CN112725256B

CN112725256B - 重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法

Info

Publication number: CN112725256B
Application number: CN202110196649.5A
Authority: CN
Inventors: 单杨; 李高阳; 王振; 刘娟; 操文军
Original assignee: HUNAN AGRICULTURAL PRODUCTS PROCESSING INSTITUTE
Current assignee: HUNAN AGRICULTURAL PRODUCTS PROCESSING INSTITUTE
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2023-01-20
Anticipated expiration: 2041-02-22
Also published as: CN112725256A

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，该重组大肠杆菌由重组质粒导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。以该重组大肠杆菌为全细胞催化剂，催化底物橙皮素，生物合成香叶木素。该方法绿色高效，反应过程不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，成本低，安全性高，且易于大规模生产。

Description

重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，具体涉及一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌将橙皮素转化为香叶木素的高效生物合成方法。

背景技术

香叶木素（Diosmetin）是一种从植物中分离出来的黄酮类化合物，其结构式如下：

香叶木素主要存在于柑橘、薄荷等植物中。游离的香叶木素在植物中含量较低，在薄荷中约为0.027%，在柑橘中约为0.016%。香叶木素在植物中主要以芸香糖苷-地奥司明的形式存在，目前香叶木素和地奥司明作为增强静脉张力的血管保护药被大量用于临床治疗，仅地奥司明片这一种药品在国内经由药店零售的部分在2016年销售额就达到了一亿元以上，且以每年10%以上的速度持续增长。

香叶木素现阶段的主要获取途径包括：①从植物中直接通过提取分离获得，但由于香叶木素及地奥司明在植物中含量极低，直接提取成本高、难度大，并没有被广泛使用。②现阶段实际生产中，地奥司明和香叶木素使用柑橘果实中含量较高的橙皮苷为原料，以吡啶为溶剂、以碘和溴为催化剂，在高热条件下脱氢获得，但该方法需要使用有毒试剂及大量有机溶剂，既不环保，也不安全。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌，还提供一种绿色高效、可避免使用大量化学试剂、成本低、安全性高、可大规模生产的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述的重组大肠杆菌，优选的，编码所述AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

上述的重组大肠杆菌，优选的，所述宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组大肠杆菌记为DE3/pAnFNSⅠ。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，所述方法包括先将所述的重组大肠杆菌置于含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基中诱导蛋白表达，所述蛋白胨中含有血红蛋白，然后以橙皮素为催化底物，进行全细胞催化，生物合成香叶木素。

上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述全细胞催化时，向催化体系中添加额外的α-酮戊二酸，所述额外的α-酮戊二酸在催化体系中的浓度为20mg/L～100mg/L。

上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述全细胞催化时，向催化体系中添加硫酸亚铁，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L。

上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述含酵母提取物、蛋白栋和氯化钠的培养基为LB培养基或TB培养基。

上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述诱导蛋白表达时，诱导培养的温度为10℃～35℃；全细胞催化体系中，所述重组大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀＝0.4～1.2，底物为10mg/L～5000mg/L的橙皮素，催化反应的温度为15℃～35℃。

本发明中，来源于欧白芷的黄酮合酶1（Flavone synthase 1 from Angelica archangelica，AnFNSⅠ）经过密码子优化后，经由pET-28a(+)质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，蛋白诱导表达后，以橙皮素（Hesperetin）作为底物，在重组大肠杆菌菌体内将橙皮素在α-酮戊二酸和亚铁离子的帮助下合成香叶木素（Diosmetin），α-酮戊二酸由重组大肠杆菌本身产生，亚铁离子来源于培养基，也可以额外增加α-酮戊二酸和/或铁源。反应过程如下式（1）所示：

式（1）

反应中二价铁离子在α-酮戊二酸和分子氧的作用下先生成四价的高活性羰基铁合物，随后铁合物在酶的作用下与底物橙皮素进行反应，经过电子转移-羟化-消去最后得到终产物香叶木素，铁离子则被还原为二价。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明筛选出来源于欧白芷的黄酮合酶1（AnFNSⅠ），经过密码子优化后与表达载体pET-28a(+)连接构建成重组质粒，再导入宿主大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，通过重组大肠杆菌来催化橙皮素合成香叶木素。本发明的AnFNSⅠ与现有文献报道可能具有类似催化活性的酶相比具有以下优点：①与不同来源的黄酮合酶1(FNSⅠ)相比，AnFNSⅠ具有更好的催化活性；②与不同类型的黄酮合酶(即FNSⅡ)相比，AnFNSⅠ属于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶，可单独发挥作用，便于在工程菌中构建相应的反应体系，而FNSⅡ属于NADPH依赖型P450家族单加氧酶，需要和其他酶(如CPR)或真核生物细胞器协同才能发挥作用；③与同属于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的黄酮醇合酶(FLS)相比，AnFNSⅠ催化橙皮素得到的反应产物主要为香叶木素，而FLS催化橙皮素得到的反应产物主要为未进行分子内消去的4-O-甲基花旗松素；④与未进行密码子优化的野生型AnFNSⅠ相比，本发明所给出的优化序列可以显著提高酶在大肠杆菌中的可溶表达。

