CN108728389B - 一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株高效生产2，3，5，6‑四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌。该工程菌是携带阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源乙偶姻合成操纵子alsRSD和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH氧化酶基因nox的大肠杆菌。利用本发明的基因工程菌转化葡萄糖生产2，3，5，6‑四甲基吡嗪，最高产量达16.40g/L，产物纯度≥98％，且具有反应条件温和、副产物少和产物易于分离纯化的优势，具有很好的应用价值。

Description

一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌及其 应用

技术领域

本发明涉及一株用于生产2，3，5，6-四甲基吡嗪的大肠杆菌基因工程菌及其应用。

背景技术

2，3，5，6-四甲基吡嗪(2，3，5，6-Tetramethylpyrazine，TMP)是有效治疗心脑血管疾病的药物。由于显著的疗效，TMP深受医患的推崇，成为目前临床最为常用的药物之一，需求巨大，因而TMP的合成研究获得广泛关注。目前，TMP的合成方法主要是化学法，包括气相催化法、α-氨基酮缩合法、邻二胺和邻二酮缩合法以及氮代邻二酮或者α-叠氮基酮缩合法(臧传近，等.山东化工.2015，44(18)：23-25)。然而，上述化学合成法均具有反应条件要求高和副产物较多的不利因素。鉴于我国“十三五”发展规划中大力提倡的绿色和可持续发展的理念，迫切需要探索TMP的新型绿色合成工艺。

与化学合成方法相比，生物合成方法具有反应条件温和、副产物少和转化率高等优点。利用生物法替代化学法生产TMP已有文献报道。例如，Zhu等利用B.subtilis野生型菌种生产TMP，摇瓶产量达到7.46g/L，发酵罐产量达到7.34g/L(Zhu BF and Xu Y.BioprocBiosyst Eng.2010，33(8)：953-959)。Xiao等利用B.subtilis生产的TMP产量达到8.34g/L，是利用野生型菌株合成TMP的最高值(Xiao Z，et al.Biotechnol Biofuels.2014， 7(7)：106-113)。上述研究利用微生物生产TMP的前体物质乙偶姻，然后添加铵盐，经简单的化学热力学过程合成TMP(图1)，该过程反应速率快，副产物少，具有工业化生产的潜质(Xiao Z，et al.Biotechnol Biofuels.2014，7(1)：1)。同时，该方法反应条件温和，纯化成本低廉。然而上述研究虽然成功实现了TMP的微生物法合成，但是产量和生产速率尚无法满足工业生产的需求，原因在于TMP的合成前体乙偶姻的浓度较低，是相关行业亟待解决的瓶颈问题之一。

研究表明，通过协同表达α-乙酰乳酸合成酶AlsS、α-乙酰乳酸脱羧酶AlsD和NADH氧化酶NOX，是解决乙偶姻产量低，实现工程菌高效合成TMP的有效途径。基因协同表达的关键，在于基因表达强度的精细调控，以使不同基因在宿主菌株代谢网络中处于合适的表达强度，有效行使催化功能。研究发现，通过改变启动子下游核糖体结合位点到基因起始密码子之间的碱基个数，以及改变核糖体结合位点的碱基，可以影响基因的翻译效率，实现基因表达的精细调控(Vellanoweth RL and Rabinowitz JC.Mol Microbiol.1992，6(9)：1105-1114)。

发明内容

针对现有技术TMP产量不足，难以工业化生产的现状，本发明要解决的问题是构建一株乙偶姻高产的大肠杆菌工程菌株，同时建立乙偶姻高效转化生产TMP的工艺，以应用该工程菌发酵葡萄糖高效生产TMP。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所述大肠杆菌工程菌，含有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源乙偶姻合成操纵子alsRSD，序列如SEQ ID 2所示，以及短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH 氧化酶基因nox，序列如SEQ ID 3所示。

上述乙偶姻合成操纵子alsRSD，含有alsR(编码乙偶姻合成调控因子)、Pabc(乙偶姻合成启动子)、alsS(α-乙酰乳酸合成酶)和alsD(α-乙酰乳酸脱羧酶)，序列长度3460个碱基。

上述NADH氧化酶基因nox的表达，是在基因上游插入P_tac启动子，TAAGGAGG核糖体结合位点，并调节核糖体结合位点与基因nox的起始密码子之间距离为3-11个碱基。 P_tac启动子核苷酸序列如SEQ ID 4所示，序列长度90个碱基。基因nox核苷酸序列如SEQ ID 3所示，序列长度1353个碱基。

