒产率平均为1000 μg/ml，即每升培养物可制备1000 mg 纯净的红色纳米单质硒.

本发明具有独特的优点：

1、茶树内生草螺菌是茶树专一性强的内生细菌，与茶树互惠共生无致病性。它既不含质粒也不含病毒，不产生任何抗生素类物质，也不具有抗生素抗性基因，对动植物或人类无无公害，还具有还原硒酸盐合成红色纳米单质硒的能力。本发明充分利用了茶树内生草螺菌这些生物学特性，使用强制进化的方法,将茶树内生草螺菌WT00F反复多次转接200 mM高浓度硒酸盐培养基, 强制进化产生高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F菌株。高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F可耐受高达1000 mM硒酸盐，目前尚未见如此高硒酸盐耐受性的细菌。高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F的成功选育，为使用微生物法生产红色纳米单质硒（Se⁰）提供了新的菌种。

2、使用高硒酸盐耐性茶树草螺菌NTC00F与400 mM 硒酸盐共培养,在温度为37℃、转速200 rpm、pH7.0、通气量为1 v/v^.min条件下发酵30 h,即可从每升培养物中纯化出1000 mg纯净的红色纳米单质硒。目前尚未见其它细菌有如此高的红色纳米单质硒产量。由此可见，使用高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F发酵生产红色纳米单质硒不仅简便可行而且产率高。

3、本发明结合细菌发酵、红色纳米单质硒制备技术,通过简单的细菌发酵方法制备红色纳米单质硒, 操作简便、成本低且易于进一步放大生产规模。

附图说明

图1为本发明实施例2和3中使用不同浓度硒酸钠培养原始菌株─茶树内生草螺菌WT00F的生长曲线和培养基变色情况,作对照使用。培养基变红指示培养基内有红色纳米单质硒生成。培养基颜色越红, 红色纳米单质硒越多。

图2为本发明实施例2和3中使用不同浓度硒酸钠培养茶树草螺菌NTC00F的生长曲线和培养基变色情况。与原始对照菌株-茶树内生草螺菌WT00F相比, 茶树草螺菌NTC00F能在高达800 mM硒酸盐培养基中生长和还原硒酸盐生成红色纳米单质硒。

图3为本发明实施例4中茶树草螺菌NTC00F在400 mM硒酸钠培养基中发酵的颜色变化。(a) 开始发酵时培养基的颜色，呈淡橙黄色；(b) 发酵30 h时培养基的颜色，呈深红色。

图4为本发明实施例4中茶树草螺菌NTC00F在400 mM硒酸钠培养基中发酵的实验结果。在400mM硒酸钠培养基中发酵后, 使用扫描电镜观察茶树草螺菌NTC00F细胞和生成的红色纳米单质硒球以及分离纯化的红色纳米单质硒样品。(A) 扫描电镜观察；(B) 红色纳米单质硒样品。扫描电镜观察发现，茶树草螺菌NTC00F细胞完整，其细胞表面附着许多白色球状物，即红色纳米单质硒球。分离纯化后的纳米单质硒样品仍呈鲜红色,说明纯化的纳米单质硒并未氧化。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

将实验室保存的茶树内生草螺菌WT00F菌株接种至LB培养基(10g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5g NaCl, 加水至1000 mL)中,37℃、200 rpm 培养12 h。离心收集细胞,悬浮在PBS(磷酸氢二钠1.44g, 磷酸二氢钾0.24g, 氯化钠8g, 氯化钾0.2g, pH7.4)中，然后使用硒酸钠处理，具体方法为：使用200 mM硒酸钠室温处理茶树内生草螺菌WT00F 2 h, 培养后的细菌按1:100比例接于200 mM硒酸钠的LB培养基中筛选。

为了进一步改进细菌硒酸盐耐受性,取出250 μl硒酸钠处理获取的细菌培养物并接种至25 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基(200 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5%NaCl, pH7.2), 37 ℃、200 rpm摇动培养24 h，再从中取出250 μl细菌培养物并接种至25 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基, 37℃、200 rpm 摇动培养24 h；重复上述过程,一共重复转接培养6次，最后将细菌培养物涂布含200 mM硒酸钠的LB平板(200 mM硒酸钠、 1%胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、15 g琼脂, pH7.2), 37℃培养箱中倒置培养24 h，挑单菌落并接入5 ml含200 mM硒酸钠的LB培养基,37℃、200 rpm摇动培养24 h，细菌培养物加甘油后置-80℃保存。

经此过程获得的菌株命名为茶树草螺菌NTC00F，该茶树草螺菌Herbaspirillum sp. NTC00F已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物中心，与原来的茶树内生草螺菌WT00F相比,获得的细菌NTC00F不仅增大了2-3倍的细胞体积,细胞表面光滑,而且细菌的趋化性和细胞膜的分子转运功能都极大地降低。

实施例2

使用强制进化方法,成功获得高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F。为了进一步验证获得的NTC00F菌株是否还是茶树草螺菌,我们使用细菌16S rRNA 基因通用引物对5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3', PCR扩增NTC00F菌株的16SrRNA基因,克隆至质粒pUC18,送至DNA测序公司测序。测序的结果表明, NTC00F菌株16SrRNA基因的序列与茶树内生草螺菌WT00F的16S rRNA基因序列完全一致。100%相同的16SrRNA基因说明高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F的确来源于茶树内生草螺菌WT00F。

