PL229056B1 - Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli TOP10F’, sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy typu dzikiego Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest starter oligonukleotydowy zsyntetyzowany w znany sposób do reakcji amplifikacji DNA o symbolu DgTreXRTAA, jak równiez sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA zawierajaca fragment DNA kodujacy bialko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 oraz wektor ekspresyjny zawierajacy wklonowane DNA z fragmentem kodujacym bialko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300. Przedmiotem wynalazku jest tez sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli TOP10F' o symbolu Escherichia coli TOP10F'-pET30Ek/LICDgeoST charakteryzujacy sie tym, ze uzyskuje sie fragment DNA kodujacy bialko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 poprzez amplifikacje DNA z zastosowaniem znanego startera DgeoSTNdeF oraz zastrzeganego w tym zgloszeniu DgTXRTAA oraz sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST charakteryzujacy sie tym, ze uzyskuje sie fragment DNA kodujacy bialko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, a takze sposób wytwarzania bialka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 charakteryzujacy sie tym, ze prowadzi sie hodowle komórek szczepu bakterii o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli TOP10F’ oraz rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS z wklonowaną sekwencją kodującą białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy typu dzikiego Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 z zastosowaniem rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS.

T rehaloza (a-D-glukopiranozylo-1,1 α-D-glukopiranozyd) jest cukrem nieredukującym, zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem a-1,1-glikozydowym. Trehaloza łatwo ulega hydrolizie do glukozy i może pełnić w komórce rolę rezerwy tego cukru. Występowanie trehalozy stwierdzono w k omórkach grzybów i drożdży, bakterii, nicieni, owadów, jaj, poczwarek oraz niektórych roślin. Właściwości trehalozy czynią z niej potencjalne źródło wielu zastosowań w medycynie, weterynarii, przemyśle farmaceutycznym i spożywczym.

Biosynteza trehalozy w żywych komórkach prowadzona jest różnymi znanymi szlakami metabolicznymi, między innymi z wykorzystaniem syntazy trehalozy.

Bakterie z rodzaju Deinococcus należą do mikroorganizmów wytwarzających syntazę trehalozy.

Geny kodujące białko syntazy trehalozy mikroorganizmów rodzaju Deinococcus klonowano w komórkach E. coli. Prowadzono również biosyntezę termostabilnych enzymów w komórkach mezofilnego gospodarza w układzie Tabora-Studiera. Zastosowane układy ekspresyjne E. coli nie należą do optymalnych i najbardziej wydajnych. Ponadto podczas otrzymywania białka nie stosowano etapu wstępnej denaturacji termicznej białek gospodarza.

W trakcie prowadzonych prac wykonano izolację i klonowanie genu kodującego syntazę trehalozy pochodzącej z D. geothermalis do wektorów ekspresyjnych w układzie Tabora-Studiera oraz jego ekspresję w różnych gospodarzach. Ustalono także optymalny sposób oczyszczania i określono właściwości białek rekombinantowych typu dzikiego w Tabora-Studiera.

Oczyszczanie białka syntazy trehalozy polega na nowatorskim zastosowaniu wstępnej denaturacji białek gospodarza, a następnie wytrąceniu z roztworu solami siarczanu amonu.

Dla białka DgeoST uzyskano preparat o wysokiej czystości oraz ustalono optymalne warunki działania enzymu. Za optymalne warunki działania enzymu wyznaczono zakres temperatur od 25° do 55°C oraz pH 6,2 do 8,7. Czas konwersji powyżej trzech godzin można uznać za bezcelowy ze względu na dalsze podwyższanie wydajności, a ilość użytego substratu nie większą niż 10% maltozy.

Według wynalazku stosuje się starter oligonukleotydowy zsyntetyzowany w znany sposób do reakcji amplifikacji DNA o wzorze 2 i o symbolu DgTreXRTAA.

Według wynalazku stosuje się sekwencję DNA otrzymaną w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 2, zawierająca fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Ndel, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny XhoI i kodon stop, o wzorze 3.

Według wynalazku stosuje się wektor ekspresyjny zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne Ndel i XhoI, kodonem stop, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na kanamycynę, z origin plazmidu pBR322, z origin f1, regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem terminacji transkrypcji T7, z miejscem operatorowym lacI o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICZ)geoST.

Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli TOP10F' o symbolu Escherichia coli TOP10F'-pET30Ek/LICDgeoST, charakteryzuje się według wynalazku tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem znanego startera DgeoSTNdeF oraz startera oligonukleotydowego o wzorze 2 i o symbolu i DgTXRTAA. Uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST, zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol, kodonem stop, z miejscem wiązania rybosomów rhs, z genem oporności na kanamycynę, z origin plazmidu pBR322, z origin f 1, regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem terminacji transkrypcji T7,

PL 229 056 B1 z miejscem operatorowym lacl. Następnie otrzymanym wektorem transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F’.

Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST charakteryzuje się według wynalazku tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem znanego startera DgeoSTNdeF oraz startera oligonukleotydowego o wzorze 2 i o symbolu i DgTXRTAA. Uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST, zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol, kodonem stop, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na kanamycynę, z origin plazmidu pBR322, z origin f 1, regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem terminacji transkrypcji T7, z miejscem operatorowym lacI. Następnie otrzymanym wektorem transformuje się komórki Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS.

Sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 polegający na produkcji białka przez komórki rekombinantowego szczepu bakterii w pożywkach płynnych, charakteryzuje się według wynalazku tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu bakterii o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST w temperaturze początkowej od 36°C do 38°C i po indukcji w temperaturze pokojowej w zakresie do 38°C, a następnie po uzyskaniu gęstości zawiesiny komórkowej od 0,3 do 0,9 prowadzi się nadekspresję genu kodującego białko przez okres od 2 do 24 godzin, poprzez dodanie do pożywki induktora jakim jest IPTG o stężeniu od 0,05 mM do 10 mM lub laktozy. Po oddzieleniu zawiesiny komórkowej od płynu pohodowlanego, dezintegracji komórek i wstępnej termicznej denaturacji, na drodze wirowa nia izoluje się białka rozpuszczalne. Następnie oczyszcza się białka stosując wytrącanie siarczanem amonu, tak aby uzyskać jego 50% stopień nasycenia, po czym zagęszcza i zawiesza się w buforze do przechowywania, korzystnie o składzie: 0,85% NaCl, 20% glic erol (v/v), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,05% IGEPAL.

Uzyskane według wynalazku rekombinantowe białko syntazy trehalozy typu dzikiego Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 cechuje się dużą aktywnością w temperaturach niewiele powyżej temperatury pokojowej co umożliwia zastosowanie go w ciągłej konwersji maltozy do trehalozy bez konieczności ponoszenia wysokich nakładów na ogrzewanie bioreaktora kolumnowego.

Wynalazek umożliwia uzyskanie rekombinantowego białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 stosunkowo szybko przy ograniczonej liczbie etapów potrzebnych do uzyskania preparatu białkowego.

Wynalazek objaśniony jest bliżej w przykładach wykonania i na rysunkach, na którym: na fig. 1 przedstawiono fragment DNA o wzorze 3 z zaznaczeniem sekwencji genu syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol;

na fig. 2 przedstawiono sekwencję nukleotydową wektora plazmidowego pET30Ek/LICDgeoST w rejonie klonowania fragmentu DNA o wzorze 3 oraz sekwencję aminokwasową białka powstającego w komórkach Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS transformowanych DNA wektora ekspresyjnego pET30Ek/LICDgeoST;

na fig. 3 przedstawiono wynik rozdziału elektroforetycznego w 12% żelu poliakrylamidowym z 6% warstwą zagęszczającą frakcji zawierającej oczyszczone białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 produkowanego przez rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST;

na fig. 4 przedstawiono schemat uzyskania fragmentu DNA o wzorze 3 z zaznaczeniem sekwencji genu syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol oraz wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST.

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300.

W celu amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 syntetyzuje się w znany sposób startery oligonukleotydowe o wzorze 2 i o symbolach

PL 229 056 B1

DgeoSTNdeF i DgTreXRTAA. Reakcję amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wykonuje się z użyciem starterów DgeoSTNF (0,2 μΜ) i DgTreXRTAA (0,2 μΜ) na matrycy wyizolowanego DNA genomowego w buforze zawierającym: 50 mM Tris-HCI pH 9,0, 2,5 mM MgCl2, 20 mM (NH4)żSO4, 5% DMSO, 200 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 0,5 U polimerazy DNA Marathon produkowanej przez A&A Biotechnology, Gdynia. Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: wstępna denaturacja 94°C - 1 minuta,5 cykli: 94°C - 1 minuta 59°C - 1 minuta, 72°C - 2 minuty; 25 cykli: 94°C - 1 minuta 64-68°C - 1 minuta, 72°C - 1,5 minuty; wydłużanie końcowe 72°C - 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 3, Fragment DNA o wzorze 3 z dokładnym zaznaczeniem sekwencji genu kodującego białko syntazy treahlozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol ilustruje fig. 1.

P r z y k ł a d 2

Otrzymywanie wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST oraz rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS -pET30Ek/LICDgeoST.

Schemat uzyskania wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST ilustruje fig. 4. W celu uzyskania wektora plazmidowego pET30Ek/LIC DgeoST przeprowadza się klonowanie fragmentu DNA o wzorze 3 otrzymanego według przykładu 1 do wektora ekspresyjnego pET30Ek/LIC firmy Merck. W tym celu przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu DNA o wielkości 5234 par zasad powstałego w wyniku trawienia plazmidu pET30Ek/LIC firmy Merck enzymami restrykcyjnymi Ndel i Xhol (wektora) z fragmentem DNA o wielkości 1673 par zasad powstałym po trawieniu produktu PCR o wzorze 3 enzymami restrykcyjnymi Ndel i Xhol (insertu), w temperaturze 17°C przez 3 godziny z użyciem 2U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CHaCOOH pH=7,8; 10 mM (CHaCOO^Mg; 66 mM CH3COOK; 0,5 mM DTT; 1 mM ATP.

Następnie mieszaniną reakcyjną transformuje się komórki kompetentne Escherichia coli TOP10F' i po wytrząsaniu przez okres 1h, w temperaturze 37°C, przy około 180 rpm, w 250 μl pożywki SOC wysiewa na pożywkę LA (pożywka LB z dodatkiem 1,5% agaru wg Sambrook i in., 1989), zawierającą tetracyklinę i kanamycynę.

Uzyskane kolonie bakteryjne Escherichia coli TOP10F'-pET30Ek/LICDgeoST zawierające ekspresyjne wektory plazmidowe przesiewa się na pożywkę LB z dodatkiem tetracykliny i kanamycyny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego.