上述用于生产TMP的大肠杆菌工程菌的制备：依据NCBI公布的Enterobactercloacae subsp.dissolvens SDM来源乙偶姻合成操纵子的基因序列(NCBI基因编号：A3UG_05855、 A3UG_05860、A3UG_05865)，人工合成双链DNA。将获得的操纵子通过BglII和XhoI双酶切，插入pET-28a(+)表达质粒的BglII和XhoI双酶切位点之间，pET-28a(+)核苷酸序列如SEQ ID 1所示；依据NCBI公布的Lactobacillus brevis来源NADH氧化酶的基因序列(NCBI基因编号：AF536177.1)，人工合成双链DNA；依据NCBI公布的P_tac启动子序列(NCBI 编号：X15234.1)，人工合成P_tac启动子双链DNA，通过引物对P_tac.f： 5′-TAGCAATGCGCATAACGGTTCTGGCAA-3′和P_tac.r： 5′-AACTGTGACTTTCATTTTCCTCCTTAGTGTGAAATTGTTATCC-3′扩增P_tac启动子，将扩增后的片段与nox基因通过重叠延伸聚合酶链式反应整合为一个DNA片段。将整合片段通过BsrDI和BglII双酶切，插入连接乙偶姻合成操纵子的表达质粒，得到重组质粒 pET-EsRSD-P_tac-nox。将重组质粒转化到E.coli(优选E.coli BL21(DE3))，获得大肠杆菌工程菌，命名为E.coli BL15。

本发明所述用于生产TMP的大肠杆菌工程菌在发酵底物葡萄糖生产TMP中的应用。

其中：上述发酵培养的方法是：在无菌条件下，将大肠杆菌工程菌E.coli BL15活化，活化好的菌液以体积比5％-10％的接种量接种到发酵培养基中，在培养基pH值5.0-9.0，培养温度37±1℃，搅拌转速200-500rpm，无菌空气通入量0.5vvm-2.0vvm条件下发酵培养48-96小时。在培养过程中，待培养基中葡萄糖浓度降至20g/L以下，补加无菌的 600-800g/L葡萄糖溶液，至培养基葡萄糖浓度为40-60g/L，当测定发酵液中乙偶姻浓度不再增加时，停止发酵。将发酵液离心，上清液加入(NH₄)₂HPO₄至溶液中NH₄ ⁺与乙偶姻的浓度比为1∶1-3∶1，在60℃-100℃条件下水浴0.5-2小时，冰浴0.5-2小时。离心，弃上清液，沉淀用冰水洗涤2次，获得2，3，5，6-四甲基吡嗪晶体。

其中，上述发酵培养基的配方为：1L蒸馏水中含有80g葡萄糖，10g酵母粉，3.0gCH₃COONa·3H₂O，0.60g KH₂PO₄，0.40g MgSO₄，0.10g MnSO₄，0.060g FeSO₄。

上述应用中：所述pH范围优选5.5-7.0。

上述应用中：所述搅拌转速范围优选350-450rpm。

上述应用中：所述通气量优选1.0vvm-1.5vvm。

上述应用中：所述NH₄ ⁺与乙偶姻的浓度比优选2∶1-3∶1。

上述应用中：所述水浴温度优选80℃-95℃。

上述应用中：所述大肠杆菌工程菌E.coli BL15活化的方法是：

(1)平板培养：将大肠杆菌工程菌E.coli BL15无菌操作划线到琼脂平板(LB培养基含有1.5-2.0％的琼脂以及50mg/L硫酸卡纳霉素)，在恒温培养箱中37±1℃培养12±2小时；

(2)种子培养：无菌操作，用无菌牙签蘸取步骤(1)的单菌落，接种到含有50mg/L硫酸卡纳霉素的LB液体培养基，恒温摇床，37±1℃震荡培养12±2小时，获得活化的大肠杆菌工程菌E.coli BL15菌液；

其中，上述步骤(1)和(2)中所述的LB培养基配方为：1L蒸馏水中含有：5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，121℃灭菌20min。