2、本发明通过合成生物学途径策略，将香叶木素在植物中的合成途径平移至微生物底盘中，构建具有香叶木素合成能力的工程菌，通过工程菌实现香叶木素的绿色、高效合成有助于解决现阶段香叶木素生产过程中高污染的问题。由于橙皮素在柑橘等植物中含量远高于香叶木素的含量、且橙皮素可以通过含量更高的橙皮苷通过水解获得，因此该方法是一种具有较大潜力的香叶木素生物合成方法，且反应过程不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，易于大规模生产。本发明创建的将低值化合物转化为香叶木素的生物合成方法，在较宽的底物浓度范围及反应条件下，均能有效合成香叶木素，与化学合成方法相比，该方法由于不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，在产品安全性及环保方面具有较大优势。

3、本发明的香叶木素生物合成方法与现有香叶木素的合成方法对比，具有如下表1所示的优势：

表1 本发明的香叶木素生物合成方法与现有香叶木素的合成方法对比表

附图说明

图1为本发明实施例1和实施例2中表达载体pET-28a(+)的结构图。

图2为本发明实施例1中香叶木素标准品的质谱图。

图3为本发明实施例1中重组菌种发酵液样品的质谱图。

图4为本发明实施例1中香叶木素、橙皮素混合标准品的色谱图。

图5为本发明实施例1中重组菌种发酵液样品的色谱图。

图6为本发明实施例1中重组菌株转化合成香叶木素的时间曲线图。

图7为本发明实施例2中重组菌株及对照菌株转化合成香叶木素的时间曲线图。

图8为对比例1中密码子优化对AnFNSⅠ表达情况影响的电泳图，其中，优化1为对比例1密码子优化后的AnFNSⅠ，本优化为实施例2密码子优化后的AnFNSⅠ。

图9为对比例1中密码子优化对AnFNSⅠ催化底物转化率影响图。

图10为对比例2中四株重组大肠杆菌发酵液中橙皮素、香叶木素、4-O-甲基花旗松素的浓度图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。单位mM：mmol/L。

橙皮素、香叶木素标准品购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO），分析纯橙皮素购自生工生物工程（上海）股份有限公司。酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠、磷酸盐（NaH₂PO₄和Na₂HPO₄）购自北京索莱宝科技有限公司，来源于欧白芷Angelica archangelica的黄酮合酶１基因经过密码子优化后由生工生物工程（上海）有限公司合成。优化前后氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4，对应的DNA序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5。

LB培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，以50mM磷酸盐缓冲液PBS将pH调整至7.4，使用前121℃高压蒸汽灭菌15min。50mM磷酸盐缓冲液PBS：分别配置50mM的NaH₂PO₄和50mM的Na₂HPO₄，以NaH₂PO₄滴定Na₂HPO₄至不同的pH。

全细胞转化的样品分析：将样品12000rpm离心2min，取上清，以甲醇稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过滤。样品分析使用Shimadzu LC-MS/MS-IT-TOF，进样体积10μL，使用自动进样器进样。使用C18反向色谱柱(Thermo scientific, ODS-2HYPERSIL, Dim.(mm)250×4.6, particle size 5μm)对样品进行分离。流动相A为水，流动相B为甲醇。使用梯度洗脱，0min 10％B，3min 30％B，10min 55％B，维持该体积浓度至15min。流速为1mL/min。柱温：40℃。使用外检测器，λ＝254nm测定香叶木素。质谱分析使用负离子模式，以提取离子流(extracted ion chromatograms, EIC)m/z＝299.0623检测香叶木素。二级质谱MS/MS分析的前体分别为：香叶木素299.0623m/z，宽度设置为1Da。通过与标准品的保留时间、一级质谱、二级质谱图进行比对，确定目标物质。使用液相色谱图的峰面积对香叶木素进行定量分析。

实施例1

一种本发明的重组大肠杆菌，重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，密码子优化前AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本实施例中，编码密码子优化前AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本实施例中，宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌记为DE3/pAnFNSⅠ。

本实施例的重组大肠杆菌的构建方法如下：

（1）AnFNSⅠ的编码基因经密码子优化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并通过双酶切克隆至pUC118，得到重组质粒pUAnFNSI。将pUAnFNSI导入扩增菌内，自我复制，然后重组质粒抽提出来，酶切下来，电泳回收，得到高浓度的目的基因序列溶液。