W wyniku izolacji uzyskuje się DNA wektora plazmidowego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST, który zawiera wklonowany gen kodujący białko syntazy trehalozy typu dzikiego Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 pod kontrolą silnego promotora faga T7 (fig. 2), co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA, np. metodą Sangera.

Dokładną sekwencję nukleotydową wektora plazmidowego o wzorze 4 i symbolu pET30Ek/LICDgeoST w rejonie klonowania fragmentu DNA o wzorze 3 ilustruje fig. 2.

P r z y k ł a d 3

Otrzymywanie białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300.

Uzyskuje się sekwencję DNA kodującą białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Ndel i Xhol o wzorze 3 według przykładu 1.

Następnie otrzymuje się ekspresyjny wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST zgodnie z przykładem 2.

W kolejnym etapie poprzez transformację komórek kompetentnych Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i presję selekcyjną na podłożu z chloramfenikolem i kanamycyną otrzymuje się rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LIGDgeoST.

Szczep hoduje się w pożywce LB z dodatkiem chloramfenikolu i kanamycyny przez 18 godzin w temperaturze 37°C. Hodowlą nocną rekombinantowego szczepu E. coli szczepi się 500 mL pożywki LB z antybiotykiem i po uzyskaniu w hodowli gęstości zawiesiny komórkowej na poziomie OD600 nm > 0,5 indukuje się ekspresję białka syntazy trehalozy IPTG lub laktozą. Hodowle po 4 h od indukcji przeprowadzoną w temperaturze 37°C (objętość pożywki 500 mL) wiruje się przez 10 minut przy 5000 rpm. Osad bakteryjny zawiesza w 30 mL buforu lizującego, homogenizuje i poddaje działaniu ultradźwięków przez 10 s - przy amplitudze A=30%, powtarzając procedurę trzykrotnie w krótkich odstępach czasowych. Otrzymany totalny lizat wiruje się przez 40 minut przy

PL 229 056 B1

000 rpm. Białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 oczyszcza się na drodze strącania termicznego innych obecnych w preparacie białek (białka mezofilnej bakterii E. coli) w temperaturze 65°C, przez 10 minut. Lizat wiruje się przez 30 minut przy 12000 rpm.

Ekstrakt bezkomórkowy zawierający niezdenaturowane białka rozpuszczalne poddaje się dalszemu oczyszczaniu stosując wysalanie siarczanem amonu.

W celu wysolenia pożądanego białka do probówki zawierającej 10 ml supe rnatantu dodaje się taką ilość siarczanu amonu in substantia, która pozwala uzyskać jego 50% stopień nasycenia. Zawartość probówki dokładnie miesza się i pozostawia w temperaturze pokojowej na co najmniej 1 godz. Po upływie tego czasu osad wytrąconego białka wiruje się przy 9000 rpm przez 15 min. Nadsącz dokładnie zlewa się znad osadu, który następnie rozpuszcza się w 1 ml wody. Uzyskany preparat, po wysoleniu siarczanem amonu odwirowuje się na filtrach wirówkowych o wielkości odcięcia równej 30 kDa (Amicon, Millipore), przy 5000 rpm, pr zez 10 minut, w celu odsolenia i zagęszczenia białka.

W trakcie zagęszczania wymienia się bufor wysokoso lny na bufor do przechowywania preparatu białkowego (np. zawierającego inhibitory proteaz lub glicerol, i/lub sól fizjologiczną. Korzystnie o składzie: 0.85% Nad. 20% glicerol (v/v), 5mM EDTA. 1mM DIT, 1mM PMSF, 0,05% IGEPAL,

Wyniki biosyntezy i oczyszczania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 analizuje się metodą elektroforezy w 125c żelu po liakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności odpowiedniego białkowego markera wielkości, co przedstawiono na fig. 3.

PL 229 056 Β1

Wzór 1. Sekwencje genu kodującego białko syntazy trehalozy Detnococcus geathermalis DSMZ 11300

ATGACGCAAACCTCCACCTCCGAGTGGTACAAGAGTGCTGTTTTCTATGA

GCTGAGTGTCCGCACCTATGCCGACGGCAATGGCGATGGCAAGGGGGAT

TTTCCTGGCCTGACCGGCAAGCTCGACTACCTGAAGAACCTGGGCGTGGA

TTGCCTGTGGCTGCTGCCCTTTTACCCCAGCCCGCTGAGGGATGACGGGT

ATGACGTGGCCGACTACACGGACATTCACCCCGATCTGGGCACGCTGGA

CGACTTCAAGGTCTTTTTGCGCGAAGCGCATGTGCGCGGCCTGCGGGTGA

TTGGTGACCTGGTGACCAACCACACCTCTTCAGACCATCCCTGGTTTCAG

GCGGCGCGGCGCGGCCCCACCCTGCCTGACGGCAGCCCCAACGAATACT

TCGACTACTACGTCTGGAGCGACACCGGCACCGAATACGCGGACGCGCG

CATCATCTTTACCGACACCGAGACGAGCAACTGGACCTTTGACGAGATGG

CCGGGAAATACTACTGGCACCGCTTCTTCTCGTCGCAGCCTGACCTCAAC

TACGACAACCCCCGGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAACGTGCTGCGCTTCT

GGCTGGACCTGGGGCTGGATGGCTTCCGAGTGGACGCGGTGCCCTACCTG

ATCGAGCGCGAGGGCACCAACTGCGAGAACCTGCCCGAGACGCACGCCA

TCTTGCAGAAGCTGCGCCGCGTGGTGGATGAGGAGTACCCAGGGCGCCT

GCTGCTGGCCGAGGCCAACCAGTGGCCGGAGGAAGTCGTCGAATACTTC

GGTACGGAGACACACCCCGAGTTCCACATGTGCTTCAACTTTCCGGTGAT

GCCAAGGCTATTTATGAGCCTGAAGCGCGAGGACACCACTTCCATTCGCG

AGATCATGGCGCGCCTGCCCAAGTTGCCCAGTTTTGGGCAGTGGGCAACG

TTTTTGCGCAACCACGACGAACTCACGCTGGAGATGGTCACCGAGGACG

AGCGCGCCTTTATGTACGCCGCCTACGCGCCCGACGCACGCATGAAGATC

AATGTGGGGATTCGCCGCCGGCTCGCGCCGCTGCTGGACAATGACCGCC

GCCGGATCGAGCTGCTGACCACCGTGCTGTTGGCCCTCCCCGGCAGTCCC

ATCCTGTACTACGGCGACGAGATCGGCATGGGCGACAACCTCTCGCTGGC

TGACCGCAACGGCGTCCGCACCCCGATGCAGTGGAATGCCGGAATCAGC

GGCGGCTTCTCGACGGCCCTACCCGAGCAGTGTTTTTATCCACCCATCAG

CGACCCGGTGTACGGGTATCAGCGAGTGAACGTGAACTCGCAGGAGCAG

GACCCCAGCAGCCTGCTGAAATGGGTGTCCCGCCAGCTTGAGGTGCGCC

GTGCCCATCCCGCCTTCGCCCACGGGGACCTCACCTTTATCGAGACGAAC

PL 229 056 Β1

AACCCCGCGGTGCTTGCCTTTACCCGCCGCTACGACAATGAAGTTCTGCT

CATCGTGAGCAATTTCGCTGGCAATGCGCAGGCGGTCGAGCTTGACCTCT

TTGCGTATCGGGGCTGCGTGCCCGTCACGCTTGCCGGTGGCAGCCACTTC

CCGCCGGTGGGTGACCGTGGCCTCTACCCCCTGACACTGGGCAAGTACGA

CTACTACTGGTTGAAGCTGTCGGGGGTGCGGTA

Informacja o sekwencji: DŁUGOŚĆ: 1671 nukleotydy TYP; kwas nukleinowy TOPOLOGIA: liniowa ILOŚĆ NICI: jedna RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA

Wzór 2. Sekwencja startera

DgTreXRTAA

5’ tat ctc gag TTA CCG CAC CCC CGA CAG C 3’ Informacja o sekwencji:

DŁUGOŚĆ: 28 nukleotydy TYP: kwas nukleinowy TOPOLOGIA: liniowa RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA

PL 229 056 Β1

Wzór 3. Sekwencja zamplifikowanego genu kodującego białko Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wraz z dodatkowymi miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Ndel i Xhol

AAAACATATGACGCAAACCTCCACCTCCGAGTGGTACAAGAGTGCTGTTT

TCTATGAGCTGAGTGTCCGCACCTATGCCGACGGCAATGGCGATGGCAA

GGGGGATTTTCCTGGCCTGACCGGCAAGCTCGACTACCTGAAGAACCTGG

GCGTGGATTGCCTGTGGCTGCTGCCCTTTTACCCCAGCCCGCTGAGGGAT

GACGGGTATGACGTGGCCGACTACACGGACATTCACCCCGATCTGGGCA

CGCTGGACGACTTCAAGGTCTTTTTGCGCGAAGCGCATGTGCGCGGCCTG

CGGGTGATTGGTGACCTGGTGACCAACCACACCTCTTCAGACCATCCCTG

GTTTCAGGCGGCGCGGCGCGGCCCCACCCTGCCTGACGGCAGCCCCAAC

GAATACTTCGACTACTACGTCTGGAGCGACACCGGCACCGAATACGCGG

ACGCGCGCATCATCTTTACCGACACCGAGACGAGCAACTGGACCTTTGAC

GAGATGGCCGGGAAATACTACTGGCACCGCTTCTTCTCGTCGCAGCCTGA

CCTCAACTACGACAACCCCCGGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAACGTGCTG

CGCTTCTGGCTGGACCTGGGGCTGGATGGCTTCCGAGTGGACGCGGTGCC

CTACCTGATCGAGCGCGAGGGCACCAACTGCGAGAACCTGCCCGAGACG

CACGCCATCTTGCAGAAGCTGCGCCGCGTGGTGGATGAGGAGTACCCAG

GGCGCCTGCTGCTGGCCGAGGCCAACCAGTGGCCGGAGGAAGTCGTCGA

ATACTTCGGTACGGAGACACACCCCGAGTTCCACATGTGCTTCAACTTTC

CGGTGATGCCAAGGCTATTTATGAGCCTGAAGCGCGAGGACACCACTTCC

ATTCGCGAGATCATGGCGCGCCTGCCCAAGTTGCCCAGTTTTGGGCAGTG

GGCAACGTTTTTGCGCAACCACGACGAACTCACGCTGGAGATGGTCACC

GAGGACGAGCGCGCCTTTATGTACGCCGCCTACGCGCCCGACGCACGCA

TGAAGATCAATGTGGGGATTCGCCGCCGGCTCGCGCCGCTGCTGGACAAT

GACCGCCGCCGGATCGAGCTGCTGACCACCGTGCTGTTGGCCCTCCCCGG

CAGTCCCATCCTGTACTACGGCGACGAGATCGGCATGGGCGACAACCTCT

CGCTGGCTGACCGCAACGGCGTCCGCACCCCGATGCAGTGGAATGCCGG

AATCAGCGGCGGCTTCTCGACGGCCCTACCCGAGCAGTGITTTTATCCAC

CCATCAGCGACCCGGTGTACGGGTATCAGCGAGTGAACGTGAACTCGCA

GGAGCAGGACCCCAGCAGCCTGCTGAAATGGGTGTCCCGCCAGCTTGAG

PL 229 056 Β1

GTGCGCCGTGCCCATCCCGCCTTCGCCCACGGGGACCTCACCTTTATCGA

GACGAACAACCCCGCGGTGCTTGCCTTTACCCGCCGCTACGACAATGAAG

TTCTGCTCATCGTGAGCAATTTCGCTGGCAATGCGCAGGCGGTCGAGCTT

GACCTCTTTGCGTATCGGGGCTGCGTGCCCGTCACGCTTGCCGGTGGCAG

CCACTTCCCGCCGGTGGGTGACCGTGGCCTCTACCCCCTGACACTGGGCA

AGTACGACTAC

TACTGGTTGAAGCTGTCGGGGGTGCGGTAACTCGAGATA

Informacja o sekwencji: DŁUGOŚĆ: 1687 nukleotydy TYP: kwas nukleinowy TOPOLOGIA: liniowa ILOŚĆ NICI: jedna RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA

PL 229 056 Β1

Wzór 4. Sekwencja plazmidu rekombinantowego pET30Ek/LICDraST.