本发明成功实现了将乙偶姻合成操纵子在E.coli BL21中表达，并以此工程菌株发酵葡萄糖生产TMP，具有反应条件温和、副产物少和产物易于分离纯化的优势。

本发明具有的突出特点是：

(1)工程菌的基因表达无需诱导操作，简化生产工艺；

(2)反应副产物少，转化率高，产品易于分离提纯；

(3)反应条件温和，对生产设备要求低；

(4)催化完毕的细胞易于回收处理，环境污染小；

(5)本发明的大肠杆菌工程菌发酵葡萄糖，生产TMP的前体乙偶姻产量最高可达64.90 g/L，转化生产的TMP产量最高可达16.40g/L。

附图说明

图1大肠杆菌工程菌E.coli BL15生产2，3，5，6-四甲基吡嗪示意图

LDH，乳酸脱氢酶；PDC，丙酮酸脱氢酶复合体；PTA，磷酸转酰基酶；AckA，乙酸激酶；AlsS，α-乙酰乳酸合成酶；AlsD，α-乙酰乳酸脱羧酶；EDH，乙醇脱氢酶；NOX，NADH 氧化酶；ALDH，乙醛脱氢酶

图2pET-EsRSD-P_tac-nox质粒图谱

f1 origin：pET-28a(+)质粒序列，有助于产生单链DNA；ori：复制起始位点；Kan^r：硫酸卡纳霉素抗性基因；SD：Shine-Dalgarno序列；nox：NADH氧化酶基因；alsR：转录调控因子；alsS：α-乙酰乳酸合成酶；alsD：α-乙酰乳酸脱羧酶；P_tac，P_alsR，P_abc：启动子

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐述本发明，但不仅限于此。

实施例1：大肠杆菌工程菌E.coli BL15的构建

1、基因合成

参考NCBI公布的Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM来源的乙偶姻合成代谢操纵子alsRSD(NCBI基因编号：A3UG_05855、A3UG_05860、A3UG_05865)，Lactobacillus brevis来源NADH氧化酶基因nox(NCBI基因编号：AF536177.1)和P_tac启动子的序列(NCBI 编号：X15234.1)，人工合成对应的双链DNA。在alsRSD的5’端和3’端分别加上核酸内切酶酶切位点BglII和XhoI，基因nox的3’端加上核酸内切酶酶切位点BglII。

2、乙偶姻合成代谢操纵子alsRSD插入质粒pET-28a(+)

将人工合成的操纵子alsRSD通过BglII和XhoI双酶切，同时BglII和XhoI双酶切处理pET-28a(+)表达质粒，切胶回收，然后T4DNA连接酶连接表达质粒和alsRSD片段，转化E.coli BL21(DE3)，无菌操作挑取转化子培养，提取质粒，通过BglII和XhoI双酶切处理，依据DNA条带大小选取构建成功的质粒。

3、质粒pET-EsRSD-P_tac-nox的构建

通过引物对P_tac.f：5′-TAGCAATGCGCATAACGGTTCTGGCAA-3′和P_tac.r：5′-AACTGTGACTTTCATTTTCCTCCTTAGTGTGAAATTGTTATCC-3′扩增P_tac启动子，将扩增后的片段与nox基因通过重叠延伸聚合酶链式反应整合为一个DNA片段P_tac-nox。将整合片段通过BsrDI和BglII双酶切，同时BsrDI和BglII双酶切插入乙偶姻合成操纵子的表达质粒，T4DNA连接酶连接质粒和P_tac-nox片段，得到重组质粒pET-EsRSD-P_tac-nox(图2)。将重组质粒转化到E.coli(优选E.coli BL21(DE3))，获得大肠杆菌工程菌，命名为E.coli BL15。

实施例2：制备大肠杆菌工程菌E.coli BL15的培养液

1、平板培养：将大肠杆菌工程菌E.coli BL15无菌操作划线到琼脂平板(LB培养基含有1.5-2.0％的琼脂以及50mg/L硫酸卡纳霉素)，恒温培养箱37±1℃培养12±2小时；

2、种子培养：无菌操作，用无菌牙签蘸取步骤(1)的单菌落，接种到含有50mg/L 硫酸卡纳霉素的LB液体培养基，恒温摇床，37±1℃震荡培养12±2小时，获得大肠杆菌工程菌E.coli BL15活化菌液；

其中，上述步骤(1)和(2)中所述的LB培养基配方为：1L蒸馏水中含有：5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，121℃灭菌20min。