（2）pET-28a(+)是包含Xba I、Nco I和Nhe I等多个酶切位点的表达载体，可以通过不同酶切位点组合策略构建不同的表达结构，pET-28a(+)的结构如图1所示，DNA序列如SEQ ID NO.3所示，该载体用于异源表达黄酮合酶AnFNS。分别使用限制性内切酶Nco I/XhoI消化重组载体pUAnFNSI和表达载体pET-28a(+)，使用琼脂糖凝胶电泳分离没切产物，并回收目的基因AnFNSI（1098bp）和表达载体pET-28a(+) (5369 bp)。将AnFNS基因与表达载体pET-28a(+)混合，使用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，得到重组质粒pAnFNSI，将重组质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。通过菌落PCR验证阳性转化子，所用引物序列为SEQ ID NO .6和SEQ ID NO .7。将阳性转化子转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养后提取重组质粒pAnFNSⅠ并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板用以筛选阳性菌，构建异源表达AnFNSⅠ的工程菌DE3/pAnFNSⅠ。

一种利用本实施例的重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，即全细胞转化方法，包括以下步骤：

（1）重组大肠杆菌的培养

将平板划线分离的单菌落转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量转接至装有25mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。37℃、220rpm培养，大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀=0.7时，添加终浓度为0.2mM的IPTG以诱导AnFNSⅠ的表达，将三角瓶转移至18℃、220rpm，诱导培养10h。将菌液收集到离心管中，4000rpm、4℃离心5min收集菌体。

（2）全细胞催化

以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS中。同时添加终浓度100mg/L橙皮素作为底物进行反应，进行全细胞催化，反应温度为23℃，该反应在恒温摇床上进行。在不同的时间点取样进行分析。香叶木素质谱图如图2和图3所示，其中图2为香叶木素标准品，图3为重组菌种发酵液（产物溶液）样品。质谱主要相应峰如下表2所示。

表２香叶木素标准品与重组菌种发酵液的质谱主要峰

由表2可见，有明显的香叶木素生成，负离子模式下其质荷比为299.0623，与标准品质谱结果及现有公开报道相符，并在重组菌种发酵液中检测到了中间产物（4-O-甲基花旗松素）的相应峰。香叶木素色谱图如图4和图5所示，其中图4为香叶木素、橙皮素混合标准品，图5为重组菌种发酵液样品，可见明显的香叶木素响应峰。通过香叶木素的产量对取样时间点作图，重组菌株转化香叶木素合成的时间曲线如图6所示，可以确定在转化6小时香叶木素产量趋于稳定，此时培养基中香叶木素浓度为42.22mg/L，底物转化率为42.48%。

本实施例的步骤（2）中，还可以加入硫酸亚铁促进反应进行，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L，得到高产香叶木素。

实施例2

一种本发明的重组大肠杆菌，重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ编码基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，密码子优化前黄酮合酶AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的黄酮合酶AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本实施例中，编码密码子优化前黄酮合酶AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码密码子优化后的黄酮合酶AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本实施例中，宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本实施例的重组大肠杆菌的构建方法如下：

分别使用限制性内切酶Nde I/Xho I消化重组载体pUAnFNSⅠ和表达载体pET-28a(+)，使用琼脂糖凝胶电泳分离没切产物，并回收目的基因AnFNSⅠ（1098bp）和表达载体pET-28a(+) (5369 bp)。将AnFNSⅠ基因与表达载体pET-28a(+)混合，使用T4连接酶在18℃条件下连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。通过菌落PCR验证阳性转化子，所用引物序列为SEQ ID NO .6/SEQ ID NO .7。将阳性转化子转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养后提取重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板用以筛选阳性菌，构建异源表达欧白芷黄酮合酶AnFNSⅠ的工程菌。

一种利用本实施例的重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，包括以下步骤：

将平板划线分离的单菌落转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量转接至装有25mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。37℃、220rpm培养，大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀=0.8时，添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导AnFNSⅠ的表达，将三角瓶转移至16℃、220rpm，诱导培养10h。将菌液收集到离心管中。直接向菌液中添加终浓度200 mg/L橙皮素作为底物进行反应，并加入终浓度为50 mg/L的α-酮戊二酸促进反应进行，该反应在恒温摇床上进行，反应温度为23℃。在不同的时间点取样进行分析，使用不含有AnFNSⅠ的大肠杆菌BL21（DE3）菌株使用同样的反应方法作为对照。通过香叶木素的产量对取样时间点作图，重组菌株及对照菌株转化香叶木素合成的时间曲线如图7所示，可以确定重组菌株在转化7小时香叶木素产量趋于稳定，此时培养基中香叶木素浓度为107.56mg/L，底物转化率为54.13%，而作为对照的不含有AnFNSⅠ的大肠杆菌BL21(DE3)菌株不能在同样的条件下将橙皮素转化为香叶木素。