GCAAGCACCG

TGGGCACGGC

ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GAGGCCCCAA

GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG

CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT

121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT

GAGTTACCGC ACCCCCGACA

181 GCTTCAACCA GTAGTAGTCG TACTTGCCCA

GTAGAGGCCA CGGTCACCCA

241 CCGGCGGGAA GTGGCTGCCA CCGGCAAGCG

GCAGCCCCGA TACGCAAAGA

301 GGTCAAGCTC GACCGCCTGC GCATTGCCAG

CACGATGAGC AGAACTTCAT 361 TGTCGTAGCG GCGGGTAAAG

CGTCTCGATA AAGGTGAGGT 421 CCCCGTGGGC GAAGGCGGGA

CTGGCGGGAC ACCCATTTCA

481 GCAGGCTGCT GGGGTCCTGC TCCTGCGAGT

TCGCTGATAC CCGTACACCG

541 GGTCGCTGAT GGGTGGATAA AAACACTGCT

CGTCGAGAAG CCGCCGCTGA

601 TTCCGGCATT CCACTGCATC GGGGTGCGGA

GTCAGCCAGC GAGAGGTTGT

661 CGCCCATGCC GATCTCGTCG CCGTAGTACA

GCCGGGGAGG GCCAACAGCA

721 CGGTGGTCAG CAGCTCGATC CGGCGGCGGT

CAGCGGCGCG AGCCGGCGGC

781 GAATCCCCAC ATTGATCTTC ATGCGTGCGT

GGCGGCGTAC ATAAAGGCGC

841 GCTCGTCCTC GGTGACCATC TCCAGCGTGA

GACCCGTTTA

CAGCAGCCAA

GGTGGTGCTC

GTGTCAGGGG

TGACGGGCAC

CGAAATTGCT

CGGGGTTGTT

GCACCTCAAG

TCACGTTCAC

CGGGTAGGGC

CGCCGTTGCG

GGATGGGACT

CATTGTCCAG

CGGGCGCGTA

GTTCGTCGTG

GTTGCGCAAA AACGTTGCCC

PL 229 056 Β1

901 ACTGCCCAAA ACTGGGCAAC

CTCGCGAATG GAAGTGGTGT

961 CCTCGCGCTT CAGGCTCATA

AAAGTTGAAG CACATGTGGA

1021 ACTCGGGGTG TGTCTCCGTA

CTCCGGCCAC TGGTTGGCCT

1081 CGGCCAGCAG CAGGCGCCCT

GCGGCGCAGC TTCTGCAAGA

1141 TGGCGTGCGT CTCGGGCAGG

GCGCTCGATC AGGTAGGGCA

1201 CCGCGTCCAC TCGGAAGCCA

GAAGCGCAGC ACGTTCAGCA

1261 GCTCCTCCTG CACCCGGGGG

CTGCGACGAG AAGAAGCGGT

1321 GCCAGTAGTA TTTCCCGGCC

GCTCGTCTCG GTGTCGGTAA

1381 AGATGATGCG CGCGTCCGCG

CCAGACGTAG TAGTCGAAGT

1441 ATTCGTTGGG GCTGCCGTCA

CGCCGCCTGA AACCAGGGAT

1501 GGTCTGAAGA GGTGTGGTTG

CCGCAGGCCG CGCACATGCG

1561 CTTCGCGCAA AAAGACCTTG

ATCGGGGTGA ATGTCCGTGT

1621 AGTCGGCCAC GTCATACCCG

GTAAAAGGGC AGCAGCCACA

1681 GGCAATCCAC GCCCAGGTTC

GGTCAGGCCA GGAAAATCCC

1741 CCTTGCCATC GCCATTGCCG

CAGCTCATAG AAAACAGCAC

TTGGGCAGGC

AATAGCCTTG

CCGAAGTATT

GGGTACTCCT

TTCTCGCAGT

TCCAGCCCCA

TTGTCGTAGT

ATCTCGTCAA

TATTCGGTGC

GGCAGGGTGG

GTCACCAGGT

AAGTCGTCCA

TCATCCCTCA

TTCAGGTAGT

TCGGCATAGG

GCGCCATGAT

GCATCACCGG

CGACGACTTC

CATCCACCAC

TGGTGCCCTC

GGTCCAGCCA

TGAGGTCAGG

AGGTCCAGTT

CGGTGTCGCT

GGCCGCGCCG

CACCAATCAC

GCGTGCCCAG

GCGGGCTGGG

CGAGCTTGCC

TGCGGACACT

PL 229 056 Β1

1801 TCTTGTACCA CTCGGAGGTG

ATCTCCTTCT TAAAGTTAAA

1861 CAAAATTATT TCTAGAGGGG

TCCCCTATAG TGAGTCGTAT

1921 TAATTTCGCG GGATCGAGAT

GGACGCATCG TGGCCGGCAT

1981 CACCGGCGCC ACAGGTGCGG

GACATCACCG ATGGGGAAGA

2041 TCGGGCTCGC CACTTCGGGC

GTGGGTATGG TGGCAGGCCC

2101 CGTGGCCGGG GGACTGTTGG

CCATTCCTTG CGGCGGCGGT

2161 GCTCAACGGC CTCAACCTAC

CAGGAGTCGC ATAAGGGAGA

2221 GCGTCGAGAT CCCGGACACC

TCGCGGTATG GCATGATAGC

2281 GCCCGGAAGA GAGTCAATTC

AGTAACGTTA TACGATGTCG

2341 CAGAGTATGC CGGTGTCTCT

GGTGAACCAG GCCAGCCACG

2401 TTTCTGCGAA AACGCGGGAA

GGAGCTGAAT TACATTCCCA

2461 ACCGCGTGGC ACAACAACTG

GATTGGCGTT GCCACCTCCA

2521 GTCTGGCCCT GCACGCGCCG

TAAATCTCGC GCCGATCAAC

2581 TGGGTGCCAG CGTGGTGGTG

CGTCGAAGCC TGTAAAGCGG

2641 CGGTGCACAA TCTTCTCGCG

CATTAACTAT CCGCTGGATG

2701 ACCAGGATGC CATTGCTGTG

TCCGGCGTTA TTTCTTGATG

GAGGTTTGCG

AATTGTTATC

CGATCTCGAT

TTGCTGGCGC

TCATGAGCGC

GCGCCATCTC

TACTGGGCTG

ATCGAATGGC

AGGGTGGTGA

TATCAGACCG

AAAGTGGAAG

GCGGGCAAAC

TCGCAAATTG

TCGATGGTAG

CAACGCGTCA

GAAGCTGCCT

TCATATGTAT

CGCTCACAAT

CCTCTACGCC

CTATATCGCC

TTGTTTCGGC

CTTGCATGCA

CTTCCTAATG

GCAAAACCTT

ATGTGAAACC

TTTCCCGCGT

CGGCGATGGC

AGTCGTTGCT

TCGCGGCGAT

AACGAAGCGG

GTGGGCTGAT

GCACTAATGT

PL 229 056 Β1

2761 TCTCTGACCA GACACCCATC

TGAAGACGGT ACGCGACTGG

2821 GCGTGGAGCA TCTGGTCGCA

GCTGTTAGCG GGCCCATTAA

2881 GTTCTGTCTC GGCGCGTCTG

ATATCTCACT CGCAATCAAA

2941 TTCAGCCGAT AGCGGAACGG

GTCCGGTTTT CAACAAACCA

3001 TGCAAATGCT GAATGAGGGC

GGTTGCCAAC GATCAGATGG

3061 CGCTGGGCGC AATGCGCGCC

CGTTGGTGCG GACATCTCGG

3121 TAGTGGGATA CGACGATACC

CCCGCCGTTA ACCACCATCA

3181 AACAGGATTT TCGCCTGCTG

CTTGCTGCAA CTCTCTCAGG

3241 GCCAGGCGGT GAAGGGCAAT

GGTGAAAAGA AAAACCACCC

3301 TGGCGCCCAA TACGCAAACC