实施例3：大肠杆菌工程菌E.coli BL15发酵葡萄糖生产乙偶姻

在无菌条件下，将大肠杆菌工程菌E.coli BL15活化，活化好的菌液以体积比5％-10％的接种量接种到发酵培养基中，在培养基pH值5.0-9.0，培养温度37±1℃，搅拌转速200 -500rpm，无菌空气通入量0.5vvm-2.0vvm条件下发酵培养48-96小时。在培养过程中，待培养基中葡萄糖浓度降至20g/L以下，补加无菌的600-800g/L葡萄糖溶液，至培养基葡萄糖浓度为40-60g/L，当测定发酵液中乙偶姻浓度不再增加时，停止发酵。

其中，上述发酵培养基的配方为：1L蒸馏水中含有80g葡萄糖，10g酵母粉，3.0gCH₃COONa·3H₂O，0.60g KH₂PO₄，0.40g MgSO₄，0.10g MnSO₄，0.060g FeSO₄。

实施例4：乙偶姻发酵液转化生产2，3，5，6-四甲基吡嗪

离心发酵液，取上清液，加入(NH₄)₂HPO₄至溶液中，NH₄ ⁺与乙偶姻的浓度比为1∶1-3∶1，在60℃-100℃条件下水浴0.5-2小时。冰浴0.5-2小时，离心，弃上清液，沉淀用冰水洗涤2次，获得2，3，5，6-四甲基吡嗪晶体。

<160>1

<210>1

<211>5369

<212>DNA

<221>pET-28a(+)

<222>(1)…(5369)

<400>1

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360

caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420

ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480

gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540

gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600

ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660

caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720

tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780

agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840

ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900

ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960

gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020

taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080

cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140

cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200

tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260

tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860

acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040

ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100

tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160

gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220

tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280

cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340

catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400

gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460

catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520

tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580

taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640

atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700

gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760

aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020

ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080

tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140

gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800

gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369

<210>2

<211>3460

<212>DNA

<221>aIsRSD

<222>(1)…(3460)