对比例1

一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，实施方案与实施例2基本相同，区别仅在于：AnFNSⅠ密码子优化不同。使用不同核苷酸序列构建的重组大肠杆菌经过IPTG诱导后，胞内可溶蛋白SDS-PAGE结果见图8，香叶木素转化率见图9。图中未优化指使用野生型SEQ ID NO.1序列进行重组大肠杆菌构建，本优化（实施例2密码子优化后的AnFNSⅠ）为使用SEQ ID NO.4序列进行重组大肠杆菌构建。优化1（对比例1密码子优化后的AnFNSⅠ）所用于构建重组大肠杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。SDS-PAGE和底物转化率结果显示，不进行密码子优化或优化策略不合适的情况下AnFNSⅠ不能在大肠杆菌中正常表达并催化底物转化，而采用本发明的密码子优化后大幅度提高了AnFNS的异源表达效率，使得该反应可以进行。

对比例2

一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，实施方案与实施例1基本相同，区别仅在于：增加了其他类型可能催化该反应的酶进行对比，构建了以密码子优化后的茶树黄酮醇合酶(Flavonol synthase from Camellia sinensis, CaFLS，核苷酸序列如SEQID NO.9所示)构建的重组大肠杆菌DE3/pCaFLS，以密码子优化后的黄芩黄酮合酶2(Flavone synthase 2 from Scutellaria baicalensis, ScFNSⅡ，核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示)构建的重组大肠杆菌DE3/pScFNSⅡ，以密码子优化后的满天星黄烷酮3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase from Gypsophila paniculata, GyFHT，核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示)构建的重组大肠杆菌DE3/pGyFHT，与本发明的序列优化后欧白芷黄酮合酶1（核苷酸序列如SEQ ID NO.5）构建的重组大肠杆菌DE3/pAnFNSⅠ。发酵12h后，四株重组大肠杆菌发酵液中橙皮素、香叶木素、4-O-甲基花旗松素（为该反应中间产物）浓度如图10所示。相较于三株对比菌株，本发明的DE3/pAnFNSⅠ发酵液中香叶木素浓度最高，为39.06 mg/L。DE3/pCaFLS和GyFHT发酵液中主要产物为4-O-甲基花旗松素，香叶木素含量分别为1.97mg/L和0.15mg/L，DE3/pScFNSⅡ发酵液中未检测到香叶木素。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 湖南省农产品加工研究所

<120> 重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 364

<212> PRT

<213> 欧白芷(Angelica archangelica)

<400> 1

Met Ala Pro Thr Thr Ile Thr Ala Leu Ala Gln Glu Lys Thr Leu Asn

1 5 10 15

Leu Ala Phe Val Arg Asp Glu Asp Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr Asn

20 25 30

Gln Phe Ser Asn Glu Ile Pro Ile Ile Ser Leu Ala Gly Met Asp Asp

35 40 45

Asp Thr Gly Arg Arg Pro Gln Ile Cys Arg Lys Ile Val Glu Ala Phe

50 55 60

Glu Asp Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asp His Gly Ile Asp Gly Thr

65 70 75 80

Leu Ile Ser Glu Met Thr Arg Leu Ser Arg Glu Phe Phe Ala Leu Pro

85 90 95

Ala Glu Glu Lys Leu Arg Tyr Asp Thr Thr Gly Gly Lys Arg Gly Gly

100 105 110

Phe Thr Ile Ser Thr His Leu Gln Gly Asp Asp Val Lys Asp Trp Arg

115 120 125

Glu Phe Val Thr Tyr Phe Ser Tyr Pro Ile Asp Asp Arg Asp Tyr Ser

130 135 140

Arg Trp Pro Asp Lys Pro Gln Gly Trp Arg Ser Thr Thr Glu Val Tyr

145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Met Val Leu Gly Ala Lys Leu Leu Glu Val Leu Ser

165 170 175

Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Lys Ala Cys Val Asn

180 185 190

Met Glu Gln Lys Val Leu Ile Asn Tyr Tyr Pro Thr Cys Pro Glu Pro

195 200 205

Asp Leu Thr Leu Gly Val Arg Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile Thr

210 215 220

Ile Leu Leu Gln Asp Met Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Arg Asp Gly

225 230 235 240

Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Val Glu Gly Ala Phe Val Val

245 250 255

Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys Asn

260 265 270

Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Thr Ser Ser Arg Leu Ser Ile

275 280 285

Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Gln Asn Ala Ile Val Tyr Pro Leu Arg