CGATTCATTA ATGCAGCTGG

3361 CACGACAGGT TTCCCGACTG

ACGCAATTAA TGTAAGTTAG

3421 CTCACTCATT AGGCACCGGG

GAGCCTTCAA CCCAGTCAGC

3481 TCCTTCCGGT GGGCGCGGGG

TTATGACTGT CTTCTTTATC

3541 ATGCAACTCG TAGGACAGGT

TTTTCGGCGA GGACCGCTTT

3601 CGCTGGAGCG CGACGATGAT

TCGGAATCTT GCACGCCCTC

3661 GCTCAAGCCT TCGTCACTGG

GCGAGAAGCA GGCCATTATC

AACAGTATTA

TTGGGTCACC

CGTCTGGCTG

GAAGGCGACT

ATCGTTCCCA

ATTACCGAGT

GAAGACAGCT

GGGCAAACCA

CAGCTGTTGC

GCCTCTCCCC

GAAAGCGGGC

ATCTCGACCG

CATGACTATC

GCCGGCAGCG

CGGCCTGTCG

TCCCGCCACC

TTTTCTCCCA

AGCAAATCGC

GCTGGCATAA

GGAGTGCCAT

CTGCGATGCT

CCGGGCTGCG

CATGTTATAT

GCGTGGACCG

CCGTCTCACT

GCGCGTTGGC

AGTGAGCGCA

ATGCCCTTGA

GTCGCCGCAC

CTCTGGGTCA

CTTGCGGTAT

AAACGTTTCG

PL 229 056 Β1

3721 GCCGGCATGG CGGCCCCACG

TGTCGTTGAG GACCCGGCTA

3781 GGCTGGCGGG GTTGCCTTAC

CGATACGCGA GCGAACGTGA

3841 AGCGACTGCT GCTGCAAAAC

CATGAATGGT CTTCGGTTTC

3901 CGTGTTTCGT AAAGTCTGGA

GCACCATTAT GTTCCGGATC

3961 TGCATCGCAG GATGCTGCTG

CATCTGTATT AACGAAGCGC

4021 TGGCATTGAC CCTGAGTGAT

TCCATACCGC CAGTTGTTTA

4081 CCCTCACAAC GTTCCAGTAA

TAACCCGTAT CGTGAGCATC

4141 CTCTCTCGTT TCATCGGTAT

ATCCCCCTTA CACGGAGGCA

4201 TCAGTGACCA AACAGGAAAA

GCTTTATCAG AAGCCAGACA

4261 TTAACGCTTC TGGAGAAACT

AACAGGCAGA CATCTGTGAA

4321 TCGCTTCACG ACCACGCTGA

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC

4381 GGTGAAAACC TCTGACACAT

CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT

4441 GCCGGGAGCA GACAAGCCCG

TTGGCGGGTG TCGGGGCGCA

4501 GCCATGACCC AGTCACGTAG

GCTTAACTAT GCGGCATCAG

4561 AGCAGATTGT ACTGAGAGTG

ATACCGCACA GATGCGTAAG

621 GAGAAAATAC CGCAT CAGGC

ACTGACTCGC TGCGCTCGGT

GGTGCGCATG

TGGTTAGCAG

GTCTGCGACC

AACGCGGAAG

GCTACCCTGT

TTTTCTCTGG

CCGGGCATGT

CATTACCCCC

AACCGCCCTT

CAACGAGCTG

TGAGCTTTAC

GCAGCTCCCG

TCAGGGCGCG

CGATAGCGGA

CACCATATAT

GCTCTTCCGC

ATCGTGCTCC

AATGAATCAC

TGAGCAACAA

TCAGCGCCCT

GGAACACCTA

TCCCGCCGCA

TCATCATCAG

ATGAACAGAA

AACATGGCCC

GACGCGGATG

CGCAGCTGCC

GAGACGGTCA

TCAGCGGGTG

GTGTATACTG

GCGGTGTGAA

TTCCTCGCTC

PL 229 056 Β1

4681 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG

GTAATACGGT TATCCACAGA 4741 ATCAGGGGAT AACGCAGGAA

CAGCAAAAGG CCAGGAACCG

4801 TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG

CCCCCTGACG AGCATCACAA

4861 AAATCGACGC TCAAGTCAGA

CTATAAAGAT ACCAGGCGTT

4921 TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG

CTGCCGCTTA CCGGATACCT

4981 GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG

AGCTCACGCT GTAGGTATCT

5041 CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC

CACGAACCCC CCGTTCAGCC

5101 CGACCGCTGC GCCTTATCCG

AACCCGGTAA GACACGACTT

5161 ATCGCCACTG GCAGCAGCCA

GCGAGGTATG TAGGCGGTGC

5221 TACAGAGTTC TTGAAGTGGT

AGAAGGACAG TATTTGGTAT

5281 CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG

GGTAGCTCTT GATCCGGCAA

5341 ACAAACCACC GCTGGTAGCG

CAGCAGATTA CGCGCAGAAA

5401 AAAAGGATCT CAAGAAGATC

TCTGACGCTC AGTGGAACGA

5461 AAACTCACGT TAAGGGATTT

GTCTGCTTAC ATAAACAGTA

5521 ATACAAGGGG TGTTATGAGC

TTGCTCTAGG CCGCGATTAA

5581 ATTCCAACAT GGATGCTGAT

TCGCGATAAT GTCGGGCAAT

TATCAGCTCA

AGAACATGTG

CGTTTTTCCA

GGTGGCGAAA

TGCGCTCTCC

GAAGCGTGGC

GCTCCAAGCT

GTAACTATCG

CTGGTAACAG

GGCCTAACTA

TTACCTTCGG

GTGGTTTTTT

CTTTGATCTT

TGGTCATGAA

CATATTCAAC

TTATATGGGT

CTCAAAGGCG

AGCAAAAGGC

TAGGCTCCGC

CCCGACAGGA

TGTTCCGACC

GCTTTCTCAT

GGGCTGTGTG

TCTTGAGTCC

GATTAGCAGA

CGGCTACACT

AAAAAGAGTT

TGTTTGCAAG

TTCTACGGGG

CAATAAAACT

GGGAAACGTC

ATAAATGGGC

PL 229 056 Β1

5641 CAGGTGCGAC AATCTATCGA

GCCAGAGTTG TTTCTGAAAC

5701 ATGGCAAAGG TAGCGTTGCC

GGTCAGACTA AACTGGCTGA

5761 CGGAATTTAT GCCTCTTCCG

TACTCCTGAT GATGCATGGT

5821 TACTCACCAG TGCGATCCCC

ATTAGAAGAA TATCCTGATT

5881 CAGGTGAAAA TATTGTTGAT

CCGGTTGCAT TCGATTCCTG

5941 TTTGTAATTG TCCTTTTAAC

CGCTCAGGCG CAATCACGAA

6001 TGAATAACGG TTTGGTTGAT

GCGTAATGGC TGGCCTGTTG

6061 AACAAGTCTG GAAAGAAATG

ACCGGATTCA GTCGTCACTC

6121 ATGGTGATTT CTCACTTGAT

GAAATTAATA GGTTGTATTG

6181 ATGTTGGACG AGTCGGAATC

TGCCATCCTA TGGAACTGCC

6241 TCGGTGAGTT TTCTCCTTCA

AAAATATGGT ATTGATAATC

6301 CTGATATGAA TAAATTGCAG