<100>2

ctactcctcg cttatcatcg tcaagaaccg cttcaccgtc cgcgagcgtt caaaccgtcg 60

ccagcagagc gcgatatcgg tataaagctc gggtgagctc aacgcatgat aggtgacatt 120

cggcggagaa atggccgcca tcgatttcgg caccagcgcg aagccgccac cggcggagac 180

catgctcagg gaggacgaaa gctgtgacga ctgcagcgcg tgctgcacgt cgatcccggc 240

ccgttcgcag cagctgtaaa cccggtcgaa caggccgggc gcgacctcct gcgggaacaa 300

caccactggc gtatcccgga gctgctccag cgccagatcg ccgcttgttg cgagcggatg 360

gtcgcgatgc agcgccacca ccatcggttc ccggtcaagg atctttaact cgaatgcctt 420

gctgctttcg cacggtagcc gcacgaaggc aatatccagt tccccctccg ccagcatcgc 480

tgtcagcgaa gacatattgg cctccacctg gtgtacctgc accgccatgt tctgtacctg 540

aaactgacga atgagcgtga aaattttggg atgaaaagca tctgaactgg taatgccaat 600

cgacaggtta ccgttcagac cgcgcgcgat gccccgggct ttctccagcg cggcgtcgct 660

cagcgccagg atcttacagg cgtcctcgta gaaggcttct cccgcttcgg ttagctctac 720

gccccgcgtc aggcgtctga acagcggcgt gcccacttcc tcttcgagcc gtttgatctg 780

ctgactcaga ggaggctgtg aaatacccag cgcttcggcc gccctggtga agtgtcgctc 840

gcgtgcaacc gcgacaaaat accgcagata acgaagttcc atatctaaaa cgtctcaaac 900

cagcatggat tctatattgg aactctctgc tgaatcgggt caacatttat ttaacctttc 960

taaataaagt tgaagaggac gagcatgatg atgcactcat ctgcctgcga ctgtgaggcc 1020

agtttatgcg agaccctgcg cgggttctcc gctaagcatc ctgacagcgt gatctatcag 1080

acatcgctaa tgagcgccct gctaagcggc gtctacgagg gggacaccac catcgccgat 1140

ctgctggcgc acggtgattt tggtctgggc accttcaacg agctggacgg cgaaatgatt 1200

gccttcagca gccaggtgta ccagctgcgc gccgacggca gcgcacgcgc cgcgaagcca 1260

gagcagaaaa cgccgttcgc ggtgatgacc tggttccagc cgcagtaccg taaaaccttt 1320

gatgcgccgg tcagtcgtca gcagatccac gacgtgatcg accagcaaat cccctccgat 1380

aacctgttct gcgcgctgcg catcgacggc aacttccgcc acgcccacac ccgtaccgta 1440

ccgcgtcaga cgccgccata ccgcgcgatg accgacgtgc tggacgacca gccggtgttc 1500

cgcttcaacc agcgcgaagg ggtgctggtc gggttccgca cgccgcagca tatgcagggc 1560

attaacgtgg ccggctatca cgaacatttc attaccgacg accgtcaggg cgggggacat 1620

ctgctcgact atcagttgga gagcggcgtg ctcacctttg gcgaaataca caagctgatg 1680

atcgatctgc cagccgacag cgcgttttta caggccaacc ttcaccccag caatcttgat 1740

gcagcgatcc gttccgtcga aaactaacag gagaactacc gtgaacagtg agaaacagtc 1800

acgtcagtgg gcgcatggcg ccgatatggt tgtaggtcaa ctggaagcgc agggcgtgaa 1860

gcaggtgttc gggatcccgg gggcgaaaat cgacaaagtc tttgactccc tgctggactc 1920

ctccattgag atcatccccg tacgccacga ggcaaacgcg gcgttcatgg cggcggcggt 1980

agggcgcctg accggcaaag ccggggtggc gctggtcacc tccggcccgg gctgttccaa 2040

cctgatcacc ggtatcgcca ccgccaacag cgaaggcgac ccggtggtgg cgctgggcgg 2100

ggcggtgaag cgggcggata aagccaagct ggtgcaccag agcatggata cggttgccat 2160

gttcagcccg gtcaccaaat acgctgttga agtcagctct ccggatgcga ttgctgaagt 2220

ggtgtcgaac gcattccgtg ccgccgagca cggcaggccg ggcggtgcgt tcgtcagcct 2280

gccgcaggat attgttgacc agcctgccac gggggcgatt ttaccggcca gcggcccggc 2340

gctgatgggc ccggctcctg aatcggccat taacgacgtg gcgaaactca tcgacaacgc 2400

caaaaacccg gtgatcctgc tggggctgat ggcgagccag cctgctaaca gcgcggcgct 2460

gcgtaagctg ctggagaaaa gccgcattcc ggtcaccagc acctatcagg ccgccggggc 2520

ggtgaaccag gagcatttca cccgcttcgc cggacgcgtt ggcctcttta acaaccaggc 2580

gggtgaccgc ctgctgcacc tggcggatct gattatctgt atcggctaca gcccggttga 2640

gtatgagccg tccatgtgga acagcggcga cgccacgctg gtgcatattg atgtactgcc 2700

tgcgtatgaa gagcgcaatt atgtccctga catcgagctg gtgggcgaca tcgccgccac 2760

gctgaacctg cttgccagcc ggattgacca caagctggag ctcagccagc gtgcgtcaga 2820

aatcctggtc gatcgccagc atcagcgcga tctgctcgat cgccgcggtg cctcgctcaa 2880

ccagtttgcc ctgcatccac tgcgtatcgt tcgcgccatg caggacatcg tcaataacga 2940

cgtgacgctg accgtcgaca tgggcagctt ccacatctgg atcgcccgct acctctacag 3000

cttccgggcg cgccaggtga tgatctccaa cggtcagcag accatgggcg ttgcgctgcc 3060

gtgggccatt ggcgcgtggc tggtcaaccc gggccgcaag gtggtgtcgg tgtccggtga 3120

cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggaaaccgcg gtgcgcctca acgccaacgt 3180

gctgcacatc atctgggtgg ataacggcta caacatggtc gccattcagg aagagaaaaa 3240

ataccagcgt ctttccggcg tggcgttcgg cccggttgac ttcaaagcct atgccgacgc 3300

ctttggcgcc aggggctttg ccgtggagag cgccgatgcc cttgaatcga cgctgcgtgc 3360

ggcgatggat gtgaatggcc cggccgtggt ggccattccc gttgactaca gcgataaccc 3420

gctgctgatg ggccagctcc atctcagcca gattttgtga 3460

<210>3

<211>1353

<212>DNA

<221>nox

<222>(1)…(1353)