实施例3

为了测试高硒酸盐耐性茶树草螺菌NTC00F对硒酸盐的耐受性，将茶树草螺菌NTC00F按1:100比例接种250ml含有0、50、100、200、400、800 mM 硒酸钠的LB液体培养基，37℃、200rpm 摇动培养。在不同培养时间取样并在紫外/可见光分光光度仪上测定OD₆₀₀值。每个点重复3次,求得平均数。最后汇制细菌的生长曲线。同时,在相同条件下测试茶树内生草螺菌WT00F作对照。茶树内生草螺菌WT00F能在高达400 mM硒酸钠的培养基中生长,但生长周期需80多小时。当硒酸盐高于400 mM, 细菌不能生长。即使在200 mM硒酸钠的培养基中, 生长周期需32小时 (见图1A)。高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F则不同, 它能在高达800 mM硒酸盐培养基中生长。即使在400 mM硒酸钠的培养基中, 生长周期需24小时 (见图2A)。

实施例4

为了测试高硒酸盐耐受茶树草螺菌NTC00F还原硒酸盐生成红色纳米单质硒的能力,将茶树草螺菌NTC00F以1:100比例接入200ml含有0、50、100、200、400、800 mM 硒酸钠的LB液体培养基中，37℃、200 rpm 摇动培养。肉眼观察细菌培养物的颜色变化。同时,在相同条件下测试茶树内生草螺菌WT00F作对照。茶树内生草螺菌WT00F能在70小时后使400 mM培养基变红,但88小时也不能让800 mM硒酸钠的培养基变色(见图1B)。高硒酸盐耐性茶树草螺菌NTC00F则能在6小时使400 mM培养基变红,也能在26小时后使800 mM硒酸盐培养基变红(见图2B)。

实施例5

在5 L发酵罐(BIOTECH, 上海保兴)中加入3 L 含400 mM硒酸钠的LB液体培养基,121℃灭菌30 min。待培养基冷却后，将放大培养的茶树草螺菌NTC00F按照1:100的接种量接入发酵罐内。在温度为37℃、转速200 rpm、pH7.0、通气量为1 v/v^.min条件下发酵30 h。发酵完成后,采用上面描述的红色纳米单质硒分离方法, 分离纯化红色纳米单质硒。一共进行了3次发酵,第一次获得960μg/ml红色纳米单质硒, 第二次获得1050μg/ml, 第三次获得990 μg/ml, 平均值为1000 μg/ml。也就是说,使用这种发酵技术即可从每升培养物中制备出1000 mg纯净的红色纳米单质硒。

对比实施例1

茶树内生草螺菌WT00F菌株活化、细胞收集方法同实施例1，但使用化学诱变和紫外线诱变两种方法。

化学诱变方法为：使用100-500μg/ml亚硝基胍(NTG) 35 ℃处理茶树内生草螺菌WT00F 2 h，然后用培养基稀释涂平板, 37℃培养过夜,最后在400 mM硒酸钠LB培养基(400 mM硒酸钠、1%胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5%NaCl, pH7.2) 中筛选。

紫外线诱变方法为: 使用15W紫外线杀菌灯(波长265 nM),在30 cm距离下照射茶树内生草螺菌WT00F(106/ml)15分钟 (细菌死亡率为75%)；取2 ml 照射菌液于30 ml液体LB培养基中37℃, 120rpm振荡培养，培养后的细菌按1:100比例接于400 mM的LB培养基中筛选。

化学诱变、紫外诱变未获得能在400 mM硒酸钠中快速生长的细菌菌株,只有硒酸盐方式处理获得了能在400 mM硒酸钠中生长的细菌。

对比实施例2

除硒酸盐处理次数为8次外，其余均同实施例1。

经过8轮培养的细菌只能在≤200mM硒酸钠培养基中生长而不能在>200mM硒酸钠培养基中生长。很显然，6轮的强制进化效果最佳,过多或过少都不会达到细菌硒酸盐耐受性最强的状态。这说明只要将茶树草螺菌NTC00F维持在200 mM硒酸钠的LB培基中培养6轮，它就能保持它特有的性状,非常稳定。再继续培养,细菌会丧失硒酸盐耐受性。

对比实施例3

除硒酸盐处理次数为4次外，其余均同实施例1。

经过4轮培养的细菌在≤200mM硒酸钠培养基中的生长比较接近且20小时后到达稳定期,但在400mM硒酸钠培养基中细菌的生长抑制期仍有5小时并且28小时后才到达稳定期。在800 mM 硒酸钠培养基中, 4轮培养细菌的生长抑制期则为15 小时, 48小时后也未达到稳定期。

Claims

1.一株高硒酸盐耐受细菌，其特征在于：该细菌为茶树草螺菌Herbaspirillum sp.NTC00F，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心, 保藏号为CCTCCNO.M2019679。

2.如权利要求1所述的一株高硒酸盐耐受细菌的筛选方法，其特征在于：茶树草螺菌WT00F在200 mM硒酸盐处理后，再经过高浓度硒酸盐培养基反复多次转接培养，强制进化成稳定的高硒酸盐耐受菌株NTC00F，具体筛选方法为：

A、先将茶树草螺菌WT00F活化，37℃、200 rpm 培养12 h；离心收集细胞,悬浮在PBS中；

B、硒酸钠处理步骤A的细胞，使用200mM硒酸钠室温处理茶树草螺菌WT00F 2 h, 培养后的细菌按1:100比例接于200 mM硒酸钠的培养基中筛选；

C、取步骤B获取的细菌培养物并接种至含200 mM硒酸钠的培养基中, 37℃、200 rpm摇动培养24 h，再从中取出细菌培养物并接种至含200 mM硒酸钠的培养基中, 37℃、200 rpm摇动培养24 h；重复上述过程,一共重复转接培养6次，即获得高硒酸盐耐受细菌NTC00F。

3.一株高硒酸盐耐受细菌的应用，其特征在于：茶树草螺菌NTC00F在高硒酸盐浓度下可发酵生产红色纳米单质硒。