290 295 300

Ile Arg Glu Gly Glu Lys Ala Val Leu Asp Glu Ala Ile Thr Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Met Tyr Lys Lys Asn Met Thr Lys His Ile Glu Val Ala Thr Leu

325 330 335

Lys Lys Leu Ala Lys Glu Lys Arg Leu Gln Glu Glu Lys Ala Lys Leu

340 345 350

Glu Thr Glu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ile Ser Ala

355 360

<210> 2

<211> 1095

<212> DNA

<213> 欧白芷(Angelica archangelica)

<400> 2

atggctccaa caactataac tgcattagcc caggagaaaa cactaaattt agcctttgtc 60

agggatgaag acgagcgtcc caaagttgcc tacaatcagt tcagcaatga aattcccatc 120

atttctttag ctggtatgga tgacgatact ggcaggagac cccagatatg tcgtaaaata 180

gttgaggcat ttgaagactg gggaattttc caggtggttg atcacggcat tgacggcact 240

ttgatttctg agatgactcg tctttctcgt gaattctttg ctttgcctgc tgaggaaaaa 300

cttcggtatg atacaactgg tggaaagaga ggcggcttta ccatctccac tcatcttcag 360

ggtgacgatg ttaaggattg gcgtgagttc gttacttact tttcgtaccc aatcgatgat 420

cgggactact caagatggcc tgataagccc cagggatgga ggtcaaccac ggaggtttat 480

agtgagaagt taatggtgct aggtgccaag ttacttgaag tgttatcaga ggccatgggg 540

cttgagaaag aggctcttac aaaggcttgt gtgaatatgg aacaaaaagt gttaatcaat 600

tactatccca cgtgccccga accggacttg acacttggag tcagaaggca tacggatcca 660

ggtactatta ccattctgct tcaggacatg gttggtgggt tacaggctac tagggatggt 720

ggcaaaactt ggattactgt tcagcctgtg gagggagctt ttgtggtcaa tttgggtgac 780

catggtcatt atttgagcaa tgggaggttc aagaatgctg accaccaagc agtagtgaat 840

tcaacctcta gcagattgtc tattgcaact ttccagaacc cggcccagaa tgcgatagtg 900

tatcccttga ggatcaggga gggagagaag gcagttcttg atgaggccat cacctacgct 960

gaaatgtata agaaaaacat gactaaacat attgaggtgg ctaccctgaa gaaattggcc 1020

aaggagaaaa ggttgcaaga ggaaaaggcc aagctggaga cggaatccaa gagtgcagat 1080

ggaatttcag cttag 1095

<210> 3

<211> 5369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5369)

<223> 表达载体pET-28a(+)的核苷酸序列

<400> 3

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360

caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420

ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480

gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540

gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600

ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660

caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720

tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780

agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840

ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900

ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960

gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020

taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080

cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140

cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200

tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260

tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860

acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040

ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100

tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160

gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220

tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280

cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340

catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400

gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460

catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520

tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580

taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640

atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700

gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760

aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020

ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080

tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140

gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800

gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369

<210> 4

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CONFLICT

<222> (1)..(365)

<223> 根据实验要求而设计，作为密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列

<400> 4

Met Gly Ala Pro Thr Thr Ile Thr Ala Leu Ala Gln Glu Lys Thr Leu

1 5 10 15

Asn Leu Ala Phe Val Arg Asp Glu Asp Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr

20 25 30

Asn Gln Phe Ser Asn Glu Ile Pro Ile Ile Ser Leu Ala Gly Met Asp

35 40 45

Asp Asp Thr Gly Arg Arg Pro Gln Ile Cys Arg Lys Ile Val Glu Ala

50 55 60

Phe Glu Asp Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asp His Gly Ile Asp Gly

65 70 75 80

Thr Leu Ile Ser Glu Met Thr Arg Leu Ser Arg Glu Phe Phe Ala Leu

85 90 95

Pro Ala Glu Glu Lys Leu Arg Tyr Asp Thr Thr Gly Gly Lys Arg Gly

100 105 110

Gly Phe Thr Ile Ser Thr His Leu Gln Gly Asp Asp Val Lys Asp Trp

115 120 125

Arg Glu Phe Val Thr Tyr Phe Ser Tyr Pro Ile Asp Asp Arg Asp Tyr

130 135 140

Ser Arg Trp Pro Asp Lys Pro Gln Gly Trp Arg Ser Thr Thr Glu Val

145 150 155 160

Tyr Ser Glu Lys Leu Met Val Leu Gly Ala Lys Leu Leu Glu Val Leu

165 170 175

Ser Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Lys Ala Cys Val

180 185 190

Asn Met Glu Gln Lys Val Leu Ile Asn Tyr Tyr Pro Thr Cys Pro Glu

195 200 205

Pro Asp Leu Thr Leu Gly Val Arg Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile

210 215 220

Thr Ile Leu Leu Gln Asp Met Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Arg Asp

225 230 235 240

Gly Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Val Glu Gly Ala Phe Val

245 250 255

Val Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys

260 265 270

Asn Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Thr Ser Ser Arg Leu Ser

275 280 285

Ile Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Gln Asn Ala Ile Val Tyr Pro Leu

290 295 300

Arg Ile Arg Glu Gly Glu Lys Ala Val Leu Asp Glu Ala Ile Thr Tyr

305 310 315 320

Ala Glu Met Tyr Lys Lys Asn Met Thr Lys His Ile Glu Val Ala Thr

325 330 335

Leu Lys Lys Leu Ala Lys Glu Lys Arg Leu Gln Glu Glu Lys Ala Lys

340 345 350

Leu Glu Thr Glu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ile Ser Ala

355 360 365

<210> 5

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1098)

<223> 根据实验要求而设计，作为编码密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列

<400> 5

atgggcgcgc cgaccaccat caccgcgctg gcgcaggaaa aaaccctgaa cctggcattc 60

gttcgtgatg aagatgaacg tccgaaagtt gcgtacaacc agttctctaa cgaaatcccg 120

atcatctccc tggcgggcat ggatgatgat accggtcgtc gtccgcagat ctgccgtaaa 180

atcgttgaag ctttcgaaga ttggggtatc ttccaggttg tggatcacgg tatcgatggc 240

accctgatct ctgaaatgac ccgtctgtcc cgtgaattct tcgcgctgcc ggcggaagaa 300

aaactgcgct acgataccac cggtggtaaa cgtggcggct tcaccatctc tacccacctg 360

cagggtgatg atgttaaaga ttggcgtgaa ttcgttacct acttctctta tccgatcgat 420

gatcgtgatt actctcgttg gccggataaa ccgcagggct ggcgtagcac caccgaagtt 480

tattctgaaa aactgatggt tctgggtgca aaactgctgg aagttctgtc tgaagcgatg 540

ggcctggaaa aagaagcgct gaccaaagcg tgcgttaaca tggaacagaa agttctgatc 600

aactattacc cgacctgtcc ggaaccggat ctgaccctgg gtgttcgccg tcataccgat 660

ccgggtacca ttaccattct gttacaggat atggttggcg gcctgcaggc aacccgtgac 720

ggtggtaaaa cttggatcac tgttcagccg gttgaaggcg cgtttgttgt gaacctgggt 780

gatcacggtc attatctgtc taacggtcgt tttaaaaacg cagaccacca ggctgttgtt 840

aactccactt ctagccgtct gtctattgcg acctttcaga acccggcgca gaacgcaatc 900

gtttacccgc tgcgtattcg tgaaggtgaa aaagcggttc tggatgaagc gattacctac 960

gctgaaatgt ataagaaaaa catgactaaa catatcgaag ttgcgaccct gaaaaaactg 1020

gctaaagaaa aacgtctgca ggaagaaaaa gctaaactgg aaaccgaatc taaatctgct 1080

gacggcatta gcgcataa 1098

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为序列优化后AnFNSI阳性转化子验证的PCR上游引物的核苷酸序列

<400> 6

cggcttcacc atctctaccc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为序列优化后AnFNSI阳性转化子验证的PCR下游引物的核苷酸序列

<400> 7

ggtttatccg gccaacgaga 20

<210> 8

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1092)