<400>3

atgaaagtca cagttgttgg ttgtacacat gccggaacct ttgcgattaa acaaatcttg 60

gccgaacacc ctgatgccga agtgaccgtc tacgaacgta acgatgtcat ttcatttctc 120

tcttgtggaa tcgcccttta cctgggggga aaagtcgctg atccgcaagg cctcttttat 180

tcaagtcctg aagaactcca aaaattaggc gctaatgtcc aaatgaatca caatgtttta 240

gcgatcgatc ctgatcaaaa gacagtgacc gttgaggact taaccagtca tgcacaaacg 300

actgagtcat acgataaact agtcatgacg tctggttctt ggccaattgt ccccaagatt 360

ccgggcatcg atagcgatcg cgttaagctc tgcaaaaact gggcacatgc gcaagctcta 420

atcgaagatg ctaaggaagc caagcggatt accgttattg gtgccggcta tattggtgct 480

gaactagcag aagcctactc cactactggt catgacgtaa ccttaattga tgcgatggac 540

cgggttatgc ccaagtactt tgatgctgat tttacggatg tcattgaaca agattatcgg 600

gatcacggtg tccaacttgc cttaagtgaa acggttgaaa gctttactga tagtgcaact 660

gggttgacca ttaagactga taagaacagc tatgaaacgg atctcgctat tttatgcatt 720

ggctttagac caaataccga cctgctgaaa ggcaaagtcg atatggcacc aaacggcgcg 780

attattacgg atgactacat gcgttcttct aaccctgata ttttcgccgc tggtgacagt 840

gctgctgtgc actacaaccc aacccatcag aatgcttaca ttcccttagc aactaacgcg 900

gtgcgtcaag gtatcctagt cggtaaaaac ctagttaagc cgaccgtcaa gtatatggga 960

acacaatcat cttctggttt ggcactctat gatcggacga tcgtctcaac tggtttaacg 1020

ctagcagctg caaaacaaca aggggtgaac gctgaacaag tgattgttga agataattat 1080

cgcccagagt ttatgccgtc aactgaaccc gttttgatgt cattagtctt tgaccccgac 1140

acacaccgga tcttaggtgg tgcgttaatg agtaaatacg atgtttcaca atcggccaac 1200

accctttctg tttgcatcca aaacgaaaat acaattgatg acttagcgat ggttgatatg 1260

ctcttccagc ctaactttga tcgaccattc aactacctaa acatcttagc gcaagctgct 1320

caggcgaaag ttgcccaatc agttaacgct taa 1353

<210>4

<211>90

<212>DNA

<222>(1)…(90)

<400>4

cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat 60

aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 90

Claims (4)

1.一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述基因工程菌含有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源乙偶姻合成操纵子alsRSD，序列如SEQ IDNO.2所示；并优化短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH氧化酶基因nox的表达，基因nox序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其中优化短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH氧化酶基因nox的表达，是通过选取P_tac启动子、强核糖体结合位点TAAGGAGG，并优化核糖体结合位点到基因nox起始密码子之间的距离为3-11个碱基实现的。

3.权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌发酵葡萄糖生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养方法如下：在无菌条件下，将过夜培养活化的所述大肠杆菌工程菌菌液以体积比1％-10％的接种量接种发酵培养基，在培养基pH值5.0-9.0，培养温度37±1℃，搅拌转速200-500rpm，无菌空气通入量0.5vvm-2.0vvm条件下发酵培养48-96小时；在培养过程中，待培养基中葡萄糖浓度降至20g/L以下，补加无菌的600-800g/L葡萄糖溶液，至培养基葡萄糖浓度为40-60g/L，当测定发酵液中乙偶姻浓度不再增加时，停止发酵；将发酵液离心，上清液加入(NH₄)₂HPO₄至溶液中NH4⁺与乙偶姻的浓度比为1:1-3:1，在60℃-100℃条件下水浴0.5-2小时，然后冰浴0.5-2小时，离心，弃上清液，沉淀用冰水洗涤2次，获得2,3,5,6-四甲基吡嗪晶体，

其中，上述发酵培养基的配方为：1L蒸馏水中含有80g葡萄糖，10g酵母粉，3.0gCH₃COONa·3H₂O，0.60g KH₂PO₄，0.40g MgSO₄，0.10g MnSO₄，0.060g FeSO₄。

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