GTTTTTCTAA GAATTAATTC

6361 ATGAGCGGAT ACATATTTGA

AAATAGGGGT TCCGCGCACA

6421 TTTCCCCGAA AAGTGCCACC

TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA

6481 AATTTTTGTT AAATCAGCTC

AAATCGGCAA AATCCCTTAT

6541 AAATCAAAAG AATAGACCGA

CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA

TTGTATGGGA

AATGATGTTA

ACCATCAAGC

GGGAAAACAG

GCGCTGGCAG

AGCGATCGCG

GCGAGTGATT

CATAAACTTT

AACCTTATTT

GCAGACCGAT

TTACAGAAAC

TTTCATTTGA

ATGTATTTAG

TGAAATTGTA

ATTTTTTAAC

GATAGGGTTG

AGCCCGATGC

CAGATGAGAT

ATTTTATCCG

CATTCCAGGT

TGTTCCTGCG

TATTTCGTCT

TTGATGACGA

TGCCATTCTC

TTGACGAGGG

ACCAGGATCT

GGCTTTTTCA

TGCTCGATGA

AAAAATAAAC

AACGTTAATA

CAATAGGCCG

AGTGTTGTTC

PL 229 056 Β1

6601 CTATTAAAGA ACGTGGACTC

CCGTCTATCA GGGCGATGGC

6661 CCACTACGTG AACCATCACC

CGAGGTGCCG TAAAGCACTA

6721 AATCGGAACC CTAAAGGGAG

GGGGAAAGCC GGCGAACGTG

6781 GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA

GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG

6841 GTCACGCTGC GCGTAACCAC

CGCCGCTACA GGGCGCGTCC 6901 CATTCGCCA

CAACGTCAAA

CTAATCAAGT

CCCCCGATTT

AGCGAAAGGA

CACACCCGCC

GGGCGAAAAA

TTTTTGGGGT

AGAGCTTGAC

GCGGGCGCTA

GCGCTTAATG

Informacja o sekwencji: DŁUGOŚĆ: 6909 nukleotydów

Claims (3)

1. Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli TOP10F’ o symbolu Escherichia coli TOP10F’-pET30Ek/LICDgeoST, znamienny tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem znanego startera DgeoSTNdeF oraz startera oligonukleotydowego o wzorze 2 i o symbolu i DgTXRTAA, a uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET300Ek/LICDgeoST, zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne Nde\ '\Xhol, kodonem stop, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na kanamycynę, z origin plazmidu pBR322, z origin f 1, regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem terminacji transkrypcji T7, z miejscem operatorowym lac\, a następnie otrzymanym wektorem transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F’.

2. Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST, znamienny tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem znanego startera DgeoSTNdeF oraz startera oligonukleotydowego o wzorze 2 i o symbolu i DgTXRTAA, a uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoST, zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne Nde\ i Xho\, kodonem stop, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na kanamycynę, z origin plazmidu

PL 229 056 B1 pBR322, z origin f1 , regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem terminacji transkrypcji T7, z miejscem operatorowym lacI, a następnie otrzymanym wektorem transformuje się komórki Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS.

3. Sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 polegający na produkcji białka przez komórki rekombinantowego szczepu bakterii w pożywkach płynnych, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu bakterii o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoST w temperaturze początkowej od 36°C do 38°C i po indukcji w temperaturze pokojowej w zakresie do 38°C, a następnie po uzyskaniu gęstości zawiesiny komórkowej od 0,3 do 0,9 prowadzi się nadekspresję genu kodującego białko przez czas z zakresu od 2 do 24 godzin, poprzez dodanie do pożywki induktora jakim jest IPTG o stężeniu od 0,05 mM do10 mM lub laktozy, a po oddzieleniu zawiesiny komórkowej od płynu pohodowlanego, dezintegracji komórek i wstępnej termicznej denaturacji, na drodze wirowania izoluje się białka rozpuszczalne, po czym oczyszcza się je stosując wytrącanie siarczanem amonu, tak aby uzyskać jego 50% stopień nasycenia, po czym zagęszcza i zawiesza się w buforze do przechowywania, korzystnie o składzie: 0,85% NaCl, 20% glicerol (v/v), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,05% IGEPAL.

PL 229 056 Β1

Rysunki

Zamplifikowany gen kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geolhermalis DSMZ 11300 wraz z dodatkowymi miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Ndel i Xhol, zachowaniem ramki odczytu i kodonem