<223> 根据实验要求而设计，作为对比例1中编码密码子优化的AnFNSⅠ的核苷酸序列

<400> 8

atggcgccaa cgactatcac tgctctggca caggaaaaaa cgctgaacct ggctttcgtt 60

cgcgatgaag atgaacgccc gaaagttgca tataaccagt tcagcaacga aatcccgatc 120

attagcctgg caggtatgga tgacgacacc ggtcgtcgtc cgcaaatttg ccgtaagatt 180

gttgaagctt ttgaagattg gggtatcttc caggttgtgg accacggcat cgacggtact 240

ctgatttctg aaatgacccg tctgagccgt gagttcttcg ctctgccggc ggaagaaaaa 300

ctgcgctatg acactaccgg tggcaagcgt ggtggcttca ccatttctac ccacctgcag 360

ggcgatgacg tgaaagactg gcgcgaattc gtcacttact tttcctatcc gatcgacgac 420

cgcgattaca gccgttggcc tgacaaaccg caaggctggc gttccaccac cgaagtttac 480

agcgaaaagc tgatggtgct gggtgctaaa ctgctggaag ttctgagcga agcaatgggc 540

ctggaaaaag aagcgctgac gaaagcctgc gttaatatgg aacagaaagt cctgatcaac 600

tattatccga cttgcccgga acctgacctg actctgggtg ttcgtcgtca cactgatccg 660

ggcacgatca ccatcctgct gcaggacatg gtgggtggcc tgcaagcgac tcgtgatggc 720

ggtaaaactt ggatcaccgt gcagccggtt gaaggtgcat tcgttgtgaa tctgggtgac 780

cacggtcact atctgagcaa cggccgcttt aaaaacgcgg accaccaggc cgttgttaac 840

tccaccagca gccgtctgtc tattgccacg ttccagaacc cggcgcaaaa cgccatcgtt 900

tacccgctgc gcatccgcga aggcgaaaaa gcggttctgg atgaagcaat cacctacgcg 960

gaaatgtata aaaaaaacat gaccaaacat attgaagtgg caaccctgaa aaaactggct 1020

aaagaaaaac gtctgcagga ggaaaaagcg aagctggaga ctgaaagcaa aagcgccgac 1080

ggtatctcct ag 1092

<210> 9

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(993)

<223> 根据实验要求而设计，作为对比例2中编码密码子优化后的茶树黄酮醇合酶CaFLS的核苷酸序列

<400> 9

atggaagtcg aacgtgttca ggcgctgtct cacgttactc tgcacgaact gccggcaaaa 60

ttcattcgtc cggcacatga acagccggag aacagcaaag cgatcgaggg cgtaactgtt 120

ccggttattt ccctgtctcg tccacacgat gttgtcgttg atgcgctgag caaagcatgc 180

agcgaatggg gtttcttcct gatcaccgac cacggcgtgg agccatccct gatcggtcgt 240

ctgaaagagg ttggcgaaga attctttaaa ctgccgcaga aagaaaaaga aagctatgcc 300

aacgacccga gcagcggcag cttcgaaggc tatggcacca aaatgacgaa gaacttcgat 360

gaaaaagtcg aatggattga ctactacttc catgttatgc acccaccgaa aaagctgaac 420

ctggacatgt ggccgaaaaa cccgtcctcc taccgtggtg ttactgagga atacaacgtt 480

gagatcctgc gtaccaccaa caagctgctg gaactgctgt ccgaaggtct gggtctggac 540

ggtaaagtac tgaactccag cctgggtggc gacgaaatcg agttcgaaat gaaaattaac 600

atgtacccgc cttgccctca gcctgaactg gcactgggtg tcgaaccgca tactgacatg 660

agcgcgctga ccctgctgat tccaaacgat gtcccgggtc tgcaggtgtg gaaagacggc 720

aactgggtgg ccgtcaatta tctgccgaac gctctgtttg tccacgttgg tgatcagctg 780

gaagtcctga gcaacggtaa atacaaaagc gtgctgcacc gctctctggt gaacaaggag 840

cgtactcgta tgagctgggc cgtgtttgtg gttccaccgc atgaagctgt cattggcccg 900

ctgccggaac tgatcgacga aaaaaacccg gcaaaatact ccaccaaaac ctatgcggaa 960

taccgttacc gtaaatttaa caaaattccg cag 993

<210> 10

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> 根据实验要求而设计，作为对比例2中编码密码子优化后的黄芩黄酮合酶2的核苷酸序列

<400> 10

atgggcgatc tggttgaagt taccctgtac gcggcgctgt tcctgctgag cgcggcgttc 60

ctgctgctga tcttcgcagg tgatcgttct agcccgccgg gtccgtttcc gctgccgatc 120

atcggtcatc tgcacctgct gggcccgaaa ctgcaccagt ccttccacgg tctgtctcag 180

cgtcacggcc cgctgatgca gatccgtctg ggcagtatta actgcgtggt tgcgagcacc 240

ccggaactgg cgaaagaatt cctgaaaacc aacgaactgg ttttcagctc tcgtaaacac 300

agcactgcga tcgatattgt tacctataac tcttccttcg cgttcagccc gtacggtccg 360

tattggaaat acatcaaaaa actgtgtact tacgaactgc tgggcgctcg taacctgcac 420

cacttccagc cgattcgtac tttcgaagtt cacaccttcc tgcgcctgct gatggaaaaa 480

tctgaaagcg gtgaatcttt taacgttacc gaagaactga tcaaactgac ctctaacgtt 540

atgagcaaca tgatgctggg cacccgttgc tccgctaccg atggcgaagc cgaagcggcg 600

cgtaccgtga tccgcgaagt gaccgaaatc tttggtgaat tcgatgcggc tgacatcatt 660

tggttctgca aaaacttcga tctgcagggc atccgtaaac gctctgaaga tattcagcgt 720

cgttacgatg cactgctgga aaaaatcatc accgatcgtg aaaaactgcg tcgctctcat 780

cgtggcggtg aagcaaaaga ttttctggac atcttcctgg atatcatgga ttccggtaac 840

agcgaagtta aattctctcg tgaacatctg aaagctctga tcctggattt cttcaccgca 900

ggcaccgaca ccaccgcgat ctctaccgaa tgggcgatcg cagaactgat gaacaacccg 960

aaagttctga aaaaagcgca ggaagaaatt cagaaagtgg tgggctcctg ccgcctgatg 1020

gacgaatctg acgcgccgaa cctgccgtac ttagaagcaa tcatcaaaga aaccttccgc 1080

ttgcacccgc cgattccgat gctggcccgt aaaagcgtgt ccgattgcgt tattgatggc 1140

tacaacatcc cggcgagcac tctgctgttt gtgaacattt ggtccattgg tcgtaacccg 1200

gaatgctggg acagcccgtt cagcttccgt ccggaacgtt tcttcgaaaa agataacgca 1260

agcatcgata ttaaaggtca gcacttccag ctgctgccgt tcggtaccgg tcgtcgcggt 1320

tgtccgggca tgctgctggc aatccaggaa ctgctgctga tcattggcac catgattcag 1380

tgctttgact gggaactgcc ggaaggttct ggtccggttg atatgaccga acgtgcgggt 1440

ctgaccgctc cgcgtgcgga agatctgatc tgtcgtgtta gctgtcgtgt tgatccgaaa 1500

atcgttttct aa 1512

<210> 11

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1095)

<223> 根据实验要求而设计，作为对比例2中编码密码子优化后的满天星黄烷酮-3-羟化酶GyFHT的核苷酸序列

<400> 11

atggttgcag accgtccaaa aactctgact tccctggaag gcgataacaa actgaacccg 60

aacttcatcc gcgacgaaga tgaacgtccg aaggtcgctt ataacacgtt tagcaacgat 120

atcccggtga tctctctggc aggtctggat ggcgaaaacc gtgcagagat ctgccgcaag 180

attgtagaag cttgcgaaga ctggggtatc tttcaggtgg tcgaccatgg cgtaggcgac 240

gacctgattg ccgacatgac ccgtctggct cgtgaattct tcgcactgcc gccggacgag 300

aagctgcaat acgacatgtc tggtggcaaa aaaggcggct ttattgttag ctctcacctg 360

cagggtgaag ttgttcagga ctggcgcgaa attgttactt acttttctta cccgattacc 420

tcccgtgatt atacccgttg gccggataaa cctgatggtt ggaaaaaagt aaccgaggaa 480

tacagcaaca aactgatggg tctggcttgt cgcctgctgg gcgttctgtc cgaagcgatg 540

ggcctggaaa gcgaggcgct gactaaagca tgtgtggata tggaccagaa aatcgttgtg 600

aactattacc cgaaatgtcc acagccggac ctgaccctgg gtctgaaacg tcacaccgat 660

ccgggcacca ttactctgct gctgcaggat caggttggtg gtctgcaggc tactcgtgac 720

ggtggtcgta cctggatcac cgtacagccg atctctggtg cgtttgtggt gaacctgggc 780

gatcacggcc acttcctgtc taacggtcgc ttcaaaaacg cggaccacca ggccgttgtt 840

aactctgaat gcagccgtct gagcatcgct acgtttcaga atccggcacc ggaagctact 900

gtatacccac tggcgatccg tgaaggtgaa aaaagcatca tggaggaacc gattaccttc 960

gcagaaatgt atcgccgtaa aatgtccaaa gatctggagg cggctcgtct gaaacgtctg 1020

gcaaaagagg aactggttat caaagagatg gataaagcaa agctggaaac caaaagcatt 1080

gagcagatcc tggcg 1095

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

4.一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述方法包括先将权利要求1～3中任一项所述的重组大肠杆菌置于含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基中诱导蛋白表达，所述蛋白胨中含有血红蛋白，然后以橙皮素为催化底物，进行全细胞催化，生物合成香叶木素。

5.根据权利要求4所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述全细胞催化时，向催化体系中添加额外的α-酮戊二酸，所述额外的α-酮戊二酸在催化体系中的浓度为20mg/L～100mg/L。

6.根据权利要求4所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述全细胞催化时，向催化体系中添加硫酸亚铁，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基为LB培养基或TB培养基。

8.根据权利要求4～6中任一项所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述诱导蛋白表达时，诱导培养的温度为10℃～35℃；全细胞催化体系中，所述重组大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀＝0.4～1.2，底物为10mg/L～5000mg/L的橙皮素，催化反应的温度为15℃～35℃。